專利名稱：利用檸檬酸廢水生產有機磷農藥降解菌劑的制作方法
技術領域：
本發明屬于微生物菌劑和廢水資源化技術領域。
背景技術：
檸檬酸作為一種重要的化工原料和食品添加劑被廣泛應用于食品、醫藥、化工等行業。目前，中國有檸檬酸生產廠近百家，總年產能力約80萬噸，是全球最大的檸檬酸生產國和出口國，出口量在全球檸檬酸貿易總量中的比重超過60%。檸檬酸的生產是以薯干或玉米為原料，依次經原料處理、發酵、提取、精制等工序制得產品。檸檬酸廢水主要來自發酵和提取工序產生的中和液、洗糖水、洗罐水和洗濾布水。廢水中主要含有淀粉、蛋白質、碳水化合物、各種有機酸、氨氮和脂肪等，COD濃度為20000 30000mg/L，屬于高濃度有機廢水。據統計，每生產I噸檸檬酸，產生高濃度廢水7. 5 15噸。直接排放會對環境將造成嚴重 污染，處理達標排放費用高昂。檸檬酸廢水的資源化利用技術開發非常緊迫。有機磷農藥以其品種多、藥效高、防治范圍廣譜等特點，至今仍是農藥中用量最多的類別，在農業生產中起到了舉足輕重的作用，我國有機磷農藥的生產和使用量占農藥總生產和使用量的一半以上。但是，有機磷農藥具有較強的毒性，長期、大量使用后，其在農作物上的殘留會引起食品安全問題，也影響了我國農產品出口，而且散落的農藥也會使水和土壤受到污染。利用微生物降解有機磷農藥殘留的生物修復方法具有低成本、無毒、無二次污染等優點，是最具應用前景的削減農藥污染的方法之一。中國發明專利(申請號200610090054. 7)公開了一株降解有機磷農藥的施氏假單胞菌，是從農藥廠排污口土壤樣品中分離的；中國發明專利(申請號200410081019.X)公開了一株降解有機磷農藥的蒼白桿菌，是從長期農藥污染的土壤中分離獲得。本專利是從油菜葉際分離出的一株高效降解有機磷農藥的枯草芽孢桿菌，能夠在植物葉際環境下保持良好的降解性能。以檸檬酸廢水為培養基的主要原料生產農藥降解菌劑的方法未見文獻報道。此方法不僅可以減少高濃度有機廢水的排放，而且降低菌劑的生產成本。
發明內容
本發明的目的是提供一種能夠資源化利用檸檬酸廢水生產有機磷農藥殘留降解菌劑的方法。本發明所使用的菌株是由發明人分離篩選出來的一株高效降解有機磷農藥殘留的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)N14菌株，該菌株于2009年11月2日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為=CGMCC No. 3374，保藏單位地址北京市朝陽區大屯路，中國科學院微生物研究所，郵編100101。本發明所述的枯草芽孢桿菌有機磷農藥降解菌劑的生產方法如下I、檸檬酸廢水預處理用氫氧化鈉水溶液調節廢水的pH到6. 7 7. 8，于115 126°C滅菌10 35分鐘。
2、液體種子制備向裝有預處理好的檸檬酸廢水的三角瓶中接種斜面保藏的枯草芽孢桿菌，于28 45°C，120 200轉/分振蕩培養24 48小時，得到液體種子。3、液態發酵向裝有預處理好的檸檬酸廢水發酵罐中接種體積比為2% 20%的液體種子，于25 40°C，通無菌空氣培養12-48小時；培養好的發酵液經平板細菌計數，活菌數達到5 X IO8CFU/毫升以上。4、固體菌劑制備以過30目篩的生物碳為載體，按照發酵液生物碳為
I 1.5 5的重量比，將發酵液添加到生物碳中，充分混合均勻，得到固態菌劑，通風干燥至菌劑含水量30 %以下，包裝，存放在陰涼干燥處。5、液體菌劑制備培養好的發酵液經細菌計數后，超濾濃縮，調節至有效活菌數5X 109CFU/mL以上，加入質量分數為0. 5%的甘氨酸和質量分數為I. 5%甘油，灌裝保藏；
使用時用水稀釋50-500倍。
具體實施例方式由本發明技術方案生產的枯草芽孢桿菌微生物菌劑能夠快速降解植物葉面和土壤中的有機磷農藥殘留，并且促進植物生長，提高農產品質量，改善農田環境質量；而且生產成本低，有效地利用了廢水，減少污染物排放。
具體實施方式
如下實施例I :檸檬酸廢水生產枯草芽孢桿菌微生物菌劑檸檬酸廢水預處理用氫氧化鈉水溶液調節廢水pH到7. 0，于121°C滅菌15分鐘。液體種子制備向裝有預處理好的檸檬酸廢水的三角瓶中接種斜面保藏的枯草芽孢桿菌，于45°C, 150轉/分振蕩培養36小時,得到液體種子。液態發酵向裝有預處理好的檸檬酸廢水發酵罐中接種5% (體積比)的液體種子，于32°C，通無菌空氣培養16小時；培養好的發酵液經平板細菌計數，活菌數達到
