專利名稱：采用虛擬針孔的共焦顯微成像系統的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種光學顯微成像領域中的共焦成像系統，具體地說，涉及一種通過采用虛擬共焦針孔使系統獲得縱向層析能力的共焦顯微系統，可廣泛應用于熒光顯微術、非線性光學顯微術等具有三維成像能力的顯微技術中。
背景技術：
由于共焦顯微成像技術不僅具有比傳統光學顯微術更高的分辨率，同時還具有獨特的縱向層析能力，因此被廣泛地應用于生物、生物醫學、工業探測以及計量學等領域。共焦針孔對共焦顯微成像系統的縱向層析能力起著至關重要的作用。系統中，被測點和共焦針孔處于共軛的位置，由于共焦針孔位置的特殊性，使得匯聚在焦點前或后的光不能或者不能完全通過針孔，而只有來自焦平面的信號光才能最大限度地通過共焦針孔被探測器接收，這使得共焦系統能夠不通過切片而獲得厚樣品的縱向層析圖像，也就是說共焦系統具備了縱向層析能力。
但是，傳統的共焦顯微系統采用的是物理共焦針孔，如光纖的芯徑。在實際實用過程中，物理共焦針孔通常存在以下一些問題針孔的尺寸一般在微米量級范圍，需要采用精密、穩定的三維定位裝置，進行精確而繁瑣的調整后，將針孔調節到收集透鏡的焦點位置，否則會很容易引起光能損失以及分辨率下降等問題；針孔尺寸大小不能根據實際實用情況隨意調節和改變；時間過長后，針孔與焦點位置很容易發生偏移，又需要重新進行三維調節和校準；另外，還存在針孔阻塞和針孔清洗麻煩等問題。
電荷耦合器件(CCD)是20世紀70年代初發展起來的半導體器件，通過CCD獲得的信號是數字信號，可以直接利用計算機對獲得的數字信號進行各種特殊處理；并且，CCD經過幾十年的發展，各方面的性能都取得了驚人的進展，特別是在像傳感器應用方面得到了迅速地發展，如可用于微弱熒光探測領域、像元尺寸僅為幾個微米等，因此被廣泛應用于現代測控、圖像獲取等領域。
發明內容
針對上述現有技術存在的缺陷，本發明將CCD應用到共焦系統中，根據共焦系統自身的結構特點和光學特性對CCD采集到的數字信號進行相應的計算機處理，提出了一種采用虛擬針孔的共焦顯微成像系統的技術方案，該系統不僅具有縱向層析能力，同時還有校準調節方便等優點。
本發明的基本思想是將CCD光敏面放置于系統收集透鏡的焦平面位置，對于CCD采集到的數字信號，利用計算機在與收集透鏡焦點相對應的位置處生成一個興趣窗口，相當于與被測點存在共軛的關系，將窗口內像元上的信號值累加起來作為當前掃描點的信號強度。興趣窗口的尺寸以及作用等與物理共焦針孔相同，且不是實體存在的，被稱之為虛擬共焦針孔。
本發明的技術方案這種采用虛擬針孔的共焦顯微成像系統，使用準直透鏡、分光鏡、顯微物鏡、掃描系統、收集透鏡、電荷耦合器件、計算機；其特點在于它由三部分組成第1部分在中心光軸依次排列點光源、準直透鏡、分光鏡、和顯微物鏡構成該系統的照明光路；第2部分依次排列顯微物鏡、分光鏡、收集透鏡、電荷耦合器件構成系統的探測光路；第3部分計算機控制掃描系統以及電荷器件，構成數據采集、處理和圖像重建部分。
本發明的有益效果1、調節定位方便。CCD的光敏面通常為毫米量級，與尺寸僅為微米量級的物理共焦針孔相比較而言，顯然，在垂直光軸面上的調節要容易得多，只要保證CCD光敏面位于焦平面，即只需進行光軸方向的精細調整，并且CCD能夠接收到信號光，就可以根據收集透鏡焦點的位置設置興趣窗口，操作非常簡單；2、虛擬針孔的位置、大小可以隨時根據實際需要進行改變，不需要對顯微系統重新進行繁瑣的定位調節；3、虛擬針孔不存在針孔堵塞問題，也不需要進行清洗方面的工作。
圖1采用虛擬針孔的共焦顯微成像系統的光路示意圖。
圖2反射鏡距離顯微物鏡焦點13.8μm時CCD探測到的光強分布。
圖3反射鏡距離顯微物鏡焦點6.8μm時CCD探測到的光強分布。
圖4反射鏡位于顯微物鏡焦平面時CCD探測到的光強分布。
