用于對樣本中的點狀目標(biāo)進(jìn)行三維定位的顯微裝置和方法

專利名稱：用于對樣本中的點狀目標(biāo)進(jìn)行三維定位的顯微裝置和方法
用于對樣本中的點狀目標(biāo)進(jìn)行三維定位的顯微裝置和方法
背景技術(shù)：
最近幾年，基于對特別是熒光分子的獨立標(biāo)記進(jìn)行連續(xù)、隨機的定位，光顯微方法得到了發(fā)展，其能夠顯示尺寸小于傳統(tǒng)光顯微鏡的衍射限制的分辨率極限的樣本結(jié)構(gòu)。這種方法描述在下述文獻(xiàn)中，例如W02006/127692A2;DE102006021317B3;W02007/128434A1, US2009/0134342A1;DE102008024568A1;W02008/091296A2;"Sub-diffraction-limit imaging bystochastic optical reconstruction microscopy(STORM)〃，NatureMethods3, 793-796(2006), M.J.Rust, M.Bates, X.Zhuang;"Resolution of Lambda/1Oinfluorescence microscopy using fast single molecule photo-switching", GeislerC.等，Appl.Phys.A，88，223-226 (2007)。顯微術(shù)的這一新分支也被稱為“定位顯微術(shù)”。從現(xiàn)有文獻(xiàn)中可獲知應(yīng)用的方法，例如，被命名為(F)PALM ((熒光)光敏定位顯微術(shù))、PALMIRA(獨立運行獲取的PALM)、GSD(IM)(基態(tài)消耗(單分子返回)顯微術(shù))、或(F)STORM ((熒光)隨機光學(xué)重建顯微術(shù))。通常，這種新的方法中，其共同之處在于待成像的樣本結(jié)構(gòu)制備有點狀目標(biāo)，被稱為標(biāo)記，其具有兩個可區(qū)分的狀態(tài)，即“明亮”狀態(tài)和“黑暗”狀態(tài)。例如，如果使用熒光染料作為標(biāo)記，明亮狀態(tài)就是可發(fā)出熒光的狀態(tài)而黑暗狀態(tài)是不能發(fā)出熒光的狀態(tài)。在優(yōu)選實施例中，例如在冊2008/09129642和冊2006/127692么2中，使用可光致轉(zhuǎn)換或光敏的熒光分子。可選地，例如在DE102006 021317B3中，使用標(biāo)準(zhǔn)熒光分子的固有黑暗狀態(tài)。為了以高于成像光學(xué)系統(tǒng)的經(jīng)典分辨率極限的分辨率對樣本結(jié)構(gòu)進(jìn)行成像，需要將標(biāo)記的一個小的子集反復(fù)地轉(zhuǎn)換至明亮狀態(tài)。組成這個激活子集的標(biāo)記的密度被選擇為在明亮狀態(tài)中、也是在可被光顯微術(shù)成像的狀態(tài)中相鄰標(biāo)記間的平均間距大于成像光學(xué)系統(tǒng)的分辨率極限。組成該激活子集的標(biāo)記被成像在空間分解光探測器上，例如CCD攝像機上，從而每一點狀標(biāo)記的光分布被以光斑的形式感測，其中光斑的尺寸由光學(xué)系統(tǒng)的分辨率極限決定。采用這一方式感測多個獨立的原始數(shù)據(jù)圖像，在每一原始數(shù)據(jù)圖像中，對不同的激活子集進(jìn)行成像。在圖像分析過程中，在每一獨立原始數(shù)據(jù)圖像中確定光分布的中心點位置，其表示明亮狀態(tài)中的點狀標(biāo)記。從獨立原始數(shù)據(jù)圖像中確定的光分布的中心點被合并成所有圖像數(shù)據(jù)組形式的整體繪圖。由該整體繪圖生成的高分辨率全圖像反映了標(biāo)記的分布。對于待成像的樣本結(jié)構(gòu)的典型再現(xiàn)，需要探測足夠大量的標(biāo)記信號。但是，由于明亮狀態(tài)中兩個標(biāo)記之間存在著最小平均間距，因而在每一激活子集中標(biāo)記的數(shù)量是受限制的，因而為了對樣本結(jié)構(gòu)進(jìn)行完全地成像必須感測非常多的獨立原始數(shù)據(jù)圖像。獨立原始數(shù)據(jù)圖像的數(shù)量典型地在10，000至100，000之間。除了對物平面(下文中也稱為X-Y平面)中標(biāo)記的橫向位置進(jìn)行上述的確定，同樣也確定軸向(下文中也稱為Z方向)上的位置。軸向表示成像系統(tǒng)的光軸的方向，即光的主傳播方向。
