用于漸逝照明和點狀掃描照明的顯微鏡的制作方法

用于漸逝照明和點狀掃描照明的顯微鏡的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種顯微鏡(30)，具有物鏡(1)和照明單元(31)，用于選擇性地產生通過物鏡(1)延伸的用于物體的點狀掃描照明的無畸變的光束路徑(14)和通過物鏡(1)延伸的用于物體的漸逝照明的圓錐光束路徑(13)，其中，所述照明單元包括：用于產生沿著照明光束路徑(32)的照明光束的光源(10)，用于偏轉照明光束路徑(32)的調節單元(7)，放置在調節單元(7)下游的用于將照明光束聚焦在掃描目鏡(8)的成像平面(11)中的掃描目鏡(8)，以及布置在掃描目鏡(8)的成像平面(11)中的反射鏡表面(6)，該反射鏡表面具有用于產生無畸變的光束路徑(14)的透光區域(27)并且具有用于從照明光束路徑(32)產生圓錐光束路徑(13)的、面向掃描目鏡(8)的至少部分反射區域(28)，其中，相對于圓錐光束路徑(13)，掃描目鏡(8)的成像平面(11)位于與物鏡(1)的出射光瞳(2)共軛的平面中。
【專利說明】
用于漸逝照明和點狀掃描照明的顯微鏡
技術領域
[0001]本發明涉及一種用于漸逝照明和點狀掃描照明的顯微鏡，其中能夠在這兩種照明方式之間轉換。本發明還涉及一種用于在所述照明方式之間轉換的方法。
【背景技術】
[0002]從現有技術已知允許在物體的漸逝照明與點狀掃描照明之間轉換的顯微鏡。
[0003]WO 2005/031428 Al公開了一種具有漸逝樣本照明的顯微鏡，該顯微鏡附加地包括用于操作樣本的光學設備。在此，激光器用于產生照明光束，照明光束被聚焦到顯微鏡物鏡的后光瞳面中。光束偏轉裝置用于調整該激光光束的焦點相對于物鏡的光軸的橫向距離，該光束偏轉裝置包括安裝萬向節的旋轉鏡。當焦點相對于物鏡光軸的距離足夠時，在樣本固定器(例如蓋玻片)與樣本之間的界面上出現全反射。由此產生的漸逝場僅穿透樣本的界面并且隨著與該界面的距離指數地減小。由此激勵位于樣本界面中的熒光團，而背景熒光可以明顯減小。由此改善了圖像對比度。這種方法一般被稱為全內反射熒光顯微術(TIRFM,Total Internal Reflect1n Fluorescence Microscopy)。
[0004]用于操作樣本的設備包括例如多線激光器，從其發射光譜中，可以使用聲光可調濾波器(AOTF)選擇具有期望波長的分量。通過另一光束偏轉裝置調整聚焦在樣本中的操作光束的位置。
[0005]在實施例中，為了在操作照明與TIRF照明之間轉換，鉸鏈式反射鏡被樞轉至TIRF照明光束路徑，以使得TIRF照明光束路徑遇到鉸鏈式反射鏡的非反射背面并且被阻止進一步傳播。鉸鏈式反射鏡在其樞轉位置被配置以使得操作光束在鉸鏈式反射鏡處被反射并由此耦合至照明光束路徑中。在另一實施例中，具有可選擇的波長的單個激光光源不僅用于TIRF照明而且用于操作照明。在這種情況下，在兩個照明模式之間轉換通過僅僅將適應光學器件加入照明光束路徑中來實現。該適應光學器件的作用是，針對TIRF照明，使激光束聚焦至顯微鏡物鏡的后光瞳面中。在沒有適應光學器件的情況下，相反地，激光束被聚焦至樣本中。操作光束通常是用于(共焦)掃描顯微術的激光掃描光束。
[0006]因此，在該文獻中，為了在TIRF照明與操作照明之間轉換，將光學組件(鉸鏈式反射鏡或者適應光學器件)加入照明光束路徑中或者從該照明光束路徑中移除。
[0007]共焦掃描顯微鏡一般包括光源、聚焦光學器件(通過它使光源的光聚焦在孔徑(被稱為“激勵針孔”)上)、分束器、用于光束控制的光束偏轉裝置、顯微光學器件、檢測針孔、以及用于檢測由樣本發出的檢測光/熒光的檢測器。照明光經由分束器耦合。由物體發出的熒光或檢測光經由光束偏轉裝置返回到分束器，通過分束器，并且之后被聚集在檢測針孔上，檢測器位于檢測針孔后面。這種檢測布置稱為“退掃描(descan)”布置。不直接來自聚焦區的檢測光不通過檢測針孔，由此得到點信息，其通過利用照明光束的焦點順序地掃描物體可以組成三維圖像。三維圖像通常通過在不同的焦面上分層地獲取圖像數據來實現。
