專利名稱：一種利用表面修飾蛋白芯片進行肺癌診斷方法
技術領域：
本發明涉及一種利用表面修飾蛋白芯片的肺癌診斷方法，屬蛋白質組學應用技術領域。
背景技術：
肺癌是當今世界各地最常見的惡性腫瘤之一。2001年美國有169500例肺癌新病人，死于肺癌的157400人，占癌癥總死亡數的1/3以上。我國許多大城市近30年來肺癌發病率明顯上升，已占常見惡性腫瘤的首位。并且幾乎不可能在早期獲得診斷。臨床上常規的檢查主要依據影像學方法如X-射線和計算機斷層掃描(CT)。雖然在常見腫瘤標志物中肺癌標記物最多，其中包括蛋白質、內分泌物質、酶、肽類和各種抗原物質。但總的來說均缺乏特異性，只能作為觀察病情變化的參考指標。因此尋找和確立肺癌特異性強、敏感性高的標志分子作為肺癌的早期診斷或預警顯得尤為重要。
蛋白質組是繼基因組后在國際迅速興起的生物科技，其主要應用領域之一是疾病診斷。從理論上說任何疾病在出現病理變化之前，細胞內的蛋白質在成分和數量上都會有相應的改變。通過對蛋白質動態的“盤點”，發現微小但有意義的變化，是進行疾病早期診斷和預警的一個被高度評價的新途徑。當然，實現這種診斷的前提，就是要找出對各種疾病有代表性的特殊標志蛋白分子(Biomarker)。表面增強激光解吸離子化飛行時間質譜(Surfaced Enhanced Laser Desorption/Ionization；SELDI)蛋白質芯片技術是新發展起來的一項蛋白質組學技術。除了快速、樣品用量少等特點外，還可以直接使用具有復雜蛋白成分的生物樣品。2001年底以來，國際上采用此項技術已從血清中陸續獲得了對大腸癌、乳腺癌、卵巢癌和前列腺癌有代表性的標志分子。國際上迄今尚無采用SELDI技術從血清中獲得肺癌標志分子的報道。
發明內容
本發明的目的是提出一種利用表面修飾蛋白芯片進行肺癌診斷方法，利用最新發展的SELDI蛋白質芯片技術，找出肺癌病人血清與正常人血清的蛋白質譜的標志性差異，再對待測病例血清中的蛋白質譜進行測定分析，從而以自動、直觀地判別病例。
本發明提出的利用表面修飾蛋白芯片進行肺癌診斷方法，包括以下步驟(1)取已確診的肺癌病人和正常人的血清，制備成表面增強激光解吸離子化飛行時間質譜蛋白質芯片，測定其蛋白質譜，從蛋白質譜中篩選出分子量為5910道爾頓、5931道爾頓、5342道爾頓、6116道爾頓、11510道爾頓和1030道爾頓的六個標志差異蛋白質作為肺癌標志蛋白質；(2)取待測病人微量血清，制備成表面增強激光解吸離子化飛行時間質譜蛋白質芯片，測定其蛋白質譜；(3)分析上述待測病人的蛋白質譜，若蛋白質譜上出現上述第1步的六個肺癌標志蛋白質，則進一步以分子量為5910道爾頓的蛋白質判斷，若此峰的強度大于7.059，則該待測病人為肺癌陽性，若此峰的強度小于或等于7.059，則該待測病人為肺癌陰性；
(4)對上述第3步判斷為肺癌陰性的待測病人，再以分子量為1030道爾頓的蛋白質判斷，若此峰的強度大于33.261，則該待測病人重劃為肺癌陽性。
上述方法中制備表面增強激光解吸離子化飛行時間質譜蛋白質芯片的過程包括以下步驟(1)分別取新鮮或-20攝氏度至-196攝氏度下保存的待測血清，在血清中加入尿素，血清與尿素體積比為1∶1.5～1∶3，混合振蕩15～30分鐘，備用；(2)用稀鹽酸滴加到弱陽離子交換芯片待用加樣點表面，保持5～10分鐘，用高純水洗芯片三次，然后在各加樣點上滴加5～50微升100毫摩爾乙酸鈉緩沖液，室溫下孵育，5～15分鐘后棄掉乙酸鈉緩沖液；(3)在每個加樣點上分別加上述第一步制備的血清/尿素混合物和乙酸鈉緩沖液，加入的比例為血清/尿素混合物∶乙酸鈉緩沖液＝1∶8～1∶20，振蕩孵育15～30分鐘，棄掉加樣點上的液體，用50～200微升100毫摩爾乙酸納洗滌芯片2～3次，每次3～5分鐘，然后芯片用高純水洗滌1～3次，待芯片表面自然晾干后，各加樣點表面加1～2次0.5微升的芥子酸，芯片表面自然晾干；(4)測定每個加樣點上所含各種蛋白質的分子量及其相對數量即強度，并建立兩者之間的關系，即蛋白質譜。
