專利名稱：一種大樣本快速三維顯微成像的方法和系統的制作方法
技術領域：
本發明涉及顯微成像方法及系統，具體地說是指一種適用于大樣本的，基于結構光三維層析的顯微光學成像方法及系統。
背景技術：
在光學顯微鏡領域，人們一直追求能在更大的成像區域內對獲取樣本的三維細節信息。但這一目標受到三方面的因素的制約，一是散射光的存在會導致背景光的產生，導致傳統顯微鏡成像除了得到物鏡焦面上的信息，還會疊加上來自其它區域的模糊背景，無法獲得樣本的三維層析圖像；二是受限于顯微物鏡的視場和成像速度，對于厘米級大樣本的顯微成像通常需要數十天，這不僅是對成像系統穩定性和壽命本身是一個很大的挑戰，成像樣本也很難在成像環境下長時間保持性狀不變；三是標記樣本的成像信號強度會由于蛋白的光漂白效應而在整個成像過程中不斷下降，成像時 間越長，曝光量越大，光漂白對成像的負面影響越大。
美國專利US6376818中描述結構光顯微成像作為一種具有獲得光學斷層成像數據的成像技術，基于面掃探測方式使其具有對樣本進行快速成像的潛力。目前的結構光顯微鏡的大都基于光柵作為光源的調制器，使用壓電位移的方式實現對結構照明光的相移， 這使得結構光顯微鏡的成像速度嚴重受限于光柵機械位移的速度，一般情況只有I赫茲左右。另一類基于數字微鏡陣列的結構光顯微鏡中(例如中國專利，申請號200810071628. 5， 201110448980. 8)，探測器進行曝光期間，數字微鏡驅動版通過產生一系列的脈寬調制信號 (PWM)控制每個微鏡開關狀態的占空比，數字微鏡時刻在翻轉，在不同的兩個狀態下不停切換，產生256級不同亮度灰度圖案。雖然數字微鏡陣列中單個微鏡的切換速度可達數萬赫茲，但這種灰度調制方式將其有效調制速度限制在數十赫茲的水平上。且微型反射鏡不斷的翻轉，使得即使在最亮的灰度級數下，灰度調制的微鏡陣列也無法將照明光全部反射至， 照明光的利用率較低，降低了結構光照明圖案的調制深度，影響了成像速度和成像效果。
綜上所述，現存的針對大樣本的三維顯微成像方法和系統存在以下不足(1)成像速度慢，對于結構光顯微鏡，其成像速度主要受限于調制器的有效調制頻率；(2)光漂白影響成像質量。這些問題在實際應用中限制了此類方法的發展和應用，因此發展一種適用于大樣本的快速三維顯微成像方法和系統很有必要。發明內容
本發明的提供一種大樣本快速三維顯微成像的方法和系統，目的在于克服現有技術中成像速度慢，對樣本光漂白嚴重，機械加工對樣本形態的影響的缺點。
一種大樣本快速三維顯微成像的方法，其特征在于包括以下步驟
(I)樣本包埋在樣本塊中，固定在精密三維電動平移臺之上；
(2)數字微鏡陣列工作在二值調制的模式下，作為結構光顯微鏡中的空間光調制器，對于照明光進行二值調制，形成結構光條紋，結構光顯微鏡采集樣本表層I 一 100微米的深度內的圖像；
(3)完成成像區域內表層的成像后，利用金剛石或硬質合金刀具，去除樣本塊表層已成像部分；
(4)重復步驟(2)和步驟(3)，直到完成數據獲取任務。
所述步驟(2 )具體方法為
(a)數字微鏡陣列工作在二值調制的模式下指當面陣相機進行曝光時，數字微鏡陣列中的每個微型反射鏡都工作在穩定狀態下，不進行任何翻轉，出射光在物鏡焦面只有亮和暗兩種狀態，分別對應微型反射鏡固定在入射光出射和非出射兩種角度的狀態，不存在灰度的變化；
(b)當曝光完成后，數字微鏡陣列的微鏡進行翻轉，改變至下一相位圖案，同時觸發面陣相機進行再次曝光，重復該過程直到完成結構光成像所需的0、2/3pi和4/3pi三幅不同相位圖像的采集；
(c)步驟(b)完成后，數字微鏡陣列中的微鏡統一翻轉至入射光非出射的角度上， 阻擋照明光照射到樣本上；
(d)壓電位移器帶動物鏡進行軸向移動，使物鏡焦面對準同一個成像子區域的更深層樣本進行成像。
(e)采集得到的圖像存儲在計算機硬盤或者內存中，利用公式
權利要求