根據(jù)被稱為“顆粒追蹤”的實驗可獲知三維定位，例如在Kajo等，1994，Biophysical Journal, 67, Holtzer et al., 2007, Applied Physics Letters, 90,以及Toprak等，2007，Nano Letters, 7 (7)中所描述的。其已應(yīng)用在基于上述獨立分子的轉(zhuǎn)換和定位的成像方法中ο參見Huang等,2008, Science, 319,以及Juette等,2008, NatureMethods ο 相關(guān)的現(xiàn)有技術(shù)還參見 Bossi 等，2008，Nano Letters, 8 (8)，2463-2468 以及Pavani 等，2009, PNAS, 106。原則上，通過評價在攝像機的探測表面上感測的光斑的變化來完成點狀目標(biāo)在Z方向上的定位，當(dāng)點狀目標(biāo)從清晰度平面(sharpness plane)或與探測表面光學(xué)共軛的焦平面中移開時，這種變化是可見的。下文中，點狀目標(biāo)被理解為尺寸小于成像系統(tǒng)的、特別是探測目鏡的衍射限制的分辨率極限的目標(biāo)。這種情況下，探測目鏡以三維聚焦光分布的形式將這種目標(biāo)成像在成像空間中。聚焦光分布在攝像機的探測表面上生成光斑，在文獻(xiàn)中也被稱為“點擴散函數(shù)”，縮寫為PSF。如果點狀目標(biāo)隨后在Z方向上、即垂直于清晰度平面的方向上被移動通過焦點，PSF的尺寸和形狀會發(fā)生改變。通過在PSF的尺寸和形狀方面分析相應(yīng)于感測的光斑的探測信號，可推斷出目標(biāo)的實際Z位置。然而在三維定位中，根本問題在于由點狀目標(biāo)得到的PSF是關(guān)于探測平面對稱的。這意味著，雖然當(dāng)點狀目標(biāo)從清晰度平面中移開時PSF發(fā)生了改變并因而可以確定出目標(biāo)距清晰度平面的距離，但在清晰度平面兩側(cè)的PSF的改變是對稱的，因此難以確定點狀目標(biāo)究竟位于清晰度平面的哪一側(cè)。當(dāng)需要執(zhí)行所謂多色彩測量時，點狀目標(biāo)的三維定位會變得更加困難，其中采用不同的染料來標(biāo)記樣本，且用于感測這些不同染料的探測信號必須被分開。多色彩測量是有益的，特別是在結(jié)構(gòu)的共定位中，例如細(xì)胞中的蛋白質(zhì)。如果能夠分開不同染料的探測信號，可得到染料的各個分布，因而得到了不同結(jié)構(gòu)的分布。當(dāng)進(jìn)行多色彩測量時，高分辨率定位顯微術(shù)中的根本問題是使用任何探測目鏡都不同程度存在著的所謂縱向色差(也被稱為軸向色差)。縱向色差可被理解為由于波長的作用、導(dǎo)致了發(fā)射不同顏色的光的目標(biāo)成像在不同的成像平面上的像差。這在圖1中示出，其中假設(shè)點狀目標(biāo)10發(fā)射出兩個波長的光(在圖1中分別由實線和虛線示出，被標(biāo)記為12和14)。在由目鏡16和鏡筒透鏡18構(gòu)成的探測光學(xué)系統(tǒng)中產(chǎn)生的縱向色差導(dǎo)致了對于不同波長探測光學(xué)系統(tǒng)生成的聚焦光分布在Z方向上彼此偏離。附圖1中，相互偏離的聚焦光分布的中心點被標(biāo)記為20和22?？v向色差產(chǎn)生的原因是透鏡材料中存在著色散，即對不同波長的光，其具有不同的折射系數(shù)。通過巧妙地設(shè)計透鏡可一定程度地減小縱向色差。例如，典型的高性能目鏡的縱向色差在150-200nm之間，這意味著在相同清晰度平面中的藍(lán)色染料和紅色染料的成像在Z方向上彼此偏離150-200nm。在傳統(tǒng)顯微術(shù)中，上述范圍內(nèi)的縱向色差是可以容忍的，因為不論怎樣其在Z方向上所能達(dá)到的分辨率僅在600-1000nm的范圍之間。然而另一方面，在基于探測獨立分子的定位顯微術(shù)中現(xiàn)已獲得了好得多的分辨率值。例如，可以得到低于50nm的分辨率。對于這一分辨率，上述大小的縱向色差是不能容忍的
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是基于多色彩測量、對點狀目標(biāo)實現(xiàn)高精度的三維定位，尤其是在Z方向上實現(xiàn)高精度的三維定位。借由根據(jù)權(quán)利要求1的顯微裝置和根據(jù)權(quán)利要求14的方法，本發(fā)明實現(xiàn)了這一目的。在一特別有利的實施例中，用于對樣本中的點狀目標(biāo)進(jìn)行三維定位的裝置包括探測光學(xué)系統(tǒng)，以三維聚焦光分布的形式將布置在物空間的點狀目標(biāo)成像至像空間；分色裝置，將用于對點狀目標(biāo)成像的探測光學(xué)系統(tǒng)產(chǎn)生的光分成至少兩個獨立的光束，其波長在不同波長區(qū)域內(nèi)；至少兩個探測單元，布置在像空間中，其中的一個探測單元接收兩個光束中的一個，而另一探測單元接收兩個光束中的另一個，每個探測單元都包括布置為與相應(yīng)光束的入射方向垂直的探測表面，用于感測光斑，每個光斑表示穿過相關(guān)聚焦光分布的平面橫截面；評價單元，通過評價在各探測表面上感測的各光斑，確定在與清晰度平面平行的物平面內(nèi)的相關(guān)點狀目標(biāo)的橫向X-Y位置，以及相關(guān)點狀目標(biāo)在垂直于清晰度平面的光軸方向上相對于清晰度平面的軸向Z位置，各清晰度平面是與像空間中布置有各探測表面的探測平面光學(xué)共軛的物空間中的平面；用于兩個波長區(qū)域中的至少一個(優(yōu)選為兩者)的至少一個Z位置校正值，存儲在評價單元中，校正值表示了探測光學(xué)系統(tǒng)在該波長區(qū)域上的縱向色差；以及評價單元使用相關(guān)Z位置校正值來校正在各波長區(qū)域上確定的各點狀目標(biāo)的Z位置。