[0008]US 7,187,494 B2的主題是具有激光源的顯微鏡，其中顯微鏡包括用于使激光束從光軸偏心的偏轉單元和物鏡，激光束穿過物鏡。在示例性實施例中，為了在掃描顯微術與TIRF顯微術之間轉換，提出了所謂的聚光透鏡布置，它被配置為可加入到照明光束路徑中并且從照明光束路徑中移除。當聚光透鏡布置在照明光束路徑中時，激光光束偏心地聚焦在物鏡的光瞳中(TIRF照明)，而當聚光透鏡布置從照明光束路徑中移除時，激光光束被聚焦在樣本上并且掃描樣本。
[0009]利用這種顯微鏡，已經證實不利的是，在TIRF顯微術與掃描顯微術之間的轉換對于許多應用來說太慢，并且如果要實現在兩種顯微模式中的精確的光束引導，針對加入到照明光束路徑中的元件的對準費用非常高。
[0010]WO 2007/020251 Al公開了一種用于TIRF顯微術的顯微鏡，其中激光源的激光首先經由反射鏡中的孔，并且之后經由調節單元朝向顯微鏡物鏡引導。針對激光光束，在反射鏡的非反射側面上的孔作為普通的孔徑開口，其直徑對應于照明光線在反射鏡的位置處的直徑。反射表面位于反射鏡的另一側面上。通過調節單元，激光束得到其對于TIRF照明所必需的偏心。結果，激光束可以以臨界角度入射到樣本載體與物體之間的界面上。對于從折射率m=l.518的蓋玻片過渡到折射率n2 = l.33的水，該臨界角度的值例如為61° (全反射角)。
[0011]在實施例中，激光束利用調節單元相對于物體的主軸可旋轉對稱地引導，以使得在物體中由于全反射產生漸逝場。只有當已知樣本的折射率時，可以計算為此所需的全反射角。然而，經常涉及通常具有未知折射率的不同樣本。因此為了允許給出全反射角的經驗指示，即允許自動地建立漸逝照明，該文獻建議，檢測在達到臨界全反射角之前發生的反射光。該光通過顯微鏡物鏡返回到調節單元，并且從調節單元進入到布置在照明光束路徑中的反射鏡的反射表面上。反射光從反射表面被反射到檢測器中。當達到全反射角時，反射光的比例急劇減小，因為激光束現在在樣本載體中在與物體的界面處被全反射，并且激勵漸逝場。可以從該過渡確定全反射的位置，即為此必需的通過調節單元的偏轉的程度。
[0012]目前在現代的、尤其倒置顯微鏡中，為了檢查諸如細胞的生命系統，對于單個樣本需要各種照明方法。為此通常，在時間順序上以非常短的時間間隔切換具有不同波長的激光，以激勵或操作樣本并用于隨后測量和評價。利用用于TIRF顯微術和激光掃描顯微術的上述系統，反射鏡元件和/或透鏡元件必須被機械地加入到照明光束路徑中，或者從照明光束路徑中移除。當借助這些可移動的光學元件將各個照明模塊耦合在一起時，每個模塊具有其特有的激光照明系統，并且它們為了實驗必須經常費力地相互同步。光學元件的機械的加入和移除對在激勵/操作與測量/評價之間的所期望的短的時間間隔具有負面的影響。此外，具有應用必需的精度的這種機械的切換和移動布置在機械上是復雜的并且相應地是昂貴的。
[0013]除了上述照明方法以外，下面還將提到光漂白之后的熒光恢復(FRAP)和熒光共振能量轉移(FRET)。在FRAP中，在樣本中的染料以高強度利用X-Y精度被破壞(漂白)，并且之后經由適合的照明(例如TIRF照明)激勵相鄰的隔間。如果被漂白和激勵的隔間被連接，則染料可以通過擴散進入到漂白區域中。為了檢測這一點，需要高的轉換速率。
[0014]FRET方法使用熒光團，其中由于共振能量轉移，供體被激勵，并且受體發光。利用適合頻率的精確的點激光掃描照明允許受體選擇地被破壞(漂白)，而保留供體。
[0015]共振能量轉移的強度尤其取決于供體與受體之間的距離。如果距離太大或者受體被漂白，則供體本身輻射能量作為熒光發射。共振能量轉移所需的距離在大約0.5至1nm的范圍內。在不存在和存在受體染料的情況下對供體染料的輻射強度的測量允許推斷在樣本中的生物化學過程。例如，供體或受體染料可以耦合至其物理相互作用將要被研究的物質。如果發生基于上述輻射強度可測量的能量轉移，則兩種物質是物理上相互作用的。與FRAP方法相比，在FRET方法需要更低的轉換率，但是為了研究正在被檢查的細胞中的生物化學過程，在分辨率方面存在更高的需求。
