納米工程化表面上的dna純化和分析的制作方法

專利名稱：納米工程化表面上的dna純化和分析的制作方法
納米工程^^面上的DM純^^分析 贈資助本發明是^W SBIR Grant No. GM072178-01資助下做出的。絲對本發 明擁有一些權利。相關申請的交叉引用本申請要求于2005年1月26日奴的美國專利申請序列號11/043， 561的 ^5^，該申請徊匕引入作為參考。發明背景1. ;^發明的4支，域本發明總的來說涉及DNA的純化，尤其是納米工程化(nanoengineered) 表面在DNA的純/f^^分析中的用途。2. m^"M的描述便攜式醫學診斷或者生物防御應用需要簡4堪因組DNA的分離、處#測 量的技術。M組織中分離的核酸的品質對于可重復、精確和有益的基因分析 數梧非常關鍵。由于DNA分離產品的商業重要li增長，在這個領域已經進行了 大量工作。其中糾巨大狄的一種才JMC是利用微流(microfluidic)裝置ijUt行基 因分析。可利用許多微陣列檢定形式，它們均有允許同時檢測來自單個樣品的 大量基因把際的能力，利用發熒光的小溝結^^" (MBs)已經開發了用于測量雙鏈DM (dsDNA) M的靈敏的';^a^r定法。當不存在DNA時，所述^可以⑩夜中自由旋轉， 辦于其的低熒光背景非常重要。當結合dsDNA時，所述^^Mfe5Mo性小溝200680009799.4說明書第2/21頁中呈現剛性平面構象，這種構象具有增強的熒光。通過小心地改造熒光MBs與 表面的附著，當DM轉移穿過微^^置時可以測量^:量。發明簡述因此，本發明的一個目的是提^"種微;綠置，所錄置同時分離基因組 DNA、測量純化的DNA的量和分g沐定濃度的標準化DNA溶液用于下游的分沖斤。本發明的另一個目的是提fr"種用于DNA分離和制備的微^^置，其中所 ii^置的^M^復雜性,錄小化。本發明的另一個目的是提供一種可以同時從生物液體中捕獲雙鏈DNA (dsDM)和測量固定4t DNA的量的微5;i^置。本發明的另一個目的是合成具有親電子或親核連接基團的發熒光的小溝結 合劑(MBs)，并在dsDNA存在時證實增強的熒光。根椐下面的描#附圖，本發明的這些以及，目的將更容易衝醉。附圖簡述

圖1描繪了與^^成的12-mer DNA雙^^體結合的Hoechst 33258的結構； 圖2顯示了為了附著至DNA探針上的連接體而開發的H33258的^性勤以 物的結構；圖3描繪了微;;^^置內流動的兩種液體的相互作用；圖4描繪了/W^^參飾的表面,W"有附著的發熒光的小溝結^剛MBs);圖5顯示了具有^性基團的^tMBs的合成；圖7顯示了適合于4^發明中使用的銜j(^置的可能的室設計；圖8是適合于4^發明中賴的微流卡(microfluidic card)的前視圖；圖9A^^^危卡的^^h^解圖，具有M的層；圖10 A-E "-^描繪了圖9的卡片的前視圖，顯示了在4^J時卡的爭降的順序；圖11顯示了具有附著的己^^接沐的熒光Hoechst染料的合成；圖12 B示在360 nm激發的BB-肌^"對BB-0H的熒光的圖表。圖13^:示四種不同;^曱亞胺表面在460 nm的熒光的圖表；和圖14A^示結合的DNA的量對于提供給玻璃和塑料蓋片的DNA的量的圖表優選實施方案的描述利用發熒光的小溝結合(MB)試劑(Hoechst 33258 )已經開發了用于測量 dsDM敝的靈敏的'W目檢定法。當;r^^在DNA時，所述襯可以在溶液中自由 旋轉；i^t于其的低熒光背景非常重要。當結合dsDNA時，所述^^^Tu7jc 性小溝中呈現剛性平面構象，這種構象具有增強的熒光。通過小心地改造熒光 MBs與表面的附著，當DNA #^多穿過微^^置時可以測量^:量。用綴^^匕學 (conjugation chemistry)方法在大分子結構Ji^熒光染料，以^^:大^^J 象的柔韋刃'l"i^^i^fe DM。Hoechst 33258 M具有多環結構，可以形成新月形結構，這與B-型DNA 的小溝另_等螺放的(isohelical)。圖1顯示了與合成的12ier DM雙鏈體結 合的Hoechst 33258的溶液腿結構(PDB結構ID號1QSX)。該新月形襯 的酚^A^于在綴合基團(conjugate group)中附著的方便附著點。在7jc溶 液中的結構是有柔軔性的，而JLA相對無熒光的。用356咖ife^U^合的分 子在492 nm處產生孩調的熒光。但是，當結合到dsDNA時，苯#^米喳環定形為 平面構象，it^-^t擴展的芳香族體系，其在458 nm發出強的熒光。所述分. 子在小溝中與水襯隔離，iii^一步增強熒光。H33258的這些熒光頓導致開 發出用于測量dsDNA ^JL和作為一種進^^胞計數的簡iM^定法的靈^^定法，》M華力i^靠咪"^i^的錯合的聯^ft用來固、定敝的。H33258的強的小 溝結^ii可食y^^t直粉離dsDNA的機制'MBs與富含腺嘌呤/胸腺<^ (A/T)的序列的小溝結合是to的，并且DNA結^f數可以J:b^小^^量試 劑例如^A劑;UL個數量l化、性熒光試劑也已經被廣泛研究。這種類型的 DM結合劑的一^K'子A^化乙錠，它通常在^生物學中W1于在電泳后染色 m中的DNA。已將甲4t^料附著于s印harose柳粒以提供DNA分離產品。^性染料例如曱錠并不與小溝結合刑類型的染^H樣地緊密結合。使用陽離子精胺連4^陣曱錠附著于sepharose顆粒，這將毫無疑問地改善DNA結合。jM^卜， 乙*結合dsDM時只顯示量子產量的少量增加。甲4t-s印harose顆粒的熒光 '歸沒有被描述。
花青類型的嵌入性染料比乙錠嵌入劑的發熒光性質強得多。噻唑橙 (thiazoleorange， T0)是一種非對稱的花青染料，其由兩個XJOf、芳香族環結 構纟M。當用509 nmife^L時，這兩個結構可以艦自由旋轉，并且幾乎沒有 熒光。但是，當dsDNA存在時，T0^A^^JJft之間，并迫使環4系變成平面 的。形成一種擴展的芳香絲系，其在533 nm狄出強的熒光。T0不像小溝結 合劑那樣緊密員合dsDNA，但是兩個T0 ^可以連接在^^從而形成強結合 小狄^A劑(bis-intercalator)。
基于花青類型染料的熒光'fM，已經開發出靈敏的DNA結合檢定法。當RNA 存在時，T0疆示高達3000倍的熒規強。這個f錄是有利的，可以應用于 RNA分離裝置。