根據(jù)本發(fā)明的裝置適于以高的空間分辨度，特別地包括Z方向，實施用于點狀目標(biāo)的三維定位的多色彩測量。為此，定位裝置包括將樣本發(fā)出的光分成至少兩個波長區(qū)域的分色裝置。如果多色彩測量中使用的是發(fā)射光譜僅輕微地重疊的染料，則分色裝置可適當(dāng)?shù)剡x自裝置的探測光路中的濾色器。這種情況下，獨立的探測濾色器及獨立的探測通道被分配至每一染料。由于染料的發(fā)射光譜應(yīng)符合可見光的可用光譜窗口，且如果可能必須沒有大部分的重疊，因此能夠以這種方式分開的染料的數(shù)量受到了限制。然而，僅使用兩個探測通道也能實施有效的分色。這種情況下，分色裝置包括諸如將用于對點狀目標(biāo)成像的探測光學(xué)系統(tǒng)產(chǎn)生的光分開的二向色分束器，不論待分開的染料的數(shù)目有多少，二向色分束器都將其分成入射至探測單元的兩個獨立光束。以這種方式，在兩個探測單元的探測表面上感測在不同波長區(qū)域上的同一目標(biāo)的圖像?；谶@兩個光斑亮度的比率，可容易地確定出染料。此時需要注意，兩個探測單元可合并為一個單元，例如攝像機中攝像機芯片的一部分用于一個探測通道，攝像機芯片的另一部分用于另一探測通道。根據(jù)本發(fā)明，通過評價在各探測單元的探測表面上感測的光斑來確定特定點狀目標(biāo)的橫向X-Y位置和Z位置。例如，評價包含對光斑產(chǎn)生的PSF的形狀和尺寸進(jìn)行分析，以確定點狀目標(biāo)相對于清晰度平面的Z位置。為此可以想象，例如基于一個合適的分配協(xié)議來進(jìn)行分析，該分配協(xié)議將正確的Z位置分配至測量的PSF的特定形狀。例如，可通過一校準(zhǔn)測量來獲得這種分配協(xié)議，在校準(zhǔn)測量中，點狀目標(biāo)在Z方向上從清晰度平面的一側(cè)移至另一側(cè)，由已知的Z位置確定出PSF的形狀。這得到了能夠在連續(xù)測量中將正確的Z位置分配至測量的PSF形狀的分配協(xié)議。例如，可使用其中PSF在X和Y方向上的尺寸的差別與Z位置相關(guān)聯(lián)的分配協(xié)議。根據(jù)本發(fā)明。對于至少兩個波長區(qū)域中的每一個，評價單元都包含有至少一個指示探測光學(xué)系統(tǒng)在各波長區(qū)域上的縱向色差的Z位置校正值。這使得能夠使用基于波長的Z位置校正值來校正以上述方式確定的目標(biāo)的Z位置，因而補償了探測光學(xué)系統(tǒng)中產(chǎn)生的縱向色差。因此本發(fā)明也能夠?qū)Σ煌玖线M(jìn)行Z方向上的高精度定位。在特別優(yōu)選的實施例中，提供一種裝置，其能夠影響各聚焦光分布從而使得當(dāng)點狀目標(biāo)位于清晰度平面中時相關(guān)的光斑具有對稱的形狀；當(dāng)點狀目標(biāo)位于清晰度平面背向探測光學(xué)系統(tǒng)的一側(cè)時，該相關(guān)的光斑具有第一非對稱形狀；而當(dāng)點狀目標(biāo)位于清晰度平面朝向探測光學(xué)系統(tǒng)的一側(cè)時，該相關(guān)的光斑具有可區(qū)分于第一非對稱形狀的第二非對稱形狀。采用這一配置，以這種方式打破對稱的結(jié)構(gòu)從而使得在探測器表面感測的來自清晰度平面一側(cè)的點狀目標(biāo)的光斑不同于來自清晰度平面另一側(cè)的點狀目標(biāo)的光斑。本文中“對稱”表不光斑關(guān)于X-Z平面和Y-Z平面鏡面對稱的狀態(tài)，其中X-Z平面和Y-Z平面都布置為垂直于位于X-Y平面中的探測表面。用于影響各聚焦光分布的裝置優(yōu)選地包含柱面透鏡。這種柱面透鏡產(chǎn)生的象散差導(dǎo)致了當(dāng)點狀目標(biāo)從清晰度平面的一側(cè)移至另一側(cè)時PSF不對稱的變化。然而如果目標(biāo)位于清晰度平面中，PSF就是對稱的(例如，略為十字形的)。基于由象散差引起的探測表面上也即橫向方向上的PSF形狀的不對稱的變化，可容易地確定目標(biāo)的Z位置。當(dāng)使用柱面透鏡時，分配至兩個探測表面的清晰度平面在物空間中是一致的。然而，分配至兩個探測表面的清晰度平面也能夠在物空間中彼此偏離，以用于打破為確定Z位置提供的PSF的對稱結(jié)構(gòu)。在該實施例中，如果待定位的目標(biāo)位于一個探測通道的清晰度平面中，則其在該通道清晰地成像，而在另一探測通道中非清晰地成像。如果目標(biāo)布置在兩個清晰度平面之間，其在兩個探測通道上都非清晰地成像，但在聚集位置距其更近的通道上更加清晰一些。由于哪一探測通道占用哪一聚焦位置是已知的，因而基于測量也能夠確定點狀目標(biāo)所處的Z位置。根據(jù)校準(zhǔn)測量可得到合適的分配協(xié)議。例如，一個可能的分配協(xié)議是一個探測通道中感測的光斑的直徑與另一探測通道中感測的光斑的直徑的差。