圖5反射鏡距離顯微物鏡焦點-6.8μm時CCD探測到的光強分布。
圖6反射鏡距離顯微物鏡焦點-13.8μm時CCD探測到的光強分布。
圖7興趣窗口的示意圖。
圖中1.點光源 2.準直透鏡 3.分光鏡 4.顯微物鏡 5.掃描系統 6.收集透鏡 7.電荷耦合器件(CCD) 8.計算機具體實施方式
下面結合附圖和實施例對本發明的具體實施方式
做進一步說明這種采用虛擬針孔的共焦顯微成像系統，使用準直透鏡、分光鏡、顯微物鏡、掃描系統、收集透鏡、電荷耦合器件、計算機；其特點在于它由三部分組成
第1部分在中心光軸依次排列點光源1、準直透鏡2、分光鏡3和顯微物鏡4構成該系統的照明光路；第2部分依次排列顯微物鏡4、分光鏡3、收集透鏡6、電荷耦合器件7構成系統的探測光路；第3部分計算機8控制掃描系統5以及電荷耦合器件7，構成數據采集、處理和圖像重建部分。
電荷耦合器件的光敏面直接位于收集透鏡的焦平面位置。
所述光源是激光光源或普通光源。
所述分光鏡是普通型分光鏡或二向色性分光鏡。
所述的采用虛擬針孔的共焦顯微成像系統的成像方法，其特點在于它包括下述步驟1)在垂直于光軸的方向上進行兩維調節使得信號光被收集透鏡匯聚到CCD的光敏面上，然后進行縱向調節使得CCD的光敏面位于收集透鏡的焦平面位置；2)光斑在CCD采集到的二維圖像上的位置，對應于收集透鏡焦點在CCD光敏面的位置，計算機在二維數字圖像上的對應位置處設置虛擬針孔，只將針孔內像元上的信號值累加起來作為當前掃描點的信號強度；3)掃描系統驅動載物臺作三維平動，對置于其上的被測樣品進行三維掃描，可以得到不同掃描點的信號強度，計算機根據這些采集到的信號最終重構出被測樣品的層析圖像。
換一種描述方法是采用虛擬針孔的共焦顯微成像系統，它包括在中心光軸依次排列的點光源，準直透鏡，分光鏡，顯微物鏡，載物臺，收集透鏡以及CCD；點光源通過準直透鏡形成平行光入射到分光鏡上，經顯微物鏡被聚焦到被測樣品；從被測樣品處產生的反射或散射光被同一顯微物鏡探測，沿原光路返回，經分光鏡后被反射到收集透鏡上，最后到達CCD，由CCD對信號進行采集；CCD的光敏面直接位于收集透鏡的焦平面位置，前方沒有采用任何物理針孔，根據收集透鏡焦點的位置，在CCD采集到的二維數字圖像上設置興趣窗口，將窗口內像元上的信號值累加起來作為當前掃描點的信號強度，窗口的位置、大小可由計算機調整；一高于微米級精度的三維平移臺驅動載物臺作三維平動，對置于其上的被測樣品進行三維掃描，得到不同掃描點的信號強度，最終重構出被測樣品的層析圖像。
盡管在該系統中沒有采用物理共焦針孔，焦點前或后的光以及雜散光均被CCD接收，但是CCD光敏面處于系統的一個特殊位置，即位于收集透鏡的焦平面，使得存在這樣一種光學特性隨著離焦量的增大，來自非焦點處的光在CCD光敏面上的分布相對于收集透鏡的焦點呈現向外擴散的現象，相應地對興趣窗口內信號強度的貢獻減弱，也就是說可以通過在收集透鏡焦點位置處設置興趣窗口排除非焦平面光以及雜散光的影響；另外，CCD的像元尺寸通常為幾個微米，可以很容易將興趣窗口的大小控制在微米量級。總的說來，興趣窗口對顯微系統起到的作用與物理共焦針孔的作用相同，可被稱作為虛擬共焦針孔。
實施例圖1給出了采用虛擬針孔的共焦顯微成像系統的光路示意圖，點光源1、準直透鏡2、分光鏡3和顯微物鏡4，它們依次成光路聯結，構成該系統的照明光路；掃描系統5控制被測樣品的移動；顯微物鏡4、分光鏡3、收集透鏡6、CCD7依次成光路聯結，構成系統的探測光路；計算機8控制掃描系統5以及CCD7，并進行數據采集、處理和圖像重建。本實施例中，顯微物鏡4采用Olympus的平場復消色差物鏡，數值孔徑為0.4；掃描系統5采用德國PI公司的P-611.3S壓電陶瓷三維平移臺，精度為2nm，有效行程為100μm；CCD7選用臺灣MINTRON公司的MTV-1881EX CCD，像元尺寸為8.3μm×8.3μm，光敏面尺寸大小為6.4×4.8mm，最小照度0.02LUX，適用于微光探測。