已將這些熒光^^拴系于，苷酸以產生DNA探針，其可以在雜交^r定 法中監控dsDNA的形成。已經開發出H33258的A^^i性衍生物用于附著至DM 探針。圖2顯示了為了附著至DNA探針上的連接沐而開發的H33258的幾種^JL 性勤以物。例如，將H33258的溴乙酰基勒以物綴合到經統基修飾的寡核苷酸。 基于花青類型染料的熒光4 ，已經開發出靈敏的DNA結合檢定法。當RNA存 在時，T0還顯示高達3000倍的熒光增強。這個M是有利的，可以應用于RM 分離裝置。
已^^些^Ut^拴系于寡核苷酸以產生DNA探針，其可以在雜交檢定 法中監控dsDNA的形成。已經開發出H33258的幾種M性衍生物用于附著至DNA 探針。圖2顯示了為了附著至DNA探針上的連接體而開發的H33258的幾種A^ 性勤以物。與互補單鏈DNA把的雜交導致結合親和力增加，以;5L^結合時的熒 辦強高達23倍。結^:率(DNA)^M^1)的提高^列特異的。當A/T區 域位于S沐附著點附近時，TmJ^^加，ii4明H33258的強DM結M應。 類似的合成化學可用于制備這些熒光染料的活性勒以物，并將它們綴合到旨 #^的玻璃或者塑料表面上。
在添加DNA互#,，寡核苷酸的花青染料綴，也導致預期的由雜^ 發的熒光。熒光隨形成的雙^^的^序列而變。T0與DNA雙鏈體的結合已知是序列特異的。花青染料的NHS酯類似物與經制#飾的寡核苷^應從而產生 在熒光"實時，，PCR檢定法中使用的DNA探針。用所i^^核苷酸綴^^L^到高 達20倍的熒光增強。因為染料的序列特異l"錄合，MGB和花青類型熒，fe苷 酸綴合物的DNA探針應用4^I^H匕。dsDNA結合的測量不應該受結合f立點的序列 特異性的影響，因為焦點是DM基因片段的異質辦。
在高濃度離液序列高的鹽溶液存在下，核tof玻璃表面具有非常高的親和 力，J脈商購可得大量基于玻璃的DNA分離產品。這些產刷M簡單，但是需 要大量移液步驟，Eppendorf管或者96孑U1，以及4M諸如^t振蕩器和離心 機的設備。,在開放實驗室中進行，并且需要相對較大的樣JM^P、以i^溶 液蒸發的問題。DNA^l通常用UV-vis分; yeJL計來測量，并且可重復的結果 需要良好的技術。盡管如此，已經證明了玻璃表面用于從^t生物樣品中分離 DM的用途。
DNA與玻璃的結*it^用是^J京脂糖m中分離經電泳純化的DNA。平坦 的 5玻璃或者硼> ^玻璃表面的DM結合能力是相當的每800平方毫米 大約300 ng DNA。 800平方毫米大fel玻璃顯微鏡M片和20 x 20咖蓋玻片 之間形成的室的表面積。大多^觀流體(腿crofluidic) DNA分離應用使用來 自管或纖維的粉末4^C璃，二氧^^:，或者硅藻的硅石骨架，因為這些支持物 具有比平Jt^面大得多的表面積。微J5^置可以^ ]更^^^NS^璃表面， 因為絲的^P、更小(沒有蒸發問題)，而錄于PCR的基因組分析所需的捕 獲的DNA量非常少。可以提供M組成、尺寸^Wil的平iS^璃，并且如果 需要^L的表面積還可以進一步進行刻蝕。
使用在一個末端攜帶熒^艮告基團且在另一個末端攜帶熒iW滅分子的 DNA寡核苷酸探針，可以在PCR期間完成mRNA或者DNA的;^目分析。在~~#形 式(TaqMan檢定法)中，探針^L的單^fe苷酸，其通過Taq聚M的y核 齡H^酶活'fciii行消化。另一種熒光形式(^"信#^定法)利用發夾狀的寡 核苷酸，其在莖上具有相鄰的熒光染^ff滅襯，^L4在互補DNA鏈時，發 夾打開從而產生熒光信號.這些焚光形式中的"3^t均可用于監控PCR的i^， 因為"f^輪成功的擴增循環均導致ltit信號的增強，這兩種基于PCR的形狄
于基于微流的平臺均是理想的，因為檢定';m^的下限是由可用設備的辦問
題(小體積的變干)和^f率決定的， 一種常用的(高通量)熱循環熒光計是
8ABI7900HT,其可以分析384孑Ul,對于每個在PCR期間測量的基因每孔10 uL。 4錄的是每^^10 pg-10 ng基因組DNA,這^l^負于PCR體系的效率和DNA的品質。
玻璃顯微鏡to片是DNA孩0車列的常用M。 J脈可利用許多微陣列檢定 形式，它們均有允許同時銜則來自單個樣品的大量基因革W示的能力。合成絲 普酸的陣列已經直接^y^L璃支持物合成，或者通*修飾的合成探針的端點附 著來制備。經^#飾的玻璃是端點附著常用的基材。y絲丙絲烷(GAPS)是 一種可用于官能^J^璃表面的揮發性試劑，并JL4在數家GAPS歉皮片的制造商。 GAPS ^U皮片的妾娥涂覆的表面可以利用雙功能連脅來活化，以產生與^^ 飾的tt苷酸溶a^應的親電子表面。這種綴^(匕學的變化形式可以用來附著 熒光DNA結合染料。
絲苷酸附著的密狄雜交性能中的一個重要因素。通iiAM^璃直M成 可以得到高密度的M苷酸，但是已皿示，當捕獲探針過于緊密地充填時， 經才斜己的DNA耙標的雜交實際上降低了。當玻璃附著點和 苷酸序列之間的 連脅^4長時，雜交性能揭到改善。狄高達80個原子的聚乙二醇(PEG) 連^W乃可改絲交信號。由此可見，為了樹^^斜目性能，固體支持物和DM ^^4十之間的^i^^的重要It。
DNA探4憤過長聚Z^醇連糾附著到玻璃表面改善了性能。商購可得具有 ^4t官能團的:^f"PEG連接沐(Quanta, Biodesign， Powell, Ohio),它們
主要用于附著至蛋白藥物以改善藥物動力學'M:。，的;^^結構已經用于
改善固定化的DNA #_針的性能。例如，已將經生物素修飾的^^信標附著至用 抗生物素蛋白^的玻璃支持物，以用于序列特異性的DNA^^斤。利用M物 素蛋白或者鏈f^t物素蛋白作為用于將DNA遠離玻璃表面M的間隔物對于 探針的功能可^i重要的。另一^L考慮的大W連M類型是樹狀聚合體， 這些商購可得的(Aldrich Chemical Co， Milwaukee, WI) ^SUl靠合成的 "生成"^JtJJ^m酯基團的交替層中合成的'這些分子的三維結構:lfolt確 控制，并且*頓非常清楚。富含胺的樹機構勤以于組蛋白，組蛋白對于細胞 內的DNA^非常重要，它們已經械功朝于將DNA序列轉^A細胞中，以 用于潛在的基因治療應用。4!^樹^^^^會為將固定的MB襯呈遞到富含 DM的溜廉中提供了優異的支架。包^t^jyi^熒光DM檢測分子的生物傳感膜(Sytox 13， Molecular Probes)用于測量塑料表面上活細菌的7K平。這 些材料不包^i接體、熒光染料或塑料表面之間的共^^接，但是通iii^u7K作 用力結^Mt^。
DNA微陣列技^^供小型化的檢定法，這得益于封閉的微艦理。例如，一
