專利名稱：全內反射照明與半全內反射照明雙光路熒光顯微系統的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種全內反射照明與半全內反射照明雙光路熒光顯微系統，屬于熒光顯微成像領域。
背景技術：
生命科學從宏觀逐漸走向微觀，在亞細胞水平實現生理條件下蛋白質、核酸等生物分子成像表征，對揭示生命的奧秘、提高疾病的預防、診斷、治療水平具有重要意義。熒光成像是最常用的成像表征技術，在細胞成像中，由于熒光標記往往不僅限于焦平面內，在使用普通寬場熒光顯微鏡成像時，焦平面以外的發光體往往會帶來較強的背景熒光干擾，限制了它在亞細胞熒光追蹤研究中的應用。2000年以來，研究人員開始在活細胞熒光成像領域使用全內反射熒光顯微鏡(Y.Sako, S.Minoghchi, T.Yanagida (2000)Nature Cell Biology2:168-172.)，全內反射顯微鏡以其對細胞膜區域成像的優勢在單分子熒光成像領域取得了巨大的進展。全內反射突光顯微成像也是一種寬場成像技術，它是在傳統寬場突光顯微鏡的基礎上，改變激發光的光路，通過調制激發光的入射角度，使激發光在折射率不同的兩種介質的交界面發生全內反射現象。光線在界面處發生全內反射時，仍會向較低折射率的介質中投射一段很短的距離，一般在百納米左右，被稱為隱矢波或隱矢場。隱矢波的電磁場沿界面法線方向迅速衰減。這樣一來焦平面以外的熒光分子不會被激發，背景熒光大大降低。在細胞成像中，這一深度剛好能照亮細胞膜區域，因此，全內反射熒光顯微成像在細胞膜區成像非常有潛力。但是，全內反射熒光顯微成像并不能直接應用到細胞內。由于細胞生命過程往往是連續的，在細胞膜上發生的生命活動往往也會延續到細胞內，例如細胞信號轉導過程。如果能夠將全內反射熒光顯微鏡拓展到細胞內，將是另一個突破。半全內反射突光顯微成像就是一種介于普通寬場突光顯微鏡和全內反射突光顯微鏡之間的成像方法。當激光入射角稍小于臨界角時，折射光會以接近平行的角度穿過細胞。折射光能夠照亮一部分細胞內的區域，同時也會照亮細胞膜，也能獲得背景干擾相對較低的突光圖像(B.X.Cui, et al., Proceedings of the National Academy of Sciences ofthe United States of Americal04:13666-13671 (2007).)。由于細胞膜區的熒光也會干擾到細胞內區域的成像，信號背景比的提升不夠明顯，半全內反射熒光顯微鏡的應用受到了一定的限制。此前，已有人應用寬場落射式熒光成像與全內反射熒光成像先后成像來對細胞內微管進行成像(J.Schmoranzer, S.M.Simon, Molecular Biology of theCelll4:1558-1569 (2003).)。在全內反射熒光顯微鏡的光路上做一些調整，增加一條光路，就能夠同時實現全內反射熒光顯微成像和半 全內反射熒光成像。既可以同時實現細胞內和細胞膜區交替成像，也可以通過細胞膜區漂白的方式來進一步提高細胞內熒光成像信號背景比。這一技術整合，將進一步拓展半全內反射熒光成像在細胞內成像中的應用。
發明內容
