一種照明深度可調的寬波段光源超分辨表層顯微成像方法

一種照明深度可調的寬波段光源超分辨表層顯微成像方法
【專利摘要】本發明公開一種照明深度可調的寬波段光源超分辨表層顯微成像方法，其中，用于所述超分辨表層顯微成像的照明器件從下到上依次包括：透明基底，光柵，金屬/介質多層膜層；所述顯微成像方法利用金屬/介質多層膜層在光柵的激發下產生的深亞波長體等離子體(BPPs)模式，作為顯微成像時的照明場，可在可見光及紫外光波段實現待測樣品5nm?300nm的表層超分辨成像。該方法有望應用于活細胞中細胞質膜的實時在線顯微成像，應用廣泛。本發明不僅可對待測樣品進行縱向照明深度的調節，也可橫向提高圖像的空間分辨率，大大提高了樣品表層成像質量。
【專利說明】
-種照明深度可調的寬波段光源超分辨表層顯微成像方法
技術領域
[0001] 本發明屬于顯微成像領域，設及一種照明深度可調的寬波段光源超分辨表層顯微 成像方法。
【背景技術】
[0002] 現代細胞科學正朝著分子尺度方向發展。其中，細胞表層區域附近的生物現象是 一個熱點研究內容。運些生物現象僅發生在距離膜表面一百納米甚至幾十納米左右的極薄 區域內。傳統的巧光顯微鏡利用傳輸波照明整個被巧光染料標記的生物樣品，但是較大的 照明深度使得膜表層圖像易受細胞內部散射光信號的干擾，降低了圖像的對比度。為獲得 清晰的細胞質膜表層圖像，僅需照明膜表層區域即可。全內反射巧光顯微鏡(TIRFM)，是利 用全內反射時產生的倏逝波，選擇性地照明膜表層一定厚度的區域(約IOOnm)，W減小表層 成像時源自樣品深層區域的光噪聲，但是能達到的照明深度一般都大于70nm，而且倏逝波 激發的巧光會受到入射激光的散射光W及激發巧光的干擾從而降低了圖像的對比度。為了 解決運些問題，近年來學者們提出了Lm)側向照明的玻璃薄板TIRF結構，但是由于Lm)的光 束發散角大，光束質量差，因而其倏逝波照明深度約為200皿。此外，其照明深度也無法進行 調節，無法用于寬波段、大發散角度的光源照明。
[0003] 百納米厚度的薄膜光波導可作為另一種倏逝波照明結構。當入射光禪合進入波導 時，就會在波導內激發特定的傳輸模式，波導界面處的倏逝波就可用于照明生物樣品薄層。 不同于棱鏡材料和浸沒式照明所用液體材料，介質薄膜材料更易于獲得更高的折射率，從 而實現更小照明深度的照明。但由于波導模式的離散性，導致照明深度無法連續調節。另 夕h光波在波導內傳輸時，由于樣品的散射損耗，界面處的倏逝波強度將沿傳輸方向緩慢衰 減，從而導致非均勻照明場。表面等離子體(SPs)被提出用于表層照明。但是由于臨近激發 結構會產生干擾光，也無法獲得均勻和低照明深度的SPs,無法用于寬波段、大發散角度的 光源照明。
[0004] 前期我們申請并授權的申請號為CN201210107957.7的中國專利"一種利用超衍射 離軸照明技術的納米表層光學顯微成像方法"通過改變金屬/介質多層膜中的材料及膜厚 可使消逝波穿透深度在5nm~200nm范圍得到調節，當多層膜材料與膜厚固定時，也無法對 照明深度進行動態的連續調節。此外，其工作帶寬還有待提高。
[0005] 本申請是專利CN201210107957.7內容的補充，增加了照明深度可調、寬波段光源 工作、大發散角度光源工作和橫向超分辨成像等保護內容。

【發明內容】

[0006] 本發明針對現有技術的不足提供一種照明深度可調的寬波段光源超分辨表層顯 微成像方法。
[0007] 本發明采用的技術方案為:一種照明深度可調的寬波段光源超分辨表層顯微成像 方法，用于所述超分辨表層顯微成像方法的照明器件包括:從下到上沿光線入射方向依次 為:透明基底，激發光柵，金屬/介質多層膜層。顯微成像樣品位于多層膜層之上，其中：