根據(jù)本發(fā)明，可采用其它的方式來打破PSF的對稱結(jié)構(gòu)，例如根據(jù)Pavani等，2009，PNAS, 106中描述的所謂雙螺旋方法。優(yōu)選地，提供沿光軸移動樣本載體和/或探測光學(xué)系統(tǒng)、特別是探測目鏡的定位裝置。這樣能夠在Z方向上即光軸方向上相對探測光學(xué)系統(tǒng)的清晰度平面移動樣本，也即待定位的點狀目標(biāo)，從而確定分配至各目標(biāo)的PSF形狀的(非對稱)變化，并因而確定該目標(biāo)的Z位置。根據(jù)本發(fā)明，定位裝置優(yōu)選地具有用于將激發(fā)光發(fā)射至樣本的光源和位于該光源之后、用于改變發(fā)射至樣本上的激發(fā)光的光譜的裝置。改變?nèi)肷湓跇颖旧系募ぐl(fā)光的光譜成分使得能夠使用例如反射校準(zhǔn)元件來精確地確定探測光學(xué)系統(tǒng)在這些波長上的縱向色差，并保存Z位置校正值并將在待定位染料隨后的測量中引入該值。根據(jù)本發(fā)明，在一有利地改進(jìn)的方法中，使用不同校準(zhǔn)波長的光照射一包含有至少一個反射或散射點狀校準(zhǔn)目標(biāo)的校準(zhǔn)樣本；對每一校準(zhǔn)波長，確定點狀校準(zhǔn)目標(biāo)的Z位置；確定對各個校準(zhǔn)波長確定的校準(zhǔn)目標(biāo)的Z位置之間的偏差；基于這些偏差確定出基于波長的Z位置校正值。該有利的實施例包含使用一校準(zhǔn)樣本來執(zhí)行校準(zhǔn)以確定出指示縱向色差的Z位置校正值，校準(zhǔn)樣本例如為玻璃基板，在樣本中或樣本上設(shè)置有諸如金的微球體或金屬納米點的反射或散射校準(zhǔn)目標(biāo)。為了確定縱向色差，可使用與隨后待定位的染料發(fā)射的相同的光分布來照射該校準(zhǔn)目標(biāo)。因此，以與隨后待定位的染料相同的波長照亮該校準(zhǔn)目標(biāo)。然后可連續(xù)地使用期望的波長來照射該校準(zhǔn)目標(biāo)。則對每一波長，確定出該校準(zhǔn)目標(biāo)的Z位置。這種情況下，對每一單個校準(zhǔn)波長，可實施用于校準(zhǔn)樣本的不同Z位置的多校準(zhǔn)測量。相似地，可經(jīng)過校準(zhǔn)樣本的特定Z位置以設(shè)定該Z位置處的各校準(zhǔn)波長。不論采用哪一方式，都能獲得必要的校準(zhǔn)信息，例如用于不同染料的校準(zhǔn)曲線。上述方法具有這樣的優(yōu)點，無需不同染料的組合在場以作為參考樣本，替代的是僅需一個校準(zhǔn)樣本。所需要的僅是生成待定位的每一染料的相應(yīng)的激發(fā)光分布。例如，可使用布置在發(fā)射激發(fā)光的光源之后的合適的濾波器來實現(xiàn)。這種情況下，每一染料類型被分配至產(chǎn)生的光譜相應(yīng)于該染料的發(fā)射光譜的濾波器。優(yōu)選地，通過對確定的Z位置校正值進(jìn)行插值法來確定用于處于兩個校準(zhǔn)波長之間的波長的Z位置校正值。附加地或可選地，通過對確定的Z位置校正值進(jìn)行外推法來確定用于比最長的校準(zhǔn)波長還長或比最短的校準(zhǔn)波長還短的波長的Z位置校正值。這些有利的改進(jìn)使得即使對校準(zhǔn)測量中未實施的波長區(qū)域，也能確定縱向色差。


參考下述附圖，下文中進(jìn)一步地解釋了本發(fā)明:圖1是圖解在探測光學(xué)系統(tǒng)中發(fā)生的縱向色差的示意圖；圖2示出了圖解柱面透鏡如何打破探測表面上感測的PSF的對稱結(jié)構(gòu)的示意圖；圖3示出了將探測表面上感測的PSF的形狀關(guān)聯(lián)至點狀目標(biāo)相對于清晰度平面的Z位置的分配協(xié)議；圖4示意性地繪出了根據(jù)本發(fā)明的定位裝置；圖5示出了圖解不同染料的光譜分離的的示意圖；以及圖6是示出用于評價探測表面上感測的PSFs的可選實施例的示意圖。
具體實施例方式參考圖2，首先解釋了本發(fā)明中如何通過評價探測表面上感測的PSF來確定點狀目標(biāo)的Z位置。為便于解釋，在圖2示出的例子中首先僅考慮單色光。圖2在a)部分示出了一個傳統(tǒng)的布置，其中點狀目標(biāo)30被由目鏡透鏡32和鏡筒透鏡34構(gòu)成的探測光學(xué)系統(tǒng)36成像在探測表面38上。假定目標(biāo)30位于與探測表面38光學(xué)共軛的清晰度平面40中。探測光學(xué)系統(tǒng)36將發(fā)自目標(biāo)30的光成形為入射在探測表面38上的三維聚焦光分布。因而探測表面38感測表示垂直于Z方向且穿過該聚焦光分布的平面橫截面的光斑42。為便于更好地解釋，圖2中以探測表面38上的平面圖的形式示出光斑42，即在X-Y平面上示出。在圖2的a)部分中示出的例子中，點狀目標(biāo)30位于清晰度平面40上，探測表面38上的光斑42為圓形，即關(guān)于X-Z和Y-Z平面鏡面對稱的形狀。圖2在b)部分示出一改進(jìn)實施例，其中除目鏡透鏡32和鏡筒透鏡34外還提供一柱面透鏡44。柱面透鏡44在X-Y方向上具有不同的折射率。探測表面38上的光斑42相應(yīng)地在X和Y方向上的變成十字形。由于在b)部分示出的例子中，點狀目標(biāo)30仍處在清晰度平面40中，因此十字形光斑42仍保留了上述意義上的對稱性。
