用漆酶使木質素解聚的方法
【專利摘要】本發明涉及使木質素解聚的方法，所述方法包括通過在至少一種溶劑中合并非酚型木質素、漆酶、氧化還原介體和氧源來使非酚型木質素氧化的步驟，由此獲得包含經氧化的非酚型木質素的混合物；和通過添加氧化劑來使如此獲得的經氧化的非酚型木質素解聚的步驟，所述非酚型木質素是從酚型木質素開始通過使所述酚型木質素的酚官能團官能化而獲得的。
【專利說明】用漆酶使木質素解聚的方法
[0001] 本發明涉及使木質素解聚的方法。
[0002] 木質素是在纖維素之后最豐富的第二種可再生的生物聚合物，并且它們兩者構成 了總生物質的超過70%。
[0003] 因此，木質素的再利用是一個重要的關鍵。
[0004] 在造紙工業中，作為副產品或廢料而獲得大量的木質素，其中僅極小部分以化學 形式進行再利用。在制糖工業中，也在從甘蔗中提取糖期間以廢料的形式獲得大量的木質 素。木質素主要用作粘合劑或分散劑，或者用于通過高溫處理(800°C-100(TC)來制備沼氣。 還存在牽涉氯化衍生物的使木質素解聚的方法，其從環境觀點來看是不令人滿意的。
[0005] 目前，存在很少的使用木質素作為原料來生產化學化合物的在經濟上可行的方 法。
[0006] 因此，對于在經濟上可行且從環境觀點來看可接受的用于對木質素進行再利用的 新方法存在需要。
[0007] 本發明的目標在于提出有效的并且從環境觀點來看合適的用于使木質素解聚的 新方法，其使得能夠獲得在各種不同的工業領域(例如，生物精煉、農產品加工或化妝品）中 可再利用的解聚產品。
[0008] 本發明的另一個目標為提出使得能夠以受控的方式獲得具有各種大小的解聚產 品的方法，所述解聚產品例如為3,4_二甲氧基苯甲酸（甲基化香草酸）、藜蘆醛（甲基化香草 醛）、藜蘆醚（甲基化愈創木酚)或甲基化二甲酰基愈創木酚。
[0009] 本發明的方法提出順次地將酶的作用與氧化劑的作用相組合。
[0010] 更具體而言，本發明涉及使木質素解聚的方法，所述方法包括：
[0011] -通過在至少一種溶劑中合并非酚型木質素、漆酶、氧化還原介體和氧源來使非酚 型木質素氧化的步驟，由此獲得包含經氧化的非酚型木質素的混合物，和
[0012] -通過添加氧化劑來使如此獲得的經氧化的非酚型木質素解聚的步驟，
[0013] 所述非酚型木質素是從酚型木質素開始通過使所述酚型木質素的酚官能團官能 化而獲得的。
[0014] 本發明的方法是非微生物學的，就不使用內源性地表達漆酶的微生物(例如真菌） 這一意義而言。
[0015] 發明人已令人驚訝地觀察到，在氧化還原介體和氧源存在下漆酶對于非酚型木質 素的作用，以及隨后的氧化劑的添加，具有有效地使木質素的結構解聚的效應。
[0016] 在該方法的第一個步驟(氧化步驟)期間，在所述非酚型木質素的芐基位置處的羥 基官能團被氧化為酮官能團。在該步驟期間，木質素的聚合結構未被片段化并且幾乎沒有 任何C-C鍵被切割。
[0017] 在該方法的第二個步驟(解聚步驟，也稱為片段化步驟)期間，木質素的聚合結構 的C-C鍵被打斷。在并不希望被束縛于特定理論的情況下，如此被打斷的C-C鍵是位于在該 方法的第一個步驟期間形成的酮官能團附近的那些。
[0018] 本發明的方法可以用下面的舉例說明性的流程來表示：
[0019]
[0020] 其中基團-OR表示所述非酚型木質素的經官能化的酚官能團，并且基團-R'表示所 示苯基基團的可能的另一個取代基(不同于酚官能團）。基團-R'的存在、數目和類型取決于 所使用的木質素。它可以例如為一個或多個甲氧基基團。
[0021] 上面的流程純粹是舉例說明性的，并且僅示意性地反映了木質素的結構。
[0022] 正如這將會在下文中進行闡述的，所述方法的兩個步驟有利地在同一個反應器中 彼此相繼地進行。
[0023] 本發明的方法的步驟的反應條件將會在下文中進行描述。
[0024] 通常，在本申請的范圍內，"反應介質"是指這樣的介質，在其中發生所述方法的步 驟，并且其包含木質素衍生物、漆酶、氧化還原介體、氧源、至少一種溶劑和可選地氧化劑 (根據它是否已經加入）。
[0025] 因此，"合并"是指將試劑添加到反應介質中。
[0026] 所述反應介質還可以包含其他試劑，正如它們在本申請中進行了描述那樣。
[0027] 現在將描述在所述方法中所使用的原料，即非酚型木質素。
[0028] 非酚型木質素
[0029] "非酚型木質素"是指酚型木質素的衍生物，其是酚型木質素(也簡單地稱為"木質 素"）的酚官能團(Ph-ΟΗ)的官能化的反應產物。