[000引所述超分辨表層顯微成像方法包括W下工作方式A，采用單色和小發散角光源照 明，發散半角<10%從基底一側，中屯、光線沿特定傾斜角度照明激發光柵結構，不改變光源 波長、激發光柵和多層膜層結構，僅僅調整中屯、光束照明角度，最大角度調節范圍0°~90°， 實現連續的照明深度調節，照明深度連續調節范圍為:5-300nm。
[0009] 或者所述超分辨表層顯微成像方法包括W下工作方式B，采用單色和大發散角光 源照明，發散半角<70°，從基底一側對稱照明激發光柵，結構，實現表層照明深度20~ SOOnm。
[0010] 或者所述超分辨表層顯微成像方法包括W下工作方式C，采用寬波帶小發散角光 源，或者多種波長激光，光源波長帶寬<400nm，或者激光波長差異<400nm，發散半角<10%從 基底一側，中屯、光線沿特定傾斜角度照明激發光柵結構，實現納米尺度的表層照明成像，照 明深度通過改變入射角度可W調節，調節范圍30~300nm。
[0011] 或者所述超分辨表層顯微成像方法包括W下工作方式D，采用寬波帶和大發散角 光源，光源帶寬<400nm，發散半角<70°，從基底一側對稱照明激發光柵結構，實現納米尺度 的表層照明成像，深度范圍40nm~300nm。
[0012] 其中，所述的照明光源可W為非相干、自然偏振光、激光，波段范圍紫外~可見光。
[0013] 其中，所述單色光源可W為引入濾波片的隸燈、納黃燈、單色L邸燈、氣燈等。
[0014] 其中，所述光源中屯、波長的真空波矢kO、中屯、光線入射角度0、光柵波矢kg、基底折 射率n、多層膜中體等離子體(BPPs)兩個波矢窗口化xmin，kxmax)和(-kxmax，-kxmin)、照明 發散半角A 0、光源波長帶寬的設計規則如下：1)光柵波矢kg選擇位于中屯、波長BPPs窗口上 邊緣kxmax; 2)針對中屯、波長和中屯、光線照明角度，選擇kg-n*sin目沖〇位于對應波長BPPs窗 口化xmin，kxmax)之內，且對于不等于1的任何正負整數m，m*kg-n*sin目*k日位于兩個對應波 長BPPs窗口之外；3) W包含在光源發散角和光源波長帶寬在內任何角度和波長組合，均滿 足規則2)。
[0015] 其中，二維激發光柵情形，光源照明使用方式同工作方式A~D，設計規則修正為1 ~4個有限二維光柵衍射級次進入BPPs窗口。
[0016] 其中，BPPs照明成像結合小角度反射照明成像，通過多幅圖像頻譜拓展疊加，實現 超分辨成像。
[0017] 其中，所述光柵所用材料可W為高折射率（折射率n〉2)的介質或金屬，包括:娃、 銘、銅。
[0018] 其中，所述金屬/介質多層膜中的金屬可W為良導體材料:金、銀、侶。
[0019] 其中，所述金屬/介質多層膜中的介質可W為低損耗的光學膜層材料:二氧化娃、 氣化儀。
[0020] 本發明原理及方法如下：
[0021] 當TM極化的單色平面波從基底背面入射至光柵，光柵協同上方的金屬/介質多層 膜層激發出體等離子體(BPPs) ,BPPs模式是由多層膜中相鄰金屬/介質層界面處存在的表 面等離子體場相互禪合產生的，其在多層膜結構中呈現傳輸特性，BPPs場分布貫穿整個S 維超材料空間，而不是局限在金屬膜層表面，離開多層膜結構時將指數衰減。為了進一步說 明BPPs模式，本發明采用等效介質理論化MT)將金屬/介質多層膜層近似為一各向異性介 質，而X，y和Z方向的等效介電常數分別為：
[0022] ex=ey=edf+em(l-f)
[0023] ￡z-i = ed-if+em-i(l-f)
[0024] 其中，Cm和Cd分別為金屬和介質的介電常數，f = hd/化d+hm)為介質層的填充因子。 在TM極化下該等效介質中的色散關系為kx2Az+kz2Ax = k〇2,其中kx，kz為沿著X，Z方向的等 效波矢分量，而ko為真空中的波矢。因此可W得到多層膜結構的色散關系為一條雙曲線，顯 然，該等效介質材料對空間頻率kx具有高通濾波的效果，也就是說，低頻BPPs模式[包括表 面等離子體(SPs)模式]無法在超材料中傳輸，從而只剩下高頻BPPs模式才能透過金屬/介 質多層膜而進入待測樣品。由于金屬/介質多層膜上表面的BPPs場是呈指數衰減的倏逝波， 因此僅對待測樣品下表面實現照明；此外，當采用光柵激發深亞波長的BPPs模式時，光柵產 生的巧射泌可被規合牽《房臘結構中的RPPs標式。此時，掙品中的照巧深原巧：