本發明的目的是提供一種全內反射照明與半全內反射照明雙光路熒光顯微系統，本發明通過在全內反射熒光顯微照明系統中加入了第二路激發光，通過獨立調節兩路激發光的入射角度同時實現全內反射熒光成像和半全內反射熒光成像。本發明所提供的全內反射照明與半全內反射照明雙光路熒光顯微系統，在激發光的光路上設置與光路呈135°的分光片I，使激發光成為2束垂直的透射光和反射光；所述透射光經反射鏡反射后與所述反射光平行；所述反射光和所述透射光的光路上分別依次設有漸變密度中性濾光片、凸透鏡1、凸透鏡II和光斑孔徑調節器；所述反射光和所述透射光分別經過所述漸變密度中性濾光片、所述凸透鏡1、所述凸透鏡II和所述光斑孔徑調節器后再分別通過反射鏡調整傳輸方向成為2束垂直光路；相互垂直的所述反射光和所述透射光的光路上均設有凸透鏡III ；所述反射光和所述透射光經過所述凸透鏡III后均入射至與所述反射光的光路呈135°的分光片II，經所述分光片II分成的2束平行光入射至顯微鏡激發光入口。上述的雙光路熒光顯微系統，所述漸變密度中性濾光片與所述凸透鏡I之前設有光閥門。上述的雙光路熒光顯微系統，所述光閥門可為機械閥門，具體可由電腦進行控制。
上述的雙光路熒光顯微系統，所述反射光和所述透射光均通過2個所述反射鏡進行調整傳輸方向成為垂直光路。上述的雙光路突光顯微系統,所述分光片I和所述分光片II均為50/50鏡形分光片。上述的雙光路熒光顯微系統，所述漸變密度中性濾光片為圓形漸變密度中性密度濾光片。本發明提供的全內反射照明與半全內反射照明雙光路熒光顯微系統中，兩路激光可以是同波長激發光，用于激發位于不同深度的同一熒光分子，也可以選用不同波長的激發光，用于激發位于不同深度的不同熒光分子。本發明提供的全內反射照明光路可以用于漂白細胞膜區熒光分子，從而避免細胞膜區熒光分子給細胞內焦平面成像時帶來的背景熒光干擾，進一步提高細胞內半全內反射熒光成像的信號背景比。
圖1為本發明的雙光路突光顯微系統的結構不意圖。圖2為本發明雙光路熒光顯微系統對綠色熒光蛋白標記的細胞內囊泡的半全內反射熒光顯微圖和全內反射熒光顯微圖，其中標尺為10微米。圖3為綠色熒光蛋白標記的細胞內囊泡的半全內反射熒光顯微圖，其中左圖為未采用全內反射照明漂白，右圖為采用了全內反射照明漂白細胞膜區域；其中標尺為10微米。圖1中各標記如下:1激發光、2，1150/50鏡形分光片、3，9反光鏡、4圓形漸變密度中性濾光片、5機械閥門、6凸透鏡1、7凸透鏡I1、8光斑孔徑調節器、10凸透鏡111、12顯微鏡激發光入口。
具體實施例方式下面結合附圖對本發明做進一步說明，但本發明并不局限于以下實施例。圖1為本發明提供的全內反射照明與半全內反射照明雙光路熒光顯微系統的結構示意圖，一束激發光I經過50/50鏡形分光片2分成兩束激光:一束反射光和一束透射光。其中透射光經反射鏡3反射后與反射光平行。反射光和透射光的強度可以由圓形漸變密度中性濾光片4調節。在反射光和透射光兩條光路上分別設有兩個由電腦控制的機械閥門5，能夠由相機給出的信號控制獨立開關。通過機械閥門5后的激發光分別被凸透鏡I 6聚焦，再由凸透鏡II 7轉化為平行光，激發光經過這兩組透鏡之后實現了激光擴束的效果。然后，使用光斑孔徑調節器8可以調節擴束之后激光光斑大小。兩路激光分別經由反射鏡9調整入射方向，在此處光路放置一個凸透鏡III 10，并通過改變凸透鏡III 10的水平位置來調節激發光射入物鏡的位置并最終實現調節激發光從物鏡出來后的射入樣品的角度。兩路激發光再次經由50/50鏡形分光片11合并平行射入顯微鏡激發光入口 12，實現了兩路激光的獨立照明。熒光信號經顯微物鏡收集后由側口雙色雙通道分光進入EMC⑶感光芯片。感光芯片分為兩半，分別接收單色的熒光信號。反射鏡9能夠隨時調整入射光的入射位置和入射角度，便于激光校準。而光斑孔徑調節器8可以根據需要選擇合適的照明區域大小，兩路光可以分別由機械閥門5控制開閉，操作中可以選擇所需的光路。本發明提供的雙光路熒光顯微系統中，其中分光片還可選擇為其它比例的鏡形分光片，通常用于漂白細胞膜的全內反射光路光強度要高一些，而細胞內成像用的半全內反射光路光強度可以稍低一些。使用上述雙光路熒光顯微系統對綠色熒光蛋白標記的細胞內囊泡進行了全內反射熒光成像和半全內反射熒光成像，結果如圖2所示，其中圖2中左圖為半全內反射熒光顯微圖，圖2中右圖為全內反射熒光顯微圖。