[0030] 非酚型木質素是經修飾或經官能化的木質素，其中至少一個酚官能團被修飾。優 選地，木質素的酸官能團的至少50%，甚至至少60%，甚至至少70%，甚至至少80%，甚至至 少90%，甚至至少95%，甚至至少99%被修飾。
[0031 ] 非酸型木質素的一種類型尤其描述在Srebotnik等人（Journal of Biotechnology 81 (2000)，179-188)中。
[0032] 優選地，非酚型木質素不包含游離的(未官能化的)酚官能團。
[0033] 通過在所述方法的氧化步驟期間酚型木質素與能夠將所述酚型木質素的酚官能 團轉化為非反應性官能團的官能化試劑進行反應來獲得非酚型木質素。木質素的官能化的 目的在于在所述方法的氧化步驟期間保護酚官能團并阻止其發生反應。因此，非酚型木質 素的經官能化的酚官能團在通過漆酶進行的氧化步驟期間不是反應性的。
[0034] 在本發明的范圍內，"木質素的官能化"是指酚官能團的選擇性官能化，即木質素 的其他羥基官能團（特別地，脂族醇)不被官能化。優選地，所述官能化是完全的，即所有酚 官能團都被官能化。
[0035] 發明人已發現，通過按照本發明的方法來使用酚型木質素，改善了木質素的解聚。
[0036] 烷基化是適合于實施所述方法的官能化的例子。為此，使用烷基化試劑作為官能 化試劑。
[0037] 根據一個實施方案，可以使用經烷基化的木質素作為非酚型木質素。
[0038] "經烷基化的木質素"是指這樣的非酚型木質素，在其中酚官能團被烷基(典型地， Cl-Cl2烷基)官能化從而廣生烷氧基官能團。
[0039] 優選地，所述經烷基化的木質素不包含游離的酚官能團，即它們全部（或幾乎全 部)處于烷氧基官能團的形式。
[0040] 根據一個有利的實施方案，可以使用經甲基化的木質素作為非酚型木質素。
[0041 ]為此使用甲基化試劑作為官能化試劑。
[0042] "經甲基化的木質素"是指這樣的經烷基化的木質素，在其中酚官能團被甲基官能 化從而產生甲氧基官能團。
[0043] 優選地，所述經甲基化的木質素不包含游離的酚官能團，即它們全部（或幾乎全 部)處于甲氧基官能團的形式。
[0044] 在使酚型木質素官能化之后，為了控制官能化的比率和官能化的選擇性，可以通 過31P NMR來定量可能剩余的酚官能團（其因此還未被官能化)的量。方法尤其描述在Granat 等人 J.Agric.Food Chem. ,1995,43(6) ,1538-1544中。
[0045] 根據一個實施方案，所述非酚型木質素為通過在堿性水溶液中合并酚型木質素和 烷基化試劑而獲得的經烷基化的木質素。
[0046] 在本發明的范圍內，烷基化試劑為這樣的化合物，所述化合物能夠通過烷基基團 來使酚官能團官能化，其中用烷基基團取代所述酚官能團的氫原子(從而產生烷氧基官能 團）。
[0047] 優選地，使用使得能夠選擇性地使木質素的酚官能團烷基化的烷基化試劑，即木 質素的其他羥基官能團(特別是仲醇)不被烷基化為烷氧基官能團。
[0048] 優選地，使用使得能夠使木質素的酚官能團完全烷基化的烷基化試劑，即所有的 (或幾乎所有的)木質素的酚官能團都被烷基化為烷氧基官能團。
[0049] 根據一個有利的實施方案，所述非酚型木質素為經甲基化的木質素，其優選地通 過在堿性水溶液中合并木質素和甲基化試劑來獲得。
[0050] 在本發明的范圍內，甲基化試劑為這樣的化合物，所述化合物能夠通過甲基基團 來使酚官能團官能化，其中用甲基基團取代所述酚官能團的氫原子。
[0051] 優選地，使用使得能夠選擇性地使木質素的酚官能團甲基化的甲基化試劑，即木 質素的其他羥基官能團(特別是仲醇)不被甲基化為甲氧基官能團。
[0052] 典型地，甲基化試劑的合并逐滴地進行。
[0053]典型地，在所述合并之后接著是在典型地50°C至100°C的溫度下加熱反應介質的 步驟。
[0054]作為甲基化試劑，可以提及硫酸二甲酯、碳酸二甲酯(DMC)、碘代甲烷和重氮甲烷。
[0055] 優選地，使用硫酸二甲酯，其使得能夠完全地和選擇性地使酚型木質素的酚官能 團甲基化。
[0056] 典型地，木質素的甲基化的步驟可以按照在Sadeghifar等人， Ind. Eng. Chem. Res .2012,51，16713-16720 中所描述的方法來進行。
[0057] 將木質素溶解在堿性水溶液中，典型地在氫氧化鈉水溶液(例如0.7M)中。攪拌所 獲得的混合物，典型地在環境溫度下，并且添加甲基化試劑，優選地逐滴地(按照相對于酚 官能團的當量數而言大約50當量的甲基化試劑）。典型地，加熱混合物(例如至80 °C)直至試 劑被消耗。然后，使混合物酸化、過濾，并且將所獲得的固體用蒸餾水進行洗滌并進行干燥 從而提供經甲基化的木質素。