[cm
[00%]式中，A和0分別為入射光波長和角度，n為光柵所在基底的折射率，e為待照明樣品 的介電常數，d為光柵周期，而q為光柵衍射級次。從上式中可W看出，在BPPs照明結構參數 不變的情況下，倏逝波照明深度依賴于樣品介電常數，W及入射光波長和角度。
[0027] 本發明與現有技術相比具有W下優點：
[0028] 本發明僅需通過單獨或同時改變入射光角度和波長即可實現對待測樣品5nm~ SOOnm深度范圍連續可調的表層均勻照明，出射面光強不均勻性因子均低于0.03,而且，本 發明不僅可對待測樣品進行縱向照明深度的調節，也可橫向提高圖像的空間分辨率，大大 提高了樣品表層成像質量。此外，本發明具有原理新穎、結構簡單、易于操作、工作帶寬寬、 效率高、成本低等優點，為實現更高質量的表層光學顯微成像開拓了新思路。
【附圖說明】
[0029] 圖1為本發明實施例1中照明器件的結構示意圖，其中，1為透明基底層，2為光柵 層，3為金屬，4為介質，5為待測樣品；
[0030] 圖2為本發明實施例1水溶液中計算得到的與仿真得到的照明深度隨入射角度的 變化關系，入射波長為532nm;
[0031] 圖3為本發明實施例1中出射界面處X方向的光強不均勻性因子與入射角度間的關 系。插圖是入射角度為5°，25°，40°及50°時X方向的光強分布曲線；
[0032] 圖4為本發明實施例2中400-700nm波長范圍內的OTF;
[0033] 圖5為本發明實施例2水溶液中BPPs所能實現的照明深度調制范圍隨入射波長的 變化關系；
[0034] 圖6為本發明實施例3中Ag/Si〇2多層膜的0TF。
【具體實施方式】
[0035] 下面結合附圖及【具體實施方式】詳細介紹本發明。但W下的實施例僅限于解釋本發 明，本發明的保護范圍應包括權利要求的全部內容，而且通過W下實施例對領域的技術人 員即可W實現本發明權利要求的全部內容。
[0036] 實施例1，通過改變入射光角度對照明深度進行連續調節。圖I是該超分辨表層顯 微成像的照明器件結構示意圖，所述器件由下到上依次為：光源、透明石英基底；娃光柵； Ag/Si化多層膜。設置娃光柵周期為20化m，深度為50皿，占空比為0.5DAg/Si〇2多層膜由9層 Ag膜(20nm)和8層Si02膜(80nm)組成。532nm光入射時，Ag的介電常數為e/^g = -11.3+0.17i， Si〇2的介電常數％0,=2-13。W照明光入=532皿的TM極化的單色平面波從基底背面入射至 光柵，光柵產生的衍射波可被禪合至多層膜結構中的BPPs模式。當Ag/Si〇2多層膜僅 激發-1級次BPPs模式時，改變入射光角度范圍0-52°。如圖2所示，由理論公式
t算得到的與全波仿真獲得的照明深度幾乎 一致，并且倏逝波照明深度將隨著入射角度的增加而增大。且可知在水溶液中，照明深度調 制范圍為19-63nm。
[0037] 接下來，本實施例進一步探討照明均勻性。在0-51°范圍內，出射面處的光強不均 勻性因子化=(Imax-Imin)/(Imax+Imin))與入射角度的關系見圖3上半部分。從中可W看出，除 了0°和52°角附近，其余入射角度下的不均勻性因子均小于0.1。由于在0°和51°角附近，金 屬/介質多層膜層中不僅激發-1級次的BPPs模式，而且還會激發其他級次衍射光，因而-1級 次BPPs模式與其他級次光波的干設會使光強均勻性稍有惡化。此外，從中還可W看出，光強 不均勻性因子隨入射角度的變化呈振蕩形式。主要原因是，超材料結構中激發的-1級次 BPPs模式泄露出的電場幅值隨入射角度而振蕩變化(見圖3下半圖），因而與變化不大的0級 傳輸光的干設作用效果也將振蕩變化，從而導致振蕩變化的光強不均勻性因子。同時，超材 料出射面處的-1級次BPPs模式電場幅值越大，其與0級傳輸光的干設作用越弱，故對應的光 強不均勻性因子將越小。此外，在5°，25°，40°和50°時的光強橫向分布見圖3插圖，此時的光 強不均勻性因子均低于0.03。