環聚^4^A^ (POO擴增。^^-;^芯片中從全iT已經證明了基因組 DM耙標的PCR擴增，所迷基因組DM革e標來自在流動室的堰(weirs)后面捕 獲的白細胞。開發了利用DNA芯片陣列的中等密度陣列方法，用于PCR產物的 診斷測序，以斷^^U的^^復雜性。在PCR擴增后一小時內，^f見覺上 ^i則到抗生素抗性的臨床分離物。另一種應用是在傳統中醫學中^JfJ的有毒藥 用植物的基于DNA序列的鑒定。在2001年，Petrik綜述了原來開^于基因組 計劃的微陣列裝置在就丙型肝炎病毒A^集篩選捐獻的血中的應用。通過在一 個孩乏芯片JiliL^雙Peltier熱電元件與電泳分^UH^r測，獲得了用于PCR分析 的絲系統。利用DNA狄注射方案使得能夠在少至十個熱循環內檢測PCR產 物。開發出一種微流藥筒(cartridge)，以通iiH聲處理，添加PCR試劑到裂 解的孢子中，并將^^加AJ'jPCR管中，來制備用于PCR分析的孢子。孢子 DM的處S^測在20分鐘內完成。開發了一種集成的微^^置，它整合了單 個DNA^^分子的隨機PCR擴增，然后是產物的毛細管電泳分析。來自重復PCR 分析的標準^^面積的直方圖顯示了反應器中由于單個有活力的^L^拷貝 而it^的量化。開發了一種用于檢測通it^于核酸序列的擴增(NASBA)而擴增 出的RM的^J充芯片。；^測了小球Et^子蟲(Cr/p^w;wWW咖/w/r咖)的樣 品，并且其可與對照明顯地區分而無需從NASBA混合物中分離擴增的RNA。已經 開發了一種自動化的微流系統，用于直接膽細胞中進糊升DNA分析，所述 微流系統包括DNA分析所需的4^P步驟注射，"給，脅，PCR，分離，M 和檢測。確立了使該系IJbii—步小型化的可能性。已經開發出一種基于絲的 #^危芯片的系統，用于重組的、腺病毒的基因療法產品的品質控制測試。病毒 身分測鄉'!定DM片段的大小和數量，并_^斤需#^的量比瓊脂糖^^法少 IOO倍,
希望開發H)NA分離裝置，它能夠處理小^^F、的Ajk (<20yL)，并為 基因分^^供標雄化的基因組DNA #^口。可以開發出一種單次^J^的微流卡，它可以被插入到由微型泵驅動的設備中，所述設備控制流體j;jfUt各種DNA處理 室。經固定和定量的0貼或者被#^^溶液中用于立即使用，或者進行儲存以 用于將來的分析。在所述裝置中通過熒光測量固定的DNA的捕獲^改的能力 允許對這種新型DNA處理系統進^it程控制。該技術可以^JJ^一種獨立的產 品以在分子生物學研究中"fi4使用，或者可以^^到更復雜的裝置中以簡化用 于生物醫學應用的基因分析。將用所開發的單孔裝置分離的、經純化和變性的 DNA的標準^i^液，經由微^I道分配到^t微:jUl形式中，以用于通過實時 PCR或者DNA微陣列進行基因分析。圖3 ;M來顯示開發小型化生物醫學裝置所 需的凝A;1物理學，所ii^置可以用于從細旨離基因組DNA。
圖3顯示了全血和另 一種在微^^置的通道內流動的液體之間的相互作用， 在所it^置內預計從全血中分離出DNA。預計用于開發小型化生物醫學裝置的微 Xjl物理學可用于從細胞中分離基因組DNA。 #參考圖3，將包含有在全血54 中的小顆粒52的第一液流50和包含有在清液(clear solution) 60中的小顆 粒58的第二液流56引入公共通道62中，在那里它們形成薄片狀流^T絲面 (laminar fluid diffusion interface, LFDI) 。 ^i它們的擴散系數，顆粒 52、 58開始擴絲過LFDI，較小的^^立58擴散得更決。所錄置可用于從全 血中提取小顆粒，或者用于以可預測的連續途徑#^劑？ I入全血中。
來自Hoechst染料研究的初步X!lS^該應用相關。當^泉變干時，7械 者緩沖溶液中的一小滴Hoechst染料顯示出增強的熒光。這涉及熒光染料環嫂 的"7K^^量"和對熒光背景的影響。為了低背景值，熒光染料必須被^f地 水合，并且強調親水表面涂層的重要性。
開始的焦點是用于dsDNA的結合和測量的熒光固體支持物的合成和測試。 首先利用已知方法的變化形式來制備具有胺^L性官能團的^MBs。這些試劑 將被固定到^f參飾的玻璃或者塑料上，并JL^用DNA處理之前^4l后測量熒 光。將就它們測量I^W DM狄的能力來^h^t連脅結構。絲所附著
顯示了待研究的典型表面的示意圖。變量例如固^支持物(玻璃或者塑料)， 連^^化學和封端基團將被研究'熒光MBs的化學計量(附著密度)將被檢查
以確定用于DNA測量的具有最佳動態范圍的表面。還將檢查DM結合能力。 SMt參考圖4，絮》置100具有^#^的表面102，該表面具有附著的小溝結M'J (MB) 104。 ^^I的胺可以5f皮保留，以提供陽離子表面。裝置110顯示， ^AJi的胺可以通^^白^f^M^行封端以提供陰離子表面112。裝置120顯 示，通過下列過程可以將MBs 104延伸到溶液中首先將包^^合胺的連沖沐 (li說狀樹狀聚^;, ^^4-PEG,多聚-L-賴氨酸)附著到表面122,并進 一步與MB衍生物A^。與所需熒a面的M同時，考慮了用于DNA分離的微;;綠置。將獲得各 種大小的DNA樣品(Sigma),并且捕^tWiit^用相同的熒; !^^在固 相和斜目中進行熒光測量來確定。將監控DM從裝置中的#^以確保DNA 和回*1議良好的。對于DM的捕獲^^的M將在熒it^m器上進行測量。 在完成DNA結合能力和洗滌實驗后，可以構建微^^置。在開發出焚光支持物 后，可以將裝置的DNA捕獲和測量功^ii^亍整合。因為可以得到^Nm^飾的固體支持物，所以用活性親電子官能團例如 硪乙^L^團、fv^ta^團、NHS酉旨基團以及^^gjl性部分可以制4^t生 物。5 ^有兩種合成方法，它們已經顯示給出具有所需的親電子或者親核"處 理"的H33258類似物，其可以與固體支持物上的互補官能團反應。最直接的途 徑來自于H33258的完全敘i的雜環系統。PEG的溴^^衍生物已^^示*性 條件下與H33258^,從而以高產^^到芳J^LH33258可從Aldrich Chemical Co.得到(500 mg = $220.80)。容易地合成叔丁IU^^保護的己胺連接體，并 且已制備了甲^^L衍生物。溴f^f生物應當容易接近并與H33258^L，如 圖5所示。郝參考圖5，用^J-化Boc衍生物處理Hoechst 33258。親核的氨 ^ii^i^團(R-H)可以^L接固定到親電子的表面上。可以將J^ 狄親電子基團例如ILWfea衍生物，如圖5所示，以用于固定^Jij親核的表 面上'通itt稀,酸進行處S^l^去Boc，然后用堿中和，從而得到伯己胺基 團(R=H)。