專利名稱：一株具有熒蒽降解能力的耐鹽堿產吲哚乙酸菌及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種微生物，說涉及一株具有熒蒽降解能力的耐鹽堿產吲哚乙酸菌及其應用。
背景技術：
在土壤中許多微生物能夠溶解難溶態磷，促進植物對磷的吸收，增加作物產量和改善作物品質，將解磷微生物作為生物肥料，不但可以提高土壤中磷的利用效率，節肥增產，而且可改善土壤結構，提高土壤有機質含量。植物促生菌(Plant Growth PromotingBacteria,簡稱PGPB)被界定為在一定條件下有利于植物生長的自由生活在土壤、根際、根表、葉際的細菌。這些細菌能夠固氮、溶磷、溶鐵，并產生植物激素，如生長素、赤霉素、細胞分裂素和乙烯。此外，它們還能提高植物的抗逆性，包括干旱、高鹽堿、重金屬和有機污染物毒害。但現在大部分植物促生菌還未被馴化成能有效提高植物各種抗逆性的菌株，因此從植物根際土中分離得到能有效提高植物各種抗逆性的植物促生菌成為熱點。
發明內容
本發明的目的是針對現有技術的上述不足，提供一種蠟狀芽孢桿菌，能高效產吲哚乙酸并能在高鹽堿條件生長且能利用難溶性磷酸鹽為磷源進行生長，并對多環芳烴熒蒽具有一定的降解效果。本發明的目的可通過如下技術方案實現；
本發明的一種蠟狀芽孢桿菌(Bacillus Cereus ZZ13)，于2013年3月15日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，分類名為蠟狀芽孢桿菌(BacillusCereus)，保藏號 CGMCC N0.7322。所述蠟狀芽孢桿菌菌落較小為淡黃色、隆起，邊緣整齊，表面光滑濕潤，不透明，不規則桿狀排列，產芽孢。所述蠟狀芽孢桿菌的生理生化特性是:革蘭氏陽性，嚴格好氧，化能異養，接觸酶陽性，M.R和VP試驗陰性，淀粉水解陽性，明膠水解陽性，硝酸鹽還原陽性，檸檬酸鹽利用陰性。本發明所述的蠟狀芽孢桿菌培養時使用的主要氮源包括但不限于蛋白胨、酵母粉、硝酸鉀、硝酸銨、硫酸銨、谷氨酸；使用的主要碳源包括但不限于蔗糖、木糖、甘露醇、麥芽糖、乳糖、果糖、葡萄糖；使用的無機組分包括但不限于氯化鉀、氯化鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鉀、磷酸三鈣、二水氯化鈣、七水合硫酸鎂、七水合硫酸亞鐵。本發明的蠟狀芽孢桿菌發酵可在20 35°C，pH6 10的環境下進行。本發明所述的蠟狀芽孢桿菌分泌吲哚乙酸(IAA)的能力強，在30°C、180r/min搖床培養條件下24h其轉化IAA能力達46.67 μ g.ml/1。吲哚乙酸是植物激素的一種，能夠促進根的發育。產吲哚乙酸的菌種，往往附著在植物根系或葉表面，利用植物代謝產生分泌物的同時產生IAA和少量GA3等植物激素來影響植物的生理過程和形態變化。表現為直接促進根的伸長，從而增大了與土壤中營養物質的接觸的機會；可提高植物體內源IAA的含量；誘導植物防衛基因的表達，提高植物體抗病，抗旱等抗逆性。作為本發明的優化方案，所述蠟狀芽孢桿菌的發酵在溫度為28°C、pH6 10下進行，該環境下產IAA量最高。作為本發明的進一步優化，所述蠟狀芽孢桿菌采用的碳源為甘露醇，采用的氮源為酵母粉或蛋白胨或兩者的組合。利用上述碳源和氮源制得的培養基，培育出的蠟狀芽孢桿菌產IAA的量最高。本發明所述的蠟狀芽孢桿菌可以在高鹽堿度條件下進行生長并產IAA。在實驗室搖瓶條件下，所述蠟狀芽孢桿菌可以在pH為10.5的條件下生長且產IAA，并可以在LB培養基含鹽度為7%的條件下生長，在含鹽度為4%時可產Ikk0本發明所述的蠟樣芽孢桿菌以難溶性磷酸鹽為磷源進行生長，并將其轉化為可溶性磷酸鹽。在實驗室搖瓶條件下，所述蠟狀芽孢桿菌對磷酸三鈣的轉化量達148.09mg.1/1。相對于空白對照的結果，所述蠟狀芽孢桿菌對磷酸三鈣的轉化量比空白對照高出