3.5 X IO9CFU/ 毫升。固體菌劑制備以過30目篩的生物碳為載體，按照發酵液生物碳為I : 3的重量比，將發酵液添加到生物碳中，充分混合均勻，得到固態菌劑，通風干燥至菌劑含水量30%以下，包裝，存放在陰涼干燥處，12個月內使用。液體菌劑制備培養好的發酵液經細菌計數后，超濾濃縮，調節至有效活菌數5 X 109CFU/mL以上，加入質量分數為0. 5%的甘氨酸和質量分數為I. 5%甘油，灌裝，室溫保藏，6個月內使用。實施例2 :有機磷農藥降解菌劑對油菜葉面敵敵畏農藥殘留的降解效果選取兩個完全相同的油菜地塊，各30m2，均勻噴灑1000倍稀釋的80%敵敵畏乳油農藥。6h后，均勻噴施用清水稀釋600倍的農藥降解液體菌劑，以噴施清水作對照。24h后，五點取樣法檢測油菜葉面敵敵畏殘留，發現處理組較對照組敵敵畏殘留量減少80%左右。實施例3 :有機磷農藥降解菌劑對土壤中樂果殘留的降解效果選取兩個完全相同的未種植作物的農田地塊，各30m2，均勻噴灑1000倍稀釋的50%樂果乳油農藥；6h后，均勻撒入固體農藥降解菌劑I公斤，翻耕均勻；36d后，五點取樣法檢測油菜葉面樂果的殘留，發現處理組較對照組樂果殘留量減少50%左右。實施例4 :枯草芽孢桿菌微生物菌劑促進油菜生長采用蔬菜大棚小區實驗，設置8個條件完全相同的實驗小區，每個小區30m2，2個小區為I組平行試驗，共分成4組，種植油菜，在油菜幼苗期，第I組2個小區不施肥作對照；第2組2個小區按照50公斤/畝的用量在 油菜完全發芽后和3周后各追施枯草芽孢桿菌微生物菌劑一次；第3組2個小區按照15公斤/畝的施肥量在油菜完全發芽后和3周后各施用尿素一次；第4組2個按照15公斤/畝的施肥量在油菜完全發芽后和3周后各施用尿素一次，并在每次施用尿素后I天按照50公斤/畝的施肥量追施微生物菌劑一次，各小區相同的灌溉和管理方式。油菜生長5周后調查產量和品質。單獨施用微生物菌劑和單獨施用尿素的油菜產量基本一致，都比不施肥的對照小區增產60%左右；兩種菌劑和尿素都施用的小區比對照小區增產90%左右；油菜中硝酸鹽和亞硝酸鹽含量以不施肥和單獨施用微生物菌劑的最低，在國家標準限量值的1/3以下，施用尿素后又施用微生物菌劑的也在國家標準限量的1/2以下，而單獨施用尿素的油菜中硝酸鹽和亞硝酸鹽含量都超標嚴重。表明該微生物菌劑具有良好的增產效果，而且可以明顯提高油菜的品質。本發明所提供的降解有機磷農藥的菌株保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期為2009年11月2日，分類命名為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)。保藏編號為CGMCC No. 3374。
權利要求
1.一種利用檸檬酸廢水生產有機磷農藥降解菌劑的方法，其特征在于有機磷農藥降解菌是枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)N14,保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號=CGMCC No. 3374。
2.利用權利要求I所述有機磷農藥降解菌劑的生產方法，其特征在于發酵培養基以檸檬酸廢水為主要原料，菌劑生產方法及步驟包括 (1)檸檬酸廢水預處理用氫氧化鈉水溶液調節廢水的PH到6.7 7. 8，于115 126°C滅菌10 35分鐘。
(2)液體種子制備向裝有預處理好的檸檬酸廢水的三角瓶中接種斜面保藏的枯草芽孢桿菌，于28 45°C，120 200轉/分振蕩培養24 48小時，得到液體種子。
(3)液態發酵向裝有預處理好的檸檬酸廢水發酵罐中接種體積比為2% 20%的液體種子，于25 40°C，通無菌空氣培養12-48小時；培養好的發酵液經平板細菌計數，活菌數達到5 X IO8CFU/毫升以上。
(4)固體菌劑制備以過30目篩的生物碳為載體，按照發酵液生物碳為I: 1.5 5的重量比，將發酵液添加到生物碳中，充分混合均勻，得到固態菌劑，通風干燥至菌劑含水量30 %以下，包裝，存放在陰涼干燥處。
(5)液體菌劑制備培養好的發酵液經細菌計數后，超濾濃縮，調節至有效活菌數5X 109CFU/mL以上，加入質量分數為0. 5%的甘氨酸和質量分數為I. 5%甘油，灌裝保藏；使用時用水稀釋50-500倍。
全文摘要
本發明涉及一種利用檸檬酸廢水生產有機磷農藥降解菌劑的方法，屬于微生物菌劑和廢水資源化技術領域。該方法主要是以檸檬酸生產過程中產生的高濃度有機廢水為主要培養基原料，采用液態發酵的方法生產枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)CGMCC No.3374菌劑。生產工藝包括(1)檸檬酸廢水pH調節和滅菌；(2)接種斜面保藏的枯草芽孢桿菌，振蕩培養獲得液體種子；(3)向裝有檸檬酸廢水培養基的發酵罐中接種液體種子，通無菌空氣培養得到液態發酵產物；(4)發酵產物用生物碳作載體可制備固體菌劑；(5)發酵液經濃縮后添加保護劑獲得液體菌劑。該工藝生產的有機磷農藥降解菌劑，具有生產成本低、環境友好的特點，產品能高效降解植物表面和土壤中的有機磷農藥殘留，而且還可以改善土壤環境質量、提高作物產量和品質。同時為檸檬酸生產過程中產生的大量高濃度廢水找到有效的資源化利用方法，減少污染物排放。
文檔編號A62D101/26GK102965293SQ20111025660
公開日2013年3月13日 申請日期2011年9月1日 優先權日2011年9月1日
發明者白志輝, 李濱, 趙志瑞, 唐景春, 馬安周, 王曉輝 申請人:中國科學院生態環境研究中心