專利名稱：一種農藥降解酶制劑的制作方法
技術領域：
本發明涉及穩定酶制劑活性的技術領域，具體地說是一種農藥降解酶制劑。
背景技術：
農藥污染所導致的環境安全及食品安全問題是農業生產和人類健康面臨的重大問題。在我國，由于農藥使用的不規范，農產品及環境都遭受到了嚴重的農藥污染。農藥污染所導致的環境安全及食品安全等問題越來越受到關注，正成為政府和廣大消費者關注的焦點之一。 相關報導顯示我國農產品的農藥殘留嚴重，居民日常膳食中的各類農藥攝入量，高于美國、日本和歐盟等發達國家數十倍。殘留農藥可以改變人體荷爾蒙，使女性內分泌紊舌L男性少精，精子成活率低；殘留農藥進入人體，一部分通過腎肝轉化或排出，增加機體工作量引起病變；一部分和血液的血紅蛋白結合，降低其供氧能力。世界衛生組織公布的調查報告表明，殘留農藥在人體內長期蓄積滯留會引發慢性中毒，以致誘發許多慢性病癥。如心腦血管病、糖尿病、癌癥等，農藥殘留甚至通過胚胎和乳汁轉移給下一代，并能夠導致“三致”:致癌、致畸、致突變，有時直接導致食用者死亡。環境激素是全世界公認的造成生物異常生長發育的主要兇手。在國際組織確定的70種環境激素中，農藥就有40種。由于農藥的使用，蔬菜瓜果等農產品經過清洗后的水流入土壤之中，農藥污染物仍未被最終降解，又可能通過其它途徑進入人體。農藥降解酶通過酶促反應原理水解磷酸酯鍵，降解農藥殘留，是目前解決農藥殘留問題的最有效技術手段，具有安全、高效、無二次污染等特點。農藥降解酶制劑的穩定性問題是其研制過程中的關鍵問題。酶是一種生物活性物質，受溫度、PH值影響較大，如果配方體系不佳，酶很容易失去活性。所以，研制穩定的農藥降解酶制劑配方，是農藥降解酶發揮作用的關鍵。
發明內容
本發明的目的在于提供一種農藥降解酶制劑。為實現上述目的，本發明采用的技術方案為—種農藥降解酶制劑，農藥降解酶制劑由農藥降解酶劑、穩定劑、表面活性劑、保護劑和水組成，其按體積百分比計，10% -20%的農藥降解酶劑、O. 1% -O. 2%的穩定劑、1% -5%的表面活性劑、30% -80%的保護劑余量為水。所述農藥降解酶劑為在LB培養基中培養后的保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號=CGMCC No. 1529的基因工程菌株發酵培養破碎。所述農藥降解酶劑為將基因工程菌在含氨芐青霉素的LB液體培養基中37°C，溶氧量20-30%，培養10-15小時，而后按體積比1% -5%的接種量將培養液接種于含氨芐青霉素的發酵培養基，在37°C，溶氧量20-30%，培養2-4小時后向發酵培養培養基中加入終濃度為25mmol/L的乳糖后，將培養溫度降到22°C _25°C，誘導表達15-22個小時，將上述所得發酵液以5000rpm離心10分鐘收集菌體，并加入1/10-1/20發酵液體積的O.1mol/LpH7. O的磷酸鹽緩沖液回溶菌體，5000rpm離心10分鐘重新收集菌體，將收集的菌體平鋪于鐵制或鋼制容器中，菌體厚度O. 1-0. 2cm,向容器中加入液氮破碎菌體，加入液氮的高度高于菌體表面O. 5-lcm，待液氮揮發干凈后將菌體真空冷凍干燥，將凍干后的菌體用O.1mol/L pH 7. O的磷酸鹽緩沖液回溶至原發酵液體積，10000-12000Rpm離心10-20分鐘收集上清液，即為農藥降解酶劑。、
所述穩定劑為聚六亞甲基胍；表面活性劑為椰油酰胺丙基甜菜堿；保護劑為甘油。所述發酵培養為按重量百分比計，蛋白胨2% -3%、酵母粉2% -3%、甘油2% -3%,K2HPO4 O. 25%,KH2PO4 O. 016%,NaCl O. 05%、MgSO4 ·H2O O. 025%，余量為蒸餾水，121°C滅菌20分鐘；含氨芐青霉素的發酵培養基為每毫升發酵培養基中添加50-75 μ g的氨芐青霉素。所述LB液體培養基為按重量百分比計，胰蛋白胨1%、酵母粉0.5%、氯化鈉1%，余量為蒸餾水，121°C滅菌20分鐘；含氨芐青霉素的LB液體培養基為每毫升LB液體培養基中添加50-75 μ g的氨芐青霉素。所述回溶菌體離心收集菌體，將收集的菌體平鋪于鐵制或鋼制容器中，菌體厚度O. 