[0016]多光子顯微術代表另一掃描成像方法。在此，借助于聚焦高能激光束產生非線性光學效應。多光子顯微鏡的構造和工作方式類似于共焦激光掃描顯微鏡的構造和工作方式。然而，共焦激光掃描顯微鏡(根據樣本)實現50至80μπι的穿透深度，而通過多光子顯微術可以實現幾百μπι的穿透深度。這允許圖像再現延伸至更深的組織區域中。在多光子熒光顯微術中，兩個或多個同時入射的光子被染料的電子吸收，并且隨著短波光子的發射，實現至基態的過渡。另一方面，激勵光子具有較長的波長。利用雙光子激勵，激勵波長大致為在熒光顯微術中通常使用的激勵波長的兩倍。
[0017]為了實現兩個或多個光子的同時吸收，需要高光子密度，其可以通過使用高強度脈沖激光器來提供。如在共焦激光掃描顯微鏡的情況中那樣，激光束通過顯微鏡的物鏡被聚焦在樣本中的一個點上。利用掃描單元在樣本上掃描聚焦的激光束。發出的熒光輻射經由物鏡和二向色分束器被引導到檢測器。在兩個激光脈沖之間的停歇時間足夠長，以使得引入到樣本中的能量可以在該時間的一部分中作為熒光輻射再次發射。因此，檢測器測量每個圖像點的亮度，以使得可以在掃描樣本以后組成樣本的完整圖像。
[0018]與共焦激光掃描顯微術相比，多光子顯微術的優點是更高的穿透深度。在雙光子顯微術中，例如，用于激勵的光是紅外光，它在生物組織中比可見光少得多地被散射和吸收。與共焦激光掃描顯微術相比，利用多光子顯微術，所有被物鏡收集的熒光都用于要創建的圖像;因此不需要針孔來濾除來自其它平面的光。這是因為，在焦平面以外的光強不足以在其中引起熒光染料的多光子激勵。因此也無需通過掃描反射鏡捕捉熒光輻射(非退掃描檢測)。利用短脈沖激光器和集成的檢測器，這種系統可以組合作為TIRF和多光子系統。
[0019]本發明的目的是描述一種顯微鏡，該顯微鏡可以在無需光學元件至照明光束路徑的機械引入或從照明光束路徑的機械移除的情況下，在點狀掃描照明(或“圖像掃描”)與漸逝照明(或“光瞳掃描”)之間進行快速轉換。下面針對點狀掃描照明的照明光束路徑被稱為“無畸變的光束路徑”，針對漸逝照明的照明光束路徑被稱為“圓錐光束路徑”。

【發明內容】

[0020]該目的通過根據權利要求1所述的根據本發明的顯微鏡以及根據權利要求15所述的方法實現。根據本發明的顯微鏡包括物鏡和照明單元，用于選擇性地產生通過物鏡延伸的用于物體的點狀掃描照明的無畸變的光束路徑和通過物鏡延伸的用于物體的漸逝照明的圓錐光束路徑。所述顯微鏡的照明單元包括用于產生沿著照明光束路徑的照明光線的光源；用于偏轉照明光束路徑的調節單元；以及放置在調節單元的后面的掃描目鏡，用于將照明光線聚焦在掃描目鏡的成像平面中。所述調節單元(掃描器)從光軸引導照明光線，其中偏轉的照明光線被掃描目鏡聚焦在掃描目鏡的成像平面中。
[0021]放置在調節單元后面的是靜止的反射鏡表面，其具有(至少部分)透光區域和(至少部分)反射區域。所述透光區域用于在照明光線穿過反射鏡表面的透光區域以后產生無畸變的光束路徑，而反射區域用于在照明光束路徑在反射表面處偏轉以后從照明光束路徑產生圓錐光束路徑。相對于圓錐光束路徑，所述掃描目鏡的成像平面位于與物鏡的出射光瞳共軛的平面中。
[0022]根據本發明，利用所述的顯微鏡構造，可以通過以下產生無畸變的光束路徑:利用調節單元偏轉照明光束路徑，以使得照明光束路徑穿過反射鏡表面的透光區域，而通過以下生成圓錐光束路徑:利用調節單元偏轉照明光束路徑，以使得照明光束路徑遇到反射鏡表面的反射區域。
[0023]在相應的應用權利要求中描述本發明的有利應用。
[0024]從各個從屬權利要求和下面的描述給出本發明的有利實施例。
[0025]本發明的優點