在此基礎上，又對比了采用全內反射照明的方法漂白細胞膜前后，細胞內半全內反射熒光成像如圖3所示，可以通過對比全內反射照明漂白前的圖像(左)和全內反射照明漂白后的圖像(右)，其中漂白細胞膜后的細胞內熒光成像比直接使用半全內反射熒光顯微鏡信號背景比提高了 40%。另外，如果將本發明光路圖中的50/50鏡形分光片2和11同時替換為二向色性片該處二向色性片能反射小于500納米的激發光，但是能透射高于500納米的激發光，激發光為488納米和561納米混合輸出時，反射光將只含有波長為488而透射光只含有波長為561的光。就可以實現兩條光路分別使用不同波長的激發光，從而實現細胞膜以內一定范圍內不同深度的雙色熒光成像。
權利要求
1.全內反射照明與半全內反射照明雙光路熒光顯微系統，其特征在于:在激發光的光路上設置與光路呈135°的分光片I，使激發光成為2束垂直的透射光和反射光；所述透射光經反射鏡反射后與所述反射光平行；所述反射光和所述透射光的光路上分別依次設有漸變密度中性濾光片、凸透鏡1、凸透鏡II和光斑孔徑調節器； 所述反射光和所述透射光分別經過所述漸變密度中性濾光片、所述凸透鏡1、所述凸透鏡II和所述光斑孔徑調節器后再分別通過反射鏡調整傳輸方向成為2束垂直光路； 相互垂直的所述反射光和所述透射光的光路上均設有凸透鏡III; 所述反射光和所述透射光經過所述凸透鏡III后均入射至與所述反射光的光路呈135°的分光片II，經所述分光片II分成的2束平行光入射至顯微鏡激發光入口。
2.根據權利要求1所述的雙光路熒光顯微系統，其特征在于:所述漸變密度中性濾光片與所述凸透鏡I之前設有光閥門。
3.根據權利要求2所述的雙光路熒光顯微系統，其特征在于:所述光閥門為機械閥門。
4.根據權利要求1-3中任一項所述的雙光路突光顯微系統,其特征在于:所述反射光和所述透射光均通過2個所述反射鏡進行調整傳輸方向成為垂直光路。
5.根據權利要求1-4中任一項所述的雙光路突光顯微系統,其特征在于:所述分光片I和所述分光片II均為50/50鏡形分光片。
6.根據權利要求1-5中任一項所述的雙光路突光顯微系統,其特征在于:所述漸變密度中性濾光片為圓形 漸變密度中性密度濾光片。
全文摘要
本發明公開了全內反射照明與半全內反射照明雙光路熒光顯微系統。在激發光的光路上設置與光路呈135°的分光片Ⅰ，使激發光成為2束垂直的透射光和反射光；透射光經反射鏡反射后與反射光平行；反射光和透射光的光路上分別依次設有漸變密度中性濾光片、凸透鏡Ⅰ、凸透鏡Ⅱ和光斑孔徑調節器；反射光和透射光再分別通過反射鏡調整傳輸方向成為2束垂直光路；相互垂直的反射光和透射光的光路上均設有凸透鏡Ⅲ；反射光和透射光經過凸透鏡Ⅲ后均入射至與反射光的光路呈135°的分光片Ⅱ，經分光片Ⅱ分成的2束平行光入射至顯微鏡激發光入口。本發明可以用于漂白細胞膜區熒光分子，避免細胞膜區熒光分子給細胞內焦平面成像時帶來的背景熒光干擾，進一步提高細胞內半全內反射熒光成像的信號背景比。
文檔編號G02B21/18GK103235406SQ20131015298
公開日2013年8月7日 申請日期2013年4月27日 優先權日2013年4月27日
發明者方曉紅, 羅望熙, 夏鐵 申請人:中國科學院化學研究所