專(zhuān)利名稱(chēng)：一種阿維菌素農(nóng)藥殘留降解菌及其生產(chǎn)的菌劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種阿維菌素農(nóng)藥殘留降解菌及其生產(chǎn)的菌劑，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，適用于現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中綠色無(wú)公害農(nóng)產(chǎn)品的生產(chǎn)與加工。
背景技術(shù)：
農(nóng)藥在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過(guò)程中對(duì)防治病蟲(chóng)害、提高農(nóng)作物產(chǎn)量必不可少，然而，農(nóng)藥在廣泛使用的同時(shí)也給環(huán)境造成了嚴(yán)重的污染，使得農(nóng)業(yè)產(chǎn)量和環(huán)境質(zhì)量之間的矛盾日益突出，許多農(nóng)藥對(duì)人和非靶動(dòng)物具有干擾內(nèi)分泌作用和“三致”作用(致癌、致畸和致突變)。阿維菌素(Avermectins簡(jiǎn)稱(chēng) AVMs)是由放線菌 iStreptomyces avermi til is)產(chǎn)生的一組大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素，已在很多國(guó)家登記使用，在我國(guó)已成為甲胺磷等高毒農(nóng)藥的替代品，其單劑和混劑產(chǎn)品在害蟲(chóng)防治工作中發(fā)揮著重要作用，廣泛適用于蔬菜、果樹(shù)、棉花和花齊等。近年來(lái)，阿維菌素及其復(fù)配農(nóng)藥品種和使用量不斷增長(zhǎng)，但是，由于其被公認(rèn)屬于生物源農(nóng)藥，致使其對(duì)土壤和環(huán)境的殘留污染隱患，一直未被公眾重視。但是，按世界衛(wèi)生組織(WHO)五級(jí)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，AVMs仍屬高毒化合物，會(huì)對(duì)環(huán)境或生物直接造成影響，而且進(jìn)入到環(huán)境中的藥物可能在生物體內(nèi)富集，并通過(guò)食物鏈的傳遞而影響到人類(lèi)的安全，因此AVMS在生物組織中的殘留必須引起我們的重視。目前，阿維菌素類(lèi)藥物在農(nóng)產(chǎn)品或畜產(chǎn)品中的最聞殘留限量(MRLs)已有規(guī)定，歐盟規(guī)定AVMs在果蔬廣品、谷物等農(nóng)廣品中MRLs為10ug/kgo然而，目前學(xué)術(shù)界對(duì)AVMs殘留降解問(wèn)題研究報(bào)道甚少，市場(chǎng)上也沒(méi)有可以工業(yè)化生產(chǎn)和大面積使用的阿維菌素殘留降解劑產(chǎn)品問(wèn)世。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的旨在提供一種阿維菌素農(nóng)藥殘留降解菌及用其生產(chǎn)的菌劑。研究表明，微生物對(duì)土壤和水環(huán)境中殘留農(nóng)藥的降解有重要的作用，從自然環(huán)境中馴化和篩選出來(lái)的土著微生物，對(duì)農(nóng)藥有一定的降解作用。本發(fā)明人從長(zhǎng)期堆放的阿維菌素發(fā)酵廢渣中，分離、篩選到一株可降解阿維菌素的菌株，經(jīng)鑒定為嗜熱脂肪芽孢桿菌stearothermophilus\舊株命名為kl\\。該菌株已在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)保藏，名稱(chēng)為嗜熱脂肪芽孢桿菌