[0026]本發明允許在兩種上述照明模式(圖像掃描與光瞳掃描)之間快速轉換，為此交換在反射鏡表面中圖像位置與光瞳位置。所述反射鏡表面例如布置在掃描目鏡的成像平面中。針對圖像掃描，照明光束路徑被調節單元(掃描器)偏轉，以使得照明光線的焦點位于靜止的反射鏡表面的透光區域內。在簡單的情況下，所述透光區域是反射鏡表面中的開口。替代地，所述反射鏡表面可以在透光區域具有高反射抑制涂層來代替鏡面(即，高反射)涂層(諸如在反射區域中施加至載體玻璃上的涂層)，并且為此有效地具有與最大圖像掃描場相同的尺寸，最大圖像掃描場的邊界通過至漸逝照明的過渡來限定。原因是，如果顯微鏡物鏡(在這里為TIRF物鏡)的出射光瞳通過放大至全反射的限制孔徑(在這里約為1.37)而經由圓錐光束路徑成像至掃描目鏡的成像平面中，從而使其與最大圖像掃描場一致；以及如果反射鏡表面通過其透光區域(其尺寸與最大圖像掃描場相同)以不同于0°的角度、適宜地以45°放置在掃描目鏡的成像平面中，則用于產生漸逝照明的光線之后在透光區域以外在反射區域處被反射到圓錐光束路徑中。
[0027]由此可以通過利用掃描器(調節單元)簡單地控制掃描角度來在圖像掃描與光瞳掃描之間轉換。原因是，只要掃描角度位于照明光線位于反射鏡表面的透光區域以內的范圍，圖像掃描(即點狀掃描照明)就可以發生直到最大掃描場。只有當掃描角度變大時，光源的照明光線入射在反射鏡表面的反射區域上并且導引到圓錐光束路徑中，并且被成像，以使得照明光線被聚焦在物鏡的物鏡光瞳的外部區域上。
[0028]可以僅通過修改掃描角度來實現從圖像掃描至光瞳掃描、即漸逝照明的過渡，而無需將光學組件加入到照明光束路徑中或者從照明光束路徑送出光學組件。根據本發明的顯微鏡的所有光學組件可以最初以永久的方式對準并且在使用顯微鏡時不需要進一步修改。另外，單個光源可以用于兩個光束路徑，結果復雜的同步和對準是多余的；還存在相應的成本優勢。根據本發明的顯微鏡在單個系統中實現兩個光束路徑，該系統尤其可以通過具有集中式軟件的單個計算機來控制。根據本發明的顯微鏡的另一優點是，正常的圖像掃描也可以沒有限制地通過使用其它物鏡(即非TIRF物鏡)直到最大掃描場。
[0029]因此，本發明不僅適用于在漸逝照明與點狀掃描照明之間的快速轉換，而且作為用于照片操作的通用模塊。對此，可以參考在說明書引言中描述的方法，例如FRAP或FRET。此外可以設想短脈沖激光器(例如便宜的光纖激光器)與集成的檢測系統(具有所謂的非退掃描檢測器)的組合作為便宜的多光子成像系統。圖像掃描模式中樣本的掃描允許以多光子顯微術的方式三維地成像樣本。在此同樣地，如上所述，在反射鏡表面中的開口限制最大掃描場的尺寸。多光子顯微術同樣已經在說明書引言中解釋過。總之，本發明可以在不同的掃描成像方法中使用，它們可以被細分為以下分組:共焦顯微術(具有Z分辨率)，具有操作激光器的寬場顯微鏡，多光子顯微術，和非共焦圖像采集(沒有Z分辨率)。上述寬場顯微術可以分別與多光子顯微術或者與非共焦圖像采集(沒有Z分辨率)組合。
[0030]尤其有利的是，如果反射鏡表面的透光區域表示原本反射的反射鏡表面中的簡單開口，則該開口相對于照明光束路徑的主軸居中地布置。“照明光束路徑的主軸”在該申請中理解為未偏轉的照明光束路徑的軸，即光軸。
[0031]為了有效地解耦在反射鏡表面的反射區域上反射的光線，所述反射鏡表面被布置為傾斜于照明光束路徑的主軸，其中傾斜角度特別地為45°。
[0032]特別有利的是，如果反射鏡表面的透光區域具有幾何形狀，該幾何形狀在垂直于照明光束路徑主軸的平面上的投影得到圓形。這通過橢圓形的幾何形狀實現。橢圓軸的尺寸被設計以使得所述投影得到圓形。
[0033]超過特定掃描角度，照明光到達反射鏡表面的反射區域并且被反射到圓錐光束路徑中。在這種情況下，適宜的是，設有附加光學器件，用于將圓錐光束路徑耦合到顯微鏡物鏡中。這個附加光學器件特別地被設計，以使得圓錐光束路徑的照明光線的焦點現在位于物鏡的出射光瞳中、特別地在其邊緣上。有利地，所述附加光學器件包括反射鏡系統和光學系統，特別地以伯特蘭透鏡的形式。在經由反射鏡系統朝顯微鏡物鏡導引圓錐光束路徑時，伯特蘭透鏡的成像被實現，以使得照明光線被聚焦在顯微鏡物鏡的出射光瞳的邊緣上。
