光鏡電鏡關聯成像用光學真空冷臺的制作方法
【專利摘要】本實用新型涉及一種光鏡電鏡關聯成像用光學真空冷臺，它包括：一真空腔室，一設置在真空腔室的一端的防污染系統適配接口，一設置在真空腔室的另一端的電鏡樣品桿適配接口，一設置在真空腔室的上壁面的上光學窗口，一設置在真空腔室的下壁面并與上光學窗口相對的下光學窗口，一設置在真空腔室的一側的真空系統適配接口，以及一設置在電鏡樣品桿適配接口與上、下光學窗口之間的真空閥；其中，真空閥與電鏡樣品桿適配接口之間構成了一預真空通道，在預真空通道的一側設置有一預抽真空閥門；在電鏡樣品桿適配接口、上光學窗口、下光學窗口、真空系統適配接口和防污染系統適配接口處均設有真空密封圈。本實用新型可廣泛應用于光電關聯成像領域，也可單獨應用于光學顯微成像。
【專利說明】光鏡電鏡關聯成像用光學真空冷臺
【技術領域】
[0001]本實用新型屬于光學成像【技術領域】，特別是關于一種光鏡電鏡關聯成像用光學真空冷臺。
【背景技術】
[0002]低溫電子顯微鏡三維重構技術與X射線晶體學、核磁共振譜學等已成為高分辨結構生物學研究最重要的實驗手段，越來越多的生物大分子結構被陸續解析出來。然而，人們最終目的是原位解析生物大分子及分子機器的結構，從而在分子、細胞器、細胞等不同層次上闡述生命活動的本質。
[0003]近幾年,通過綜合突光蛋白標記技術、突光顯微鏡技術、免疫電鏡技術和低溫電鏡電子斷層掃描技術，人們可以直接觀察目標分子在細胞內的定位和運動，并解析出目標分子所在位置的細胞超微結構。隨著細胞生物學的深入發展，利用熒光顯微鏡和電子顯微鏡對同一細胞內同一位置的分子機器同時進行高精度定位和高分辨率超微結構的研究成為非常有力的研究手段，這項技術稱為光電聯合顯微成像技術(Correlative Light andElectron Microscopy CLEM)。通過突光顯微技術對目標進行標記定位,通過電鏡三維重構技術獲取細胞指定部位的三維結構，將定位信息和結構信息進行整合和處理，從而獲得大量關于分子機器在細胞原位的三維結構信息，并由此統計歸納出目標分子機器原位動態變化規律。
[0004]目前，光電關聯成像技術的硬件實現主要有兩種方式:一種是光鏡電鏡一體化集成系統，即在電鏡內部集成光學成像模塊，其優勢在于可實現生物樣品的原位光鏡、電鏡分別成像甚至同時成像，光學成像與電鏡成像圖像匹配方便，避免了光鏡、電鏡間的樣品轉移的繁瑣步驟及可能造成的樣品污染。然而由于透射電鏡物鏡極靴間的空間有限，對放入其中的光學成像系統產生諸多限制，物鏡工作距離較大，難于獲得高分辨率熒光圖像。另外一種較靈活的關聯方式是光鏡電鏡分體成像，在獨立的光學成像系統上搭載冷臺，完成低溫熒光成像，再將樣品從冷臺轉移到低溫電鏡中成像。這種關聯方式的優勢在于光鏡與電鏡在硬件上互不限制，光學成像模式多樣，有利于實現更高分辨率的熒光定位。然而，現有的低溫冷臺設計方案多是采用液氮(或低溫氮氣)流動制冷，液氮震動造成的樣品焦面漂移以及超低溫對物鏡的損壞都是影響該技術推廣普及的難題。同時，低溫樣品在光鏡成像和到低溫電鏡的傳輸過程中面臨的易損壞、易污染也是一項重大挑戰。
【發明內容】
[0005]針對上述問題，本實用新型的目的是提供一種基于現有低溫透射電鏡和熒光顯微鏡成像系統，用于實現光電關聯成像技術的高真空熒光顯微鏡低溫樣品觀察冷臺。
