煤矸石中耐重金屬青霉菌的分離鑒定及應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種從礦區煤矸石中篩選出的耐重金屬鎘的青霉菌BJKD4(Penicillium?sp.)，該菌保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏號CGMCC?NO.6620。本發明青霉菌BJKD4菌株對鎘鹽及多種重金屬復合污染有強耐性，在煤矸石山的復墾和土壤重金屬污染的生態修復中起著重要作用。
【專利說明】煤矸石中耐重金屬青霉菌的分離鑒定及應用
【技術領域】:
[0001]本發明涉及治理重金屬污染的生物修復【技術領域】，具體涉及一種耐重金屬鎘青霉菌的分離及其應用。
【背景技術】:
[0002]高硫煤矸石經風化淋溶作用可產生強酸性的淋溶液，導致其中的重金屬被淋溶出來，這些含重金屬的酸性廢水沿矸石堆徑流，向周邊土壤和水體遷移，導致矸石山及周邊土壤和水體受到嚴重酸化和重金屬污染，如鎘、銅、鉛、鋅等。有些金屬是有機體生命活動不可缺少的元素，但過量的重金屬都存在潛在的毒性效應，Berny P等報道了重金屬對人類、動物、植物和微生物造成的一系列嚴重危害。廣泛用于重金屬污染修復的物理或化學等方法，存在許多缺點，費用昂貴，處理過程中向土壤中加入的試劑等又給周邊環境造成二次污染，另外Wang and chen等研究表明當重金屬污染物含量低于100mg/L時,這些方法都不能有效降低重金屬毒性。而生物修復被認為是一種清潔、無污染且效率高的方法，越來越受到廣大學者關注，其中微生物修復是主要的修復技術。
[0003]用于修復重金屬污染的微生物主要是土著真菌和細菌，不同微生物種類對重金屬污染的耐性也不同，通常為真菌 > 細菌 > 放線菌，又由于真菌在自然界中分布很廣，對環境適應能力強，且許多具有重金屬抗性和富集能力，在生物處理技術中得到廣泛關注。污染土壤中的微生物往往具有較高的重金屬抗性，從污染區分離篩選的土著微生物適應了當地的自然環境，所以能有效修復重金屬污染。杜愛雪等從銅礦尾礦土壤中分離出一株高抗Cu2+、Zn2+和Cd2+等的青霉菌。在銅礦冶煉廢水中篩選出高抗銅的惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida strain S4) 能在提供營養液條件下有效去除水體中的Cu2+和Zn2+。白腐真菌對鉛有較強的去除作用，其最大吸附量可達108.4mg/g，吸附率可達95%。從鎘污染土壤中篩選出2株酵母菌，對Cd2+吸附率可分別達到79.85%和89.04%。盡管多種耐重金屬真菌已被分離，但由于高硫煤矸石經風化淋溶作用產生含較高濃度重金屬的強酸性廢水，致使多數微生物無法繁衍，另外，用于治理煤矸石污染的微生物和修復菌劑未見報道。因此，在酸性矸石山中篩選耐重金屬真菌，研究其重金屬的耐性和富集機理，對煤矸石山重金屬污染的修復具有十分重要的意義。
【發明內容】
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[0004]本發明的目的是提供一種能夠耐受重金屬鎘的菌種——青霉菌BJKD4 (Penicillium sp.)。
[0005]本發明所提供的菌株為青霉菌BJKD4菌株，該菌株于2012年09月25日保藏于北京市朝陽區北辰西路I號院，中國科學院微生物研究所，中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏號CGMCC N0.6620。
[0006]本發明所述耐重金屬鎘的青霉菌具有以下有益效果:耐受重金屬鎘的能力強，可以耐受3.2g/L鎘離子濃度，且對多種重金屬鹽具有較強的耐性，在對生物修復由酸性煤矸石淋溶引起的重金屬污染中起著重要作用。
【專利附圖】
【附圖說明】:
[0007]圖1:BJKD4菌株在固體查氏培養基中的菌落形態
[0008]圖2:顯微鏡下BJKD4菌株的分生孢子梗
[0009]圖3:BJKD4菌株的系統進化發育分析樹
[0010]圖4:不同濃度CdCl2脅迫對BJKD4菌株生長的影響
[0011]圖5:不同重金屬對BJKD4菌株生長的影響
[0012]圖6:不同濃度煤矸石浸出液對BJKD4生長的影響
【具體實施方式】
[0013]以下通過具體實施例來詳細說明本發明