1.一種大樣本快速三維顯微成像的方法，其特征在于包括以下步驟 (1)樣本包埋在樣本塊中，固定在精密三維電動平移臺之上； (2)數字微鏡陣列工作在二值調制的模式下，對照明光進行二值調制，形成結構光條紋，結構光顯微鏡采集樣本表層I 一 100微米深度內的圖像； (3)完成成像區域內表層的成像后，利用金剛石或硬質合金刀具，去除樣本塊表層已成像部分； (4)重復步驟(2)和步驟(3)，直到完成數據獲取任務。
2.根據權利要求I所述的大樣本快速三維顯微成像的方法，其特征在于所述步驟(2)具體方法為 (a)數字微鏡陣列工作在二值調制的模式下指當面陣相機進行曝光時，數字微鏡陣列中的每個微型反射鏡都工作在穩定狀態下，不進行任何翻轉，出射光在物鏡焦面只有亮和暗兩種狀態，分別對應微型反射鏡固定在入射光出射和非出射兩種角度的狀態，不存在灰度的變化； (b)當曝光完成后，數字微鏡陣列中的微鏡進行翻轉，改變至下一相位圖案，同時觸發面陣相機進行再次曝光，重復該過程直到完成結構光成像所需的0、2/3pi和4/3pi三幅不同相位圖像的采集； (c)步驟(b)完成后，數字微鏡陣列中的微鏡統一翻轉至入射光非出射的角度上，阻擋照明光照射到樣本上； (d)壓電位移器帶動物鏡進行軸向移動，使物鏡焦面對準同一個成像子區域的更深層樣本進行成像； Ce)采集得到的圖像存儲在計算機硬盤或者內存中，利用公式
3.一種大樣本快速三維顯微成像系統，包括光源、光導、一塊激發濾光片、一塊發射濾光片、三塊透鏡、數字微鏡陣列、二塊反射鏡、一塊二向色鏡、壓電位移器、物鏡、精密三維電動平移臺、面陣相機、數字微鏡陣列驅動板、壓電位移驅動器、平臺控制器、圖像采集卡、計算機、金剛石或硬質合金刀具，其特征在于計算機分別與數字微鏡陣列驅動板、壓電位移驅動器、平臺控制器、圖像采集卡相連，數字微鏡陣列與數字微鏡陣列驅動板相連，壓電位移器與壓電位移驅動器相連，精密三維電動平移臺與平臺控制器相連，面陣相機與圖像采集卡相連，面陣相機受數字微鏡陣列驅動板輸出的觸發脈沖信號控制采集時刻；由光源出射的光耦合入光導中，均勻化后經由激發濾光片、第一透鏡進行準直，第一反射鏡將光束反射至數字微鏡陣列中，當數字微鏡陣列中的微鏡處于12狀態時，被微鏡反射的光線經由第二反射鏡被第二透鏡收集，經過二向色鏡反射后進入固定在壓電位移器上的物鏡中；樣本固定在精密三維電動平移臺之上，樣本接受激發光后發出的光經物鏡、二向色鏡，第三透鏡和發射濾光片，最后在面陣相機上成像；金剛石或硬質合金刀具固定在鋼制刀架上。
4.根據權利要求3所述的大樣本快速三維顯微成像系統，其特征在于所述的光源為LED、鹵素燈或汞燈。
5.根據權利要求3所述的大樣本快速三維顯微成像系統，其特征在于所述的光導為光纖或液態光導。
6.根據權利要求3所述的大樣本快速三維顯微成像系統，其特征在于所述的面陣相機為電荷耦合元件CCD相機或互補金屬氧化物半導體CMOS相機。
全文摘要
本發明涉及一種大樣本快速三維顯微成像的方法及系統，本發明方法(1)樣本包埋在樣本塊中固定在精密三維電動平移臺上；(2)數字微鏡陣列工作在二值調制的模式下，對照明光進行二值調制，形成結構光條紋，結構光顯微鏡采集樣本表層1－100微米深度內的圖像；(3)完成成像區域內表層的成像后，利用金剛石或硬質合金刀具，去除樣本塊表層已成像部分；(4)重復步驟(2)和步驟(3)，直到完成數據獲取任務。本發明的數字微鏡陣列工作在二值調制的模式下，有效加快成像速度；通過數字微鏡陣列與面陣相機的曝光同步方法，使得只有在面陣相機曝光時樣本才會接受到激發光的照射，進一步降低樣本的曝光量，避免光漂白效應對成像帶來負面影響。
文檔編號G02B21/06GK102928970SQ201210402820
公開日2013年2月13日 申請日期2012年10月19日 優先權日2012年10月19日
發明者駱清銘, 龔輝, 許冬力, 李安安 申請人:華中科技大學