[0034]已經證實特別有利的是，所述附加光學器件包括分束器，該分束器布置在無畸變的光束路徑中，并且在兩個光束路徑穿過顯微鏡物鏡以前，組合圓錐光束路徑和無畸變的光束路徑。
[0035]因此，合適的附加光學器件包括下面的光學組件:第一透鏡，跟隨有偏轉反射鏡，其使圓錐光束路徑在基本平行于無畸變的光束路徑的方向上偏轉。跟隨這個偏轉反射鏡的另一偏轉反射鏡，另一偏轉反射鏡使圓錐光束路徑基本以90°偏轉，以通過第二透鏡。接著圓錐光束路徑遇到布置在無畸變的光束路徑中的分束器，該分束器允許無畸變的光束路徑通過，而反射圓錐光束路徑，以使得兩個光束路徑一起被導引到顯微鏡物鏡。
[0036]在分束器的特定實施例中，使用極化分束器。在這種情況下，偏振激光可以用于照明，其中在兩個光束路徑的一個光束路徑中加入λ/2板，用于相反地偏振相關的光束路徑。利用上述的附加光學器件的構造，例如，λ/2板可以在圓錐光束路徑中布置在兩個偏轉反射鏡之間。偏振分束器根據偏振是透光或反射的。結果是以相同的波長實現光束分離，并且在所考慮的情況下，以相同的波長實現兩個光束路徑的組合。如果對于兩個照明模式要使用不同的波長，則作為分束器可以使用相應的波長敏感的分束器。
[0037]此外有利的是，一個或多個用于產生特定波長光譜的照明光線的激光器被提出作為根據本發明的顯微鏡的照明單元的光源，則波長選擇器被不知在照明光束路徑中以用于選擇合適的波長。所述波長選擇器特別地是聲光可調濾波器(AOTF)。這種AOTF允許非常快速地轉換并由此選擇特定的波長。這是因為，如果利用不同的波長實施兩種照明模式，則在這些照明模式之間的根據本發明快速轉換隨著必需波長的轉換同時發生。同時，AOTF也可以用作快速快門，即對于一種特定照明模式，可以將所需的波長注入照明光束路徑中，并且對于另一照明模式，可以沒有激光注入到照明光束路徑中。這在方法轉換期間是有意義的，例如在掃描器朝向圓錐光束路徑移動時關閉激光的情況下。此外，除了準確定位調節單元以外，精確地操作樣本也要求在移動至操作區域期間抑制激光。
[0038]用于偏轉照明光束路徑的調節單元(掃描器)特別地被實現，以使得可以實施圓形偏轉。在這種情況下，可以實現關于物鏡的主軸可旋轉地對稱的TIRF照明。然而，此外，在圖像掃描場內照明時，也可以實現斜照明(“落射照明”(ep1-1IIuminat1n))，它例如也可以沿著圓形軌跡實現，以使得出現隨時間平均化的經典的落射照明。
[0039]關于根據本發明的方法，用于選擇性地產生無畸變的光束路徑和圓錐光束路徑，特別地用于在這些光束路徑之間快速轉換，可以參照上面的描述。同樣適用于根據本發明的顯微鏡的根據本發明應用和根據本發明的方法。在這里所述的本發明的特征對于前述本發明的方面具有相同的重要性。
[0040]通過說明書和附圖給出本發明的其它優點和實施例。
[0041]可以理解，在不背離本發明的范圍的情況下，以上詳述的和下面還要解釋的特征不僅在所給出的相應組合中使用，而且也可以以其它的組合或者單獨地使用。
[0042]本發明基于示例性實施例在附圖中示意性地示出，并且在下文參考附圖詳細描述。
【附圖說明】
[0043]圖1示出根據本發明的顯微鏡的照明單元的示意構造；
[0044]圖2示出具有用于寬場顯微術的照明單元的根據本發明的顯微鏡；以及
[0045]圖3示出具有用于共焦顯微術的照明單元的根據本發明的顯微鏡。
【具體實施方式】
[0046]圖1示出用于選擇性地產生無畸變的光束路徑14和圓錐光束路徑13的照明單元的特別優選的實施例，其可以在相應的照明模式之間進行快速轉換。為此，照明單元31包括激光器10作為光源，跟隨聲光可調濾波器(AOTF)作為波長選擇器9。根據具體的應用，可以利用AOTF 9從激光器10的波長光譜中選擇期望波長。照明光線(激光)沿著照明光束路徑32傳播并且入射到調節單元7，調節單元7也稱為“掃描器”。由現有技術已知用于照明光束路徑32的高度精確的調節的X-Y掃描器。圖1示意性地示出兩個可能的照明光束路徑32，其中兩個照明光束路徑32的一個照明光束路徑沿著主軸33(光軸)傳播，而另一照明光束路徑在最大可能的圖像掃描場的邊緣處延伸。照明光線由掃描目鏡8聚焦在掃描目鏡8的成像平面11中，在那里布置反射鏡表面6，也稱為掃描反射鏡或環形反射鏡。