[0058]在并不希望被束縛于特定理論的情況下，發明人觀察到，木質素的甲基化通過選 擇性地和完全地封閉酚官能團而使得能夠在漆酶作用期間非常有效地避免木質素的聚合 反應，并因此改善解聚。
[0059] 甲基化的效應尤其在下面所描述的比較實施例中進行舉例說明。通過本發明的方 法進行處理的非酚型(未甲基化的)木質素不被解聚。
[0060] 酚型木質素
[0061 ]在本發明的范圍內，"酚型木質素"或"木質素"是指木質素的天然形式，其包含游 離的酚官能團(Ph-〇H)。
[0062] 木質素的結構呈現為復雜的三維網格形式，其源自具有苯丙烷基元作為骨架的基 本單元的聚合。因此，木質素更通常地被稱為"一些"木質素，根據構成其的基本單元。在木 質素的基本單元(也稱為單體木素醇(monolignol))之中，可以主要提及對香豆醇、松柏醇 和芥子醇。
[0063] 在本發明的范圍內，"解聚"是指這樣的反應，在其過程中木質素的聚合結構的共 價鍵被打斷，從而導致具有小于起始木質素的大小的解聚產物。
[0064] "小于......的大小"是指，按照本發明的方法而獲得的解聚產物具有小于起始非 酸型木質素的分子量的分子量。
[0065] 然而，在本發明的范圍內，術語"解聚"的含義不應當局限于非酚型木質素向上面 所描述的基本單元的轉變。
[0066] 典型地，按照本發明的方法而獲得的木質素的解聚產物由一個基本單元、幾個基 本單元、甚至幾十個基本單元形成。通常，獲得解聚產物的混合物，其包含不同數目的基本 單元。
[0067]通常，考慮到木質素的復雜結構，本發明的方法提供了具有各種大小和結構的解 聚產物的混合物，所述解聚產物可以攜帶各種不同的官能團，例如酮基團、醛基團、酸基團、 酚基團、醇基團或甲氧基基團，優選地酸基團、甲氧基基團、醇基團和酮基團。
[0068]可以將所述解聚產物定義為非酚型木質素的"單體"、"低聚物"或"片段"。
[0069]因此，"解聚方法"也是指木質素結構的"片段化方法"。
[0070] 按照本發明的方法而獲得的解聚產物具有在100g/mol和5000g/mol之間，優選地 在150g/mol和4000g/mol之間，有利地在200g/mol和3000g/mol之間，優選地在500g/mol和 2500g/mol之間的大小。
[0071] 典型地，木質素的解聚產物的混合物通過其平均分子量Mw來進行表征，其表示通 過每種產物的質量進行加權的分子量平均值，并且其具有下述公式：
[0072]
[0073] 其中m表不產物i的數目，和Mi表不產物i的分子量。
[0074]對于按照本發明的方法而獲得的解聚產物的混合物，平均分子量Mw可以通過空間 排阻色譜法(SEC:大小排阻色譜法)來進行測量。
[0075] 典型地，解聚產物的混合物具有在100g/mol和5000g/mol之間，優選地在150g/mol 和4000g/mol之間，有利地在200g/mol和3000g/mol之間，優選地在500g/mol和2500g/mol之 間的平均分子量Mw。
[0076] 按照本發明的方法而獲得的解聚產物的混合物還可以通過所述混合物的質均分 子量Mw與起始木質素的質均分子量Mug之間的摩爾比來進行表征。
[0077] 典型地，通過使用本發明的方法，獲得了在1/3和1/10之間的Mw/Mlls#爾比。
[0078] 在本發明的方法中充當原料的非酚型木質素可以從任何可得的酚型木質素來源 (不論其是商業的，還是從富含木質素的工業殘留物中提取的)開始通過任何本身已知的官 能化方法(烷基化、甲基化、...）來獲得。
[0079] 作為酚型木質素的來源，可以使用下面所描述的木質素，優選地牛皮紙木質素(例 如源自黑液的），其任選地是經純化的，或者甘蔗渣木質素，或者任何其他工業木質素。 [0080] 在本發明的范圍內可使用的木質素尤其描述在Lignins and Lignans:Advances in Chemistry,Cyril Heitne,John Schmidt,CRC Press,Taylor&Francis Group,2010中。
[0081] 有利地，使木質素經歷預處理以便使其在水性介質中可溶。
[0082] 作為酚型木質素，可以使用牛皮紙木質素，例如從黑液中提取的。
[0083]牛皮紙木質素（也稱為硫代木質素）是源自通過使用硫酸根離子的紙漿的工業生 產的水溶性化合物。
[0084] 典型地，在本發明的方法中可使用的牛皮紙木質素通過對黑液進行提取來獲得， 所述黑液是源自牛皮紙制造的蒸煮液。它是由從紙漿中溶解出的木質素和半纖維素殘留物 以及其他無機化學化合物(溶解的鹽)組成的水溶液。