[0038] 實施例2,本發明在寬帶波長范圍內的工作性能，BPPs照明結構在可見光波長范圍 內也能實現極低的照明深度。圖4顯示了在可見光范圍（400-700nm)內金屬/介質多層膜層 的光學傳遞函數。從中可W看出，OTF窗口下限幾乎不隨入射波長而變化，其上限將隨著入 射波長的增加而緩慢減小。其中，多層膜結構OTF的上下限定義為窗口抑制比約為20(透過 率大于0.015的條件下)或者透過率約為0.015(0TF窗口抑制比大于20的條件下)時的kx值。 同時發現波長接近400nm時，攜帶有低頻空間波矢的BPPs模式將被多層膜結構傳輸。
[0039] 當入射波長為650nmW及530nm時，超材料僅支持一定帶寬的高頻BPPs模式，而 450nm時其還能同時還能激發低頻BPPs模式。通過計算發現波長小于530nm時金屬/介質多 層膜層可W同時激發高頻和低頻空間波矢BPPs模式，而530nm W及更長入射波長時，僅有存 在高頻BPPs模式。因而為了僅支持高頻BPPs模式，入射光波長不能小于530nm。通過優化照 明結構材料及參數，就可W將工作波長拓展至紫外光波段。
[0040] 在530-700nm入射波長范圍內，倏逝波照明源在水溶液中的照明深度如圖5所示。 可獲得的最小照明深度從530皿波長時的19皿緩慢增加至700皿時的27皿，即最小照明深度 關于入射波長變化不大，本發明可在寬波帶范圍內工作。
[0041] 實施例3,基于該發明可W提升橫向成像分辨率。成像器件結構與圖1類似，基底層 為玻璃襯底，光柵層為亞波長Cr激發光柵（周期為160nm，占空比為0.5)，金屬/介質多層膜 層由30對20皿厚的Ag膜(入射波長為442皿時介電常數為-5.77+0.225i)和30皿厚的Si化膜 (介電常數為2.13)交替堆疊而成。波長為442nm的平面波入射時，Ag/Si化多層膜的OTF見圖 6。從中可W看出，僅在P極化入射光時，多層膜結構呈現帶通濾波特性，只有橫向波矢位于 2.2k〇~3. Sko的倏逝波分量可被多層膜結構增強和透過。光柵激發的± 1級次衍射光的橫向 波矢為±2.76k〇,均位于多層膜結構的帶通窗口之內，±1級次衍射光在多層膜結構內產生 的兩高頻BPPs模式相互干設，干設后的BPPs模式橫向波矢可增大為原來的兩倍，即5.5化0。 該BPPs模式可作為高空間頻率的結構照明場。由于結構照明場的空間頻率越高，成像時可 達到的空間分辨率越大，因而該發明具有實現超衍射高分辨率的成像。通過理論估算，此時 可W將空間分辨率提高為傳統巧光顯微鏡的6.5倍。具體實現成像時，需調節照明場的相 位，獲取多幅頻譜擴展后的原始圖像，后經過圖像重建算法得到超高分辨率圖像。
[0042]因此，上面結合附圖對本發明的實施例進行了描述，但是本發明并不局限于上述 的【具體實施方式】，上述的實施方式僅僅是示意性的，而不是限制性的。本領域的普通技術人 員在本發明的啟示下，在不脫離本發明宗旨和權利要求所保護的范圍情況下，還可做出很 多形式，運些均屬于本發明的保護之內。本發明未詳細闡述部分屬于本領域技術人員的公 知技術。
【主權項】