[0047]在這個實施例中，反射鏡表面6由環形反射鏡、即反射環形表面28組成，它包圍透光開口 27。因此，穿過該開口 27的照明光線沿著無畸變的光束路徑14傳播。它們(基本上)無阻礙地通過分束器3并且通過掃描透鏡15和顯微鏡30(在這里僅初步地示出)的物鏡I在物體平面中聚焦在物體上。可以利用照明光束路徑32的X-Y調節來掃描最大圖像掃描場以及由此物體上的相應場。因此，無畸變的光束路徑能夠實現物體的點狀掃描照明。最大圖像掃描場通過反射鏡6中的開口 27確定。
[0048]如果掃描角超過特定值，則照明光束路徑在開口27外部到達環形反射鏡6的反射區域28。激光束12在反射表面處反射以后，經由附加光學器件29沿著圓錐光束路徑的主軸13傳播。附加光學器件29包含反射鏡系統5和光學系統4a、4b，通過附加光學器件29，圓錐光束路徑再次與無畸變的光束路徑在掃描透鏡15的上游組合。光學系統4a、4b被設計以使得顯微鏡物鏡1(在該情況下為TIRF物鏡)的出射光瞳2通過放大至全反射的限制孔徑(在這里約為1.37)而成像至掃描目鏡8的成像平面11中，從而使其與最大圖像掃描場一致。這確保了，只要調節單元7的掃描角度達到照明光束路徑32遇到反射鏡表面6的反射區域28的值，就發生漸逝照明。在最大圖像掃描場內，也可以通過使用不同的物鏡I沒有限制地進行正常的圖像掃描。
[0049]附加光學器件29有利地包含在此由兩個偏轉反射鏡組成的反射鏡系統5，以及具有伯特蘭透鏡單元的功能的光學系統4a和4b，。
[0050]在反射鏡表面6中的開口27有利地是橢圓形的，以使得開口 27在垂直于主軸33的平面上的投影得到圓形的圖像掃描場。在該示例性實施例中，所有反射表面相對于各自的主軸傾斜45°，由此在反射鏡表面處發生光束路徑的基本90°反射。
[0051]在許多應用情況下，點狀掃描照明以不同于漸逝照明的波長實現。在這種情況下，在必需的波長之間的轉換通過AOTF 9以非常短的轉換時間進行。也可以設想其中兩個照明模式以相同波長實施的應用。此外可以設想實施例，其中(可能除了其它照明模式)間歇地需要僅點狀掃描照明，或者僅漸逝照明。對于這種情況，AOTF 9可以作為快門操作，其根據需要選擇或阻擋合適的波長。
[0052]分束器3可以是波長特定分束器或者偏振分束器。如果對于光束路徑13和14需要不同的波長，則波長特定分束器3是合適的。相反，如果也需要提供可能的相同波長的情況，則可以使用偏振分束器作為分束器3。為此使用偏振激光，其偏振方向例如在沿著無畸變的光束路徑14傳播時無阻礙地通過分束器3。另一方面，在圓錐光束路徑13中，優選地在反射鏡系統5的兩個偏轉反射鏡之間加入λ / 2板。這導致偏振方向的9 O °旋轉。構成偏振分束器的分束器3針對該偏振方向是反射的。這兩個光束路徑由此再次組合，如圖1所示。
[0053]圖2示出寬場顯微鏡的實施例，具有與其適配的照明單元31，其中照明單元31的通常構造與圖1的構造一致。因此不再說明相互一致的組成部分。
[0054]顯微鏡30的重要組成部分(除了照明單元31以外)在圖2中示出顯微鏡物鏡1、鏡筒透鏡19以及分束器20，分束器20將觀察光束路徑分割成視覺光束路徑21和記錄光束路徑22。視覺光束路徑21被導引到顯微鏡30的(未示出的)目鏡，而記錄光束路徑22通常導引到照相機。在這里所考慮的應用情況下，為了使照明光束路徑與觀察光束路徑分開，設有特定的焚光濾波器塊17。數字16表不顯微鏡的標準焚光入射光軸，其經由接口 18親合至顯微鏡中。在18’提供另一接口，它可以用于耦合附加的照明單元。
