專利名稱::在線細胞顯微觀察儀的制作方法
技術領域:
:本實用新型涉及一種在線細胞顯微觀察儀,特別是一種應用于生化反應罐的在線細胞顯微形態(tài)觀察儀。技術背景生物反應過程中以活細胞培養(yǎng)進行產(chǎn)品生產(chǎn)時,細胞生長與形態(tài)變化是極重要的監(jiān)測參數(shù),長期來以從罐中取樣的方法,通過離線顯微鏡觀察獲得。近年來隨著電子技術的進步,可以把圖象轉化為數(shù)字信號,進行計算機處理,由此得到量化的生長與形態(tài)變化信息。但是,以上方法只是離線間隔采樣,缺乏動態(tài)觀察,特別如動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)過程,抗雜菌污染是過程操作的首要問題,因此不可能頻繁取樣,由此帶來觀察動態(tài)性差,過程分析困難的問題。根據(jù)以上使用情況,插入到發(fā)酵罐的在線細胞顯微觀察儀必須符合以下基本要求1)顯微觀察儀的分辨率和視野能清晰區(qū)分細菌、真菌和動物細胞,死細胞與活細胞,并作相應的形態(tài)分析;2)由于培養(yǎng)過程細胞濃度變化,顯微觀察儀必須有相應的最大濃度界限;3)必須克服顯微探頭長期插入發(fā)酵罐后形成的鏡頭表面菌體生長或吸附;4)顯微觀察儀結構有利于生物反應器的滅菌和無菌操作;5)顯微觀察儀必須具有符合反應器要求的實時數(shù)字圖象信號轉化與處理能力。德國DrChristophBittner于1994年在博士學位論文中描述了一種熒光激發(fā)法的在線顯微裝置(原位顯微鏡培養(yǎng)過程中生物量在線測定的新過程,DrChristophBittner,Hannover,1994)。其主要工作原理如圖1所示,激光發(fā)出的單色紫外光經(jīng)透鏡Ll、小孔空間濾波后再經(jīng)透鏡組L2、L3由雙色鏡片反射至物鏡,然后由物鏡投射至反應罐腔內(nèi)的細胞表面,由于熒光效應,細胞產(chǎn)生的熒光經(jīng)物鏡匯聚,雙色鏡片以及反射鏡,再經(jīng)濾波片后成像于同步攝像機上。由于反應罐內(nèi)的細胞高速旋轉,因此要求同步攝像機的曝光時間很短,--般不超過2ms(根據(jù)放大倍數(shù)的不同可能需要調(diào)整)。此方法的優(yōu)點為不需要復雜的機械取樣裝置。但該方案采用亮視場照明方式,對于透明細胞所成圖像的對比度以及分辨率不好;又由于采用高速攝影,單波長熒光激發(fā)的方式,在使用中更換激發(fā)光波長成本較高。在2004年美國有專利介紹了一種基于在線采樣的顯微觀察儀(US6,809,862)。如圖2所示,采樣窗口4來回移動,當采樣窗口4移動到顯微鏡16以及照明燈源所在位置時,反應罐10內(nèi)的細胞溶液就流入觀察腔12;當采樣窗口4移動至其他位置時,觀察腔12內(nèi)的細胞溶寫相對穩(wěn)定,以便于顯微觀察。為了更換顯微鏡頭方便,如圖3所示專門設計了一個清洗腔。拉動拉桿2,使得顯微鏡頭以及采樣窗口4到達清洗腔位置,清洗腔腔壁有孔8,可用于引入蒸汽或消毒液進行消毒或清洗。同時在此位置,可以方便地更換顯微鏡鏡頭。但該方案采用亮視場照明方式,對于透明細胞所成圖像的對比度以及分辨率不好;又由于照明系統(tǒng)在反應罐內(nèi)工作,不便于更換光源、切換光源激發(fā)波長,無法區(qū)分不同種類的細胞,如死細胞與活細胞;且頻繁的取樣與消毒會給在線的生物培養(yǎng)造成染菌的隱患。2004年德國專利DE10350243介紹了一種利用SLD(SuperLightDiode)照明,MultimodeFiber(多模光纖)傳輸、同步高速攝像的在線細胞顯微觀察儀。