專利名稱：食品級微生物益生菌在降解雙酚a中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及微生物領域，特別涉及到食品級微生物益生菌降解菌株等在降解包裝材料或環境污染物中的雙酚A的應用。
背景技術：
雙酚A是從食品包裝材料中發現的一種“內分泌干擾物”(EndocrineDisrupting Chemicals，E⑶)，具有某些雌激素特性。雙酚A簡稱BPA，主要是用于制造高分子材料如聚碳酸酯(簡稱PC)。許多日常消費品如食品包裝器、嬰兒奶瓶等都可能含有雙酚Α。雙酚 A在加熱過程中會析出到食物中去，會干擾人體正常的荷爾蒙分泌功能，刺激人體雌激素的分泌，抑制雄性激素分泌。如果長時間大量攝入，可能會導致心血管疾病甚至癌癥，會影響兒童的發育進程，特別是發育中的胎兒、嬰兒和兒童。數以百計的研究證明了與BPA相關的疾病越來越多，如心血管疾病、腸道疾病、免疫系統等，也證明了雙酚A對干擾人體內分泌系統造成的重大危害。2008年加拿大宣布在所有食品包裝和容器(包括奶瓶)上禁用雙酚A，成為第一個全面禁止雙酚A的國家；澳大利亞也從2010年7月1日起逐漸淘汰含雙酚A的嬰兒奶瓶；美國的一些州縣也規定兒童護理品中不得含有雙酚A。據悉，歐洲食品安全局在2010年 9月發布了針對雙酚A的規定每人每天對雙酚A的攝入量必須小于0. 05m g/kg。而對雙酚A可能對嬰兒造成一些其他影響的問題，當時歐洲食品安全局的專家表示需要進一步的研究。日前，歐盟宣布，其成員國自2011年3月1日起禁止使用含雙酚A的塑料生產嬰兒奶瓶，并從6月1日起禁止進口此類塑料嬰兒奶瓶。我國塑料奶瓶多以PC材質為主，而 PC奶瓶多含雙酚A。而我國尚沒有專門針對嬰兒奶瓶的雙酚A標準，目前只有一份適用于所有P C品的現行國家標準，就是1994年頒布的《食品容器及包裝材料用聚碳酸酯樹脂衛生標準》(標準號GB14942-1994)，其中對雙酚A用量規定一升蒸餾水中所含雙酚A須不大于0. 05毫克。雙酚A的問題目前受到了方方面面的關注。我國衛生部目前正在清理食品包裝材料，并出臺征求意見稿，其中規定雙酚A將不能再用于接觸嬰幼兒的食品。衛生部監督局2011年2月1日發布《關于公開征求擬批準食品包裝材料用添加劑和樹脂意見的函》，規定PC塑料中雙酚A最大殘留量為0. 6mg/kg，備注同時要求不能用于接觸嬰幼兒食品。根據2010/8/17發布的一份關于加拿大人的尿液研究報告稱，平均每10人中有9 個以上的人體內含有BPA (雙酚A)。其中年齡為6歲的加拿大兒童，尿液中含有BPA占79% 到91 %。這些數據表明，加拿大兒童和青少年體內含有的BPA含量比以往任何時候都要高。 調查還發現，幾乎每一位加拿大民眾體內都含有一定數量的BPA。美國紐約州最近通過《禁止兒童和嬰幼兒產品使用雙酚A法令》，禁止生產、分銷和銷售含有雙酚A的某些兒童護理產品。《華盛頓郵報》報道說，93%的6歲以上美國人的尿液中，可以檢測到雙酚A成分。雙酚A的降解方法可分為物理降解、化學降解和生物降解。雙酚A有一定的吸附性能，在物理降解方法中，自然界污泥和活性炭的雙酚A吸附有較多的研究。有研究報道， 活性炭對50mg/L的雙酚A的吸附速度很快，1小時即可取得較好的處理效果。經過厭氧處理的污泥堆雙酚A吸附很快，15min的吸附力可達最大吸附量的89. 1%，而雙酚A在厭氧污泥的吸附是可逆的，對處理后期可能會產生一定的影響。雙酚A的化學降解主要為光降解。 現研究多以二氧化鈦為催化劑，雙酚A可以得到礦化。用紫外光代替太陽光，雙酚A有較高的降解率，可達到97%。對于生物方法降解雙酚A的方法亦有較多報道，但目前生物降解方面的研究局限于自然界篩選的菌種和部分真菌的降解，但此類菌株對雙酚A的降解一般都需經過較長的時間，且在1到3個月的時間的降解效率也僅在20%到40%左右，效率較為低下。
發明內容