5tearo thermophilus )AZ 11，保藏號(hào)為 CGMCC NO. 6119，保藏日期為 2012年5 月 17 日，保藏地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所。本發(fā)明人使用上述嗜熱脂肪芽孢桿菌iBaciIlus s tearo thermophiIus )菌株AZ11，經(jīng)工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)過(guò)程，制備了阿維菌素農(nóng)藥殘留降解菌劑(含菌量30X 108cfu/g)，該菌劑對(duì)阿維菌素殘留的降解率達(dá)到90%以上，可廣泛用于土壤、水體中阿維菌素污染的修復(fù)及阿維菌素發(fā)酵廢渣中殘留的降解。本發(fā)明的技術(shù)方案包括以下方面
本發(fā)明提供了一種阿維菌素農(nóng)藥殘留降解菌株，該菌株是從長(zhǎng)期堆放的阿維菌素發(fā)酵廢渣中，分離、篩選獲得的一株可降解阿維菌素的菌株AZ11，經(jīng)鑒定為耐高溫的嗜熱脂肪芽孢桿菌{Bacillus s tearo thermophi Ius ),革蘭氏染色為陽(yáng)性；鏡檢觀察菌體呈桿狀，可形成芽孢，芽孢為橢圓形，端生。在LB平板上菌落圓形，灰白色，表面干燥光滑，邊緣整齊，半透明；菌株AZll能在葡萄糖復(fù)合瓊脂上進(jìn)行厭氧生長(zhǎng)，且能在含7% NaCl肉湯培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，V. P.試驗(yàn)呈陰性，檸檬酸鹽利用試驗(yàn)、卵磷脂酶反應(yīng)、淀粉水解試驗(yàn)、酪素水解試驗(yàn)均呈陽(yáng)性反應(yīng)，甲基紅試驗(yàn)、吲哚產(chǎn)生試驗(yàn)和苯丙氨酸脫氨試驗(yàn)呈陰性反應(yīng)，具有分解葡萄糖、阿拉伯糖、乳糖、甘露醇和木糖的能力，適宜生長(zhǎng)PH為7. 0-8. O。上述阿維菌素農(nóng)藥殘留降解菌劑的生產(chǎn)過(guò)程包括如下步驟
斜面、搖瓶種子培養(yǎng)-種子發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)-生產(chǎn)發(fā)酵罐發(fā)酵生產(chǎn)-與載體混勻-產(chǎn)品包裝。上述阿維菌素殘留降解菌劑的具體生產(chǎn)步驟和工藝條件如下
1)將阿維菌素降解菌AZll斜面保存試管種子，接種至LB液體培養(yǎng)基中，40-45°C振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；
2)將培養(yǎng)好的菌液以10%的接種量接種到IOL種子發(fā)酵罐中，40-45°C培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。種子發(fā)酵罐的培養(yǎng)及配方為玉米粉2%;豆餅粉1%;葡萄糖0.5%;K2HP04 0 . 4%;MgSO4 7H20 0. 02% ；CaCO3 0. 2% ；pH 7. 2-7. 5 ；
3)將種子發(fā)酵罐的發(fā)酵液以10%的接種量接種到生產(chǎn)發(fā)酵罐中發(fā)酵生產(chǎn)，發(fā)酵生產(chǎn)中使用的培養(yǎng)基配方為玉米粉3% ;豆餅粉2% ；CaCO3 0. 5% ；K2HPO4 0. 2% ；ZnSO4 5H20 0. 05% ；MgSO4 7H20 0. 05% ；pH 值 7. 2 ;
發(fā)酵生產(chǎn)的工藝條件為培養(yǎng)溫度40— 45°C，攪拌速度150r/min，罐壓為0. 04—0. 06Mpa，無(wú)菌空氣通氣量1:0. 8-1，培養(yǎng)48小時(shí)菌數(shù)達(dá)到35 X 108cfu/mL。4)發(fā)酵完成后，發(fā)酵完成后，發(fā)酵液可以直接稀釋為液體菌劑作為產(chǎn)品使用，也可以用草炭或硅藻土吸附，形成固體菌劑，調(diào)整菌數(shù)為30X 108cfu/g，然后分裝為袋裝產(chǎn)品。。