專利名稱：表皮葡萄球菌對多氯聯苯的降解方法
技術領域：
本發明屬用于污染微生物降解領域，特別是涉及一種表皮葡萄球菌對多氯聯苯的降解 方法。
背景技術：
Jensen在1966年首次報道了環境中多氯聯苯(Polychlorinated biphenyls， PCBs)的污 染，從此，PCBs的存在和它的持久性己成為人們所關注的熱點問題。由于PCBs的持久性 和難于降解性，PCBs是環境中最重要的污染物之一，其廣泛積累于土壤、水、沉積物和大 氣中。目前處理PCBs污染的方法主要是物理或者化學技術，兩者都存在或者價格昂貴或 者產生二次污染的問題。而微生物處理技術作為經濟、有效的方法而被各國采納并開展研 究。
微生物針對不同的污染物會分泌不同的酶參與反應，從而改變有機污染物的結構，將 其降解成為簡單有機物，降低其不利的影響。在PCBs的降解過程中存在著兩種不同的作 用模式厭氧脫氯作用和好氧生物降解作用。
由于微生物對環境的適應性強，且污染過程經歷一段自然馴化期，因而可以通過馴化 從自然環境中篩選到可降解某一污染物的微生物降解菌株。
發明內容
本發明的目的是提供一種微生物降解多氯聯苯的方法，通過表皮葡萄球菌對多氯聯苯 降解，為其污染治理和應用提供技術方法。
本發明的表皮葡萄球菌對多氯聯苯的降解方法，包括
(1) 將表皮葡萄球菌接種于多氯聯苯降解培養基28 32"C搖床培養24 120h;
(2) 培養物經高效液相色譜測定，可分析該菌株對多氯聯苯的降解效果；
(3) 在添加了外加碳源葡萄糖后，提高了多氯聯苯的降解效率，獲得降解多氯聯苯的條 件。
所述表皮葡萄球菌是從上海松江污水處理廠的活性污泥中篩選出來的，此菌株屬于微 球菌科(wz'cracoccaceae)，葡萄球菌屬。該菌株的馴化培養基是0.5 g/L KH2P04、 0.5 g/L K2HP04、 0.2g/LMgSO4、 0.1 g/LCaCl2、 0.2 g/LNaCl、 1.0 g/L (NH4)2S04、 1 g/L聯苯。 該菌落為圓形，邊緣整齊，乳白色，光滑，濕潤，凸起；菌體呈球狀，革蘭氏染色陰性， 菌體周圍有粘液層包裹。
所述的多氯聯苯降解培養基是0.5 g/L KH2P04、 0.5 g/L K2HP04、 0.2 g/LMgS04， 0.1g/LCaCl2、 0.2 g/L NaCl、 1.0 g/L (NH4)2S04、 100mg/L 2,3，,4，,5-四氯聯苯一丙酮溶液， pH6.8-7.2。
所述的降解多氯聯苯的條件為pH7.0， 30°C，搖床的轉動頻率150rpm。
有益效果
表皮葡萄球菌在pH7.0， 30°C，搖床的轉動頻率150rpm，在添加了外加碳源葡萄糖的 降解培養基中發酵5天，表皮葡萄球菌對2,3'，4'5-四氯聯苯的降解效率達到93.33%。
圖1是表皮葡萄球菌(5to; /^/ococc^印/cfem7/^y)所屬種群系統樹；
圖2是2,3',4',5-四氯聯苯一丙酮溶液作為標準樣品的高效液相色譜圖3是降解培養基(DM)作為對照樣品的高效液相色譜圖4是降解培養基(DM)中表皮葡萄球菌對PCBs降解的高效液相色譜圖5是在添加了外加碳源葡萄糖的降解培養基中表皮葡萄球菌對PCBs的降解效率。
具體實施例方式
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明 而不用于限制本發明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發明講授的內容之后，本領域技術 人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限
定的范圍。
實施例1多氯聯苯降解菌的分離鑒定
1、菌株的分離
(1)采集上海松江污水處理廠的活性污泥，置于一個長60cm，寬40cm，高50cm的玻 璃馴化裝置，在不加營養物質，沒有進水出水交換的基礎上用空壓機曝氣3天，然后進行 換水，排出裝置中大約10L的泥水混合物，加入營養液并進行不間斷曝氣。在培養了 10 天后在加入營養液的同時開始加入PCBs的廢液進行馴化培養，培養馴化兩個月。培養液 的配制葡萄糖5克、尿素2克、磷酸二氫鉀l克。配制成大約IO升左右的營養液。