本發明的目的在于提供一種降解包裝污染物雙酚A的新途徑，即應用食品級微生物益生菌來降解雙酚A，其降解效率高、降解周期短、產物安全，從而克服了現有方法的不足。為實現上述發明目的，本發明采用了如下技術方案食品級微生物益生菌在降解雙酚A中的應用，所述益生菌為瑞士乳桿菌、羅伊式乳桿菌、短乳桿菌、德式乳桿菌保加利亞亞種、干酪乳桿菌和納豆枯草芽孢桿菌中的任意一種或多種。進一步地，所述益生菌優選采用短乳桿菌。所述益生菌的活化菌株在雙酚A培養基中的接種量在0. 1% (體積百分比，下同) 以上。針對現有降解雙酚A的生物方法的不足，本案發明人經長期研究，通過對現有已知的所有食品級微生物進行篩選，并通過將其在雙酚A培養基中培養，再檢測其培養基中雙酚A含量的變化，從而判斷菌種對雙酚A的降解情況。以下以對實驗室可得的三十多種食品級菌種進行篩選的過程為例進行說明以600ppb的BPA濃度為原始濃度和實驗對照，選取前述三十多中食品級菌種進行探索，篩選出對雙酚A有一定降解效果的菌種，其過程具體如下(1)益生菌的活化培養針對不同菌種選定合適條件分別配制培養基，再按0. 2%的量接種，培養M小時為一代，培養兩代為活化培養結束。(2)雙酚A培養基的培養I.雙酚A培養基的配制用無菌水配制90%的乙醇溶液100ml，稱取一定量的雙酚A標準物，配制成雙酚A 溶液。配制好的雙酚A溶液經過0.22um的微孔濾膜過濾備用。稱取培養基配方的各化學物質，溶解，調節相應PH值，封裝，121°C滅菌20min。在滅菌臺把經微孔濾膜過濾的雙酚A 溶液按照5%的體積比加入到已滅菌的培養基中，最終配制成雙酚A濃度為600ppb的雙酚 A培養基。前述的培養基可選用LB培養基和MRS培養基。LB培養基蛋白胨10. 0克、酵母粉5. 0克、氯化鈉10. 0克、蒸餾水1. 0升，調節pH 值到7. 5。MRS培養基葡萄糖20. 0克、蛋白胨10. 0克、牛肉浸取物(牛肉膏)10. 0克、酵母提取液(酵母膏或酵母粉)5. O克、乙酸鈉5. O克、檸檬酸氫二胺2. O克、吐溫-80 1. 0ml、 磷酸氫二鉀2. 0克、無水硫酸鎂0. 283克、一水合硫酸錳0. 189克、蒸餾水1. 0升，調節pH 值到6. 5。雙酚A培養基的培養，按0. 2%的接種量接種，37°C搖床120r/min培養4天的時間。待處理。其中納豆枯草芽孢桿菌用LB培養基，其余菌種用MRS培養基。II.菌種雙酚A培養基的降解培養按0. 2%的接種量 將活化后的菌種接種至雙酚A培養基中，37°C搖床120r/min培養4天的時間。待處理。
(3)培養液的萃取濃縮將培養4天后的雙酚A培養基取出離心，離心條件為4°C、8000rpm、10min，轉移上
清液，備用。培養基上清液采用固相萃取的方式進行HPLC進樣前處理。選取C 18小柱進行固相萃取，首先分別用6ml甲醇和6ml去離子水對萃取柱進行活化。取20ml培養基上清液以 5ml/min的流速通過萃取柱。接著用6ml 20%的甲醇淋洗萃取柱，洗去可能存在的雜質。淋洗完畢，真空抽干萃取柱水分。最后，用2*3ml的甲醇以5ml/min的流速洗脫，收集洗脫液。 洗脫液用氮氣吹干，用甲醇定容為2ml，并以HPLC檢測其中雙酚A的殘留量，該HPLC檢測條件可在本領域技術人員熟知的各種條件中選取。經過重復實驗，可以篩選得到6種菌種對雙酚A有不同程度的降解性能，分別是瑞士乳桿菌、羅伊式乳桿菌、短乳桿菌、德式乳桿菌保加利亞亞種、干酪乳桿菌和納豆枯草芽孢桿菌，具體可參閱下表1 :表1食品級微生物益生菌及其對雙酚A的降解效率
權利要求
1.食品級微生物益生菌在降解雙酚A中的應用，所述益生菌為瑞士乳桿菌、羅伊式乳桿菌、短乳桿菌、德式乳桿菌保加利亞亞種、干酪乳桿菌和納豆枯草芽孢桿菌中的任意一種或多種。
2.根據權利要求1所述的食品級微生物益生菌在降解雙酚A中的應用，其特征在于，所述益生菌優選采用短乳桿菌。
3.根據權利要求1所述的食品級微生物益生菌在降解雙酚A中的應用，其特征在于，所述益生菌的活化菌株在雙酚A培養基中的接種量在0. 1% V/V以上。
全文摘要
本發明涉及食品級微生物益生菌在降解雙酚A中的應用，所述益生菌為瑞士乳桿菌、羅伊式乳桿菌、短乳桿菌、德式乳桿菌保加利亞亞種、干酪乳桿菌和納豆枯草芽孢桿菌中的任意一種或多種。進一步的，所述益生菌優選采用短乳桿菌。本發明的優點在于采用食品級益生菌株降解包裝材料中遷移進食品中的具有雌激素效應的雙酚A，其降解周期短，降解效率高，產物安全，對于食品安全方面具有顯而易見的好處，并可為雙酚A的降解提供一個新的途徑。
文檔編號A62D3/02GK102198313SQ20111007268
公開日2011年9月28日 申請日期2011年3月25日 優先權日2011年3月25日
發明者姚衛蓉 申請人:江南大學