本發(fā)明所制備的阿維菌素降解菌劑對(duì)阿維菌素殘留的降解率達(dá)到90%以上，可廣泛用于土壤、水體中阿維菌素殘留污染的修復(fù)，也可用于阿維菌素發(fā)酵廢渣及其他有機(jī)肥料原料中的阿維菌素殘留的降解，還可以在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中直接噴灑于土壤或植物表面，可有效降解去除阿維菌素農(nóng)藥殘留，使用方便，成本低，可有效降解去除阿維菌素等農(nóng)藥殘留，去除率達(dá)到97%以上；還可以直接用于阿維菌素廢渣的發(fā)酵生產(chǎn)過(guò)程中，使廢渣發(fā)酵產(chǎn)品達(dá)到無(wú)害化、資源化利用。本發(fā)明對(duì)于保護(hù)環(huán)境、土壤及水體污染修復(fù)和減少農(nóng)產(chǎn)品農(nóng)藥殘留，改善農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)具有重要的意義，適合用于無(wú)公害綠色農(nóng)產(chǎn)品的生產(chǎn)及利用阿維菌素發(fā)酵廢渣進(jìn)行無(wú)殘留生物有機(jī)肥料的生產(chǎn)應(yīng)用。
圖I為添加外源營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)對(duì)阿維菌素降解的影響 圖2為不同濃度阿維菌素對(duì)菌株AZll生長(zhǎng)的影響
圖3為阿維菌素對(duì)溫室盆栽模擬污染土壤的降解效果。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說(shuō)明，但本發(fā)明并不局限于此。實(shí)施例I:降解菌株的分離
取阿維菌素發(fā)酵廢渣樣品10g，加入裝有90mL無(wú)菌水的三角瓶中(250mL規(guī)格，內(nèi)裝玻璃珠)。振蕩15min，靜止澄清后，取ImL上清加入99mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別置4(rC、50°C、60°C恒溫箱中，150r/min振蕩培養(yǎng)。3天為一周期進(jìn)行馴化，共5個(gè)周期，阿維菌素濃度設(shè)置為25mg/L、50mg/L、100mg/L、150mg/L、200mg/L，每個(gè)馴化周期逐步提高。將每次的馴化培養(yǎng)液按照10_\10_2和10_3稀釋度涂布基礎(chǔ)培養(yǎng)基平板(作為對(duì)照)及含阿維菌素的選擇培養(yǎng)基平板，挑選生長(zhǎng)速度快且能以阿維菌素為唯一碳源的單菌落進(jìn)一步分離純化，直至有單菌落出現(xiàn)。
將生長(zhǎng)良好的菌株，搖菌培養(yǎng)后，接種到含阿維菌素(濃度為100mg/L)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，置于400C、500C和600C搖床中，150r/min振蕩培養(yǎng)，設(shè)不接菌的處理為對(duì)照，每處理重復(fù)3次。分別于接種后6h、12h、24h、48h、72h取培養(yǎng)液，4 °C，lOOOOr/min離心5min，取上清液2mL，用HPLC方法測(cè)定阿維菌素含量，計(jì)算降解率。降解率(%) = (對(duì)照樣品殘留量-處理樣品殘留量)/對(duì)照樣品殘留量X 100%。
__表I. ___薩麵釀銖觀_
權(quán)利要求
1.一種阿維菌素農(nóng)藥殘留降解菌株，從阿維菌素發(fā)酵廢渣中分離、篩選獲得，該菌株已在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)保藏，名稱(chēng)為嗜熱脂肪芽孢桿菌 Cfeci77w5· stearothermophiIusIklW，媒氣號(hào)% CGMCC NO. 6119,保藏日期為 2012 年5月17日。
2.應(yīng)用權(quán)利要求I所述的阿維菌素農(nóng)藥殘留降解菌株AZll生產(chǎn)阿維菌素殘留降解菌劑的方法，其特征在于生產(chǎn)過(guò)程如下 斜面、搖瓶種子培養(yǎng)；種子發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)；生產(chǎn)發(fā)酵罐發(fā)酵生產(chǎn)；產(chǎn)品劑型加工、分裝。