親核的伯胺可以選棒)^與親電^劑，良中反應，只有很少的 由^^it^^l竟爭，l^i^i。這種化學應當可應用于固體表面的修飾，所ii4 面用親電子的官能團^ ^i^， H33258己胺勤以物可以與留有一個親電子 錄的雙功^^4^MJi。 ILWta具有類^^功^^糾的'M，以將包含 胺的官能團連接在；，在兩個^11*^接后，剩余的第三個氯基團是不M 的。這種綴^ft學可以在以后用于合成經^^的表面，另一種M方案是將陽 離子的H33258結合到陰離子的表面，如由m^團所形成的。這些表面可以是適當i^急定的和有柔韋刃性的，以允許所需的與DNA的熒it^。像大多數固相化學一樣，可以容易地iiJ'J試劑的大大過量(相對于可用的 表面基團)，并iL^易地洗滌所^面以除去過量試劑。因此，〗^m率可以 非常的高(可以實現緊密充填)。玻璃和塑料M的表面積、固定^f匕學、連 糾類型和"可連接的"熒ib^^ (熒光染料)的密度將得到最佳化。商購 可得的樹^€*、聚-L-賴氨酸和聚乙二醇^r^應當將熒光染料在溶液中定位 于遠離表面并朝向dsDNA。目標;l^大化固定的熒光染料的構象柔韋刃性(以最小 化背景)，并JIJ:大化對dsDNA的可接近性(以最大化DNA結#動力學)。 ^f多飾的玻璃和塑料支持物可以作為1 x 3英寸的顯孩史4^U波片而獲得， 并且是用于DM微陣列的常用基材。大多數載玻片由鈉鉀玻璃(Erie Scientific, Portsmouth, NH)制成，并用(y) ^J^丙^J fc^團進^fl^從 而得到均一密度的伯胺。GAPS艦片還可以以^tML璃類型(Corning Glass) 獲得，或者具有增加的Wil(Erie)。經絲丙基&f皮的塑^i^片也是可 用的(Nunc，丹麥)。用胺官能化的斜旨薄膜(Mylar)也可用作片(Diagnostic Laminations Engineering, 0ceanside, CA，或者Adhesive Research, Inc., Glen Rock， PA)，并JUM^被檢查。這些^#將直接用于親電子MB類似物的 固定化，或者將用雙功能連M來"活化"它們以得到親電子的表面。圖6顯 示了一種可能的綴合化學系統。應當檢查^M;活化以及其他的脂質雙功能 連楱沐(Pierce Chemical Co.)。載玻片可以在無水有;t U^劑中用i^7j^生親電子試劑例如H^i^^t活化，以狄試劑的7jc解，并達到較高密度的親電子 4飾。因此，可以預期PEG胺(或者她多胺)的高載量。首先嘗^i行熒光 MB親電子試劑(例如，圖5的H^酯)的直^f繊，應當扇J^iit種(無連接 體)熒;^面并將其用作"Mt不同表面的熒光研究的對照。塑^皮片要求更緩和的水性活^tt^以及碳二亞^W^者^)活化的 酯連接水。在每個;W包含NHS酯的PEG大^^是商購可得的。可以使用tK^物。親水ll的第3.5和4.5代PAMAM樹狀聚，是特別有吸引力的，因為這些 ^"分別^T 64和128個表面m酯。這些W不顯示密集的"星ifelt狀"群 集，所述"IiW狀"群集影響更大的樹狀聚合物。在(用乙酸酐)封閉表面 上的殘留^后，可以再次用EDC活^i^^Ui的m酯，并將^f^B'J包含己胺的MB，如圖5中所示。在徹底洗滌以后，在板讀數器JJt過PiUt^測量共 麟合到M片上的MB的量。Hoechst 33258生色團在356 nm處p絲，并且 Bio-Tek板讀數器可以用合適的過濾器進^i殳定以直接在顯微鏡歉皮片上測量 這個波長。載玻片可以被干燥，并就以后的^^]進^W。應該研究表面上熒 光染料單層的穩定性(儲藏絲)。大W連4^結構將作為支架以在溶液中將熒光MB傳感器展示給dsDNA。 應該在dsDNA存在或者;f^在的糾下檢查表面結構的焚光'性質。重要的是， 當就熒光DNA結合f錄進frif估時，表面#戰全水化，因為已知H33258衍生物 當^L璃上干燥時會發出熒光。在徵i^f嫂中到達平衡的時間更快，這可負^: 有利的。首先通過將"灌注室(perfusion chamber)"附著到目#^片的表 面來檢測^t連M結構的熒光背景。這些是被附著到載玻片上的簡##^襯 墊，然后用具有進口和出口的蓋玻片M。 ^iW室以后，移入目標分析物 ，并密封所述口。將使用200jaL的室容量。樹不同大小的DNA樣品獲自夕Mp來源(Sigma Chemical Co，)。基因組DNA 可能需要進行剪切，以狄當其在微-^^置所4^1的溫和流動糾下穿過孩腿 道時K^^。通過將溶液數次穿過18號針可以容易地實現基因組DM的剪切。 還應該考;fl^種不同長度(40 kb， 4000 bp， 400 bp，和40 bp)的匿標準。 首先，將中'嫂沖液添加到目標熒ilej^上，并4^讀數器('^1=356 nm)上 測量狄背景(在458 nm和492 nm)。當MB涂層航全水化時，應該得到穩 定的背景測量值。然后，將各種不同M的dsDNA(通過A柳測量，50 ug/mL dsDNA =1 0D#^i)導A^注室中，J^^^每次^t之間完全沖'^^斤述室，當DNA ^JL增加時，458 nm熒光(dsDM結合的特征)應該以線性方式增強。MB的密 度可能與測量值的動態范圍有關，it^該被考慮。如早;^斤述，MB)^真的密度 是由糾的A說決定的。微J5i^置將處理高yt^的DNA驗，因此熒光的DNA 狄"閾值"狄目標。如果DNA ^H低于狄閾值，那么分離禾J^鄉續。 同糾，如果lt^號高于閾值，則已經^Jl]所需的最低DM狄。要注意的 是，利用熒it^璃支持物的DNA糊，淋在生理鹽艦下進^^查，這種所趙 理鹽M下玻璃與DNA的結合應該最小，與^tit^面的進展同時，禍使用少堂^MM^查對于dsDM的有效固定和 財璃Ji^UM"斤需的沐通過數學建^^佳化麵A #^少錄沖液中。在將DNA結合JJ^^中的處理步驟依靠生物樣品的'M，并JL^方法 中存擬艮多變化形式。對于富含DNA的來源和名&顆粒設計出了下述步驟。首 先通it^加2M石M^ (GuSCN)緩沖質溶液(pH 6. 4)來禱細胞。這種離 '絲列高的鹽^iM^因組DNA中除去組蛋白，滅活核,，并且驅動DNA-^^復#形成。';^走振蕩和離心固定的DM-敘(這可能剪切長的DNA鏈)， 并用更多GuSCN緩沖液沖走細胞碎片。最終，干燥DNA-硅石，和用^Jl緩沖液 '皿純化的DNA,并通過260咖處的吸ittJMi行測量。盡管該過程是簡單的， ^Sii些步驟要,Wf工作(piecework )和AXM，以確^^5顆津雖渦旋振 蕩后是均質的。