激光或發(fā)光二極管發(fā)出的光線經(jīng)多模光纖傳輸?shù)椒磻迌?nèi),照射反應罐(反應器)內(nèi)的細胞,細胞反射的光線經(jīng)物鏡匯聚后成像在CCD攝像機上。由于細胞在反應罐內(nèi)不斷地運動,因此要求攝像機的曝光時間比較小,才能在瞬間抓住細胞影像。攝像機拍攝的圖片送入計算機處理。該方案采用亮視場照明方式,對于透明細胞所成圖像的對比度以及分辨率不好;又由于在反應罐攪拌速度較快的情況下必然采用高速攝像機,由于沒有取樣裝置限制景深,因此與圖1所示方案一樣對景深影響無法消除;同時由于其光源采用復雜的SLD(SuperLightDiode超亮發(fā)光二極管),光源驅動控制器比較復雜,因此更換光源、切換激發(fā)波長成本高且比較困難。
發(fā)明內(nèi)容本實用新型所要解決的技術問題是采用暗視場照明以提高在線細胞顯微觀察儀對于細胞所成圖像的對比度以及分辨率;提供一種可更換波長的外部光源系統(tǒng);結構簡單的機械取樣裝置,操作簡便和制造成本低的用于生化反應器的在線細胞顯微觀察儀。為解決上述技術問題,本實用新型采用的技術方案如下一種在線細胞顯微觀察儀,包括觀察儀主體,物鏡,觀察入射窗,取樣裝置,外部光源系統(tǒng);觀察儀主體前端設置觀察入射窗,觀察入射窗前部設置取樣裝置,觀察儀主體內(nèi),觀察入射窗后面放置物鏡和外部光源系統(tǒng),其特點是外部光源系統(tǒng)與物鏡之間設置反射棱鏡,物鏡后面,觀察入射窗前設有反射鏡,反射棱鏡前面放置環(huán)形光闌片,反射棱鏡側面上部置有CCD或面陣圖像傳感器;取樣裝置由取樣塊,彈性元件,移動裝置構成,其中,取樣塊與移動裝置的驅動軸之間連接彈性元件,取樣塊前端面與觀察入射窗之間的間隙構成采樣池。外部光源系統(tǒng)由光源,聚光鏡,可換濾色片7組成;光源為鹵素燈或LED燈,其發(fā)射的光線經(jīng)過聚光鏡聚焦后形成平行光束后透過可換濾色片產(chǎn)生所需的波段光線。觀察儀主體通過鎖緊螺母與反應罐相連接;觀察儀主體與反應罐之間采用密封圈密封。移動裝置之一由驅動軸,連接桿,取樣拉桿,彈性元件組成,其中裝有驅動軸的連接桿通過螺絲與取樣拉桿相連接,取樣拉桿與彈性元件在連接處通過焊接進行密封和連接,同時彈性元件的另外一端面也在連接處通過焊接與觀察儀主體相連接。移動裝置之二由驅動軸,電機,取樣筒組成,其中取樣筒連接在觀察儀主體的前端,取樣筒后端置有電機,電機輸出軸連接驅動軸。取樣塊由三個不同直徑圓柱體構成,且由不銹鋼或藍寶石材料制成。CCD或面陣圖像傳感器經(jīng)光電轉換將數(shù)字信號傳輸給圖像采集處理單元,集處理單元將處理結果送入計算機分析,顯示或存儲。本實用新型的有益效果是(1)光源發(fā)出平行光束透過可替換的不同濾色片產(chǎn)生特定波段的光線后,通過環(huán)形光闌片處理將所入射的光線轉換為環(huán)形的平行光束,并且經(jīng)過反射鏡形成一個具有大環(huán)形孔徑角的照明光線照射取樣塊與觀察儀觀察窗之間所形成的取樣池內(nèi)部的細胞溶液。由于照明光線是環(huán)繞細胞溶液進行入射照明的,其光線不返回進入物鏡。因此視場是暗視場。只有被照射的溶液中細胞或顆粒的反射光線進入物鏡后經(jīng)鍍有反射膜的45度反射棱鏡反射后投射到CCD或面陣圖像傳感器上。因此,本實用新型的外部光源系統(tǒng)通過替換不同濾色片、能很方便地更換波長;同時暗視場照明能提高觀察儀對于透明細胞所成圖像的對比度以及分辨率;(2)取樣裝置由取樣塊,彈性元件,移動裝置構成,取樣塊的端面與觀察儀觀察窗之間的間隙空間形成了一個與反應罐隔離的取樣池,此時取樣池內(nèi)的溶液細胞與反應罐內(nèi)的溶液細胞相對隔離,不隨反應罐的攪拌器運動,便于觀察。