[0014]實施例1:本發明青霉菌的分離。
[0015]從淮南謝家集煤礦區隨機取12個樣點混合組成代表樣，進行富集篩選。將5g矸石樣加入到45mL馬丁氏液體培養基中，28°C、180r/min富集培養48h，然后，取2mL富集菌液接種于含100mg/L Cd2+的新鮮培養基中培養，渾濁后取ImL富集培養液接種于含200mg/L Cd2+的液體培養基中培養，依此類推，逐級提高Cd2+濃度，在300-5000mg/L Cd2+的培養基中進行馴化培養。取0.2mL1000mg/L Cd2+的菌液涂布在5000mg/L Cd2+的固體培養基上，倒置于28°C恒溫培養箱中培養120h，分離耐Cd菌株。根據菌落形態初步觀察BJKD4單克隆菌株為霉菌，將其接種到500~3500mg/L Cd2+查氏培養基中馴化培養，進行菌種鑒定和耐重金屬特性研究。
[0016]馬丁氏培養基:葡萄糖IOg,磷酸二氫鉀Ig,蛋白胨5g,硫酸鎂0.5g, 1/3000孟加拉紅IOOmL,加蒸餾水800mL，pH自然。121°C滅菌30min，臨用前加入0.03%鏈霉素稀釋液IOOmL,使每毫升培養基中含鏈霉素30 μ g。固體培養基是在此培養基中加入15~20g瓊脂。
[0017]查氏培養基:硝酸鈉2g，磷酸氫二鉀lg，氯化鉀0.5g，硫酸鎂0.5g，硫酸亞鐵0.018，蔗糖308，瓊脂18-208，去離子水10001^，？!1自然。重金屬篩選培養基是在此培養基中加入不同濃度的重金屬鹽。
[0018]菌落形態特征:BJKD4菌株在固體查氏培養基中培養14d后(圖1)，菌落為氈狀，表面有滲出液，有規則的放射狀褶裂，中心有臍狀突起并有幾道同心紋，顯微鏡觀察到菌絲有隔膜(圖2)，從氣生菌絲生出單生的分生孢子梗，分生孢子梗有橫隔膜，頂端生排列成帚狀的間枝，分支I次或多次，分生孢子串成不分支的鏈狀，分生孢子呈球形。
[0019]實施例2:本發明青霉菌BJKD4菌株的18S rDNA序列測定
[0020] 菌株的18S rDNA序列分析:采用CTAB (十六烷基三甲基溴化銨)法提取基因組。使用擴增引物:SSU817TTA GCA TGG AAT AAT RRAATA GGA 和 SSU1536AAT GCAATG CYC TATCCC CA進行聚合酶鏈式反應(PCR)擴增DNA。50 μ L反應體系含有:10*PCR緩沖液5 μ L、IOmmoI/L Dntp0.25L、45pmol/ μ L 引物 0.5 μ L、2.5U/ μ L Taq 酶 0.5 μ L、DNA 模板 I μ L 和滅菌的去離子水42.25 μ L0 PCR反應條件:94°C變性lmin，50°C退火30s、72°C延伸90s、40個循環，72°C最終延伸5min。PCR反應產物2 μ L于I %的瓊脂凝膠電泳。DNA序列由北京華大基因公司測定，用BLAST (http: //www.ncb1.nlm.nih.gov/BLAST)程序進行DNA序列比對。
[0021]BLAST比對分析表明:BJKD4的18S rDNA序列(基因序列注冊號:HM439093)與青霉屬(Penicilliumsp.)、正青霉屬(Eupenicillium sp.)和子囊菌綱(Ascomycetesp.)的同源性均為99%，用MEGA5.0軟件構建18S rDNA系統發育樹(圖3)。結合形態觀察和分子分析，我們認為BJKD4屬于青霉屬(Penicilliumsp.)。
[0022]實施例3:本發明所述青霉菌耐重金屬的能力測定
[0023]1、BJKD4菌株對重金屬鎘的耐性:將活化2天的菌株接種到含0、1、3、9、18或36mmol/LCd2+的固體查氏培養基中，28°C下培養16d，第3d時開始測量菌落直徑。[0024]測試結果表明:BJKD4菌株在含0-36mmol/L Cd2+的查氏固體培養基中生長16d，其菌落直徑隨著培養天數的延長而增加，隨著Cd2+濃度的增加而降低(圖4)。在無Cd2+培養基(對照)中，菌落生長的延滯期為0-4d，對數生長期為4-15d，16d時進入穩定期；而添加重金屬Cd2+(l-36mm0l/L)后，延滯期延長到第6d，然后進入對數期，14_15d時達到穩定期。與對照相比，BJKD4菌株在l-36mmol/L Cd2+平板上生長5_16d時，其菌落直徑顯著低于對照，而不同濃度Cd2+處理對菌落直徑大小無明顯影響，說明BJKD4為耐鎘菌。