圖2在c)部分示出一個例子，其中點狀目標(biāo)30被布置在清晰度平面40的上方。關(guān)于清晰度平面40的這種偏離導(dǎo)致探測平面38上的光斑42不對稱地變成橢圓形。目標(biāo)30距清晰度平面越遠(yuǎn)，光斑42的橢圓形狀就越顯著。圖2在d)部分示出一個例子，其中點狀目標(biāo)30位于清晰度平面40的下方。同樣，探測表面38上的光斑42變成橢圓形，但橢圓的取向不同與c)部分中光斑42的取向。因而基于光斑42的形狀，相應(yīng)地能夠探測點狀目標(biāo)究竟是布置在清晰度平面40的上方還是下方。從圖2可明顯地看出，基于探測表面38上光斑42的形狀和尺寸可確定點狀目標(biāo)30相對于清晰度平面40的Z位置。在該典型實施例中，這是基于圖3示例性地示出的分配協(xié)議來實現(xiàn)的。借由校準(zhǔn)測量獲得該分配協(xié)議，在校準(zhǔn)測量中沿Z方向移動點狀目標(biāo)30并分別確定出對于各個Z位置的光斑42的形狀也即PSF的形狀。圖3示出的分配協(xié)議中，使用兩個相互垂直的橢圓軸的長PSFx和PSFy的差作為PSF形狀的參數(shù)，并與Z位置相比較。從圖3中可明顯地看出，每一個Z位置被明確地分配一個PSFx-PSFy的差值。如果上述差的值為零，則可推斷出該點狀目標(biāo)30恰位于清晰度平面40中。嚴(yán)格來說，圖3示出的分配協(xié)議僅對于單個預(yù)確定的波長是有效的。如果所考慮的不僅是單個波長，而是多個不同波長或波長區(qū)域，則相較于圖3示出的分配協(xié)議，其結(jié)果是偏移的、也可能是變形的多個分配協(xié)議，這是由縱向色差造成的?？v向色差本質(zhì)上產(chǎn)生圖3中示出的零交點的偏移。根據(jù)本發(fā)明，在校準(zhǔn)測量中對每一感興趣的波長都確定出圖3中示出的這種分配協(xié)議。根據(jù)由此獲得的校準(zhǔn)曲線的零交點的上述偏移，可得到表示探測光學(xué)系統(tǒng)在各個波長上的縱向色差的Z位置校正值，并在確定點狀目標(biāo)的Z位置時予以考慮。圖4示出表示本發(fā)明的典型實施例的顯微裝置100。裝置100具有激發(fā)光源102，其將激發(fā)光發(fā)射至改變激發(fā)光的光譜的裝置104上。例如，裝置104包括可選擇地插入激發(fā)光的光路中的多個光學(xué)濾波器的布置。裝置104發(fā)出的激發(fā)光入射在二向色分束器106上，分束器106被具體設(shè)置為朝著目鏡108反射激發(fā)光。目鏡108將激發(fā)光傳送至布置在可移動的樣本支架110上的樣本112,樣本包括多個待定位的點狀目標(biāo)。圖4中僅示意性地繪出這些目標(biāo)中的一個目標(biāo),標(biāo)記為114。這里假定點狀目標(biāo)114的尺寸小于目鏡108的衍射限制的分辨率極限。樣本支架110被耦合至定位裝置116，其沿光軸O移動樣本支架110。點狀目標(biāo)114發(fā)出的光被引導(dǎo)穿過目鏡108并入射在分束器106上。分束器106被具體設(shè)置為將目標(biāo)114發(fā)出的光透射至探測濾波器118。光隨后穿過鏡筒透鏡120并入射在反射鏡122上。反射鏡122反射的光隨后穿過柱面透鏡124，且柱面透鏡124以圖2示出的方式影響了該光。在穿過柱面透鏡124以后，光抵達(dá)分色裝置126。分色裝置126包括二向色分束器128，下面將參考圖5的a)部分來詳細(xì)地解釋分束器128的作用。二向色分束器128允許第一波長區(qū)域內(nèi)的部分熒光透過，并反射第二波長區(qū)域內(nèi)的剩余的熒光(參見圖5的a)部分)。允許透過的該部分熒光被反射鏡130，132，134和136引導(dǎo)至攝像機138。在分束器128上反射的另一部分熒光被引導(dǎo)至不同的光路，其通過反射鏡140，142和144的布置也抵達(dá)攝像機138。攝像機138包括兩個獨立的探測單元146和148，每一個分別具有探測表面150和152。分束器128允許通過的部分熒光入射至探測表面150上，而分束器128反射的另一部分熒光入射至探測表面152上。從而，分色裝置借由二向色分束器128將探測光路分成了兩個獨立的探測通道，其中一個通向探測表面150，另一個通向探測表面152。裝置100進(jìn)一步包括控制器154，其對裝置100的個別組件施加控制并根據(jù)本發(fā)明評價由攝像機138生成的信號以對點狀目標(biāo)114進(jìn)行定位。分色裝置126實現(xiàn)了對包含在樣本112中的不同染料的光譜分離，下文中將參考附圖5解釋該光譜分離。圖5在a)部分示出三個不同染料A，B和C的熒光發(fā)射，以及被標(biāo)記為160的二向色分束器128的透射特征曲線。如前所述，二向色分束器128將探測光路分成了通向兩個獨立的探測表面150和152的兩個獨立的探測通道。