而且移動裝置結構簡單,使用方便,制造成本低。圖1是熒光激發(fā)法的在線顯微裝置的結構原理圖;圖2是美國專利US6,809,862的顯微觀察儀的光學原理示意圖;圖3是美國專利US6,809,862的顯微觀察儀的采樣腔、清洗腔結構示意圖;圖4是本實用新型的光學照明以及成像光路示意圖;圖5是本實用新型的取樣裝置實施例之一結構示意圖6是本實用新型的取樣裝置實施例之二結構示意圖;圖7,8是采樣池的工作示意圖。具體實施方式以下結合附圖與實施例對本實用新型作進一的說明。如圖4所示,本實用新型的用于生化反應器的在線細胞顯微觀察儀,包括觀察儀主體43,反射鏡23,物鏡24,觀察入射窗22,取樣裝置40,外部光源系統(tǒng)60,反射棱鏡25,環(huán)形光闌片26,CCD或面陣圖像傳感器30。觀察儀主體前端設置觀察入射窗22,觀察入射窗22前部設置取樣裝置40,觀察儀主體43內(nèi),觀察入射窗22后面放置物鏡24和外部光源系統(tǒng)60。外部光源系統(tǒng)60與物鏡24之間設置反射棱鏡25,物鏡24后面,觀察入射窗22前設有反射鏡23,反射棱鏡25前面放置環(huán)形光闌片26,反射棱鏡25側面上部置有CCD或面陣圖像傳感器30。外部光源系統(tǒng)60由光源28,聚光鏡29,可換濾色片27組成;燈源28可以采用鹵素燈、LED燈,其發(fā)射的光線經(jīng)過聚光鏡29聚焦后形成平行光束出射。平行光束透過可替換濾色片27產(chǎn)生特定波段的光線后,通過環(huán)形光闌片26處理將所入射的光線轉換為環(huán)形的平行光束。環(huán)形平行光束經(jīng)過反射鏡23形成一個具有大環(huán)形孔徑角的照明光線照射取樣塊21與觀察儀觀察窗22之間所形成的取樣池內(nèi)部的細胞溶液。由于照明光線是環(huán)繞細胞溶液進行入射照明的,其光線不返回進入物鏡24。因此視場是暗視場。只有被照射的溶液中細胞或顆粒的反射光線進入物鏡24后經(jīng)鍍有反射膜的45度反射棱鏡25反射后投射到CCD或面陣圖像傳感器30上。經(jīng)30光電轉換后成為數(shù)字信號傳輸給圖像采集處理單元31。圖像采集處理單元31將處理結果送計算機32進行分析,顯示或存儲。如圖5,6所示,取樣裝置40由取樣塊21,彈性元件38,移動裝置構成,其中,取樣塊21與移動裝置的驅動軸51之間連接彈性元件38,取樣塊21前端面與觀察入射窗22之間的間隙構成采樣池50。如圖5所示,移動裝置之一由驅動軸51,連接桿46,取樣拉桿44,彈性元件39組成,其中裝有驅動軸51的連接桿46通過螺絲47與取樣拉桿44相連接,取樣拉桿44與彈性元件39通過在9a處焊接進行密封和連接,同時彈性元件39的另外一端面也通過在9b處焊接與觀察儀主體43相連接。觀察儀主體43通過鎖緊螺母42與反應罐41相連接。觀察儀主體43與反應罐41之間采用密封圈45密封。觀察儀觀察入射窗22浸入反應罐41內(nèi)部,其材料為石英玻璃或藍寶石。取樣塊21為三個不同直徑圓柱體形狀,采用不銹鋼或藍寶石材料制成。其一端面與彈性元件38焊接,另外一端面可以沿觀察儀觀察窗中心軸線方向左右移動,與觀察儀觀察窗22組成了一個采樣池50。向外拉動取樣拉桿44,取樣拉桿44通過連接桿46、彈性元件38推動取樣塊21向靠近觀察窗22方向移動,同時彈性元件39處于壓縮狀態(tài);向內(nèi)推動取樣拉桿44,取樣拉桿44通過連接桿46、彈性元件38推動取樣塊21向遠離觀察窗22方向移動,同時彈性元件39處于松弛狀態(tài)。