3.如權(quán)利要求2所述生產(chǎn)阿維菌素殘留降解菌劑的方法，其特征在于具體生產(chǎn)步驟和工藝條件如下 1)將阿維菌素降解菌AZll斜面保存試管種子，接種至LB液體培養(yǎng)基中，40-45°C振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期； 2)將培養(yǎng)好的菌液以10%的接種量接種到IOL種子發(fā)酵罐中，40-45°C培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，種子發(fā)酵罐的培養(yǎng)及配方為玉米粉2% ;豆餅粉1% ;葡萄糖O. 5% ；Κ2ΗΡ04 O. 4% ；MgSO4 · 7H20 O. 02% ；CaCO3 O. 2% ；pH 7. 2-7. 5 ； 3)將種子發(fā)酵罐的發(fā)酵液以10%的接種量接種到生產(chǎn)發(fā)酵罐中發(fā)酵生產(chǎn)，發(fā)酵生產(chǎn)中使用的培養(yǎng)基配方為玉米粉3% ;豆餅粉2% ；CaCO3 O. 5% ；K2HPO4 O. 2% ；ZnSO4 · 5H20 O. 05% ；MgSO4 · 7H20 O. 05% ；pH 值 7· 2 ;發(fā)酵生產(chǎn)的工藝條件為培養(yǎng)溫度40— 45°C，攪拌速度150r/min，罐壓為O. 04—O.06Mpa，無(wú)菌空氣通氣量1:0. 8_1，培養(yǎng)48小時(shí)菌數(shù)達(dá)到35X 108cfu/mL ；4)發(fā)酵完成后，發(fā)酵液可以直接稀釋為液體菌劑或用草炭或硅藻土吸附，形成固體菌劑。
4.如權(quán)利要求2或3所述生產(chǎn)方法制備的阿維菌素殘留降解菌劑的應(yīng)用，其特征在于用于土壤、水體中阿維菌素殘留污染的修復(fù)。
5.如權(quán)利要求2或3所述生產(chǎn)方法制備的阿維菌素殘留降解菌劑的應(yīng)用，其特征在于用于阿維菌素發(fā)酵廢渣及其他有機(jī)肥料原料中的阿維菌素殘留的降解。
6.如權(quán)利要求2或3所述生產(chǎn)方法制備的阿維菌素殘留降解菌劑的應(yīng)用，其特征在于直接用于阿維菌素廢渣發(fā)酵生產(chǎn)過(guò)程中，使廢渣發(fā)酵產(chǎn)品達(dá)到無(wú)害化。
7.如權(quán)利要求2或3所述生產(chǎn)方法制備的阿維菌素殘留降解菌劑的應(yīng)用，其特征在于在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中直接噴灑于土壤或植物表面，有效降解去除阿維菌素農(nóng)藥殘留。
全文摘要
本發(fā)明為一種阿維菌素農(nóng)藥殘留降解菌及其生產(chǎn)的菌劑，涉及嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillusstearothermophilus)AZ11的分離、篩選及用其發(fā)酵生產(chǎn)的菌劑及應(yīng)用。所述菌株已在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏號(hào)為CGMCC NO.6119。使用所述菌株AZ11發(fā)酵生產(chǎn)的阿維菌素農(nóng)藥殘留降解菌劑可廣泛用于土壤、水體中阿維菌素殘留污染的修復(fù)，也可用于阿維菌素發(fā)酵廢渣及其他有機(jī)肥料原料中的阿維菌素殘留的降解，還可以在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中直接噴灑于土壤或植物表面，可有效降解去除阿維菌素農(nóng)藥殘留，使用方便，成本低，還可以直接用于阿維菌素廢渣的發(fā)酵生產(chǎn)過(guò)程中，使廢渣發(fā)酵產(chǎn)品達(dá)到無(wú)害化、資源化利用。
文檔編號(hào)A62D3/02GK102732455SQ201210181069
公開(kāi)日2012年10月17日 申請(qǐng)日期2012年6月5日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月5日
發(fā)明者周紅姿, 李紅梅, 李紀(jì)順, 楊合同, 陳凱, 魏艷麗 申請(qǐng)人:山東省科學(xué)院生物研究所