110.66mg.L_1o本發明所述的蠟樣芽孢桿菌多環芳烴熒蒽具有一定的降解效果。在實驗室搖瓶條件下，所述蠟狀芽孢桿菌在熒蒽初始濃度為SOmg.!/1的無機鹽培養基條件下培養7d后降解率為18.89%，有一定的降解效果。有益效果:本發明的一種蠟狀芽孢桿菌能能高產吲哚乙酸并能耐鹽堿生長且能利用難溶性磷酸鹽為磷源進行生長，并對多環芳烴熒蒽具有一定的降解效果，可用于制備生物肥料。
·圖1是本發明菌株ZZ13的菌落2表示ZZ13菌株對難溶性磷的利用情況圖3表示不同裝液量對菌株ZZ13產IAA的影響圖4表示不同初始pH對ZZ13菌株產IAA的影響圖5表示不同碳源對菌株ZZ13產IAA的影響圖6表示不同氮源對ZZ13菌株產IAA的影響圖7表示不同含鹽度對ZZ13菌株產IAA的影響圖8表示ZZ13菌株對多環芳烴熒蒽的降解效果生物材料保藏信息蠟狀芽孢桿菌ZZ13，分類命名為蠟狀芽孢桿菌Bacillus Cereus，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期為2013年3月15日，保藏地址為北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，保藏號CGMCC N0.7322。
具體實施例方式下面結合附圖對本發明作更進一步的說明。實施例1首先準備以下三種培養基。LB培養基:蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化鈉10g，瓊脂20g，蒸餾水1000ml，ρΗ7.0 - 7.2，121°C滅菌，20min。LB液體培養基:不加瓊脂，其它條件同上。無機磷細菌培養基(ΡΚ0培養基):磷酸三鈣5g，葡萄糖10g，硫酸銨0.5g，氯化鈉
0.3g，七水合硫酸鎂0.3g，氯化鉀0.3g，硫酸錳0.03g,七水合硫酸亞鐵0.03g, ρΗ7.0瓊脂20g，蒸餾水 1000ml, ρΗ7.0 7.2。121°C滅菌，20min。無機鹽培養基:硫酸銨2.0g ;磷酸二氫鈉0.5g ;磷酸氫二鉀0.5g ;七水硫酸鎂
0.2g ;二水氯化鈣 0.lg，蒸餾水 IOOOmL, ρΗ7.0,121°C滅菌，20min。將從南京紫金山腳采取的植物根際土挑根過篩后稱取IOg置于盛有IOOml滅菌水的250ml的三角瓶中，在搖床中，30°〇，1501'.1^11_1振蕩20min，靜置lOmin，得到土壤懸浮液。該土壤懸浮液中含有若干種促生菌，采用稀釋法稀釋后涂于LB培養基，將平板倒置，于300C，恒溫箱中培養24h后，挑取不同類型典型單個菌落，經平板純化后，4°C保存在LB斜面待用。下面再通過定性測定和定量測定篩選出可分泌吲哚乙酸的細菌。定性測定:將分離純化后的細菌接種于含有L -色氨酸(200mg/L)的LB液體培養基，30°C，180r.min_1搖床培養Id。取50yL菌懸液滴于白色陶瓷板上，同時加50yLSalkowski 比色液(50mL35%HC104+lmL0.5M FeCl3)。