彈性元件38、39均采用不銹鋼材料制成,同時連接桿46、拉桿44也是由不銹鋼材料制成。如圖7,8所示,當連接桿46沿箭頭方向移動時,連接桿46通過彈性元件38帶動取樣塊21朝著遠離觀察儀觀察窗22的方向移動,取樣塊21與觀察儀觀察窗22之間的距離變大,這時取樣塊21與觀察儀觀察窗22之間的組成的取樣池50與反應罐41連通,取樣池細胞溶液與反應罐內(nèi)的細胞溶液連通。當連接桿46通過彈性元件38帶動取樣塊21朝著靠近觀察儀觀察窗22的方向移動時,取樣塊21與觀察儀觀察窗22之間的距離變小,到達極限位置時,取樣塊21的端面與觀察儀觀察窗22之間的間隙空間形成了一個與反應罐41隔離的取樣池50,此時取樣池50內(nèi)的溶液細胞與反應罐內(nèi)的溶液細胞相對隔離,不隨反應罐的攪拌器運動,便于觀察。成形后的取樣池的深度大小可以通過控制取樣塊21端面與觀察儀觀察窗22之間的距離來獲得。如圖6所示,移動裝置之二由驅動軸51,電機48,取樣筒49組成,其中取樣筒49連接在觀察儀主體43的前端,取樣筒49后端置有電機48,電機48輸出軸連接驅動軸51。觀察儀主體43與反應罐41通過鎖緊螺母42相連接。采樣池50是由取樣塊21的一個端面與觀察儀觀察窗22之間的間隙組成。電機48為耐高溫電機,密封在觀察儀主體43中的浸入反應罐溶液部分中。當電機48通過彈性元件38帶動取樣塊21沿著使采樣池50體積變小的方向移動至一個極限位置,采樣池50內(nèi)的細胞溶液與反應罐內(nèi)的溶液隔離,因此釆樣池內(nèi)的細胞溶液相對靜止,便于觀察。相反,當電機48帶動取樣塊21向另一方向移動時,取樣池50內(nèi)的溶液與反應罐41內(nèi)的細胞溶液混合。本實用新型的實施例一為驗證本實用新型,使用本實用新型的一種用于生化反應器的在線細胞顯微觀察儀在微生物反應器中對重組酵母發(fā)酵過程觀察應用在培養(yǎng)過程中每2h取樣一次進行細胞光密度(0D600)測定、細胞干重、離線顯微鏡血球計數(shù),同時在線細胞顯微觀察儀進行自動觀察和計數(shù),結果如表l。由表1可知在線細胞顯微觀察儀的細胞在線計數(shù)結果與細胞光密度(0D600)、細胞血球計數(shù)板計數(shù)結果基本一致,而在培養(yǎng)后期時稍微偏大。各細胞濃度與發(fā)酵時間進行指數(shù)方程擬合,線性相關系數(shù)以在線細胞顯微觀察儀最高,與血球計數(shù)板離線計數(shù)基本一致,而明顯高于細胞光密度和細胞干重計數(shù)法的結果,這是由于光密度法和干重法均無法區(qū)分死、活細胞、以及發(fā)酵液中的固形物顆粒,因而誤差較大。表l離線、在線細胞計數(shù)和細胞光密度、細胞干重結果比較離線血球計數(shù)在線細胞顯微細胞光密度細胞干重<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>本實用新型的實例二-為驗證本實用新型,使用本實用新型的用于生化反應器的在線細胞顯微觀察儀在哺乳動物細胞反應器中對重組動物細胞(HEK293)培養(yǎng)過程觀察應用發(fā)酵過程每24h取樣一次進行離線細胞血球計數(shù)。二者細胞計數(shù)結果如表2。由表2可知,離線的血球計數(shù)和在線細胞顯微觀察儀的細胞數(shù)量計數(shù)結果基本一致。表5L機械攪拌式反應器培養(yǎng)HEK293細胞密度比較<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>權利要求1.