[0055]通過熒光入射光軸16和反射鏡24使激勵光以常見的方式通過熒光濾波器塊引導至顯微鏡物鏡I。由物體發出的熒光再次通過顯微鏡物鏡I和熒光濾波器塊17到達鏡筒透鏡19，并且從那里進入視覺光束路徑或記錄光束路徑。
[0056]圓錐的和無畸變的光束路徑通過轉換反射鏡34引導至物鏡I。反射鏡34也可以在省略任何轉換的情況下固定地實現為二向色或者偏振的分束器。兩個光束路徑的操作的方式已經被描述并且不再解釋。熒光顯微鏡可以通過這種方式與TIRF顯微鏡、操作顯微鏡和多光子顯微鏡組合或擴展至包括TIRF顯微鏡、操作顯微鏡和多光子顯微鏡。
[0057]圖3示出源自圖1中所示的共焦顯微鏡的示意構造的另一可能的布置。
[0058]焚光軸仍然以16表不，焚光濾波器塊以17表不O由物體發出的焚光仍然通過顯微鏡物鏡I和熒光濾波器塊17到達鏡筒透鏡19，并且從那里到達視覺光束路徑或記錄光束路徑(參見圖2的解釋)。將光譜分束器25和共焦檢測光束路徑26加入照明單元31以擴展成共焦掃描顯微鏡。根據已知的共焦顯微術原理，實現利用共焦成像的圖像生成。在本實施例中，調節單元7具有共焦掃描反射鏡和退掃描反射鏡的功能，它將激勵光以位置準確的方式導引到樣本，并且使檢測光經由光譜分束器25引導回至靜止定位的共焦檢測器26。
[0059]在通過圓錐光束路徑13導引激勵光的情況下，從樣本發出的、散射或者反射的光的檢測借助于傳統的成像導引到記錄光束路徑22中。
[0000]以這種形式，焚光顯微鏡可以與TIRF顯微鏡、操作顯微鏡、多光子顯微鏡和共焦掃描顯微鏡組合或擴展至包括這些顯微鏡。
[0061 ]部件列表
[0062]I 物鏡
[0063]2出射光瞳
[0064]3分束器
[0065]4a,4b光學系統(伯特蘭透鏡單元)
[0066]5反射鏡系統
[0067]6反射鏡表面
[0068]7調節單元，掃描器
[0069]8掃描目鏡
[0070]9波長選擇器，AOTF
[0071]10光源，激光
[0072]11掃描目鏡的成像平面
[0073]12激光束
[0074]13圓錐光束路徑
[0075]14無畸變的光束路徑
[0076]15掃描透鏡
[0077]16熒光入射光軸
[0078]17熒光濾波器塊
[0079]18,18’用于其它照明單元的接口
[0080]19鏡筒透鏡[0081 ] 20分束器
[0082]21視覺觀察光束路徑
[0083]22記錄光束路徑
[0084]23共焦接口
[0085]24反射鏡
[0086]25光譜分束器
[0087]26共焦檢測光束路徑
[0088]27透光區域，開口
[0089]28反射區域
[0090]29附加光學器件[0091 ]30顯微鏡
[0092]31照明單元
[0093]32照明光束路徑
[0094]33照明光束路徑的主軸
【主權項】
1.一種顯微鏡(30)，包括物鏡(I)和照明單元(31)，用于選擇性地產生通過所述物鏡(I)延伸的用于物體的點狀掃描照明的無畸變的光束路徑(14)和通過所述物鏡(I)延伸的用于物體的漸逝照明的圓錐光束路徑(13)，其中，所述照明單元包括: 光源(10)，用于產生沿著照明光束路徑(32)的照明光線； 調節單元(7)，用于偏轉所述照明光束路徑(32); 掃描目鏡(8)，放置在所述調節單元(7)的后面，用于將照明光線聚焦在所述掃描目鏡(8)的成像平面(11)中；以及 反射鏡表面(6)，布置在所述掃描目鏡(8)的成像平面(11)中，所述反射鏡表面(6)具有用于產生無畸變的光束路徑(14)的透光區域(27)并且具有用于從所述照明光束路徑(32)產生圓錐光束路徑(13)的、面向所述掃描目鏡(8)的至少部分反射區域(28)， 其中相對于所述圓錐光束路徑(13)，所述掃描目鏡(8)的成像平面(11)位于與所述物鏡(I)的出射光瞳(2)共軛的平面中。2.根據權利要求1所述的顯微鏡，其中，所述反射鏡表面(6)的透光區域(27)表示反射鏡中的開口，其中所述開口相對于所述照明光束路徑(32)的主軸(33)居中地布置。3.