1. 一種照明深度可調的寬波段光源超分辨表層顯微成像方法，其特征在于，用于所述 超分辨表層顯微成像方法的照明器件包括:從下到上沿光線入射方向依次為:透明基底，激 發光柵，金屬/介質多層膜層，顯微成像樣品位于多層膜層之上，其中： 所述超分辨表層顯微成像方法包括以下工作方式A，采用單色和小發散角光源照明，發 散半角〈10°，從基底一側，中心光線沿特定傾斜角度照明激發光柵結構，不改變光源波長、 激發光柵和多層膜層結構，僅僅調整中心光束照明角度，最大角度調節范圍0°~90°，實現 連續的照明深度調節，照明深度連續調節范圍為:5~300nm; 或者所述超分辨表層顯微成像方法包括以下工作方式B，采用單色和大發散角光源照 明，發散半角〈70°，從基底一側對稱照明激發光柵結構，實現表層照明深度20~300nm; 或者所述超分辨表層顯微成像方法包括以下工作方式C，采用寬波帶小發散角光源，或 者多種波長激光，光源波長帶寬<400nm，或者激光波長差異<400nm，發散半角〈10°，從基底 一側，中心光線沿特定傾斜角度照明激發光柵結構，實現納米尺度的表層照明成像，照明深 度通過改變入射角度可以調節，調節范圍30~300nm; 或者所述超分辨表層顯微成像方法包括以下工作方式D，采用寬波帶和大發散角光源， 光源帶寬<400nm，發散半角〈70°，從基底一側對稱照明激發光柵結構，實現納米尺度的表層 照明成像，深度范圍40nm~300nm〇2. 根據權利要求1所述的一種照明深度可調的寬波段光源超分辨表層顯微成像方法， 其特征在于，所述的照明光源可以為非相干、自然偏振光、激光，波段范圍紫外~可見光。3. 根據權利要求1所述的一種照明深度可調的寬波段光源超分辨表層顯微成像方法， 其特征在于，所述單色光源可以為引入濾波片的汞燈、納黃燈、單色LED燈或氙燈。4. 根據權利要求1所述的一種照明深度可調的寬波段光源超分辨表層顯微成像方法， 其特征在于，所述光源中心波長的真空波矢k〇、中心光線入射角度Θ、光柵波矢kg、基底折射 率η、多層膜中體等離子體(BPPs)兩個波矢窗口（ kxmin，kxmax)和(-kxmax，-kxmin)、照明發散半 角A Θ、光源波長帶寬的設計規則如下：1)光柵波矢kg選擇位于中心波長BPPs窗口上邊緣 kxmax; 2)針對中心波長和中心光線照明角度，選擇kg-n*sin9*k〇位于對應波長BPPs窗口 (kxmin，kxmax)之內，且對于不等于1的任何正負整數m，m*kg-n*sin 9*k〇位于兩個對應波長 BPPs窗口之外；3)以包含在光源發散角和光源波長帶寬在內任何角度和波長組合，均滿足 規則2)。5. 根據權利要求1所述的一種照明深度可調的寬波段光源超分辨表層顯微成像方法， 其特征在于，二維激發光柵情形，光源照明使用方式同工作方式A~D，設計規則修正為1~4 個有限二維光柵衍射級次進入BPPs窗口。6. 根據權利要求1所述的一種照明深度可調的寬波段光源超分辨表層顯微成像方法， 其特征在于，BPPs照明成像結合小角度反射照明成像，通過多幅圖像頻譜拓展疊加，實現超 分辨成像。7. 根據權利要求1所述的一種照明深度可調的寬波段光源超分辨表層顯微成像方法， 其特征在于，所述光柵所用材料可以為高折射率的介質或金屬，包括:硅、鉻或銅，高折射率 為折射率n>2。8. 根據權利要求1所述的一種照明深度可調的寬波段光源超分辨表層顯微成像方法， 其特征在于，所述金屬/介質多層膜中的金屬可以為良導體材料:金、銀或鋁。9.根據權利要求1所述的一種照明深度可調的寬波段光源超分辨表層顯微成像方法， 其特征在于，所述金屬/介質多層膜中的介質可以為低損耗的光學膜層材料:二氧化硅或氟 化鎂。
【文檔編號】G02B21/06GK105954866SQ201610556663
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年7月15日
【發明人】羅先剛, 趙澤宇, 王長濤, 孔維杰, 王彥欽, 劉凱鵬, 劉玲, 蒲明博, 高平, 王炯
【申請人】中國科學院光電技術研究所