專利名稱：擬除蟲菊酯類農藥降解菌及其分離純化方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，尤其是涉及一種降解海水環境中擬除蟲菊酯類農藥降解菌及其分離純化方法和應用。
背景技術：
擬除蟲菊酯類農藥是一類高效、廣譜農藥，具有低毒、排泄迅速、能被生物降解等特點，因此，經常用于漁業生產上殺滅寄生蟲和敵害生物。然而，由于養殖用戶缺乏科學理論的知識，在清塘時大量使用擬除蟲菊酯類農藥，同時，擬除蟲菊酯類農藥在農田使用后，隨地表徑流進入近海養殖海域；最終導致近海海域水環境和沉積物中環境質量惡化，造成農藥殘留污染。由于此類農藥對魚、貝和甲殼類等水生生物毒性較大，因此，近年來，頻繁發生污染、養殖生物死亡事件，特別是最近研究表明，由于此類農藥的降解速度較慢且屬親脂 性農藥，易被水生生物富集，并且有些品種有致癌、致畸、致突變和神經毒性等生理作用，從而對水體生態系統和水產品質量產生嚴重影響，最終導致市售水產品中該類農藥出現超標現象，其殘留給人類健康帶來了巨大的威脅。因此，擬除蟲菊酯類農藥引起的海水養殖環境污染問題受到人們的普遍關注，如何有效的去除擬除蟲菊酯類農藥的殘留污染和進行監控對保護近海生態環境、發展綠色養殖和保障食品安全具有重要意義。現有的以生物修復為理論基礎的農藥殘留降解技術為解決這一難題提供了新的思路，微生物降解作為環境中農藥降解的主要方式，具有以下優點①農藥本身在自然界中的降解速度較慢，而利用微生物可加速農藥的降解過程；②利用微生物對農藥的降解通常只是一個自然過程的強化，不會導致二次污染和污染物的轉移，可使環境中的污染物減少到最小程度。然而，目前微生物降解農藥的研究主要集中在土壤、水果和淡水沉積物等環境，而對于近海環境中擬除蟲菊酯類農藥殘留的降解菌的篩選等研究較少。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種能夠同時降解海水養殖環境中氯氰菊酯、溴氰菊酯、氰戊菊酯、氟氯氰菊酯和聯苯菊酯的擬除蟲菊酯類農藥降解菌及其分離純化方法和應用。本發明解決上述技術問題所采用的技術方案為一種擬除蟲菊酯類農藥降解菌，該菌株為HS-24菌株，分類命名為噬甲基菌(Methylophaga sp.)，于2012年4月24日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No. 6046，該菌株的16S rRNA 的 Genbank 登陸號為 JX087925。菌株的生物學特征為革蘭氏染色陰性，為桿菌，精氨酸雙水解試驗、賴氨酸脫羧酶試驗、V-P反應、明膠液化試驗陽性，β -半乳糖甙酶、鳥氨酸脫羧酶、色氨酸脫氨酶試驗、尿素酶試驗、吲哚試驗、H2S反應均為陰性，不可以利用蔗糖。該菌株海水中生長，最適生長溫度25_30°C，最適生長pH為7. 0-7. 8，在固體培養基上，菌落圓形、較薄，呈白色，半透明。
一種擬除蟲菊酯類農藥降解菌的分離純化方法，具體包括如下步驟
(1)培養基配制
將氯氰菊酯、溴氰菊酯、氰戊菊酯、氟氯氰菊酯和聯苯菊酯分別相應加入I. 5倍重量的乳化劑，制備成相應的濃乳液，然后將各個濃乳液分別加入到營養培養基中，使氯氰菊酯、溴氰菊酯、氰戊菊酯、氟氯氰菊酯和聯苯菊酯終濃度分別為100mg/L，得到富集培養液；
(2)降解菌分離純化