[0085] 典型地，黑液的純化如下來進行。使黑液酸化以沉淀木質素。將所獲得的固體離 心、分離和用乙醇提取。回收液體級分，并通過蒸發乙醇來進行濃縮。將殘留物用酸性溶液 進行洗滌以去除殘留的鹽。如此獲得牛皮紙木質素。
[0086] 可以如下地進一步純化從黑液中提取出的牛皮紙木質素以去除雜質（典型地，單 酚化合物和降解殘留物）。將牛皮紙木質素與四氫呋喃合并，過濾所獲得的混合物以去除固 體，通過蒸發溶劑來濃縮濾液，然后用二乙醚來洗滌所獲得的固體以去除有機雜質例如單 酚化合物(香草醛、香草酸、...）和降解殘留物。使所回收的固體干燥，從而產生經純化的牛 皮紙木質素。
[0087] 作為酚型木質素，還可以使用源自甘蔗渣的木質素。
[0088] 甘蔗渣是在糖提取后獲得的甘蔗的纖維性殘留物。它構成了制糖工業的重要的廢 料，其沒有被足夠地再利用。甘蔗渣木質素是商購可得的(Solvay)。
[0089] 還可以使用工業木質素來源，或者包含木質素的化合物的混合物，典型地包含木 質素和其他成分(例如纖維素和/或半纖維素）的生物質的混合物，或者牛皮紙木質素的混 合物。
[0090] 典型地，在本發明的方法中所使用的木質素具有在1000g/mol和10000g/mol之間， 優選地在l〇〇〇g/mol和5000g/mol之間的質均分子量(Mi ig)。
[0091] 起始木質素的質均分子量(Mug)表示通過每種木質素大小的質量進行加權的分子 量平均值，并且具有下述公式：
[0092]
[0093]其中nj表不具有大小j的木質素的分子數目，和Mj表不具有大小j的木質素的分子 量。
[0094]該值通常由木質素的供應商指明，或者可以通過如在上面所描述的空間排阻色譜 法測量來測定。
[0095]現在將描述本發明的方法的步驟。
[0096] 通過漆酶進行氧化的步驟
[0097] 本發明的方法的第一個步驟在于在至少一種溶劑中合并上面所描述的非酚型木 質素、漆酶、氧化還原介體和氧源。
[0098] 該步驟導致在氧源存在下通過"漆酶/介體"系統的作用來氧化非酚型木質素，由 此獲得包含經氧化的非酚型木質素的混合物。
[0099] "經氧化的非酚型木質素"是指在上面所定義的非酚型木質素，其中在芐基位置處 的羥基官能團已被選擇性地轉化為酮官能團。
[0100] 在該步驟期間，非酚型木質素基本上不被解聚，即該步驟不(或非常少地)影響木 質素的聚合結構，特別地它不(或非常少地)打斷C-C鍵。
[0101] SB
[0102] 漆酶(EC 1.10.3.2)是在眾多植物、真菌和微生物中被發現的酶家族。
[0103] 在體內，漆酶具有氧化活性并且在酶促氧化過程之中作為催化劑起作用。
[0104] 在本發明的方法中可使用的漆酶可以源自植物、真菌或微生物。源自真菌的漆酶 尤其包括下列屬的漆酶：曲霉屬(Aspergillus)、脈孢菌屬(Neurospora)(例如，粗糙脈胞菌 (Neurospora crassa))、柄孢殼屬（Podospora)、葡萄孢屬（Botrytis)、金錢菌屬 (Collybia)、層孔菌屬（Fomes)、香燕屬（Lentinus)、側耳屬（Pleurotus)、栓菌屬 (Trametes)(例如，絨毛檢菌（Trametes villosa)和變色檢菌（Trametes versicolor))、絲 核菌屬（Rhizoctonia)(例如，立枯絲核菌（Rhizoctonia solani))、鬼傘屬（Coprinus)(例 如，灰蓋鬼傘(Coprinus cinereus )、毛頭鬼傘（Coprinus comatus)、費賴斯鬼傘(Coprinus friesii)和糟紋鬼傘(Coprinus plicatilis))、小脆柄燕屬(？83也7代11&)(例如，黃蓋小 脆柄燕（？83七117^113(3011(1611631^))、斑糟燕屬（？31^6〇1118)(例如，蝶形斑糟燕 (Panaeolus papilionaceus))、毀絲霉屬（Myceliophthora)(例如，嗜熱毀絲霉 (Myceliophthora thermophila))、節格抱屬（Schytalidium)(例如，嗜熱節格抱 (Schytalidium thermophilum))、多孔菌屬（Polyporus)(例如，Polyporus pinsitus)、射 脈菌屬(Phlebia)(例如，射脈菌(Phlebia radiata))、密孔菌屬(Pycnoporus)(例如，朱紅 密孔菌(Pycnoporus cinnabarinus))或革蓋菌屬(Coriolus)(例如，毛革蓋菌(Coriolus hirsutus))。源自細菌的漆酶例如源自芽孢桿菌屬(Bacillus)。