微流形^當^/斤iiit程i^K線化，如下面表A中所述表A1. 裂解細胞，除去組蛋白，并用高GuSCN將DNA結合^C璃2. 用高GuSCN洗、絲合^L璃上的DNA3. 用生理鹽水^^璃上#^合的0^4. 在具有熒iWt的室內讀W^的DM的M5. 從熒iti^l"Ji^tDNA,并進4預i制以用于基于PCR的檢定法為^h玻璃糾(顯微鏡組片)的DNA結合能力，只有步驟2、 3、 4和5 將被檢查。處理步驟可以在灌注室中用玻璃蓋玻片進行。^Mt大小和M的DNA 與高GuSCN的混合對于DNA結合;U^鍵性的。目標;i接i^^斤公開的在栽玻片和 蓋玻片的玻璃表面f司300 ng的DNA結合能力。絲合以后，從室中排出高 GuSCN,并用生理鹽水充滿。徊ij達平衡以后，結合的DNA應該游離^iMEi^中， 并從室中收集。利用7iHf的使用H33258的熒光方法，^^測量^的DNA 的等^iW。因為DM^if用于基于PCR的檢定法，所以洗m沖^t將與該用 途L還將檢查狄MB糾的DNA結合能力.相同的灌注室系^P柳于檢查各 種不同的DM狄，利用在最終裝置中彩'J的^t緩沖^M^查結合能力。特 別感M的是dsDNA從經MB ^t的JjN"上的釋放條降。結合的DM雙^^可能 需要變性才肯^#_11#^，就制狄甲錠DNA捕絲的情況一樣。^til種情 況下，稀釋的NaOH ■，并JL^將變性的DNA ^用乙酸銨中和,4^，可以采用加熱或者非常^^度的鹽來變性DNA。產生的結^#^文數據將用作多物理學(multiphysics)模型的基礎，所 述多物理學模型將指引微-綠置的設計。這個模型將計算表面結合，擴散，平 流，和基于原型幾何學、溶劑和溶質性質的所得到的鹽和DNA的局部濃度，以 ^Jt:i^斤產生的數據進行表怔的結合行為。具有最佳預期表見的裝置設計將變 成所需的原型i殳計。將綜合性能與模型的預測進行》bi艮，it將^^供了關于裝置 內部的不^it過實驗獲得的局部物理學的認識。，于^ft不同表面的'M,數種設計方案是可行的，如圖7中所示。例 如，熒光MB支持物150可以ii5'J雙重目的，即用于DNA結^H^以于^f^]曱錠 顆粒的測量。玻璃表面可能具有更高的結合能力，并且單室設計152可以將玻 璃捕a面與用于DNA測量的熒光MB表面相組合。DNA結#測量可能需要不 同的條件，利用雙室的裝置154將;U:^i殳計。初步計算表明，如圖8所示的 單室設計能夠捕獲和測量84 ng DNA，甚至在用光滑的玻璃表面(粗糙的玻璃表 面可以結合絲更多的DM)時，在所述單室設計中DNA結合^L璃表面上，和 MB測量擬目對的塑料表面上。圖8顯示了 62 x 40x 3.55 nm的棉b綠置160,其包括5 m 1的DNA結合室 162、 750 u 1的廢^Ht道164和用于在該過禾1^束時接納釋故的DNA的25 ji 1 的通道166。通鄉液管將液絲^f出主射口 168。擁于狄料排放口 168 狄出口 170為開放的，液體前iiJA頓道164或;^^tDNA通道166。通過 移液管可以^#^的DNA從卡160中取出，從產物排放口 172或者出口 170中。 圖9顯示了組^^置的全部5個疊壓層的部件分解圖。層180由0.125咖的乙 烯Ji且成；層182是0. 025咖的粘合層；層184是3.175咖的PMMA;層186 是0.100咖的ACA;層188是0.125咖的乙烯基和層190由適合層180的 Pyrex蓋玻片插/^物纟JL^,每層^ 3個對準孔192用預準用途。層182和 186包^"jl^^^，其以防漏方式^P所ii^fj^W^^在^^表A的處理步^t^齡顯示在圖10 A-E中。圖10A顯示了輛it^液管注 射DM 202 ^的微^^置160,所述DNA》^^ 202在包^J^的^^細胞的高鹽GuSCN中。在用高鹽GrnSCN 203 (沖ifetit^^dtii 162 ^E^Nt道 164)進^^t滌(圖10B)后，室162用生理鹽水205沖洗(圖10C) ， vMj^璃 190Ji^的DNA通it^205而附著J^Ut的MBs，從而可以讀出dsDNA^1209(圖10D)。最終，絲離子水(DI)移絲欲^t道162以使DNA變性，并 將其運輸到釋改DM通道166以侵最^ge^室162純化的，如圖10E中所示。 在逸泉上，可以開放產物排放口 132 (參見圖8)以回收DNA。絮Jj!A夠小的 以容易itkit合96孑U1讀數器，^H皮設計成使6孔中心位置在結^if道內以<級 ##確的0狀^1的多重讀數。在該過禾錄束時，固定的熒光MB基團(#大 fei非熒光的)條留在固體支持物上，并且與裝置的其糾分丟棄于實驗室 廢棄物中。實施例進^^接有所附己胺的熒光Hoechst染料的合成。SU^^考圖11,顯示了 所述合成。除非另作說明，試劑是從Sigma-Adrich獲得的。在嚴密封口的瓶子 中獲得無水溶劑。從5x7 cm的涂覆有^的鋁片(Merck)上切出7 cm長的 TLC條，，常利用手持長波紫夕卜燈照射通過熒i^Ui行可^W匕。為進行TLC 檢定法，測量焚^ya^、相對于溶劑前沿的ii^多率(Rf)。用于熒光DNA結合檢 定法的Hoechst 33258標準品(X50pf亞胺，BB~0H)在由Sigma出售的DNA定 量試劑盒中獲得。所述試劑盒包含雙苯甲亞胺(10 mg/mL,在水中)，10x熒 it^r定法緩沖液(10 x FAB = 100mM Tris HC1， lOmM EDTA， 2M NaCl， pH 7. 4 )， 和DM標準品(經剪切的小牛胸腺DM， 1 mg/mL，在1 x FAB中)。這/H^劑 盒用作用于測量在圖12中所示的DNA熒光測量值的標準。經丁^J^ (Boc)保護的氨基己醇^材料購自Sigma，并根梧已經公 開的考聘(Keller和Haner， C力i瓜^"a， 76 (1993) 884-892 )將500 mg轉變為所需的J^t ^JKJiiiita色鐠法來分離產物，從而得到292 mg( 45% 產率)的產物，其為淺黃色液體。因為缺少:^對于^溴的TLC指示劑，因 而^他污染物中分離所需產物是困難的，M室中的染色以^^^l進行。 TLC (2:1己)^/乙酸乙酯)起始R0H的Rf - 0.17， RBr的Rf - 0.67,Hoechst 33258染料(4甲ilEJ疾，BB-OH)作為三鹽酸鹽(五水合物)購 自Aldrich,在干燥的15 mL圓細抝中，將9. 5 mg染料(15.2微摩爾)溶于 5 mL無水DMF中，36. 