為進一步說明非焦平面光隨離焦量增大向外擴散的光學特性，對一垂直于光軸的反射鏡進行縱向移動，可以得到反射鏡在不同軸向位置時，CCD探測到的光強分布，如圖2-圖6所示。顯然，隨著反射鏡離焦距離的增大，光強出現明顯的向外擴散趨勢。
物理共焦針孔的位置選擇在收集透鏡的焦點位置，使得非焦平面信號光不能或者不能完全被探測器接收。對于本發明所提出的顯微系統，可以通過計算機對CCD采集到的二維數字圖像進行處理，即加入虛擬共焦針孔的方法來實現。具體過程如下對CCD探測到的一幅二維數字圖像，在與收集透鏡焦點相對應的位置上設置興趣窗口，如圖7所示，只將被黑點標注的像元上的信號值累加起來作為當前掃描點的信號強度，就可以完全排除被興趣窗口以外像元接收到的信號光的影響，也就是說排除了非焦平面信號光以及雜散光的影響。根據MTV-1881EX型CCD的像元大小計算，圖7中窗口的直徑大約為41.5μm。同時由于CCD位于收集透鏡的焦平面，興趣窗口位置的選取是依據收集透鏡的焦點位置，它與被測點存在共軛關系，對顯微系統所起的作用與物理共焦針孔的作用相同，可將其稱作虛擬共焦針孔。虛擬共焦針孔是由計算機生成的，它的大小、位置也可以用計算機根據實際實用情況進行調整，非常方便。
權利要求
1.一種采用虛擬針孔的共焦顯微成像系統，使用準直透鏡、分光鏡、顯微物鏡、掃描系統、收集透鏡、電荷耦合器件、計算機；其特征在于它由三部分組成第1部分在中心光軸依次排列點光源(1)、準直透鏡(2)、分光鏡(3)和顯微物鏡(4)構成該系統的照明光路；第2部分依次排列顯微物鏡(4)、分光鏡(3)、收集透鏡(6)、電荷耦合器件CCD(7)構成系統的探測光路；第3部分計算機(8)控制掃描系統(5)以及電荷耦合器件(7)，構成數據采集、處理和圖像重建部分。
2.根據權利要求1所述的采用虛擬針孔的共焦顯微成像系統，其特征在于CCD的光敏面直接位于收集透鏡的焦平面位置。
3.根據權利要求1所述的采用虛擬針孔的共焦顯微成像系統，其特征在于所述光源是激光光源或普通光源。
4.根據權利要求1所述的采用虛擬針孔的共焦顯微成像系統，其特征在于所述分光鏡是普通型分光鏡或二向色性分光鏡。
5.根據權利要求1所述的采用虛擬針孔的共焦顯微成像系統的成像方法，其特征在于它包括下述步驟1)在垂直于光軸的方向上進行兩維調節使得信號光被收集透鏡匯聚到電荷耦合器件的光敏面上，然后進行縱向調節使得CCD的光敏面位于收集透鏡的焦平面位置；2)光斑在CCD采集到的二維圖像上的位置，對應于收集透鏡焦點在CCD光敏面的位置，計算機在二維數字圖像上的對應位置處設置虛擬針孔，只將針孔內像元上的信號值累加起來作為當前掃描點的信號強度；3)掃描系統驅動載物臺作三維平動，對置于其上的被測樣品進行三維掃描，可以得到不同掃描點的信號強度，計算機根據這些采集到的信號最終重構出被測樣品的層析圖像。
全文摘要
本發明涉及一種光學顯微成像領域中的共焦成像系統，是一種通過采用虛擬共焦針孔使系統獲得縱向層析能力的共焦顯微系統，可廣泛應用于熒光顯微術、非線性光學顯微術等具有三維成像能力的顯微技術中。本發明包括點光源，準直透鏡，分光鏡，顯微物鏡，載物臺，收集透鏡以及CCD。其特點是CCD的光敏面直接位于收集透鏡的焦平面位置，計算機根據收集透鏡焦點的位置，在CCD采集到的二維數字圖像上的相應位置設置虛擬針孔，只將針孔內像元上的信號值累加起來作為當前掃描點的信號強度，排除了非焦平面雜散光對成像質量的影響。虛擬共焦針孔的作用與物理共焦針孔的作用相當，且位置、大小可由計算機控制和調整，具有校準調節方便等優點。
文檔編號G02B21/00GK1971333SQ20061001613
公開日2007年5月30日 申請日期2006年10月11日 優先權日2006年10月11日
發明者王湘暉, 林列 申請人:南開大學