1-0. 2cm,向容器中加入液氮破碎菌體，加入液氮的高度高于菌體表面O. 5-lcm，待液氮揮發干凈后將菌體真空冷凍干燥，其真空度30pa，凍干溫度_50°C，凍干時間8-12h。所述農藥降解酶制劑用于降解有機磷農藥的殘留。本發明所具有的優點1.本發明的農藥降解酶制劑酶活性高，可以有效降解有機磷農藥殘留，保障食品安全。2.本發明的農藥降解酶制劑具有優良的穩定性，酶不易失活。3.本發明的農藥降解酶制劑降解效果迅速。4.本發明的農藥降解酶制劑安全高效、無毒副作用。本發明制劑在4°C條件下保存，6個月內酶活損失不高于10%;在室溫下保存，6個月內酶活性損失不高于30%。同時本發明的農藥降解酶制劑能夠降解有機磷農藥殘留。
具體實施例方式實施例1農藥降解酶制劑由農藥降解酶劑、聚六亞甲基胍、椰油酰胺丙基甜菜堿、甘油和水組成，其按體積百分比計，20 %的農藥降解酶劑(酶活力為11500U) ,0.1%的聚六亞甲基胍、I %的椰油酰胺丙基甜菜堿、75 %的甘油，余量為滅菌蒸餾水。所述農藥降解酶劑，將保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號=CGMCC No. 1529的基因工程菌株接種于含氨芐青霉素的LB液體培養基，培養溫度37°C，溶氧量20%，培養時間10個小時。LB液體培養基為按重量百分比計，胰蛋白胨I %、酵母粉O. 5%、氯化鈉I %，余量為蒸餾水，121°C滅菌20分鐘；含氨芐青霉素的LB液體培養基為每毫升LB液體培養基中添加50 μ g的氨芐青霉素。所述基因工程菌株，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號=CGMCC No. 1529，另參見申請號200510086957. 3中的相關記載。而后按體積比1%的接種量將培養液接種于含氨芐青霉素的發酵培養基，在37°C，溶氧量20%，培養2小時后向發酵培養培養基中加入終濃度為25mmol/L的乳糖后，將培養溫度降到25°C，誘導表達20個小時后將發酵液以5000rpm離心10分鐘收集菌體，并加入1/10發酵液體積的O.1mol/LpH 7. O的磷酸鹽緩沖液(稱取Na2HPO4 ·2Η20 10. 86g，NaH2PO4 · H2O 5. 38g，用蒸餾水溶解并定容至1000mL。上述緩沖液的pH值應使用酸度計加以校正。)回溶菌體，5000rpm離心10分鐘重新收集菌體，將收集的菌體平鋪于鐵制或鋼制容器中，菌體厚度O.1cm,向容器中加入液氮破碎菌體，液氮的高度高于菌體表面O. 5cm，待液氮揮發干凈后將菌體置于真空冷凍干燥機冷凍干燥，其中真空冷凍干燥真空度30pa，凍干溫度_50°C，凍干時間12h，將凍干后的菌體用O. lmol/L pH 7. O的磷酸鹽緩沖液回溶至原發酵液體積，IOOOORpm離心20分鐘收集上清液，即為農藥降解酶劑。發酵培養為按重量百分比計，蛋白胨2%、酵母粉2%、甘油2 %、K2HPO4O. 25 %,KH2PO4 0. 016%, NaCl 0. 05%, MgSO4 · H2O 0. 025%，蒸餾水，121°C滅菌 20 分鐘；含氨芐青霉素的發酵培養基為每毫升發酵培養基中添加50 μ g的氨芐青霉素。上述農藥降解酶制劑的酶活力的測定將上述制劑在4°C或者室溫放置，而后分別測定其酶活穩定性，吸取980 μ I O. lmol/L ρΗ7· O的磷酸鹽緩沖液，10 μ I 10mg/mL的對硫磷溶液(稱取對硫磷標準品IOOmg,用乙醇溶解并定容至IOmL),充分混勻,加入10 μ I上述農藥降解酶劑，30°C反應I分鐘，用20 μ I 6mol/L的HCl終止反應，吸取0. 5ml加入4. 5mL0. 05mol/LpH10. O的NaOH-甘氨酸緩沖液(甘氨酸3. 78g，氫氧化鈉1. 28g，用蒸餾水溶解并定容至1000mL。上述緩沖液的pH值應使用酸度計加以校正。)，充分混勻，于410nm波長下測定產物對硝基苯酚的吸光度，通過標準曲線，計算酶活力。酶活力單位(U)定義為在30°C, pH 7. O的條件下，I分鐘降解I μ g甲基對硫磷所需要的酶量定義為一個酶活力單位U。測定結果參見表1，由上述測定酶活力可知制備所得制劑能夠降解有機磷農藥殘留。表I酶活穩定性