5 mg (265辦爾)的^^鉀和7.1 uL (8. 5 mg, 30. 4 微學爾)的經Boc旨的溴己胺。于53度將^^^磁力撒悴6小時，并在室溫下麟2天。當用長波UV燈(365 nm)照射時，TLC (10%甲醇，5% N-乙^ 異丙M， 85。/。二氯甲烷)顯示出藍色焚ito^、的;^^。 ^i臺BB"0H(Rf = 0) 轉變為所需產物(Rf = 0. 3)和一種較高遷移率的副產物(Rf = 0. 5)。將上 層DMF ig^倒出，并用另外的2 mL DMF洗涂殘余的碳酸鉀。通#真空中旋轉 蒸發來棘M的濕合物。將殘留物溶于2ml 5%曱醇、5% N-乙J^i異丙J^、 90%二氯曱烷中，并脅至用相同溶劑填充的2x 10 cm^^柱(230-400目)。 在除去50 mL前出液后，以~75 mL收集較高遷移率的副產物。可以利用手持uv燈ii^宗該色鐠法的i^。 ' ^中的曱醇百分比^1增加到10%,并jl;斤需產物被分離在90 mL溶劑中。在旋轉蒸發器上除去溶劑后得到10. 5 mg黃色固 體(理論產率-9.5mg)。通過TLC,該產物是一條主要的藍色熒光條帶，只有 痕量的務fe熒光污染物。將產物溶于2raL氖氯仿以用于以后的NMR。 1 mL CDCl3溶液按下艦做。將取自密封玻^^的三氟乙酸(1 mL)添加到溶于1 mL 0)013中的5 mL BB-NHBoc。將均質溶液保存于密封的1務線(dram)的玻璃小瓶中。脫保護后 進行TLC(35。/。甲醇，5。/。N-乙J^1異丙基胺，60%二氯甲烷)。^^BB-NHBoc (Rf = 0. 7 )轉變為較低遷移率的鹽(Rf = 0. 5 )，其被緩'lt^保護^^f^i 移率的產物(Rf = 0) 。 24小時后，通過下列過程將^Jl';^物的100 uL等分 ^#轉變為游離堿^t轉蒸發器上除去過量TFA，重新il^"在曱醇中，和添加 少量^^鉀。室溫下獲得的BB-NH2的游離堿形式顯示出單一主要熒ife^帶(Rf -0, 07)和痕量熒光污染物。如J^斤述將大量^:^^轉變為游離堿，并溶于3 mL 2:1/甲醇:氯仿中。產物不進##$ ( ~1.7 mg/mL)，頓過與絲絲曱 亞胺染料(BB"OH)的UV ^Jbl進行tb^M十算產率。在1 x FAB中的10 uM BB~0H #的UV-vis光鐠在340 nm處具有最大^Ut 度(0.18賴)。通it^ 995. 7 uL lxFAB中絲4.3 uL的所述一1.7 mg/mL '絲，制備了 BB~NH2^L最大^Jtl在342咖(0. 075賴)，BB"OH 和BB-NH2具有相同的消光系數，^i十算BB-NH2的UV-vis樣品的濃度(10 uM x (0. 075/0.18 )= 4. 4 uM),脅出所述~ 1. 7 mg/mL絲的實測^！0.7 mg/mL (0.98 mM)。 BB-NH2的產率(2.1 mg， 2. 9毫摩爾)相當于Mj^ BM)H賴 的38%產率。這種檢定法t誠重少量物質能夠更精確地測定產率一一鹽和不可見 的(通過NMR)三氟乙酸的存在^t;jrn^。在圖12中于220處顯示的BB-OH分子的熒光，在dsDNA存在時，從492 nm 處的微溺發射變^J'J 458 nm處的強發射。將Sigma的DNA定量試劑盒(基于 BB-OH)用于在Bio-Tek FL600熒; t^L讀數器上產生標準曲線。按照提供的方案， 在96孑Uf明條中進^^定法。0.1 ug/mL的BB-OH ^jy，作每種DNA標準 品(20-1000 ng/mL)的指示緩沖液。結^示在圖12中。圖12顯示，于222處所示的BB-NH2,了雙苯曱亞胺染料的焚光DNA枱r測 '1"錄。對于Hoechst 33258襯上的酚的#^沒有 UV-vis 入狄為~340 nm)，并且當在360 nm敝時(40 nm隙縫狄)經己^f辦的勤以物給 出強的熒光信號(在460 nm處檢測，40咖池慮器隙縫^1)。己胺連皿改 善DM特異性熒光，著可能是由于DNA與陽離子伯胺的親和力增強。BB-NH2分 子在平面4甲J^結構的每個^具有陽離子a，因jtMf其錨定在DNA的 小溝結合劑中。，DM親和力試劑(如暮該苷酸)已經證明可以作為溶液中 的熒娜十。考慮了M用于制備熒光MB表面的固定^fW匕學。dsDNA檢測表面的設計中 的3個主要成分是1. 指示劑。只有在dsDNA存在時發熒光；連M附著至具有很少熒光背景 的間隔物W。2. 糾。在目標光語區域中是透明的；容易地用間隔物/指示劑襯敝3. 間隔物。容易地綴合至熒i^旨示劑和^;允許熒光MB沒有位FJitk^ 近細A。圖12中描述的BB-0H和BB-NH2 DNA指示劑具有所需的DM特異性熒光性質， 并且具有可以充當附著點的獨特官能團。與親電子試劑例如活化的酯或者M Sb^的反應可以j l^分子中的多個位置處，這些副反應可以減少所需的DNA 特異ti熒光。"受損的"在新月形DNA結合區域中的結構可以^ DM特異性 熒光。兩種襯在一個^均有^^fe^i^基團，其可以^J^化，咪錄 團也為J^i^ll供了一個可f^i點。M不同的表面結構可以具有所需的DM 特異l!i^t，但是有利的是具有均質且可重現的表面結構以提^"^L的DNA特 異li熒光。BB-NH2連糾包^f白己胺基團，所錄團可以選棒ki^與親電子試 劑反應。如果需要，連接體臂可以用聚乙二醇連接體進行延伸。Quantum Biodesign出售一種經Boc保護的羧酸，M為BB ^it染料附著至固體支持物(糾)提供親水性更高并廁象更具^+刃性的連糾。當發JM用360 nm ^ 、射時于460 nm處出ltt^的背景熒光時，斷氐了 對塑料(mylar)基材的興趣。Scotch 帶(用于密封裝置上的口 ) hU^JW 絲的460 nm熒光。因此，實驗集中于玻璃狄。存在用于將絲苷酸固^ 1 x 3 cm絲片以得到DM樣0車列的豐富文#數種化學方法。纖&皮的栽 玻片(M丙l^)從Sigma獲得，用作用于納米工程^i^^^指示劑分 子的M。還檢查了另一種商購可得的MC片化學產品(AmershamBiosciences 的CodeUnk"。這些載玻片具有延伸的連M結構，所iii^M結構終止于活 化的酯(N-羥J^U白艦胺酯)基團。CodeLink M片宣稱"允許固定化以胺 ^iJf止的寡核苷酸并且無需長PEG連掩沐即可雜交"。因為BB-nh2熒it^^h可 以與該表面直^"反應，所以它首先3皮^r查。于pH 8.5，在3D-Link做片上的蓋玻片之下進行BB-冊2的固定化。購買 多孔雜交室(Grace Bio-Labs)，其允許同時檢^:Wc片高達16個的孔。