將加入 50 μ L50mg/L 吲哚乙酸的比色液作為陽性對照。白色陶瓷板于室溫避光放置30min后觀察，顏色變紅者表示能夠分泌吲哚乙酸。定量測定:對初篩獲得的分泌IAA的細菌進行定量測定，培養條件同上。首先用分光光度法測定菌懸液的0D_值 ，然后將菌懸液以IOOOOr.HiirT1離心IOmin取上清液加入等體積Salkowski比色液，避光靜置30min，測定其OD53tl值。計算菌濃度OD6tltl值為I時，單位體積發酵液中吲哚乙酸的含量。標準曲線的繪制采用分析純的吲哚乙酸梯度稀釋制備。把得到的產IAA菌進行溶磷情況的篩選測定，將供試菌株接種于盛有30mL無機磷細菌液體培養基的150mL三角瓶，30°C，180r.mirT1培養4d后，將培養液裝入離心管4°C下IOOOOr.mirT1離心，15min。取上清液用鑰藍比色法測定有效磷含量。通過以上測定即篩選出一株高產吲哚乙酸且溶磷能力強的菌株，如圖1所示，該菌株形成的菌落為較小淡黃色、隆起，邊緣整齊，表面光滑濕潤，不透明，不規則桿狀排列，產芽孢，株型命名為ZZ13。該菌株在實驗室搖瓶條件下，所述蠟狀芽孢桿菌對磷酸三鈣的轉化量達148.09mg-L^10相對于空白對照的結果，所述蠟狀芽孢桿菌對磷酸三鈣的轉化量比空白對照高出110.66mg.1/1 (圖2)。將上述方法篩選分離出的菌株，經上海英俊生物工程有限公司測序，根據16SrDNA的測序結果，在http://www.ncb1.nlm.nih.gov在線查詢分析,利用Blast軟件在GenBank中與其它的16S rDNA序列進行同源性比較，選擇相近的序列與ZZ13的序列用MEGAversion3軟件構建ZZ13的16SrDNA系統進化樹。根據該菌株的生理生化特征，鑒定為蠟狀芽孢桿菌(Bacillus Cereus)，同源性為99%。將該菌株于2013年3月15日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏號CGMCC N0.7322。實施例2好氧性試驗把滅過菌的LB培養基倒入3個已滅菌的試管中，大約在2/3處，在無菌操作臺上，用接種針挑取斜面培養的菌ZZ13(CGMCC N0.7322)，穿刺接種到上述培養基中(必須穿刺到管底)。30°C培養，分別在3天至7天觀察結果。在瓊脂柱表面上生長者為好氧菌，如沿穿刺線生長者為厭氧菌或兼性厭氧菌。過氧化氫酶的測定在干凈載玻片上滴I滴3%H202，取18 24h的LB斜面培養物I環，在H2O2中涂抹，若有氣泡產生則為陽性，否則為陰性。甲基紅試驗(M.R試驗)a.培養基及試劑:蛋白胨5g,葡萄糖5g,氯化鈉5g,蒸懼水IOOOmL,調節pH7.0
7.2，分裝試管，每管裝4 5mL，121°C滅菌20min。試劑:甲基紅0.1g, 95%酒精300mL，蒸餾水200mL。b.菌種培養及結果觀察接種菌株于上述培養液中，30°C培養I 2天。在培養液中加入幾滴甲基紅試劑，如培養液呈現紅色，為甲基紅陽性，黃色為陰性(甲基紅變色范圍