[0006]為實現上述目的，本實用新型采用以下技術方案:一種光鏡電鏡關聯成像用光學真空冷臺，其特征在于，它包括:一真空腔室，一設置在所述真空腔室的一端的防污染系統適配接口，一設置在所述真空腔室的另一端的電鏡樣品桿適配接口，一設置在所述真空腔室的上壁面的上光學窗口，一設置在所述真空腔室的下壁面并與所述上光學窗口相對的下光學窗口，一設置在所述真空腔室的一側的真空系統適配接口，以及一設置在所述電鏡樣品桿適配接口與所述上、下光學窗口之間的真空閥；其中，所述真空閥與所述電鏡樣品桿適配接口之間構成了一預真空通道，在所述預真空通道的一側設置有一預抽真空閥門；在所述電鏡樣品桿適配接口、上光學窗口、下光學窗口、真空系統適配接口和防污染系統適配接口處均設有真空密封圈。
[0007]還包括一防污染系統，所述防污染系統包括:一通過所述防污染系統適配接口部分伸入所述真空腔室I的導熱桿，一連接在所述導熱桿位于所述真空腔室內的一端的金屬冷盒，一連接在所述導熱桿位于所述真空腔室外的一端的導熱芯，以及一杜瓦罐；其中，所述金屬冷盒與所述上、下光學窗口位置相對，所述金屬冷盒的上、下表面相對設置有一對通光孔；所述杜瓦罐內部形成充裝有液氮的液氮腔室，所述導熱芯設置于所述液氮腔室內。
[0008]所述導熱桿、金屬冷盒和導熱芯由紫銅或銀制成。
[0009]本實用新型由于采取以上技術方案，其具有以下優點:1、本實用新型提供了一種能夠與低溫透射電鏡樣品桿相適配的光學真空冷臺，其為樣品創造了一個真空環境，使得低溫樣品在光學真空冷臺中完成光學成像后可快速轉移至透射電鏡中成像，由于本實用新型以真空環境來代替現有技術中冷臺的液氮(或低溫氮氣)制冷，因此本實用新型冷臺能夠有效地避免液氮(或氮氣)震動造成的樣品焦面漂移以及超低溫對物鏡的損壞，并且本實用新型在轉移過程中無需直接觸碰樣品，可有效避免夾取樣品過程中載網形變、污染物污染以及樣品位置的移動。2、本實用新型還提供了一套防污染系統，該系統可以在低溫樣品四周維持一個低溫環境，用以吸附凝結光學成像過程中真空腔室內的污染物，從而可以有效解決長時間光學成像過程中低溫樣品的污染問題。3、本實用新型可以通過載物臺適配架方便地安裝在不同類型的光學顯微鏡(不僅是普通正置或倒置熒光顯微鏡，也可用于光激活定位超分辨熒光顯微鏡等)上，且可根據實際實驗需求實現光學物鏡外置工作模式，物鏡半嵌入式工作模式或者物鏡全嵌入式工作模式，以適應不同工作距離的光學物鏡成像。4、本實用新型涉及的電鏡樣品桿適配接口可經過適當尺寸和形狀的調整應用于不同型號的透射電子顯微鏡樣品桿甚至拓展到掃描電子顯微鏡等。本實用新型可廣泛應用于光電關聯成像領域，也可單獨應用于光學顯微成像，可以配合不同類型的樣品桿實現低溫、高溫、氣氛、液相等不同條件下成像。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0010]圖1是本實用新型整體結構示意圖；
[0011]圖2是本實用新型在物鏡內置工作模式下的兩種結構示意圖；
[0012]其中，圖2(a)表示本實用新型與物鏡的半封閉式連接關系；圖2(b)表示本實用新型與物鏡的全封閉式連接關系。
【具體實施方式】
[0013]下面結合附圖和實施例對本實用新型進行詳細的描述。