在 M不同時間后，餘片用緩沖液漂、雄過量的BB-NH2，并利用相同的蓋玻片 方M端。在"if^熒光DNA結合歸前，用1 x FAB ii4t^后的漂洗。可能可以改善BB-nh2指示劑的性質。460 nm處的熒光背景^:鍵性質，如 ^^在高背景或者dsDNA ^fe&弱的問題，則所述'&資可以進行優化，然后利 用,^^皮的M片對^k^面i^4亍研究。將用CodeLinkM片ii^t研究的一 個關4t^量是在BB-nh2的固定化后利用^不同胺進行封端的效果。這將 ^g:液中在BB^^子、間隔物和dsDNA的界面處的襯性質。該界面的,M 可能影響熒光染料與dsDNA的結合以及DM與固體表面的結^力學,CodeLink ##用50慮乙醇^4行封端，并Jit^當給出中性的表面涂層，用<=^或者 ，多胺進行封端可以使^:片表面帶凈正電荷并且不可ie^合DNA 放)。另一方面，這些正電荷可以加it^^l率或者增加dsDNA的局部狄(更好的信號)。用賴"K^團對經活化的酯進行封端將得到兩性離子的^ILi^面，其對于DNA ;Ij&有吸附力的，因此"4帖t"表面。另一種將M酯基團引 J^面上的方法是在BB-朋2的固定化后簡單^MC解冊S酯.因為固定化在高pH(8. 5)下M，所以將^L片4il種緩沖液中^t夜可能如m^片表面 上的可得的NHS酯。這將在^片表面和DNA的界面處產生凈負電荷，并且可 能影響熒光信號和背景。這還可以衫^J作用于固定陽離子熒i^旨示劑的方法。CodeLink歉皮片從Amersham Biosciences獲得，并^照下列方案進行使用。 將單個做片用于檢查16種不同的固定^gjS。利用"96孑L形式"夾具系統 (ProPlate Grace Bio-labs)將16孑Ufc^^村墊附著到紅。在做片上形 成的方形孑L具有高達300 uL的體積，并且可以用透明的塑膠粘附密封薄膜(提 供的)M。活化的酯載玻片表面面朝上，并且為了定向目的，載玻片上的 "CodeLink"名稱被置于孔1和2的頂部。如前所述制備BB"0H (1 mg/ml，在 水中)和BB-NH2 (0. 7 mg/ml，在曱醇中)溶液。將包含3 mg/ml氨基乙醇(50 mM)的pH 8.5碳^iUL (0.1 M)用作封端絲。將BB-冊2溶液(100 uL)與300 uL曱醇^^，并用600 ml pH 8. 5>^Il 鈉(0.1\0進##釋。該溶液(70ug/mL)用于制備在pH8.5碳^lL鹽中的7 ug/mL BB-冊2和0. 7 ug/mL的溶液。所述i^液在長波UV ( 356 nm)燈下具有淺 綠色熒光。>^^斤述1 mg/mL溶液制備在pH 8. 5碳^HJlL中的10 ug/mL BB-OH 溶液。按下列方法處理CodeLink做片表面上的16個孔孑Ll-4， 0.7ug/mL BB—NH2;孑L5-8， 7 ug/mL BB—NH2;孑L9 —12， 70 ug/mL;孑L13-16， 10 ug/mL BB-0H。在注滿孑L^ (每孔0.2 ml) , Wc片^^)粘附j^M,并置于室溫 18小時(在暗處)。除去膜，從每個孔中除去包含BB的溶液，添加0.2 ml封端絲，并重新密封所述孔。7小時后，從每個孔中除械端絲，并^y^c片上除去襯墊以進#" 。將歉波片浸于在50ml離心管中的40ml 40%甲醇/60% ^i^鈉(0.1 M)之中20^^中，取出餘片，并浸于lxFAB中20^^中。取 出M片，并在熒i^l讀數器上^^斤。表征了 DNA指示,ll^面的靈^l^lt確度。通過使用前面所述的dsDNA標 #務似的板"^:^^形式il^r查對于包含BB-NH2的歉波片表面的評階。"Wh先前制備的經BB-NH2處理的；l^p經BB"0H處理的孔。在經處理的和 CodeLink做片頂部重新敘己16孑U^lb^t墊。通雄Kirawipe上輕叩iM^ 玻片表面上除去殘留的1 x FAB緩沖液(保留一些W離)，用于每種固定';^^ 的4個孔中^—個孔用下列遂i^之一再水化1000 ng/mL DNA， 200 ng/mLDNA， 1 x FAB，無液體，按限例就460咖處的熒iMM^^f鮮制備的溶液(底部m， 靈#^ = 115) 。 ^J"孑li^tW^，通湖去離子7Ki^豫^^除去DNA，并 重新測量。在dsDM存在下，所有經BB處理的^L片表面在460咖 示出熒，強，如圖13中所示。在230處所示的與最高濃度的BB-冊2 (70ug/mL)的固定 4t^應顯示最強的熒光信號。但是，該高載量水平^til成高熒光背景(無DNA 時具有> 50，000計數)。在232處所示的7 ug/raL固定^^I給出最佳性能。 在低至200 ng/mL DNA觀篇剖劑量應答。在234處所示的固定^^應中最^^K 平的BB-肌hMM^ 200 ng/mL DNA給出劑量應答。雖然信號較低，但是即使 在236處所示的BB"OH指示劑也隨著DM濃度增加而給出所需的460 nm焚光的 增強。在用7踏DM從孔中洗滌出后，孑l^殳有顯示460nm處的DNA特務性熒光 的^^T跡象。具有相同水平的固定的熒i^料的所有孑U^有翻以的熒光。在圖13的數據中在溶液中沒有熒光染^——DNA結合檢定法利用固定的 BB-肌或者BB"OH。所有表面在BB-冊2固定區域中顯示出一些460 nm處的熒光 信號，即^f絲DNA不存在時。當將dsDNA引至指示'錄面時，460nm熒絲強。 tt片表面的對照區域(無DNA)可用于背景扣除。固定的BB-NH2熒光染料在dsDNA存在時產生缺的劑量應答。460 nm處的 熒光信號強度與溶液中的BB-肌應答;J^t相同，但是背景較高(參見圖13)。 固定的BB-NH2的主狄點A^斤需^ 很小。與斜目檢定法需要200uL孑U^p、不 同，只需足夠的DNA溶*完全潤濕固定的BB表面。這#(吏得能夠制備用于DM 純化的銜綠置。^A已經z^f"了玻璃表面用于M雜生物;^^中純化DNA的用途，這 些結果已^iliif^l熒光BB檢定法進行了驗證。微^t^置所需的步驟如下表B 中所示。'W目BB ;^定法用于測定未#^玻璃的DNA結^p^MC平。表B1. 鶴細胞，除去組蛋白，并用高GuSCN將DM結合JJ^璃2. 用高GuSCN^^合4i^璃上的DNA3. 用生理鹽7JC^C璃Ji^^合的DNA4. 在^TIbtJ^的室內"W^t的DNA的^L5. 從熒iti^Ji^DNA, ^H^f預IL制以用于基于PCR的檢定法在^t DNA結合檢定法中檢查多;M^J胍(10M)，發現在高^1時于460 nm 處產生熒光背景。