由于分配至兩個探測表面150和152的清晰度平面在物空間是一致的，因而探測表面150和152感測樣本112上相同的區(qū)域。然而，進(jìn)入兩個探測通道的波長區(qū)域是不同的。例如，染料A的發(fā)射區(qū)域幾乎全部落入一個探測通道內(nèi)，而染料C的發(fā)射區(qū)域幾乎全部落入另一探測通道內(nèi)。但染料B的發(fā)射區(qū)域大體上位于兩個探測通道的中間。當(dāng)接收單個染料發(fā)出的熒光時，熒光以圖5的a)部分示出的方式分布在兩個探測通道上。圖5在b)部分示出源自三個染料A，B和C并被探測表面150和152感測的光斑的示例。從圖中可看出，染料A在一個探測通道上留下的光斑具有相對較高的信號級，而在另一探測通道上生成的光斑具有相對較低的信號級。由染料C生成的光斑則完全相反。但另一方面，源自染料B的光斑在兩個探測通道上具有大約相同的信號級。對每一單分子信號，能夠測量其在兩個探測通道上的亮度分布也即光子分布，在圖5的C)部分中以圖示出。圖中，每一測量的單分子信號生成由極坐標(biāo)r和Φ定義的測量點。這里，角度Φ提供了染料顏色的信息，而距坐標(biāo)系原點的距離r表示亮度。測量來自三個染料A，B和C的大量信號，即得到c)部分中示出的分布，值得注意的就是彼此分離的三個“染料云”。這些染料云的空間范圍由各探測通道上光子分布的統(tǒng)計波動定義，由于單分子信號都具有不同的亮度，因此每個信號中光子的總數(shù)目也是隨機的。當(dāng)此時測量其光子分布落入這些染料云中的一個區(qū)域的信號時，就能明確地確定該分子是染料類型A，B和C中的哪一個。因此可彼此分開的染料的數(shù)目遠(yuǎn)大于所需要的探測通道的數(shù)目。另外，還能夠分離發(fā)射光譜大體上彼此重疊的染料。這是非常有利的，鑒于是以相同的激發(fā)光照射所有的染料。還需要提及的是，結(jié)合上述參考圖5的光譜信號分離和三維定位，還能得到可用于確定縱向色差的其它有用的信息。例如，信號被分離至兩個光譜不同的探測通道，則在每個探測通道上所引起的縱向色差具有不同的效果。因此，用于同一單分子的信號在兩個探測通道上看起來是不一樣的。如果對兩個信號都使用相同的由PSF的形狀推出Z位置所基于的分配協(xié)議，則對兩個探測通道獲得用于Z位置的不同的值。根據(jù)這兩個值可推出染料光譜的分布和絕對縱向色差。參考圖5所描述的光譜信號分離具有進(jìn)一步的優(yōu)點。特別地，如果測量圖5的c)部分中所示出的染料云，通常各染料云的寬度明顯地大于根據(jù)純粹的統(tǒng)計考慮所期望的寬度。這是因為染料微環(huán)境的改變會導(dǎo)致其發(fā)射光譜的改變?；谌玖系募磿r環(huán)境的性質(zhì)，因此染料分子在樣本中某一位置處的光譜不同于在另一位置處的光譜。光譜信號分離提供了這樣的優(yōu)點，即對每一單個染料分子可以分別地測量光譜偏移，因此也可對每一單個分子相應(yīng)地校正縱向色差。上述實施例應(yīng)被理解為僅僅是示例性的。圖6中示出可能的變型例中的一個。圖6中示出的布置具有兩個獨立的探測通道，其中一個基本上由目鏡170和鏡筒透鏡172定義，另一個由目鏡170和鏡筒透鏡174定義。點狀目標(biāo)180發(fā)出的光被分束器182和反射鏡184，186和187等分地引導(dǎo)至兩個探測通道。這兩個探測通道在聚焦位置上略微不同。這意味著，一個探測通道具有第一成像面188，其與第一清晰度平面190是光學(xué)共軛的，而另一探測通道具有在Z向上偏離于第一成像面188的第二成像面192，其與在Z向上偏離于第一清晰度平面190的第二清晰度平面194是光學(xué)共軛的。如果待定位的目標(biāo)180位于一個探測通道的清晰度平面中，則其在該通道中清晰地成像，而在另一探測通道中非清晰地成像。如果其位于兩個清晰度平面190和194之間，則在兩個探測通道上都非清晰地成像。如果目標(biāo)180被布置在焦平面190和194的上方，則在兩個探測通道上都非清晰地成像，但其在清晰度平面更接近于目標(biāo)180的探測通道中的成像要更清晰一些。由于探測通道的聚焦位置是已知的，因而能夠基于測量確定目標(biāo)180的位置。根據(jù)校準(zhǔn)測量可得到合適的分配協(xié)議。例如，一個可能的分配協(xié)議可以是在一個探測通道中感測的光斑198的直徑和在另一探測通道中感測的光斑200的直徑的差。這種分配協(xié)議相似于圖3中示出的分配協(xié)議。
權(quán)利要求