本發明提出的利用表面修飾蛋白芯片進行肺癌診斷方法，用其對臨床取得的39例肺癌病人和35例正常人血清進行初步盲篩，結果表明，其對肺癌檢出的敏感性為92.3％，特異性為97.1％，(敏感性定義為檢測陽性的病人數與全部肺癌病人數之百分比，特異性定義為表達陰性的正常人數與全部正常人數之百分比)，這表明其診斷功能良好，優于目前臨床使用中的任何單個分子指標。并具有標本采集簡單、無侵害、用量少(5-10微升)、技術操作簡便、快速等優點。
圖1是WCX-2芯片上5000-8000道爾頓分子量范圍內峰形曲線示例。圖中橫坐標為分子量，縱坐標為強度，上面三個曲線為正常人，下面三個曲線為肺癌病人，圖中標出的蛋白質峰為病人與正常人相比有差異的蛋白質峰。
具體實施例方式本發明提出的利用表面修飾蛋白芯片進行肺癌診斷方法，首先取已確診肺癌病人和正常人的血清，制備成表面增強激光解吸離子化飛行時間質譜蛋白質芯片，測定其蛋白質譜，從蛋白質譜中篩選出分子量為5910道爾頓、5931道爾頓、5342道爾頓、6116道爾頓、11510道爾頓和1030道爾頓的六個與正常人有差異的蛋白質作為肺癌標志蛋白質。本診斷方法對75個已獲嚴格確診的肺癌病人及66個健康人的血清樣品進行分析。肺癌病人血清樣品來自首都醫科大學附屬天壇醫院呼吸科，所有病人均具有完整的臨床資料和病理診斷，其中肺腺癌32例、磷癌22例、小細胞肺癌21例。病人年齡在40-77歲之間。66例對照組血清來源于國家體育總局健康普查時篩選出的樣本，年齡和性別與肺癌病人基本匹配。取待測病人微量血清，制備成表面增強激光解吸離子化飛行時間質譜蛋白質芯片，測定其蛋白質譜；分析待測病人的蛋白質譜，若蛋白質譜上出現六個肺癌標志蛋白質峰，則進一步以分子量為5910道爾頓的蛋白質判斷，若此峰的強度大于7.059，則該待測病人為肺癌陽性，若此峰的強度小于或等于7.059，則該待測病人為肺癌陰性；對已判斷為肺癌陽性的待測病人，再以分子量為1030道爾頓的蛋白質判斷，若此峰的強度大于33.261，則該待測病人為肺癌陽性。
上述方法中制備表面增強激光解吸離子化飛行時間質譜蛋白質芯片的過程為分別取新鮮或-20攝氏度至-196攝氏度下保存的待測血清，在血清中加入尿素，血清與尿素體積比為1∶1.5～1∶3，混合振蕩15～30分鐘，備用；用稀鹽酸滴加到弱陽離子交換芯片待用加樣點表面，保持5～10分鐘，用高純水洗芯片三次，然后在各加樣點上滴加5～50微升100毫摩爾乙酸鈉緩沖液，室溫下孵育，5～15分鐘后棄掉乙酸鈉緩沖液；在每個加樣點上分別加上血清/尿素混合物和乙酸鈉緩沖液，加入的比例為血清/尿素混合物∶乙酸鈉緩沖液＝1∶8～1∶20，振蕩孵育15～30分鐘，棄掉加樣點上的液體，用50～200微升100毫摩爾乙酸納洗滌芯片2～3次，每次3～5分鐘，然后芯片用高純水洗滌1～3次，待芯片表面自然晾干后，各加樣點表面加1～2次0.5微升的芥子酸，芯片表面自然晾干；測定每個加樣點上所含各種蛋白質的分子量及其相對數量即強度，并建立兩者之間的關系，即蛋白質譜。
本發明方法中，所用的表面增強激光解吸離子化飛行時間質譜(Surfaced EnhancedLaser Desorption/Ionization；SELDI)蛋白質芯片技術首先是對芯片的表面加以化學修飾，使其能特異性地捕獲樣品中具有某一特性的蛋白質(如疏水性、金屬親和性或一定范圍等電點等)。在激光束轟擊下蛋白質分子被離子化，并在電場加速和高真空下飛向檢測器。其飛行速度取決于分子質量，根據準確測定的飛行時間即可讀出每種蛋白質的分子量，故稱為飛行時間質譜。
下面介紹本發明的實施例。