[0105] 優選地，使用由Sigma Aldrich銷售的源自變色栓菌的漆酶。
[0106] 所合并的漆酶的量（以mg表示)與在反應介質中存在的非酚型木質素的起始量（以 克表示）的比例通常在0.1/1和5/1之間。
[0107] 在其體外使用的情形下，對于由體積大的分子(典型地，具有大于5000g/mo 1的分 子量)構成的底物的氧化，通常將漆酶與"氧化還原介體"相聯合，后者是作為在漆酶分子與 待氧化的底物分子之間的氧化還原中間物起作用的、具有小的大小（典型地，具有低于 1000g/mol的分子量）的化學化合物。氧化還原介體尤其描述在Bourbonnais R.Appl.Enviro.Microbiol·1995,61，1876-1880中。
[0108] 氧化還原介體也稱為電子轉移試劑，因為它們促進在漆酶與待氧化的底物之間的 電子轉移。
[0109] 氧化還原中介的原理是本身已知的技術。
[0110] 在用漆酶來處理木質素的情形下，在氧化還原介體不存在下，不利于漆酶(其是具 有大的大小的蛋白質）與木質素分子(其是具有大的大小的聚合物)之間的化學相互作用。 因此，添加氧化還原介體以便加速由漆酶所催化的酶促氧化過程。
[0111 ]所合并的氧化還原介體的量（以mmo 1表示）與所合并的漆酶的量（以mg表示）的比 例通常在1/1和1/50之間。
[0112] 優選地，按照本發明的方法所使用的氧化還原介體為2,2_連氮基-雙-(3-乙基苯 并噻唑啉-6-磺酸）(ABTS)。
[0113] 該介體特別適合于用漆酶來氧化木質素。
[0114] 與其他氧化還原介體(例如，在漆酶存在下快速降解從而喪失其介體活性的羥基 苯并三唑(H0Bt)(H0Bt由于失去氧原子而變成HBt))相反，ABTS作為氧化還原介體具有更好 的活性。
[0115]下面的氧化還原介體也適合于本發明的實施:紫尿酸、羥基鄰氨基苯甲酸、TEMPO、 N-羥基苯鄰二甲酰亞胺(Chakar等人Can · J · Chem · 82:344- 352 (2004))。
[0116]麵
[0117] "氧源"是指能夠使在上面所提及的酶促氧化過程的范圍內所牽涉的漆酶的活性 位點再生(再氧化)的試劑，所述酶促氧化過程從非酚型木質素開始最后提供經氧化的非酚 型木質素。"氧"在此是指雙氧(〇2)。
[0118]優選地，所述氧源為包含氧的氣體，例如空氣或純氧。
[0119]作為氧源，可以提及純氧(02)，其通過在大氣壓力下或在幾個巴的壓力下鼓吹入 在氧化步驟開始時包含非酚型木質素、漆酶、氧化還原介體和至少一種溶劑的反應介質中 來合并。如此，達到有利地使反應介質在溶解氧方面飽和。
[0120]作為氧源，還可以提及空氣或者任何富含氧的氣體混合物。
[0121] "氧源的合并"是指將所述氧源引入到本發明的方法的反應介質中。所述合并可以 按時地或延時地，優選地延時地進行，其中所尋求的目標是使反應介質在溶解氧方面飽和。
[0122] 備選地，代替氧源，可以使用任何能夠使在上面所描述的酶促氧化過程中所牽涉 的漆酶的活性位點再生(再氧化)的氧化劑。
[0123] 所述方法的第一個步驟有利地在對于所使用的漆酶的反應性來說合適的pH和溫 度條件下，即在不使漆酶的特性變性的pH和溫度條件下進行。
[0124] 優選地，本發明的方法的第一個步驟在酸性介質中，典型地在pH = 4的緩沖液中進 行。
[0125] 優選地，本發明的方法的第一個步驟在處于20°C和60°C之間，優選地大約40°C的 溫度下進行。
[0126] 這些條件特別適合于使用源自變色栓菌的漆酶。
[0127] 將可以采用與所使用的漆酶類型相關的最佳pH和溫度條件，其中這些條件對于給 定的漆酶來說通常是已知的。
[0128] 根據本發明的方法的第一個步驟在至少一種溶劑存在下進行。
[0129] 根據一個實施方案，所述溶劑為包含水和極性有機溶劑的混合物。
[0130] 優選地，所述溶劑為包含具有酸性pH(典型地，pH=4)的緩沖溶液和極性有機溶劑 的混合物。
[0131] 這樣的混合物作為溶劑的使用的優點在于使非酚型木質素以及所有所合并的試 劑增溶。如此，獲得其中化學相互作用受到促進的均質的反應混合物。
[0132] 根據該實施方案，所述溶劑優選地包含相對于該溶劑的總體積而言30體積％至70 體積％，有利地40體積％至60體積％的水。
[0133] 溶劑的補足部分典型地由極性有機溶劑構成，所述極性有機溶劑優選地對于通過 蒸發(任選地在減壓下)來分開解聚產物來說具有足夠的揮發性。