權利要求
1.一種農藥降解酶制劑，其特征在于農藥降解酶制劑由農藥降解酶劑、穩定劑、表面活性劑、保護劑和水組成，其按體積百分比計，10% -20%的農藥降解酶劑、O. 1% -O. 2%的穩定劑、I % _5%的表面活性劑、30% -80%的保護劑余量為水。
2.按權利要求1所述的農藥降解酶制劑，其特征在于所述農藥降解酶劑為在LB培養基中培養后的保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號CGMCCNo. 1529的基因工程菌株發酵培養破碎。
3.按權利要求1所述的農藥降解酶制劑，其特征在于所述農藥降解酶劑制備為將基因工程菌在含氨芐青霉素的LB液體培養基中37°C，溶氧量20-30%，培養10-15小時，而后按體積比1% _5%的接種量將培養液接種于含氨芐青霉素的發酵培養基，在37°C，溶氧量20-30%，培養2-4小時后向發酵培養培養基中加入終濃度為25mmol/L的乳糖后，將培養溫度降到22°C -25°C，誘導表達15-22個小時，將上述所得發酵液以5000rpm離心10分鐘收集菌體，并加入1/10-1/20發酵液體積的O. lmol/L pH 7. O的磷酸鹽緩沖液回溶菌體，5000rpm離心10分鐘重新收集菌體，將收集的菌體平鋪于鐵制或鋼制容器中，菌體厚度O.1-ο. 2cm,向容器中加入液氮破碎菌體，加入液氮的高度高于菌體表面O. 5-lcm，待液氮揮發干凈后將菌體真空冷凍干燥，將凍干后的菌體用O. lmol/L pH 7. O的磷酸鹽緩沖液回溶至原發酵液體積，10000-12000Rpm離心10-20分鐘收集上清液，即為農藥降解酶劑。
4.按權利要求1所述的農藥降解酶制劑，其特征在于所述穩定劑為聚六亞甲基胍；表面活性劑為椰油酰胺丙基甜菜堿；保護劑為甘油。
5.按權利要求3所述的農藥降解酶制劑，其特征在于所述發酵培養為按重量百分比計，蛋白胨 2%-3%、酵母粉 2%-3%、甘油 2%-3%、K2HP04 O. 25%,KH2PO4 O. 016%,NaClO.05%,MgSO4 · H2O O. 025%，余量為蒸餾水，121°C滅菌20分鐘；含氨芐青霉素的發酵培養基為每毫升發酵培養基中添加50-75 μ g的氨芐青霉素。
6.按權利要求3所述的農藥降解酶制劑，其特征在于所述LB液體培養基為按重量百分比計，胰蛋白胨I %、酵母粉O. 5 %、氯化鈉I %，余量為蒸餾水，121 °C滅菌20分鐘；含氨芐青霉素的LB液體培養基為每毫升LB液體培養基中添加50-75 μ g的氨芐青霉素。
7.按權利要求3所述的農藥降解酶制劑，其特征在于所述回溶菌體離心收集菌體，將收集的菌體平鋪于鐵制或鋼制容器中，菌體厚度O. 1-0. 2cm,向容器中加入液氮破碎菌體，加入液氮的高度高于菌體表面O. 5-lcm，待液氮揮發干凈后將菌體真空冷凍干燥，其真空度30pa，凍干溫度_50°C，凍干時間8-12h。
8.按權利要求1所述的農藥降解酶制劑，其特征在于所述農藥降解酶制劑用于降解有機磷農藥的殘留。
全文摘要
本發明涉及穩定酶制劑活性的技術領域，具體地說是一種農藥降解酶制劑。農藥降解酶制劑由農藥降解酶劑、穩定劑、表面活性劑、保護劑和水組成，其按體積百分比計，10％-20％的農藥降解酶劑、0.1％-0.2％的穩定劑、1％-5％的表面活性劑、30％-80％的保護劑余量為水。本發明制劑在4℃條件下保存，6個月內酶活損失不高于10％；在室溫下保存，6個月內酶活性損失不高于30％。同時本發明農藥降解酶制劑能夠降解有機磷農藥殘留。
文檔編號A62D3/02GK102994488SQ201110431638
公開日2013年3月27日 申請日期2011年12月20日 優先權日2011年12月20日
發明者謝建飛, 石元亮, 盧宗云, 張惠文, 李鵬程, 邢云鵬 申請人:遼寧中科生物工程有限公司