實施例1樣品收集待檢測的病人，取靜脈血5毫升，不抗凝。4攝氏度存放30分鐘，每分鐘4000轉離心15分鐘，取血清等量分裝后-80攝氏度保存。取-80攝氏度保存的病人血清10微升，在血清中加入30微升的尿素，混合振蕩30分鐘。用5微升的稀鹽酸滴加到弱陽離子交換芯片(其型號為WCX-2)第1個至第8個加樣點(A-H點)表面5分鐘，用高純水洗芯片三次，在芯片每個加樣點上加50微升100毫摩爾乙酸鈉緩沖液，室溫下孵育15分鐘，棄掉乙酸鈉緩沖液。在每個加樣點分別加10微升上述血清/尿素混合物和90微升100毫摩爾乙酸鈉緩沖液，振蕩孵育30分鐘后，棄掉加樣點上的液體。用150微升100毫摩爾乙酸納洗滌芯片3次，每次5分鐘，而后芯片用高純水洗滌3次，待芯片表面自然晾干后，各加樣點表面加2次0.5微升的芥子酸(SPA)，芯片表面自然晾干。用蛋白質芯片閱讀機在每個加樣點的樣品上采集分子量數據，蛋白質芯片閱讀機設置如下激光強度190、檢測器敏感度9，優化分子質量范圍3000至30000原子量單位，最高分子量200000原子量單位，每個加樣點上收集分子量測定數據85次，采用賽弗吉公司專用軟件3.0(Ciphergen proteinchip 3.0)進行數據處理和統計學分析。軟件分析時具體設置如下信噪比“signal/noise”為5，收集閾值“minimum peak threshold”為10％，聚集質量“cluster mass”為2％，聚集質量補償信噪比“the signal/noise for the secondpass”為2％。所得數據用賽弗吉公司專用的標志分子組合式樣分析軟件(BiomarkerPattern 4.0)，查所得數據中分子量為5910道爾頓的峰強度為11.066，診斷為肺癌陽性。
實施例2收集待檢測的病人靜脈血10毫升，不抗凝。室溫放置10分鐘，每分鐘3000轉離心30分鐘，取血清等量分裝后-196攝氏度保存保存。取-196攝氏度至的病人血清5微升，在血清中加入10微升的尿素，混合振蕩15分鐘。用10微升的稀鹽酸滴加到弱陽離子交換芯片(WCX-2芯片)第1個至第8個加樣點(A-H點)表面8分鐘，用高純水洗芯片三次。芯片每個加樣點加10微升100毫摩爾乙酸鈉緩沖液，室溫下孵育5分鐘，棄掉乙酸鈉緩沖液。在每個加樣點分別加5微升上述血清/尿素混合物和95微升100毫摩爾乙酸鈉緩沖液，振蕩孵育20分鐘，棄掉加樣點上的液體，用100微升100毫摩爾乙酸納洗滌芯片3次，每次3分鐘，而后芯片用高純水洗滌2次，待芯片表面自然晾干后，各加樣點表面加1次1微升的芥子酸(SPA)，芯片表面自然晾干。用蛋白質芯片閱讀機在每個加樣點的樣品上采集分子量數據，蛋白質芯片閱讀機設置如下激光強度205、檢測器敏感度8，優化分子質量范圍5000至50000原子量單位，最高分子量200000原子量單位，每個加樣點上收集分子量測定數據65次，采用賽弗吉公司專用軟件3.0(Ciphergenproteinchip 3.0)進行數據處理和統計學分析。軟件分析時具體設置如下信噪比“signal/noise”為3，收集閾值“minimum peak threshold”為10％，聚集質量“cluster mass”為0.5％，聚集質量補償信噪比“the signal/noise for the second pass”為2％。所得數據用賽弗吉公司專用的標志分子組合式樣分析軟件(Biomarker Pattern 4.0)，數據中分子量5910道爾頓的峰強度為5.731，分子量為1030道爾頓的強度為9.303，自動顯示診斷為肺癌陰性。
實施例3待檢測病人，取靜脈血5毫升，不抗凝。4攝氏度存放30分鐘，每分鐘4000轉離心15分鐘，取血清等量分裝后-80攝氏度保存。取-80攝氏度保存的病人血清4微升，在血清中加入6微升的尿素，混合振蕩20分鐘。用5微升的稀鹽酸滴加到弱陽離子交換芯片(WCX-2芯片)第1個至第8個加樣點(A-H點)表面5分鐘，用高純水洗芯片三次，在芯片每個加樣點上加50微升100毫摩爾乙酸鈉緩沖液，室溫下孵育15分鐘，棄掉乙酸鈉緩沖液。在每個加樣點分別加5微升上述血清/尿素混合物和60微升100毫摩爾乙酸鈉緩沖液(血清/尿素混合物與100毫摩爾乙酸鈉緩沖液體積之比為1∶12)，放入濕盒內孵育20分鐘后，棄掉加樣點上的液體。