根據權利要求1或2所述的顯微鏡，其中，所述反射鏡表面(6)被布置為傾斜于所述照明光束路徑(32)的主軸(33)。4.根據權利要求3所述的顯微鏡，其中，所述反射鏡表面(6)被布置為以45°傾斜于所述照明光束路徑(32)的主軸(33)。5.根據前述權利要求中任一項所述的顯微鏡，其中，所述反射鏡表面(6)的透光區域(27)具有幾何形狀，該幾何形狀在垂直于所述照明光束路徑(32)主軸的平面上的投影得到圓形。6.根據權利要求5所述的顯微鏡，其中，所述反射鏡表面(6)的透光區域具有橢圓形的幾何形狀。7.根據權利要求5或6所述的顯微鏡，其中，所述透光區域(27)在所述平面上的投影在所述圓錐光束路徑(13)中的全反射的限制孔徑處與所述物鏡(I)的出射光瞳(2)的圖像一致。8.根據前述權利要求中任一項所述的顯微鏡，其中，附加光學器件(29)被設置用于將所述圓錐光束路徑(13)耦合至顯微鏡的物鏡(I)中。9.根據權利要求8所述的顯微鏡，其中，所述附加光學器件(29)包括反射鏡系統(5)和匹配的光學系統(4a，4b)，其被設計為使得所述圓錐光束路徑(13)的照明光線的焦點位于所述物鏡(I)的出射光瞳(2)中。10.根據權利要求9所述的顯微鏡，其中，所述匹配的光學系統包括兩個伯特蘭透鏡(4a,4b)ο11.根據權利要求8至10中任一項所述的顯微鏡，其中，所述附加光學器件包括分束器(3)，所述分束器(3)布置在所述無畸變的光束路徑(14)中并且將所述圓錐光束路徑(13)與所述無畸變的光束路徑(14)組合。12.根據權利要求11所述的顯微鏡，其中，所述分束器(3)是偏振分束器，其中λ/2板被布置在所述無畸變的或者在圓錐的光束路徑(13; 14)中。13.根據前述權利要求中任一項所述的顯微鏡，其中，一個或多個用于產生特定波長光譜的照明光的激光器作為光源(10)存在，其中波長選擇器(9)被布置在所述照明光束路徑(32)中。14.根據權利要求13所述的顯微鏡，其中，所述波長選擇器(9)是聲光可調濾波器(AOTF) ο15.—種方法，用于選擇性地產生通過顯微鏡(30)的物鏡(I)延伸的用于物體的點狀掃描照明的無畸變的光束路徑(14)和通過所述物鏡(I)延伸的用于物體的漸逝照明的圓錐光束路徑(13)，其中， 通過光源(10)產生沿著照明光束路徑的照明光線； 通過調節單元(7)偏轉照明光束路徑(32); 利用放置在所述調節單元(7)后面的掃描目鏡(8)將所述照明光線聚焦在掃描目鏡(8)的成像平面(11)中；以及 具有透光區域(27)并且具有面向所述掃描目鏡(8)的至少部分反射區域(28)的反射鏡表面(6)布置在所述掃描目鏡(8)的成像平面(11)中， 所述掃描目鏡(8)的成像平面(11)相對于所述圓錐光束路徑(13)位于與所述物鏡(I)的出射光瞳(2)共軛的平面中，以及 所述無畸變的光束路徑(14)通過以下方式產生:利用所述調節單元(7)偏轉照明光束路徑，以使得照明光束路徑穿過所述反射鏡表面(6)的透光區域(27)，并且所述圓錐光束路徑(13)通過以下方式產生:利用所述調節單元(7)偏轉照明光束路徑(32)以使得照明光束路徑到達所述反射鏡表面(6)的反射區域(28)。16.根據權利要求1至14中任一項所述的顯微鏡或者根據權利要求15所述的方法用于在所述顯微鏡(30)中在物體的點狀掃描照明與漸逝照明之間快速轉換的應用。17.根據權利要求16所述的應用，其用于掃描成像方法。18.根據權利要求17所述的應用，其中所述掃描成像方法是以下方法中的至少一種方法:全內熒光顯微術(TIRFM)、掃描顯微術、共焦掃描顯微術、FRAP(光漂白之后的熒光恢復)、FRET(熒光共振能量轉移)和多光子顯微術。
【文檔編號】G02B21/00GK105849615SQ201480060715
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2014年10月30日
【發明人】P·豪特恩爾, C·舒曼
【申請人】徠卡顯微系統復合顯微鏡有限公司