(2)將馴化后的水樣沉淀30分鐘后取上清夜，然后用8層紗布過濾兩遍，濾液與富集 培養基按體積1:5的比例配成溶液移入錐形瓶中，放在搖床上培養。搖床轉速為150r/min， 溫度為3(TC，調節溶液pH值為7.0。富集培養基(Enrichment Medium)的主要成分為 牛肉浸膏5g/L，蛋白胨10g/L，氯化鈉5g/L， pH7.4 7.6。
在馴化培養中利用聯苯作為唯一碳源再進行馴化培養。取馴化培養基100ml移入250ml的錐形瓶中，調節pH值為7.0，在無菌條件下移入富集培養基的混濁液lml。放入 搖床中培養，搖床轉速為150r/min，溫度為30°C，培養時間為兩個星期。馴化培養基 (Domestication Medium)的主要成分為0.5 g/LKH2P04、 0.5 g/L K2HP04、 0.2g/LMgSO4， 0.1g/LCaCl2、 0.2g/LNaCl、 1.0 g/L (NH4)2S04、 1 g/L聯苯。
菌株劃線分離，分離培養基SM (SeparateMedium)的主要成分為牛肉浸膏5g/L、 蛋白胨10g/L、氯化鈉5g/L、瓊脂粉20g/L、聯苯0.5g/L。得到單一菌株，在純化富集培 養基中富集培養。純化富集培養基PEM (Purification Enrichment Medium)主要成分為 0.5 g/L KH2P04、 0.5 g/L K2HP04、 0.2 g/L MgS04， 0.1 g/L CaCl2、 0.2 g/L NaCl、 1.0 g/L (NH4)2S04、 2g/L聯苯。
2、菌株的鑒定
(1) 菌體及菌落形態特征
菌株個體為球狀，革蘭氏染色陰性，菌體周圍有粘液層包裹；其菌落為圓形，邊緣整 齊，乳白色，光滑，濕潤，凸起。
(2) 通過16S rDNA序列測定和分析比較，該序列與表皮葡萄球菌16S rDNA序列的 同源性達到99%，確定該菌株為表皮葡萄球菌(Sto戶/^/ococciw印fflfeA7w'cfo),其16SrDNA 序列如表l。
實施例2表皮葡萄球菌對多氯聯苯的降解分析 將表皮葡萄球菌接種到經滅菌的馴化培養基中(0.5 g/L KH2P04、 0.5 g/L K2HP04、 0.2g/LMgSO4、 0.1g/LCaCl2、 0.2 g/LNaCl、 1.0 g/L (NH4)2S04、 1 g/L聯苯)，置于恒溫 搖床內，30°C， 150rpm，培養14天。然后接種于PCBs降解培養基(DegradationMedium) (0.5g/LKH2PO4、 0.5g/LK2HPO4、 0.2g/LMgSO4， 0.1g/LCaCl2、 0.2g/LNaCl、 1.0 g/L (NIL02SO4、 100mg/L2，3，,4，,5-四氯聯苯一丙酮溶液、pH7.0)，樣品經高效液相色譜測定， 分析該菌對PCBs的降解效果。 液相色譜條件
① 單柱單檢測系統，長250mm，內徑5mm活性炭柱。
② 載體比例色譜級甲醇10%，純凈水90%
③ 柱溫150°C
④ 泵及泵壓范圍二元泵，20 400Pa
⑤ 進樣方式手動進樣⑥ 進樣量50 UL
⑦ 波長范圍檢測波長230nm，參比波長360nm
先用2,3'，4'，5-四氯聯苯一丙酮溶液作為標準樣品測得樣品中的PCBs在7. 5min處出現 波峰，如圖2。確定了PCBs標準樣品的出峰時間，就可以進一步分析PCBs的降解效果。 通過在降解培養基(DN)中未接種表皮葡萄球菌作為對照和接種表皮葡萄球菌樣品的高效 液相色譜圖比較(如圖3、圖4)可以得到PCBs的初始濃度為15. 7ng/ix L，最終濃度為5. 9ng/ U L ，降解效率為62. 4%。
實施例3外加碳源對多氯聯苯降解效率的影響
(1) 將表皮葡萄球菌，接入富集培養基EM內，置于搖床內3(TC， 150rpm，富集培養 5天。
(2) 配制三份50ml的降解培養基DM，其中一份添加2g/L葡萄糖做外加碳源，置于 150ml錐形瓶中。一瓶不接種留作空白，另兩瓶分別接種100ul富集菌液。搖床30'C， 150rpm培養。
(3) 在無菌操作條件下，分別于接種后ld、 2d、 3d、 4d、 5d取出5ml菌液。
(4) 樣品預處理