1.一種用于對樣本(112)中的點狀目標(biāo)(30，114)實現(xiàn)三維定位的顯微裝置(100)，包括: 探測光學(xué)系統(tǒng)(36，108)，以三維聚焦光分布的形式將布置在物空間的點狀目標(biāo)(30，114)成像至像空間； 至少一個探測單元(146，148)，布置在像空間中，其接收來自探測光系統(tǒng)(36，108)的一個光束，該探測單兀(146，148)包括布置為與該光束的入射方向垂直的探測表面(38, 150, 152),用于感測光斑(42),每一光斑表不穿過相關(guān)聚焦光分布的平面橫截面； 評價單元(154)，通過評價在探測表面(38，150，152)上感測的光斑(42)，確定在與清晰度平面(40)平行的物平面內(nèi)的相關(guān)點狀目標(biāo)(30，114)的橫向X-Y位置，以及相關(guān)點狀目標(biāo)(30，114 )在垂直于清晰度平面(40 )的光軸(O)方向上相對于清晰度平面(40 )的軸向Z位置，清晰度平面(40)是與像空間中布置有探測表面(38，150，152)的探測平面光學(xué)共軛的物空間中的平面； 用于可被探測單元(146，148)探測的不同波長區(qū)域的各個Z位置校正值，存儲在評價單元(154)中，Z位置校正值表示探測光學(xué)系統(tǒng)(36，108)在相應(yīng)波長區(qū)域上的縱向色差；以及 評價單元(154)使用相關(guān)Z位置校正值來校正在各波長區(qū)域上確定的各點狀目標(biāo)(30，114)的 Z 位置。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的顯微裝置(100)，其特征在于濾波器，其設(shè)置為從探測單元(146，148)接收的光束中濾除由光源發(fā)射的激發(fā)光。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的顯微裝置(100)，其特征在于 分色裝置(126)，將 用于對點狀目標(biāo)(30，114)成像的探測光學(xué)系統(tǒng)(36，108)產(chǎn)生的光分成至少兩個獨立的光束，其波長位于不同的波長區(qū)域； 其中所述至少一個探測單元包括至少兩個探測單元(146，148)，它們布置在像空間中，其中的一個探測單元接收兩個光束中的一個，而另一探測單元接收兩個光束中的另一個，每個探測單元(146，148)都包括布置為與相應(yīng)的光束的入射方向垂直的探測表面(38, 150, 152),用于感測光斑(42),每個光斑表不穿過相關(guān)聚焦光分布的平面橫截面。
4.根據(jù)前述權(quán)利要求之一的顯微裝置(100)，其特征在于 影響各聚焦光分布的裝置(44，124)，使得當(dāng)點狀目標(biāo)(30，114)位于清晰度平面(40)中時，其相關(guān)的光斑(42)具有對稱的形狀；當(dāng)點狀目標(biāo)(30，114)位于清晰度平面(40)背向探測光學(xué)系統(tǒng)(36，108)的一側(cè)時，其相關(guān)的光斑(42)具有第一非對稱形狀；而當(dāng)點狀目標(biāo)(30，114)位于清晰度平面(40)朝向探測光學(xué)系統(tǒng)(36，108)的一側(cè)時，其相關(guān)的光斑(42)具有可區(qū)分于第一非對稱形狀的第二非對稱形狀。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的顯微裝置(100)，其中各非對稱的形狀至少大約構(gòu)成橢圓形，評價單元(154)基于兩個相互垂直的橢圓軸的長度差來確定各點狀目標(biāo)(30，114)的軸向Z位置。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5的顯微裝置(100)，其中影響各聚焦光分布的裝置包含柱面透鏡(44，124)。
7.根據(jù)權(quán)利要求3至6之一的顯微裝置(100)，其中分配至兩個探測表面(150，152)的清晰度平面在物空間是一致的。
8.根據(jù)權(quán)利要求3的顯微裝置(100)，其中分配至兩個探測表面的清晰度平面在物空間是彼此偏離的。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的顯微裝置(100)，其中兩個探測表面感測屬于一個相同的點狀目標(biāo)的光斑，且評價單元基于光斑的尺寸比率來確定該點狀目標(biāo)(30，114)的軸向Z位置。
10.根據(jù)權(quán)利要求3至9之一的顯微裝置(100)，其中該分色裝置(126)包括二向色分束器(128)。
11.根據(jù)權(quán)利要求3至10之一的顯微裝置(100)，其中評價單元基于屬于該點狀目標(biāo)(30，114)且被兩個探測表面(150，152)感測的光斑的亮度比率來確定各個成像的點狀目標(biāo)(30，114)的顏色，并將確定的顏色指定為表示該顏色的縱向色差的相關(guān)Z位置校正值。
12.根據(jù)前述任一權(quán)利要求的顯微裝置(100)，其特征在于沿光軸(O)移動樣本載體(110)和/或探測光學(xué)系統(tǒng)(36，108)的定位裝置(116)。
13.根據(jù)前述任一權(quán)利要求的顯微裝置(100)，其特征在于用于將激發(fā)光發(fā)射至樣本(112)上的光源(102)，以及布置在該光源之后、用于改變發(fā)射至樣本(112)上的激發(fā)光的光譜的裝置(104)。