[0134] 典型地，所述溶劑為用于使漆酶增溶的水和能夠使非酚型木質素增溶的醚(例如， 二0惡燒)的混合物。典型地，可以使用二0惡烷/水(1/1)的混合物。
[0135] 第一個步驟按照這樣的稀釋度來進行，即對于lg非酚型木質素，使用10mL至 100mL，優選地30mL至70mL，典型地50mL的溶劑體積。
[0136] 技術人員將能夠根據起始非酚型木質素的溶解度、反應的溫度和/或反應混合物 的粘度來調整反應介質的稀釋度。
[0137] 解聚步驟
[0138] 發明人已發現，通過將源自本發明的方法的第一個步驟的經氧化的非酚型木質素 與氧化劑相合并，達到了使木質素的結構有效地解聚從而獲得木質素的解聚產物。
[0139] "氧化劑"是指能夠將在反應介質中存在的種類氧化的物質。優選地，所述氧化劑 是親核性的。
[0140] 作為親核性氧化劑，可以提及例如，過氧化物例如過氧化氫(H2〇2)和過氧化苯甲 酰，或者諸如〇3、KMn〇4和NaI〇4的化合物，或者任何在有機化學中常規使用的親核性氧化劑。
[0141] 所述氧化劑優選地為過氧化氫(H2〇2)。
[0142] 典型地，過氧化氫是以35質量％ (這等價于大約10M的體積摩爾濃度）的水溶液的 形式可得的。
[0143] 優選地，典型地當所述氧化劑為過氧化氫時，所合并的氧化劑的量（以mol表示)與 在反應介質中存在的經氧化的非酚型木質素的量（以克表示）的比例在0.01/1和0.02/1之 間。
[0144] 所述方法的第二個步驟優選地在堿性介質中發生，尤其是當所述氧化劑為過氧化 氫時。因此，當所述方法的第一個步驟已經在具有中性或酸性pH的介質中發生時，則需要轉 換成堿性介質，并且這優選地在合并氧化劑之前。為了轉換成堿性介質，可以使用任何本身 已知的方法，例如將堿性水溶液(典型地，氫氧化鈉水溶液)添加到反應介質中。
[0145] 所述方法的實施
[0146] 現在將描述本發明的方法的典型實施。
[0147] 典型地，在同一個反應器中相繼地實施所述方法的步驟。
[0148] 備選地，可以在兩個不同的反應器中分開地施行這兩個步驟。
[0149] 根據一個特別的實施方案，在裝備有加熱系統、攪拌工具和任選地冷卻系統的反 應器中，引入非酚型木質素和一部分的溶劑，并且進行攪拌直至完全溶解。然后，添加在一 部分的溶劑中的氧化還原介體的溶液，隨后添加在其余的溶劑中的漆酶的溶液。
[0150] 然后，合并氧源，優選地連續地，典型地通過鼓吹入反應介質中，當所述氧源為氣 體的時。
[0151] 典型地，將混合物的溫度維持在20°C和60°C之間，優選地大約40°C，直至達到非酚 型木質素的完全氧化。在該階段，所述方法的第一個步驟就完成了。
[0152] 然后，可以回收經氧化的非酚型木質素。
[0153] 備選地，可以有利地通過在同一個反應器中施行第二個步驟來繼續所述方法。根 據該方式，可以通過使反應介質堿化(如果需要)來處于堿性pH中。
[0154] 然后，可以添加氧化劑，優選地連續地，典型地逐滴地，當所述氧化劑為溶液時。
[0155] 典型地，將混合物的溫度維持高于70°C，典型地大約90°C。
[0156] 通過SEC(空間排阻色譜法)來追蹤反應的進展。
[0157] 繼續攪拌和加熱反應介質直至獲得所希望的解聚程度。
[0158] -旦解聚結束，就可以通過使用本領域中的常規的純化技術（即過濾、提取、蒸餾 和/或通過色譜法分開)來回收木質素的解聚產物。尤其，可以通過蒸發來撤除溶劑，任選地 在減壓下。
[0159] 現在將借助于實施例和比較實施例來舉例說明本發明的方法。 實施例
[0160] 麵
[0161] 黑液（由 SMURF IT Kappa 提供的）
[0162] 硫酸二甲酯（由Sigma Aldrich銷售的）
[0163] 甘蔗渣木質素（由S0LVAY提供的）
[0164] 2，2-連氮基-雙-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）（ABTS)(由Sigma Aldrich銷售的）
[0165] 變色栓菌的漆酶（由Sigma Aldrich銷售的）
[0166] 乙酸鹽緩沖液(pH=4;50mM)
[0167] 過氧化氫(35% )(由Sigma Aldrich銷售的）
[0168] 實施例1 一從黑液開始提取牛皮紙木質素
[0169] 通過進行酸處理以便使牛皮紙木質素沉淀，來從蒸煮液（由SMURFIT KAPPA銷售 的）中提取牛皮紙木質素。用乙醇進行的后處理使得能夠去除殘留的鈉鹽。