一種在線細胞顯微觀察儀,包括觀察儀主體(43),物鏡(24),觀察入射窗(22),取樣裝置(40),外部光源系統(tǒng)(60),觀察儀主體(43)前端設置觀察入射窗(22),觀察入射窗(22)前部設置取樣裝置(40),觀察儀主體(41)內(nèi),觀察入射窗(22)后面放置物鏡(24)和外部光源系統(tǒng)(60),其特征在于,所述外部光源系統(tǒng)(60)與物鏡(24)之間設置反射棱鏡(25),物鏡(24)后面,觀察入射窗(22)前設有反射鏡(23),反射棱鏡(25)前面放置環(huán)形光闌片(26),反射棱鏡(25)側面上部置有CCD或面陣圖像傳感器(30);所述取樣裝置(40)由取樣塊(21),彈性元件(38),移動裝置構成,其中,取樣塊(21)與移動裝置的驅動軸(51)之間連接彈性元件(38),取樣塊(21)前端面與觀察入射窗(22)之間的間隙構成采樣池(50)。2.根據(jù)權利要求1所述的在線細胞顯微觀察儀,其特征在于,所述外部光源系統(tǒng)(60)由光源(28),聚光鏡(29),可換濾色片(27)組成;所述光源(28)為鹵素燈或LED燈,其發(fā)射的光線經(jīng)過聚光鏡(29)聚焦后形成平行光束后透過可換濾色片(27)產(chǎn)生所需的波段光線。3.根據(jù)權利要求1所述的在線細胞顯微觀察儀,其特征在于,所述觀察儀主體(43)通過鎖緊螺母(42)與反應罐(41)相連接;觀察儀主體(43)與反應罐(41)之間采用密封圈(45)密封。4.根據(jù)權利要求1所述的在線細胞顯微觀察儀,其特征在于,所述移動裝置由驅動軸(51),連接桿(46),取樣拉桿(44),彈性元件(39)組成,其中裝有驅動軸(51)的連接桿(46)通過螺絲(47)與取樣拉桿(44)相連接,取樣拉桿(44)與彈性元件(39)在連接處(9a)通過焊接進行密封和連接,同時彈性元件(39)的另外一端面也在連接處(9b)通過焊接與觀察儀主體(43)相連接。5.根據(jù)權利要求1所述的在線細胞顯微觀察儀,其特征在于,所述移動裝置由驅動軸(51),電機(48),取樣筒(49)組成,其中取樣筒(49)連接在觀察儀主體(43)的前端,取樣筒(49)后端置有電機(48),電機(48)輸出軸連接驅動軸(51)。6..根據(jù)權利要求1所述的在線細胞顯微觀察儀,其特征在于,所述取樣塊(21)由三個不同直徑圓柱體構成,且由不銹鋼或藍寶石材料制成。7..根據(jù)權利要求1所述的在線細胞顯微觀察儀,其特征在于,所述CCD或面陣圖像傳感器(30)經(jīng)光電轉換將數(shù)字信號傳輸給圖像采集處理單元(31),集處理單元(31)將處理結果送入計算機(32)分析,顯示或存儲。專利摘要本實用新型涉及一種用于生化反應器的在線細胞顯微觀察儀,包括觀察儀主體,物鏡,觀察入射窗,取樣裝置,外部光源系統(tǒng);其特點是外部光源系統(tǒng)與物鏡之間設置反射棱鏡,物鏡后面,觀察入射窗前設有反射鏡,反射棱鏡前面放置環(huán)形光闌片,反射棱鏡側面上部置有CCD或面陣圖像傳感器;取樣裝置由取樣塊,彈性元件,移動裝置構成,其中,取樣塊與移動裝置的驅動軸之間連接彈性元件,取樣塊前端面與觀察入射窗之間的間隙構成采樣池。本實用新型的外部光源系統(tǒng)通過替換不同濾色片、能很方便地更換波長;同時暗視場照明能提高觀察儀對于細胞所成圖像的對比度以及分辨率;并且具有結構簡單,使用方便,制造成本低等特點。文檔編號G02B21/36GK201047885SQ20072007120公開日2008年4月16日申請日期2007年6月18日優(yōu)先權日2007年6月18日發(fā)明者健劉,恂張,明張,張嗣良,張岳芳,王紹娟,袁旭軍,賀莉清,郭美錦,馬文峰申請人:上海國強生化工程裝備有限公司;上??圃措娮涌萍加邢薰?