14.一種用于對樣本(112)中的點狀目標(biāo)(30，114)實現(xiàn)三維定位的方法，包括: 借由探測光學(xué)系統(tǒng)(36，108)，以三維聚焦光分布的形式將布置在物空間的點狀目標(biāo)(30，114)成像至像空間； 借由至少一個布置在像空間`中的探測單元(146，148)接收來自探測光系統(tǒng)(36，108)的一個光束，該探測單兀(146，148)包括布置為與該光束的入射方向垂直的探測表面(38, 150, 152),用于感測光斑(42),每一光斑表不穿過相關(guān)聚焦光分布的平面橫截面；通過評價在探測表面(38，150，152)上感測的相關(guān)光斑(42)，確定在與清晰度平面(40)平行的物平面內(nèi)的各個點狀目標(biāo)(30，114)的橫向X-Y位置，以及各個點狀目標(biāo)(30，114)在垂直于清晰度平面(40)的光軸(O)方向上相對于清晰度平面(40)的軸向Z位置，清晰度平面(40)是與像空間中布置有探測表面(38，150，152)的探測平面光學(xué)共軛的物空間中的平面； 對可被探測單元(146，148)探測的不同波長區(qū)域分別確定可用的一個Z位置校正值，各個Z位置校正值表示探測光學(xué)系統(tǒng)(108)在相關(guān)波長區(qū)域上的縱向色差；以及 使用相關(guān)的Z位置校正值來校正在各波長區(qū)域上確定的各點狀目標(biāo)(30，114)的Z位置。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其特征在于借由濾波器從探測單元(146，148)接收的光束中濾除由光源發(fā)射的激發(fā)光。
16.根據(jù)權(quán)利要求14或15的方法,其特征在于: 將用于對點狀目標(biāo)(30，114)成像的探測光學(xué)系統(tǒng)(108)產(chǎn)生的光分成至少兩個獨立的光束，其波長位于不同的波長區(qū)域； 借由布置在像空間中的一個探測單元(146)接收兩個光束中的一個，借由布置在像空間中的另一探測單元(148)接收兩個光束中的另一個，每個探測單元(146，148)都包括布置為與相應(yīng)的光束的入射方向垂直的探測表面(38，150，152)，用于感測光斑(42)，每個光斑表示穿過相關(guān)聚焦光分布的平面橫截面。
17.根據(jù)權(quán)利要求14至16之一的方法，其中使用不同校準(zhǔn)波長的光照射包含有至少一個反射或散射點狀校準(zhǔn)目標(biāo)的校準(zhǔn)樣本； 對每一校準(zhǔn)波長，確定點狀校準(zhǔn)目標(biāo)的Z位置； 確定對各個校準(zhǔn)波長確定的校準(zhǔn)目標(biāo)的Z位置之間的偏差； 基于這些偏差確定出基于波長的Z位置校正值。
18.根據(jù)權(quán)利要求14至16之一的方法，其特征在于 采用不同激發(fā)波長的光照射包含有多個不同熒光染料的校準(zhǔn)樣本，其中每一激發(fā)波長分別激發(fā)被分配至其的熒光染料以發(fā)射熒光，該熒光的熒光波長不同于其它熒光染料發(fā)射的熒光的熒光波長， 對定義校準(zhǔn)波長的每一熒光波長，確定點狀校準(zhǔn)目標(biāo)的Z位置， 確定對各個校準(zhǔn)波長確定的校準(zhǔn)目標(biāo)的Z位置之間的偏差，以及 基于這些偏差確定出基于波長的Z位置校正值。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中通過對確定的Z位置校正值進(jìn)行插值法來確定用于處于兩個校準(zhǔn)波長之間的波長的Z位置校正值，和/或通過對確定的Z位置校正值進(jìn)行外推法來確定用于比最長的校準(zhǔn)波長還長或比最短的校準(zhǔn)波長還短的波長的Z位置校正值。
全文摘要
用于對樣本中點狀目標(biāo)實現(xiàn)三維定位的顯微裝置，包括探測光學(xué)系統(tǒng)，以三維聚焦光分布的形式將布置在物空間的點狀目標(biāo)成像至像空間；分色裝置，將光分成至少兩個獨立的光束，其波長落入不同的波長區(qū)域；至少兩個探測單元，布置在像空間中，其中的一個接收兩個光束中的一個，而另一個接收兩個光束中的另一個，每個探測單元都包括布置與各光束的入射方向垂直的探測表面，用于感測光斑；評價單元，通過評價在探測表面上感測的光斑，確定在相關(guān)點狀目標(biāo)的橫向X-Y位置，以及相關(guān)點狀目標(biāo)在垂直于清晰度平面的光軸方向上相對于清晰度平面的軸向Z位置；用于兩個波長區(qū)域中的至少一個區(qū)域的至少一個Z位置校正值，存儲在評價單元中，校正值表示了探測光學(xué)系統(tǒng)在該波長區(qū)域上的縱向色差；以及評價單元使用相關(guān)Z位置校正值來校正在各波長區(qū)域上確定的Z位置。
文檔編號G02B21/00GK103105382SQ20121044735
公開日2013年5月15日 申請日期2012年11月9日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月11日
發(fā)明者J·弗林 申請人:徠卡顯微系統(tǒng)復(fù)合顯微鏡有限公司