[0025]2、BJKD4菌株對不同重金屬的耐性:菌株在液體查氏培養基中活化2d，取2 μ L菌液接種到含有單一不同濃度重金屬 Cd2+(0、1、3、9、18 和 36mmol/L)、Cu2+(0,0.05,0.1、0.2、
0.3 和 0.4mmol/L) ,Ni2+ (0,0.9、1.8、2.7、3.6 和 4.5mmol/L)、Pb2+(0、1、2、4、6 和 8mmol/L)、Zn2+(0、14、28、42、56 和 70mmol/L)、或 Mn2+(0、20、40、60、80 和 IOOmmoI/L)的固體查氏培養基中，倒置于恒溫培養箱中，28°C培養8d時測量菌落直徑。
[0026]測試結果表明:不同重金屬對BJKD4菌株生長的抑制效果不同(圖5)，其菌落直徑隨著重金屬濃度的升高逐漸減小。BJKD4菌落直徑在含有0.05mmol/L Cu2+培養基中迅速下降，0.2mmol/L Cu2+時菌株不能生長；Cd2+濃度為lmmol/L時,菌落直徑顯著降低,之后隨著 Cd 濃度(l-36mmol/L)的增加緩慢減小；隨著 Ni2+(0_4.5mmol/L)、Pb2+(0-8mmol/L)和Zn2+(0-70mmol/L)濃度的升高，菌落直徑直線下降，且重金屬濃度相同時，Pb2+和Zn2+脅迫時菌斑直徑大于Ni2+脅迫時的直徑；在小于20mmol/LMn2+(低濃度)時可以促進BJKD4菌株生長，而在大于20mmol/L Mn2+(高濃度)時其直徑隨Mn2+濃度升高而迅速減小。在y軸最大生長速率的50%處作水平線，其與生長率曲線相交點處所對應X軸上的濃度則為EC50。比較EC50得知不同重金屬對BJKD4的毒性大小依次為:Cu2+ > Ni2+ > Cd2+ > Pb2+或Zn2+ >Mn2+。
[0027]3、BJKD4菌株對復合重金屬污染的耐性:根據單一重金屬(Cd2+、Ni2+、Zn2+、Mn2+)對菌株生長的影響，設計L25 (54)正交試驗，配制不同重金屬復合污染的固體培養基，接種2yL菌液，28°C培養8d，測定菌落直徑。實驗重復三次，用SPSS軟件分析。
[0028]測試結果表明:BJKD4菌株在重金屬復合污染培養基生長8d的菌落直徑見表1。BJKD4菌落直徑在4種重金屬復合污染條件下均增加；從直觀分析表中極差(R)的大小(表I)看出不同重金屬對BJKD4生長影響的大小依次為:Mn2+ > Cd2+ > Zn2+ > Ni2+。從K值分析可知Cd2+和Mn2+抑制菌株生長，而Zn2+表現為低濃度促進作用，Ni2+在5水平下的K值相近。方差分析(表2)表明:Cd2+、Zn2+和Mn2+顯著影響BJKD4的生長，Ni2+沒有顯著作用。此外，濃度為 2.2Smmol/T, Cd2+, 1 Smmol/I, Zn2+,0-2.4mmo1 /T-Ni2+ 和 80mmol/L Mn2+等復合重金屬對BJKD4生長的抑制作用小于其他組合，表明BJKD4菌株可耐多種重金屬復合污染。
[0029]表1正交試驗BJKD4的直徑及直觀分析
[0030]
【權利要求】
1.一株耐重金屬鎘的青霉菌,其特征在于,該菌株屬于青霉菌屬Penicillium sp.,命名為BJKD4 ;該菌株保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏號 CGMCC N0.6620。
2.如權利要求書I所述的耐重金屬鎘的青霉菌BJKD4，其形態和生理生化特征: a、BJKD4菌落為氈狀，表面有滲出液，有規則的放射狀褶裂，中心有臍狀突起并有幾道同心紋，在液體培養基中有菌絲也有菌絲球，培養液較透明。 b、菌絲有隔膜，從氣生菌絲生出誕生的分生孢子梗，分生孢子梗有橫隔膜，頂端生排列成帚狀的間枝，分支I次或多次，分生孢子串成不分支的鏈狀，分生孢子呈球形。
3.如權利要求書I所述的耐重金屬鎘的青霉菌BJKD4，其特征在于，所述菌株的18SrDNA序列如SEQID N0.1所示。
4.如權利要求書1-3所述的耐重金屬鎘的青霉菌BJKD4，能用于煤矸石山復墾和土壤重金屬污染的生態 修復。
【文檔編號】A62D101/43GK103923839SQ201310015361
【公開日】2014年7月16日 申請日期:2013年1月16日 優先權日:2013年1月16日
【發明者】張玉秀, 柴團耀, 李霞 申請人:中國礦業大學(北京)