取500 mL海水樣品無菌狀態下過濾富集后，加入到含富集培養液的三角瓶中，在溫度28°C、轉速180 rpm的條件下，培養7d，按10%接種量轉移到新配制的富集培養液中，再在溫度28°C、轉速180 rpm的條件下，培養7d，取培養基發酵液進行平板劃線分離、純化，直到篩選得到單個菌落，將純化后的各菌落分別接至新配制的富集培養液中，在溫度28°C、轉速180 rpm的條件下，振蕩培養7d，通過氣相色譜-電子捕獲器檢測各富集培養液中擬除蟲菊·酯類農藥殘留量，篩選對氯氰菊酯、溴氰菊酯、氰戊菊酯、氟氯氰菊酯和聯苯菊酯5種擬除蟲菊酯類農藥具有高效降解能力的菌株，即為降解海水環境中擬除蟲菊酯類農藥的降解菌HS-24。所述的營養培養基的配制方法如下蛋白胨5. O g，磷酸高鐵O. 01 g，酵母膏I. Og，過濾海水1000 mL, pH 7. 0-7. 8,于121°C高壓蒸汽滅菌20 min后制得。所述的乳化劑為吐溫-20。一種擬除蟲菊酯類農藥降解菌的應用，該菌株可用于海水及沉積物環境中氯氰菊酯、溴氰菊酯、氰戊菊酯、氟氯氰菊酯、聯苯菊酯農藥的生物降解。該菌株在ρΗ7· 0-7. 8、溫度25_30°C、擬除蟲菊酯類農藥濃度100 mg/L條件下對氯氰菊酯(CYP)、溴氰菊酯(DEL)、氰戊菊酯(FEN)、氟氯氰菊酯(CYF)、聯苯菊酯(BIF)五種擬除蟲菊酯類農藥的降解能力均達到75%以上。與現有技術相比，本發明的優點在于本發明的高效擬除蟲菊酯類農藥降解菌可安全、高效、快速的降解海水環境中殘留的氯氰菊酯、溴氰菊酯、氰戊菊酯、氟氯氰菊酯和聯苯菊酯5種擬除蟲菊酯類農藥，在近海環境保護、養殖環境農藥殘留污染治理和保障食品安全方面具有很好的應用前景。上述降解海水環境中擬除蟲菊酯類農藥的降解菌，該菌株分類命名為噬甲基菌(Methylophaga sp.)菌株為 HS-24 株，保藏編號為 CGMCC No. 6046，于 2012 年 4 月 24 日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址為北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所。
圖I為本發明擬除蟲菊酯類農藥降解菌的掃描電鏡 圖2為本發明氯氰菊酯(CYP)、溴氰菊酯(DEL)、氰戊菊酯(FEN)、氟氯氰菊酯(CYF)、聯苯菊酯(BIF)的標準樣品色譜圖。
具體實施例方式以下結合附圖實施例對本發明作進一步詳細描述。
具體實施例一
擬除蟲菊酯類農藥降解菌株的篩選
I、培養基和試劑
營養培養基蛋白胨5. O g，磷酸高鐵O. 01 g，酵母膏I. O g，過濾海水1000 mL, pH7.6-7.8，高壓蒸汽滅菌(1211，20 min)后制得；
富集培養液將氯氰菊酯、溴氰菊酯、氰戊菊酯、氟氯氰菊酯和聯苯菊酯分別相應加入
I.5倍重量的乳化劑吐溫-20，制備成相應的濃乳液，然后將各個濃乳液分別加入到營養培養基中，使氯氰菊酯、溴氰菊酯、氰戊菊酯、氟氯氰菊酯和聯苯菊酯終濃度分別為IOOmg/L，得到富集培養液。2、菌株分離純化
海水樣品采自寧波近岸海域，取500 mL海水無菌狀態下過濾，富集后，加入到含有濃度為100 mg/L的氯氰菊酯、100 mg/L的溴氰菊酯、100 mg/L的氰戍菊酯、100 mg/L的氟氯氰菊酯、100 mg/L的聯苯菊酯的富集培養液的250ml三角瓶中，在溫度28°C、轉速180 rpm的條件下，培養7 d，按10%體積接種量轉移到新鮮的含氯氰菊酯、溴氰菊酯、氰戊菊酯、氟氯氰菊酯、聯苯菊酯各100 mg/L的富集培養液中，同條件培養I周，取培養基發酵液進行平板劃線分離、純化，直到篩選得到單個菌落，將純化后的各菌落分別接至富集培養液中振蕩培養(25°C，180 rpm)7d，通過氣相色譜-電子捕獲器(GC-E⑶)檢測各富集培養液中擬除蟲菊酯類農藥殘留量，最后篩選獲得一株對上述5種擬除蟲菊酯類農藥具有高效降解能力的菌株，命名為HS-24。