[0170] 將800g黑液溶解在2L蒸餾水中，并且借助于6N HC1溶液使混合物緩慢地酸化(從 pH= 13至pH= 1.5)。然后，將混合物在4000rpm下離心10分鐘，回收粒狀沉淀，并且用pH = 1.5的HC1溶液再次進行處理和再次進行離心（用pH=l.3的HC1重做3次）。然后，向所獲得的 固體添加乙醇。在過濾后，蒸發乙醇相，并且用pH=l.5的HC1溶液洗滌殘留物以去除殘留的 鹽。在離心后，回收粒狀沉淀并凍干。獲得180g牛皮紙木質素。
[0171] 從180g如此獲得的牛皮紙木質素中，抽取10g，將其溶解在200mL四氫呋喃（THF) 中。在超聲下攪拌30分鐘后，將混合物過濾以去除在THF中不溶的白色固體沉積物。在蒸發 THF后，獲得9.2g棕色固體。將該棕色固體溶解在100mL二乙醚中（Et20)中。一個級分在Et20 中仍然是不溶的（8. lg)，和將可溶的級分(0.9g)在進行甲硅烷基化以便使這些化合物成為 揮發性的之后通過GC-MS來進行分析。
[0172] 該分析證明了單酚類例如香草醛或香草酸以及糖的降解殘留物的存在。不溶的級 分由經純化的牛皮紙木質素組成，其可以在后來用于甲基化和本發明的解聚方法。
[0173] 實施例2A-牛皮紙木質素的甲基化
[0174] 將lg牛皮紙木質素溶解在20mL的0.7M NaOH溶液(0.56g)中并在環境溫度下攪拌 混合物10分鐘，隨后緩慢地添加(逐滴地)〇. 8mL硫酸二甲酯（(Me0)2S02)。在環境溫度下繼續 攪拌30分鐘。然后，將反應混合物加熱至80°C并持續4小時，同時添加0.7M NaOH溶液以使反 應介質均質化(添加額外的大約l〇mL的0.7M NaOH)。在反應4小時后，將混合物帶回至環境 溫度，并且借助于2M HC1溶液來進行酸化直至pH = 2。過濾反應粗制物，并且將所獲得的固 體用蒸餾水進行洗滌，隨后通過凍干來進行干燥。獲得〇.874g經甲基化的木質素。
[0175] 實施例2B-甘蔗渣木質素的甲基化
[0176] 使用由S0LVAY所提供的甘蔗渣木質素，而無預先的預處理。
[0177] 將甘蔗渣木質素在實施例2A中所描述的條件下進行處理。獲得0.92g經甲基化的 木質素。
[0178] 實施例3A-經甲基化的木質素(源自牛皮紙木質素)的解聚
[0179] 將lg在實施例2A中所獲得的經甲基化的木質素溶解在25mL二卩惡烷中，并且在環 境溫度下攪拌混合物直至完全溶解。
[0180] 然后，制備51mg 2，2-連氮基-雙-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）（ABTS) (0 · lmmol) 在lmL乙酸鹽緩沖液(pH=4; 50mM)中的溶液，將其添加至經甲基化的木質素的溶液中。
[0181] 然后，制備5mg漆酶在200mL乙酸鹽緩沖液中的溶液，抽取24mL該溶液，將其緩慢地 添加至處于40°C的包含經甲基化的木質素的介質中。在添加漆酶后，通過在40°C下鼓吹1小 時來將氣態氧引入到混合物中，其中使用充滿氧的燒瓶。
[0182] 在于4°C下反應22小時后，添加 lmL的3M NaOH溶液，隨后緩慢地添加 lmL過氧化氫 水溶液(35%，1 Ommo 1)，將混合物在90°C下進行攪拌。
[0183] 通過SEC (空間排阻色譜法)來追蹤反應的進展。SEC分析通過使用三個串聯的TSK-凝膠類型的柱子(3000PW、4000PW、3000PW)來進行，其中使用在滲透水中的直至pH=12的1M 氫氧化鈉和NaN3(3%)作為洗脫劑。流量為lmL/分鐘，并且用波長為280nm的UV來進行檢測。
[0184] 所述反應的第一個步驟(漆酶/ABTS系統的作用）導致弱的解聚。第二個步驟(過氧 化氫的作用)導致強的解聚，其中形成已被分離和鑒定的低分子量的分子。
[0185] 在反應40小時后，借助于IN HC1溶液將混合物帶回至pH=6-7,并且用二氯甲烷(3 X50mL)對反應粗制物進行提取。在將有機相通過硫酸鈉(Na2S04)進行干燥并且使揮發性溶 劑蒸發之后，通過快速色譜法(洗脫劑為:二氯甲烷/甲醇99/1至90/10)來純化該粗制物。
[0186] 如此，從lg在實施例2A中所獲得的經甲基化的木質素開始分離出了30mg 3,4_二 甲氧基苯甲酸。
[0187] 比較實施例1
[0188] 作為比較，使在實施例1中所獲得的經純化的牛皮紙木質素經歷漆酶/ABTS系統的 作用，其中直接應用在實施例3A中所描述的反應條件(即不施行木質素的甲基化）。
[0189] 通過SEC來追蹤反應的進展(上面所描述的條件）：
[0190]
[0191] MP:分子量峰值，以g/mol表不
[0192] Mn:數均分子量，以g/mol表不