用5微升100毫摩爾乙酸納洗滌芯片3次，每次5分鐘，而后芯片用高純水洗滌3次，待芯片表面自然晾干后，各加樣點表面加2次0.5微升的芥子酸(SPA)，芯片表面自然晾干。用蛋白質芯片閱讀機在每個加樣點的樣品上采集分子量數據，蛋白質芯片閱讀機設置如下激光強度195、檢測器敏感度9，優化分子質量范圍3000至30000原子量單位，最高分子量200000原子量單位，每個加樣點上收集分子量測定數據85次，采用賽弗吉公司專用軟件3.0(Ciphergenproteinchip 3.0)進行數據處理和統計學分析。軟件分析時具體設置如下信噪比“signal/noise”為5，收集閾值“minimum peak threshold”為10％，聚集質量“cluster mass”為2％，聚集質量補償信噪比“the signal/noise for the second pass”為2％。所得數據中分子量為5910道爾頓的峰強度為10.546，但分子量1030道爾頓的峰強度為39.336，診斷為肺癌陽性。
權利要求
1.一種利用表面修飾蛋白芯片進行肺癌診斷方法，其特征在于該方法包括以下步驟(1)取已確診的肺癌病人和正常人的血清，制備成表面增強激光解吸離子化飛行時間質譜蛋白質芯片，測定其蛋白質譜，從蛋白質譜中篩選出分子量為5910道爾頓、5931道爾頓、5342道爾頓、6116道爾頓、11510道爾頓和1030道爾頓的六個標志差異蛋白質作為肺癌標志蛋白質；(2)取待測病人微量血清，制備成表面增強激光解吸離子化飛行時間質譜蛋白質芯片，測定其蛋白質譜；(3)分析上述待測病人的蛋白質譜，若蛋白質譜上出現上述第1步的六個肺癌標志蛋白質峰，則進一步以分子量為5910道爾頓的蛋白質判斷，若此峰的強度大于7.059，則該待測病人為肺癌陽性，若此峰的強度小于或等于7.059，則該待測病人為肺癌陰性；(4)對上述第3步判斷為肺癌陰性的待測病人，再以分子量為1030道爾頓的蛋白質判斷，若此峰的強度大于33.261，則該待測病人為肺癌陽性。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于其中制備表面增強激光解吸離子化飛行時間質譜蛋白質芯片的過程包括以下步驟(1)分別取新鮮或-20攝氏度至-196攝氏度下保存的待測血清，在血清中加入尿素，血清與尿素體積比為1∶1.5～1∶3，混合振蕩15～30分鐘，備用；(2)用稀鹽酸滴加到弱陽離子交換芯片待用加樣點表面，保持5～10分鐘，用高純水洗芯片三次，然后在各加樣點上滴加5～50微升100毫摩爾乙酸鈉緩沖液，室溫下孵育，5～15分鐘后棄掉乙酸鈉緩沖液；(3)在每個加樣點上分別加上述第一步制備的血清/尿素混合物和乙酸鈉緩沖液，加入的比例為血清/尿素混合物∶乙酸鈉緩沖液＝1∶8～1∶20，振蕩孵育15～30分鐘，棄掉加樣點上的液體，用50～200微升100毫摩爾乙酸納洗滌芯片2～3次，每次3～5分鐘，然后芯片用高純水洗滌1～3次，待芯片表面自然晾干后，各加樣點表面加1～2次0.5微升的芥子酸，芯片表面自然晾干；(4)測定每個加樣點上所含各種蛋白質的分子量及其相對數量即強度，并建立兩者之間的關系，即蛋白質譜。
全文摘要
本發明涉及一種利用表面修飾蛋白芯片進行肺癌診斷方法，屬蛋白質組學應用技術領域。該方法首先取肺癌病人和正常人的血清，制備成表面增強激光解吸離子化飛行時間質譜蛋白質芯片，測定其蛋白質譜，從蛋白質譜中篩選出六個標志差異蛋白質作為肺癌標志蛋白質；取待測病人微量血清，制備成表面增強激光解吸離子化飛行時間質譜蛋白質芯片，測定其蛋白質譜；以分子量為5910道爾頓和1030道爾頓的蛋白質判斷，根據峰的強度判斷是否為肺癌病人。本發明的診斷方法，所達到的敏感性和特異性優于目前臨床使用中的任何單個分子指標，并具有標本采集簡單、無侵害、用量少(5－10微升)、技術操作簡便、快速等優點。
文檔編號H01J49/40GK1455257SQ0313695
公開日2003年11月12日 申請日期2003年5月23日 優先權日2003年5月23日
發明者何大澄 申請人:北京師范大學