該菌株分類命名為噬甲基菌(Methylophaga sp.)，菌株為HS-24株，保藏編號為CGMCCNo. 6046，于2012年4月24日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址為北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，該菌株的16S rRNA的 Genbank 登陸號為 JX087925。菌株的生物學特征為革蘭氏染色陰性，為桿菌，精氨酸雙水解試驗、賴氨酸脫羧酶試驗、V-P反應、明膠液化試驗陽性，β -半乳糖甙酶、鳥氨酸脫羧酶、色氨酸脫氨酶試驗、尿素酶試驗、吲哚試驗、H2S反應均為陰性，不可以利用蔗糖。 該菌株海水中生長，最適生長溫度25-30 V，最適生長pH為7. 0-7. 8，在固體培養基上，菌落圓形、較薄，呈白色，半透明。具體實施例二
擬除蟲菊酯類農藥降解菌株的鑒定
將上述獲得的菌株進行形態特征和分子生物學鑒定，該菌株的掃描電鏡照片如圖I所示。該菌株的主要生物學特征為革蘭氏染色陰性，為桿菌，精氨酸雙水解試驗、賴氨酸脫羧酶試驗、V-P反應、明膠液化試驗陽性，β -半乳糖甙酶、鳥氨酸脫羧酶、色氨酸脫氨酶試驗、尿素酶試驗、吲哚試驗、H2S反應均為陰性，不可以利用蔗糖。該菌株海水中生長，25-30°C，最適生長pH為7. 0-7. 8，在固體培養基上，菌落圓形、較薄，呈白色，半透明。該菌株經16SrRNA序列分析鑒定為與曬甲基菌(Methylophaga sp.)的相似性最高,達到98%。具體實施例三
擬除蟲菊酯類農藥降解菌對海水中擬除蟲菊酯類農藥的降解效果及應用
將分離、純化后的菌株以菌量OD415nm=O. 2接種到100 mL含氯氰菊酯、溴氰菊酯、氰戍菊酯、氟氯氰菊酯、聯苯菊酯各100 mg/L的富集培養基((配制方法如實施例一所示))的250mL三角瓶中，以不接菌的富集培養基作對照，在28 0C >180 rpm的恒溫搖床上震蕩培養7do培養結束后，吸取I mL培養液，加O. 4 g NaCL，渦旋混勻，依次采用4 mL的正己烷與丙酮(體積比1:1)的混合溶液和2 mL的正己烷與丙酮的混合溶液萃取，合并兩次萃取所得上清液，取3 mL上清液，加入0.4 g無水硫酸鈉，氮氣吹干后用I mL異辛烷與丙酮的混合液(體積比1:1)溶解，用氣相色譜檢測，每個實驗重復三次，通過考察降解率來判斷該菌的降解能力。降解率計算公式降解率(％)=(對照樣品殘留量-處理樣品殘留量)X 100/對照樣品殘留量
氯氰菊酯、溴氰菊酯、氰戊菊酯、氟氯氰菊酯、聯苯菊酯的標準樣品色譜圖如圖2所示，本發明菌株對濃度為100 mg/L的氯氰菊酯、溴氰菊酯、氰戊菊酯、氟氯氰菊酯、聯苯菊酯混合擬除蟲菊酯類農藥的降解率分別為87. 7%,84. 6%,77. 3%,75. 5%和80. 3%，表明建立的菌液中擬除蟲菊酯類農藥的檢測方法具有較好的應用效果。 實驗結果表明該菌對海水中擬除蟲菊酯類農藥殘留具有較好的降解能力，因此，該菌對環境中擬除蟲菊酯類農藥的降解，尤其是海水養殖環境污染的修復具有廣泛的應用前景。上述實施例是對本發明的進一步詳細說明，但本發明的保護范圍不限于上述實施例，以權利要求書為準。
權利要求
1.一種擬除蟲菊酯類農藥降解菌，其特征在于該菌株為HS-24菌株，分類命名為噬甲基菌(Methylophaga sp.)，于2012年4月24日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No. 6046，該菌株的16S rRNA的Genbank登陸號為JX087925。