4.4紅色 6.0黃色)。乙酞甲基甲醇試驗(VP試驗)a.培養基培養基同甲基紅試驗。b.菌種 培養及結果觀察接種與培養同甲基紅試驗。做VP試驗時，取培養液(約2mL)和等量的40%Na0H相混合，加少量肌酸，充分振蕩2 5min后，如培養液出現紅色，即為VP陽性。淀粉水解試驗a.培養基及試劑在肉湯蛋白胨瓊脂中添加0.2%的可溶性淀粉，分裝三角瓶，121°C滅菌20min備用。路哥氏碘液:碘片lg，碘化鉀2g，先用少量(3 5mL)蒸餾水溶解碘化鉀，現加入碘片，待碘完全溶解后，加水稀釋至300mL。b.菌種培養及結果觀察取菌種點接于平板上，30°C培養2 4天，形成菌落后，在平板上滴加路哥氏碘液，以鋪滿菌落周圍為度，平板呈藍色，而菌落周圍如有無色透明圈出現，說明淀粉已被水解。透明圈的大小一般說明水解淀粉能力的大小。明膠水解試驗a.培養基及試劑蛋白胨5g，明膠120g，蒸餾水1000mL。調節ρΗ7.2 7.4，分裝試管，培養基高度約為4 5cm，121°C滅菌20min。b.菌種培養及結果觀察用穿刺法接種在試管中央。在30°C溫箱中培養一個月，觀察明膠是否液化。硝酸鹽還原試驗a.培養基及試劑蛋白胨10g, KNO3Ig,蒸餾水IOOOmL, ρΗ7.0 7.4。格里斯氏(Gries)試劑:Α液:對氨基苯磺酸0.5g，稀醋酸(10%左右)150mL ；B液:蔡胺0.lg，蒸餾水20mL，稀醋酸(10%左右)150mL。二苯胺試劑:二苯胺0.5g溶于IOOmL濃硫酸中，用2OmL蒸餾水稀釋。b.菌種培養及結果觀察將試驗菌接種于硝酸鹽液體培養基中，30°C培養1、3、5天。在白色瓷盤小孔中倒入少許培養液，然后在其中分別滴I滴試劑A和B液，當培養液變為粉紅色、玫瑰紅色、橙色或棕色等時，表示有亞硝酸鹽存在，為硝酸鹽還原陽性，否則為陰性。
檸檬酸鹽的利用a.培養基及試劑檸檬酸鈉 2g，NaC15g, MgSO4.7H200.2g，(NH4) 2.HPO4Ig, 1% 澳百里香酚藍水溶液10mL，瓊脂20g，蒸餾水IOOOmL, ρΗ6.8 - 7.0,121°C滅菌20min。b.菌種培養及結果觀察取幼齡菌種接種于斜面上，30°C培養3 - 7天,培養基呈堿性(藍色)者為陽性反應，不變者則為陰性。表I蠟狀芽孢桿菌ZZ13 (CGMCC N0.7322)生理生化特征
權利要求
1.一株具有突蒽降解能力的耐鹽堿臘狀芽孢桿菌(Bacillus Cereus)ZZ13,于2013年3月15日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏號CGMCC N0.7322。
2.權利要求1所述的臘狀芽孢桿菌(BacillusCereus) ZZ13在降解多環芳烴突蒽中的應用。
3.權利要求1所述的蠟狀芽孢桿菌(BacillusCereus) ZZ13在制備生物肥料中的應用 。
全文摘要
本發明公開了一株具有熒蒽降解能力的耐鹽堿產吲哚乙酸菌及其應用，屬于微生物領域，該蠟狀芽孢桿菌(Bacillus Cereus ZZ13)，于2013年3月15日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，分類名為蠟狀芽孢桿菌(Bacillus Cereus)，保藏號CGMCC No.7322。該菌株能高產吲哚乙酸并能耐鹽堿生長且能利用難溶性磷酸鹽為磷源進行生長，并對多環芳烴熒蒽具有一定的降解效果。
文檔編號A62D101/20GK103243055SQ201310200180
公開日2013年8月14日 申請日期2013年5月24日 優先權日2013年5月24日
發明者李輝信, 張振, 徐莉, 陳雄, 李偉明, 李方卉, 焦加國, 劉滿強, 陳小云, 胡鋒 申請人:南京農業大學