[0014]實施例一:
[0015]如圖1所示，本實施例包括一真空腔室1，真空腔室I的一端設置有一防污染系統適配接口 2，另一端設置有一電鏡樣品桿適配接口 3。在真空腔室I上、下兩壁面相對設置有一上光學窗口 4和一下光學窗口 5,上、下光學窗口 4、5可以通過螺栓固定連接的方式與真空腔室I連接以方便拆卸。在真空腔室I的一側設置有一真空系統適配接口 6，其用于連接為真空腔室I抽取真空的真空泵組。在位于電鏡樣品桿適配接口 3與上、下光學窗口 4、5之間的真空腔室I內設置有一真空閥7，真空閥7與電鏡樣品桿適配接口 3之間構成了一預真空通道，在預真空通道的一側設置有一預抽真空閥門8，其用于連接低級真空泵組。
[0016]在本實施例中，電鏡樣品桿適配接口 3、上光學窗口 4、下光學窗口 5、真空系統適配接口6和防污染系統適配接口2處均設有真空密封圈(設置方式為本領域常規手段)以保證整個系統在工作過程中維持恒定的真空度。
[0017]本實施例中所述的光學真空冷臺在使用時，可按照如下步驟進行:
[0018]I)將本實施例光學真空冷臺通過適配架安裝在倒置突光顯微鏡(如:01ympus1X73等)的載物臺上，選用長工作距離光學物鏡(如:LUCPLFLN 40X)用于熒光成像；同時使用真空盲板將防污染系統適配接口 2直接密封，將真空系統適配接口 6連接真空泵組。
[0019]2)安裝完畢后，首先將真空腔室I的真空閥7關閉，然后啟動真空泵組為真空腔室I抽真空，直到真空腔室I內真空抽到規定值(通常優于5*10_3Pa)。
[0020]3)將固定有低溫冷凍樣品的電鏡低溫樣品桿插入電鏡樣品桿適配接口 3，打開預抽真空閥門8及與其連接的低級真空泵組對預真空通道預抽真空，待預真空通道內真空度優于設定值(通常優于IPa)，關閉預抽真空閥門8，并打開真空閥7，將電鏡低溫樣品桿完全推入真空腔室I內，確保樣品位于上、下光學窗口 4、5之間，并等待真空腔室I內真空恢復到規定值。
[0021]4)真空腔室I內真空恢復后，打開電鏡低溫樣品桿上的金屬擋片，即可進行熒光顯微鏡觀察、成像。
[0022]5)光學成像完成后，關閉電鏡低溫樣品桿上的金屬擋片，拉出電鏡低溫樣品桿至最前端出了真空閥7，關閉真空閥7，繼續拉電鏡低溫樣品桿直至完全從電鏡樣品桿適配接口 3內完全拔出，并轉移到透射電鏡中，根據熒光顯微鏡得到的熒光圖像，選擇感興趣的目標區域進行電鏡成像，從而獲得光鏡電鏡關聯成像數據。
[0023]實施例二:
[0024]如圖1所不,在實施例一的基礎上,本實施例還包括一防污染系統，防污染系統包括一通過防污染系統適配接口 2部分伸入真空腔室I的導熱桿9，導熱桿9位于真空腔室I內的一端連接一金屬冷盒10,金屬冷盒10與上、下光學窗口 4、5位置相對,在金屬冷盒10的上、下表面相對設置有一對通光孔(圖中未示出)。導熱桿9位于真空腔室I外的一端連接一導熱芯11。防污染系統還包括一杜瓦罐12，杜瓦罐12內部形成液氮腔室，液氮腔室內充滿液氮且由液氮腔室封蓋13蓋住罐口，導熱芯11設置于液氮腔室13內。
[0025]本實施例中的導熱桿9、金屬冷盒10和導熱芯11均可以由紫銅、銀等高熱導率的材質制成。
[0026]本實施例所述的光學真空冷臺在使用過程中與實施例一有所不同的是:
[0027]在步驟I)中，由于安裝了防污染系統，光學真空冷臺的防污染系統適配接口 2不采取直接密封；在步驟3)中將電鏡低溫樣品桿完全推入真空腔室I后，應確保樣品位于金屬冷盒10內。這樣在光鏡觀察過程中，金屬冷盒10會罩在樣品周圍，吸附真空腔室I內的污染物，避免樣品在成像過程中受到污染。
[0028]本實用新型光學顯微鏡真空冷臺可允許實現的工作模式包括兩種:
[0029]一、當樣品到下光學窗口 5的下表面的距離可以滿足光學物鏡的工作距離時，物鏡為外置式(如圖1所示)。
[0030]二、當樣品到下光學窗口 5的外表面的距離不能滿足光學物鏡的工作距離時，則需將下光學窗口 5拆除，同時將光學物鏡14通過軟波紋管15、真空密封圈16、密封固定夾17安裝在原下光學窗口 5所在的位置，使物鏡的上端位于真空腔室I內。光學物鏡14 (物鏡在這種使用方式下，應保證良好的真空密封性。)的下端可以以原有方式處在大氣環境中(如圖2 (a)所示)，也可以安裝一透光片18使整個物鏡完全封閉在真空環境內(如圖2 (b)所示)，前者稱之為半封閉式，后者稱之為全封閉式。這樣，能夠保證樣品與光學物鏡14之間的距離滿足成像條件。此外，光學物鏡14與冷臺之間為波紋管軟連接，不影響成像過程中物鏡與樣品之間的相對移動。
[0031]本實用新型僅以上述實施例進行說明，各部件的結構、設置位置及其連接都是可以有所變化的，在本實用新型技術方案的基礎上，凡根據本實用新型原理對個別部件進行的改進和等同變換，均不應排除在本實用新型的保護范圍之外。
【權利要求】
1.一種光鏡電鏡關聯成像用光學真空冷臺，其特征在于，它包括: 一真空腔室， 一設置在所述真空腔室的一端的防污染系統適配接口， 一設置在所述真空腔室的另一端的電鏡樣品桿適配接口， 一設置在所述真空腔室的上壁面的上光學窗口， 一設置在所述真空腔室的下壁面并與所述上光學窗口相對的下光學窗口， 一設置在所述真空腔室的一側的真空系統適配接口，以及 一設置在所述電鏡樣品桿適配接口與所述上、下光學窗口之間的真空閥； 其中，所述真空閥與所述電鏡樣品桿適配接口之間構成了一預真空通道，在所述預真空通道的一側設置有一預抽真空閥門；在所述電鏡樣品桿適配接口、上光學窗口、下光學窗口、真空系統適配接口和防污染系統適配接口處均設有真空密封圈。
2.如權利要求1所述的光鏡電鏡關聯成像用光學真空冷臺，其特征在于，還包括一防污染系統，所述防污染系統包括: 一通過所述防污染系統適配接口部分伸入所述真空腔室I的導熱桿， 一連接在所述導熱桿位于所述真空腔室內的一端的金屬冷盒， 一連接在所述導熱桿位于所述真空腔室外的一端的導熱芯，以及 一杜瓦罐； 其中，所述金屬冷盒與所述上、下光學窗口位置相對，所述金屬冷盒的上、下表面相對設置有一對通光孔；所述杜瓦罐內部形成充裝有液氮的液氮腔室，所述導熱芯設置于所述液氮腔室內。
3.如權利要求2所述的光鏡電鏡關聯成像用光學真空冷臺，其特征在于，所述導熱桿、金屬冷盒和導熱芯由紫銅或銀制成。
【文檔編號】G02B21/00GK204008431SQ201420419041
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年7月28日 優先權日:2014年7月28日
【發明者】季剛, 李碩果, 孫飛 申請人:中國科學院生物物理研究所