① 將菌液置于分液漏斗內，分三次加入二氯甲烷。第一、二次加入2ml，第三次加入 lml。每次加入后充分振蕩，靜置片刻。待上下完全分層后，取出下層油相層。
② 將上述所取的油相，用無水硫酸鈉過濾。并統一濃縮至lml。 液相色譜條件與實施例2中的液相色譜條件相同。
經分析測定，得到表皮葡萄球菌降解多氯聯苯的條件在pH7.0， 30'C,搖床的轉動 頻率150rpm，添加了外加碳源葡萄糖的降解培養基中發酵5天，表皮葡萄球菌對2,3',4'5-四氯聯苯的降解效率達到93.33%，見圖5。表1 16S rDNA序列 caccttcgac ggctagctcc aaatggttac tccaccggct tcgggtgtta caaactctcg 60 tggtgtgacg ggcggtgtgt acaagacccg ggaacgtatt caccgtagca tgctgatcta 120 cgattactag cgattccagc ttcatatagt cgagttgcag actacaatcc gaactgagaa 180 caactttatg ggatttgctt gacctcgcgg tttcgctacc ctttgtattg tccattgtag 240 cacgtgtgta gcccaaatca taaggggcat gatgatttga cgtcatcccc accttcctcc 300 ggtttgtcac cggcagtcaa cttagagtgc ccaacttaat gatggcaact aagcttaagg 360 gttgcgctcg ttgcgggact taacccaaca tctcacgaca cgagctgacg acaaccatgc 420 accacctgtc actctgtccc ccgaagggga aaactctatc tctagagggg tcagaggatg 480 tcaagatttg gtaaggttct tcgcgttgct tcgaattaaa ccacatgctc caccgcttgt 540 gcgggtcccc gtcaattcct ttgagtttca accttgcggt cgtactcccc aggcggagtg 600 cttaatgcgt tagctgcagc acttaagggc ggaaaccccc taacactt 648
權利要求
1. 表皮葡萄球菌對多氯聯苯的降解方法，包括(1)將表皮葡萄球菌接種于多氯聯苯降解培養基28～32℃搖床培養24～120h；(2)培養物經高效液相色譜測定，分析該菌株對多氯聯苯的降解效果；(3)在添加了外加碳源葡萄糖后，獲得降解多氯聯苯的條件。
2. 根據權利要求1所述的表皮葡萄球菌對多氯聯苯的降解方法，其特征在于所述表皮葡萄球菌是從上海松江污水處理廠的活性污泥中篩選出來的，其馴化培養基是0.5 g/L KH2P04、 0.5 g/L K2HP04、 0.2g/LMgSO4、 0.1 g/LCaCl2、 0.2 g/LNaCl、 1.0 g/L (NH4)2S04、 1 g/L聯苯。
3. 根據權利要求1所述的表皮葡萄球菌對多氯聯苯的降解方法，其特征在于所述的多氯聯苯降解培養基是0.5 g/LKH2P04、 0.5 g/LK2HP04、 0.2 g/LMgS04， 0.1 g/LCaCl2、 0.2 g/L NaCl、 1.0g/L(NH4)2SO4、 100mg/L 2,3，,4，,5-四氯聯苯_丙酮溶液、pH 6.8-7.2。
4. 根據權利要求1所述的表皮葡萄球菌對多氯聯苯的降解方法，其特征在于所述的降 解多氯聯苯的條件為pH7.0， 30°C，搖床的轉動頻率150rpm。
全文摘要
本發明涉及表皮葡萄球菌對多氯聯苯的降解方法，包括將表皮葡萄球菌接種于多氯聯苯降解培養基28～32℃搖床培養24～120h，其培養物經高效液相色譜測定，可分析該菌株對PCBs的降解效果。在添加了外加碳源葡萄糖后，可提高表皮葡萄球菌對多氯聯苯的降解效率，獲得該菌降解多氯聯苯的條件。
文檔編號A62D3/00GK101428171SQ200810041050
公開日2009年5月13日 申請日期2008年7月25日 優先權日2008年7月25日
發明者任昱宗, 龐曉倩, 瑤 彭, 趙曉祥 申請人:東華大學