2.根據權利要求I所述的擬除蟲菊酯類農藥降解菌，其特征在于該菌株的生物學特征為革蘭氏染色陰性，為桿菌，精氨酸雙水解試驗、賴氨酸脫羧酶試驗、V-P反應、明膠液化試驗陽性，β -半乳糖甙酶、鳥氨酸脫羧酶、色氨酸脫氨酶試驗、尿素酶試驗、吲哚試驗、H2S反應均為陰性，不可以利用蔗糖。
3.根據權利要求I所述的擬除蟲菊酯類農藥降解菌，其特征在于該菌株海水中生長，最適生長溫度25-30 V，最適生長pH為7. 0-7. 8，在固體培養基上，菌落圓形、較薄，呈白色，半透明。
4.一種根據權利要求I所述的擬除蟲菊酯類農藥降解菌的分離純化方法，其特征在于具體包括如下步驟 (1)培養基配制 將氯氰菊酯、溴氰菊酯、氰戊菊酯、氟氯氰菊酯和聯苯菊酯分別相應加入I. 5倍重量的乳化劑，制備成相應的濃乳液，然后將各個濃乳液分別加入到營養培養基中，使氯氰菊酯、溴氰菊酯、氰戊菊酯、氟氯氰菊酯和聯苯菊酯終濃度分別為100mg/L，得到富集培養液； (2)降解菌分離純化 取500 mL海水樣品無菌狀態下過濾富集后，加入到含富集培養液的三角瓶中，在溫度28 °C、轉速180 rpm的條件下，培養7d，按10%體積接種量轉移到新配制的富集培養液中，再在溫度28 °C、轉速180 rpm的條件下，培養7 d，取培養基發酵液進行平板劃線分離、純化，直到篩選得到單個菌落，將純化后的各菌落分別接至新配制的富集培養液中，在溫度28°C、轉速180 rpm的條件下，振蕩培養7 d，通過氣相色譜-電子捕獲器檢測各富集培養液中擬除蟲菊酯類農藥殘留量，篩選對氯氰菊酯、溴氰菊酯、氰戊菊酯、氟氯氰菊酯和聯苯菊酯5種擬除蟲菊酯類農藥具有高效降解能力的菌株，即為降解海水環境中擬除蟲菊酯類農藥的降解菌HS-24菌株。
5.根據權利要求4所述的擬除蟲菊酯類農藥降解菌的分離純化方法，其特征在于所述的營養培養基的配制方法如下蛋白胨5. O g,磷酸高鐵O. 01 g，酵母膏I. O g,過濾海水1000 mL, pH 7. 0-7. 8，于121 °C高壓蒸汽滅菌20 min后制得。
6.根據權利要求4所述的擬除蟲菊酯類農藥降解菌的分離純化方法，其特征在于所述的乳化劑為吐溫-20。
7.一種根據權利要求I所述的擬除蟲菊酯類農藥降解菌的應用，其特征在于該菌株可用于海水及沉積物環境中氯氰菊酯、溴氰菊酯、氰戊菊酯、氟氯氰菊酯、聯苯菊酯農藥的生物降解。
8.根據權利要求7所述的擬除蟲菊酯類農藥的降解菌的應用，其特征在于該菌株在pH 7. 0-7. 8、溫度25-30 °C、擬除蟲菊酯類農藥濃度100 mg/L條件下對氯氰菊酯、溴氰菊酯、氰戊菊酯、氟氯氰菊酯和聯苯菊酯五種擬除蟲菊酯類農藥的降解能力均達到75%以上。
全文摘要
本發明公開了一種擬除蟲菊酯類農藥降解菌，該菌株為HS-24株，分類命名為噬甲基菌(Methylophagasp.)，于2012年4月24日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCCNo.6046，該菌株的16SrRNA的Genbank登陸號為JX087925，該發明同時公開了擬除蟲菊酯類農藥降解菌的分離純化方法及應用，優點是可安全、高效、快速的降解海水環境中氯氰菊酯、溴氰菊酯、氰戊菊酯、氟氯氰菊酯和聯苯菊酯5種擬除蟲菊酯類農藥，在近海環境保護、養殖環境農藥殘留污染治理和保障食品安全方面具有很好的應用前景。
文檔編號A62D3/02GK102899270SQ201210345259
公開日2013年1月30日 申請日期2012年9月18日 優先權日2012年9月18日
發明者史西志, 劉菁華, 孫愛麗, 李德祥, 周磊, 陳炯 申請人:寧波大學