另-^t用于DNA結合JJ^璃的常用離、;^'J是;^f^1 (12M)。它具有低背景，但是比高氯酸鈉更貴，并且更難于^ft (溶液褪色)。因此，選擇高氯酸鈉(6M)用于顯色。在6M高氯酸鈉(pH 8 Tris)中制備O. 1 mL含 50、 500或者5000 ng DM的溶液。將這些0.1 mL詢^P、轉移到^:乙烯培^jnL 中，并在上面M 22 x 22咖蓋玻片(玻璃或者塑料)，在室溫下1.5小時后， 小心地傾斜蓋玻片，并除去殘液。將蓋玻片置于Ki咖ipes上(DNA側向下)以 除^f^T殘留液滴。#^個蓋玻片##到在培#^中的0.1 mL^P、的1 x熒光 檢定法緩沖液(1 x FAB: 10 mM Tris HC1, 1 mM EDTA， 200 mM NaCl, pH 7. 4 ) 之中。在室溫下4小時后，取出蓋玻片，并用0.15 mL 1 x FAB漂洗DNA側。用 1 x FAB #^并的來自各載玻片的緩沖;^成0. 27 mL,并添加30 uL的1 ug/mL 4甲亞胺(BB-OH)溶液(在1 xFAB中)。將來自各蓋玻片的200微fH^P、 #^多到微孔(透明底部)中，并且在Biotek FL-600板讀數器Ji^樣品進e^ 數。在460 nm處讀取熒光，并才娥標準曲,定DM艦。賄參考圖14，顯示了蓋玻片對DNA捕獲^^t的效率。在250處，塑料 蓋玻片顯示沒有DNA結合。在252處所示的玻璃蓋玻片對DNA捕獲^#^的效 率對于少量DM是最大的。在50 ng DNA/蓋玻片的情況下，回收了 7. 2 ng (14% 效率)。在500 ng DNA/蓋玻片的情況下，回收了 68 ng (14%效率)。在5000 ng DNA/蓋玻片的情況下，回收了 113 ng DNA (2%效率)，il些結果顯示，玻璃蓋 玻片;I^I于微流DNA純化的合it4面，從500ng樣品中可以有艦回Jl^少68 ng ■。原型卡已經^^液的手##液添加進行了優化，并iWM經過訓練的手和 Rainin 200 uL Pipett咖n可以iiJ'j 100 uL/分鐘的流速。更低的流速(對于最 小化氣泡形成來iXA非常重要的) _難達到的，但是200 uL移液器*械功用 于注滿DM結^Jiii (20 uL)而沒有引AJl^色，先前討輛卡經過一些微小變^iM^功的。在低^^下內^H"有玻璃的 通道潤濕了孑L，并Jii過讓空氣5/yiii道可以除去液體。將DNA |^^孔設計成 用于收^^斤有純化的DM，以用于^熒it^讀數器進行分析。利用固定的BB 表面，可以將DNAiji^^孔設計^^^^氐型(lowprofile)通道，其可以容易地 ^^Z^)于在熒^"析后將DM^SeJ'J^mii中.因為狄BB染料是固定 的，所以當絲到下游DM分析室中時，純化的DNA不^L指示性熒it^料污 染。盡管本發明已經才M居^it實施方案進行了顯示和描述，但W當理解， 本發明不局限于4封可特定的實施方案，而且可以進行變化而不背離所附權利要 求書中所定義的本發明的真JL^f申和范圍。
權利要求
1. 微流系統，包括液體進口；與所述液體進口接觸的DNA結合通道；和液體出口，其中將所述DNA結合通道內至少一個表面的至少一部分用結合試劑修飾，從而DNA優先地結合所述表面。
2. 4WJ要求1所述的孩&充系統，其中所ii^^t道具有J4Ui長方形的橫 截面，以;S^—個頂壁、 一個底壁和兩個側壁。
3. 權矛J^求2所述的微流系統，其中所^^i3it^頂壁和底壁間有200 的距離，并且其中用結M劑^^的所述DNA結^iiii內的所ii4面位于 頂壁a壁，或者位于頂壁和底壁。
4. 權利要求l所述的裝置,其中所ii^M口為移液管尖^^供加壓密封。
5. 相W要求2所述的裝置，其中至少一個^A由與，壁不同的材辨，J成的。
6. 相^漆求2所述的裝置，其中至少一個所述塾t由玻璃制成的。
7. 45U'J^求2所述的裝置，還包括與所述DNA結^1對目連的廢#^存室。
8， ^U']^求2所述的裝置，還包括與所述DM結^道相連的產物孔，
9. ;M'J^求2所述的裝置，還^與所述DM結^it道相連的產物孔。
10. ^5U'漆求1所述的裝置，其中所ii^X由這樣的材^^成，所it^料 允i^t過用于潮發在所^置內所包^l染料分子的光線，以及A^斤ii^料 ^"發出的^。
11. W'漆求l所述的裝置，^^有與在96孑Ufcl缺器中;^^^目容 的大小和幾何形狀。
12. 物質的組絲，^t用于測定多聚DNA或RNA的狄的固定^f誠敏NA) 指示性lb^"。
13. ;M'虔求12所述的組^，還包括能夠結合NA指示性襯的狄， 所述NA指示性^具有對于熒光測量來"^斤需的光學'l!lt。
14. ;M，JJ^求12所述的組合物，其中所述NA指示性^"對于雙鏈DM或單鏈醒是特異的。
15. 斥5U'J要求14所述的組楊，其中所述NA指示性襯選自苯并咪峻染 料(Hoechst 33258 )和DNA耙向小i^青染料(城青染料)。
16. 權利要求14所述的組*，其中所述NA指示性襯對于RNA是特異 的，并她自漆哇橙。
17. 微流系統，包括與所it^^^i口4^觸的DNA結^t逸和 液體出口，其中將所述DNA結^1道內至少一個表面的至少,分用結^^劑#^， 從而DNA優先^ki^^所述表面，所iiii^^劑包括用于測定多聚DNA或RNA的 濃度的固定化核酸(NA)指示性焚光分子。
18. 權利要求17所述的裝置，還包括用于分離和純^fe酸的未修飾的玻璃 表面。
19. 相為漆求i3所述的組合物，其中所iii^t選自玻璃、塑料、硝化纖維 素、金屬或者雞聚合材料。
20. ^U']^求13所述的組^吻，其中所iij^包括用親電子基團活化的載 玻片，所述親電子基團例如為能夠結合在NA指示性熒it^中的ilt^基的活化 的酯基團或者f^^。全文摘要
一種用于從人白細胞中分離基因組DNA并同時捕獲和測量所述DNA以簡化基因分析的微流裝置。所述裝置包括液體進口、液體出口和與液體進口接觸的DNA結合通道，其中將所述DNA結合通道內至少一個表面的至少一部分用結合試劑修飾，從而DNA優先地結合所述表面。
文檔編號G02B6/12GK101248187SQ200680009799
公開日2008年8月20日 申請日期2006年1月25日 優先權日2005年1月26日
發明者伯恩哈德·H·魏格爾, 羅納德·L·巴德爾 申請人:邁克爾·W·里德;伯恩哈德·H·魏格爾;羅納德·L·巴德爾