[0193] Mw:質均分子量，以g/mol表不
[0194] 觀察到，所存在的種類的平均分子量隨反應持續時間而增加。
[0195] 因此，當在未甲基化的牛皮紙木質素上施行漆酶/ABTS系統的作用時，沒有觀察到 解聚，而是相反地，觀察到木質素的分子量的增加。
[0196] 實施例3B-經甲基化的木質素(源自甘蔗渣木質素)的解聚
[0197] 通過應用在實施例3A中所描述的反應條件(將漆酶的作用延長至65小時，其后添 加過氧化氫)來處理在實施例2B中所獲得的經甲基化的木質素。
[0198] 通過SEC來追蹤反應的進展(上面所描述的條件）：
[0199]
[0200] 所述反應的第一個步驟(漆酶/ABTS)導致弱的解聚。第二個步驟(在t = 65小時之 時添加過氧化氫)導致解聚，其中產生未被分離和鑒定的低分子量的酚類。
[0201] 比較實施例2
[0202]作為比較，使甘蔗渣木質素經歷漆酶/ABTS系統的作用，其中直接應用在實施例3A 中所描述的反應條件(即不施行木質素的甲基化）。
[0203] 通過SEC來追蹤反應的進展(上面所描述的條件）： 「02041
[0205] 觀察到，所存在的種類的平均分子量隨反應持續時間而增加。
[0206] 因此，當在未甲基化的甘蔗渣木質素上施行漆酶/ABTS系統的作用時，沒有觀察到 解聚，而是相反地，觀察到木質素的分子量的增加。
[0207] 比較實施例3
[0208] 作為比較，使在實施例2B中所獲得的經甲基化的木質素在堿性介質中經歷過氧化 氫的作用，其中沒有預先經歷漆酶/ABTS系統的作用。
[0209] 將lg在實施例2B中所獲得的經甲基化的木質素溶解在25mL二13惡烷中，并且在環 境溫度下攪拌混合物直至完全溶解。
[0210]然后，向混合物添加25mL滲透水。
[0211] 添加 lmL的3M NaOH溶液，隨后緩慢地添加 lmL過氧化氫水溶液（35%，10mmol)，其 中在90 °C下攪拌混合物。
[0212] 通過SEC來追蹤反應的進展(上面所描述的條件）：
[0213]
[0214] ~觀察到比當將它預先通過漆酶/ABTS系統的作用進行處理時少的量的經甲基化的 木質素解聚。
[0215] 在并不希望被束縛于特定理論的情況下，該部分解聚通過下述事實來解釋:在木 質素中（和因此在經甲基化的木質素中），一定百分比的旨在通過合并"漆酶/介體"系統來 進行氧化的羥基官能團已經處于氧化狀態，即以酮的形式。在這些酮官能團附近的C-C鍵的 氧化斷裂引起部分解聚。
[0216] 然而，該實施例顯示，所述方法的第一個步驟對于優化過氧化氫的解聚作用來說 是必需的。
[0217] 在實施例2B、3B結束后和在比較實施例3結束后獲得的甘蔗渣木質素的比較分析 證明，當使經甲基化的木質素依次地經歷漆酶/ABTS系統的作用和然后經歷過氧化氫的作 用時，木質素的片段化是最有效的：
[0218]
【主權項】
1. 使木質素解聚的方法，所述方法包括： -通過在至少一種溶劑中合并非酚型木質素、漆酶、氧化還原介體和氧源來使非酚型木 質素氧化的步驟，由此獲得包含經氧化的木質素的混合物，和 -通過添加氧化劑來使如此獲得的經氧化的木質素解聚的步驟， 所述非酚型木質素是從酚型木質素開始通過使所述酚型木質素的酚官能團官能化而 獲得的。2. 根據權利要求1的方法，其中所述非酚型木質素為經烷基化的木質素。3. 根據權利要求1或2中任一項的方法，其中所述非酚型木質素為經甲基化的木質素。4. 根據權利要求3的方法，其中所述經甲基化的木質素是通過在堿性水溶液中合并酚 型木質素和甲基化試劑而獲得的。5. 根據權利要求4的方法，其中所述甲基化試劑為硫酸二甲酯。6. 根據權利要求1至5中任一項的方法，其中所述氧源為純氧或空氣。7. 根據權利要求1至6中任一項的方法，其中所述氧化還原介體為2,2_連氮基-雙-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）。8. 根據權利要求1至7中任一項的方法，其中所述氧化劑為過氧化氫。9. 根據權利要求1至8中任一項的方法，其中所述氧化步驟在堿性介質中進行。10. 根據權利要求1至9中任一項的方法，其中所述非酚型木質素源自牛皮紙木質素或 甘蔗渣木質素的酚官能團的官能化。
【文檔編號】C12P7/00GK105899728SQ201480073131
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2014年11月26日
【發明人】S·格赫里埃, G·庫巴尤亞
【申請人】波爾多聚合技術研究所, 波爾多大學, 國家科研中心