牛奶樣品布氏桿菌套式pcr檢測方法

專利名稱：：牛奶樣品布氏桿菌套式pcr檢測方法
技術領域：
：本發明屬于生物
技術領域：
，涉及基因工程技術，具體為牛奶樣品布氏桿菌的套式PCR檢測方法。
背景技術：
：布氏桿菌病(3^^//^)又稱馬爾他熱或波狀熱，是由布氏桿菌屬(5^"http://"引起的人畜共患的自然疫源性傳染病，對人類健康和畜牧業生產都有嚴重危害，1859年由Morston首次報道。布氏桿菌可感染人類、多種家畜和野生動物，引起相似的臨床癥狀與病理損傷，如發熱、流產與不育、慢性關節炎及神經損害等，可導致巨大的經濟損失和嚴重的公共衛生問題。家畜布氏桿菌病常發于豬、羊和牛，是人類布氏桿病的主要傳染源。布氏桿菌傳染性強、傳播迅速，世界動物衛生組織(OIE)將其列為B類動物疫病，我國列為二類動物疫病。1995年以來，我國人畜布氏桿菌疫情明顯回升，2000年以后開始呈快速增長趨勢，局部地區甚至出現爆發，衛生部統計數據顯示1994年布病新發病人數為815人，發病率0.05/10萬，到2005年新發病人數已經接近2萬人，發病率高達1.41/10萬，比2004年增加60.2%，疫情形勢十分嚴峻。布氏桿菌病是國際貿易檢疫中必檢的傳染病，我國每年均開展對奶牛的布氏桿菌病的普査和監控。目前，我國所采用的布氏桿菌檢測技術包括虎紅平板凝集試驗(RBT)、試管凝集試驗(SAT)和補體結合試驗(CFT)等，均不能適應現代檢驗檢疫需求。RBT和SAT等凝集試驗雖然操作簡便、耗時短，但存在假陽性反應，OIE已取消其作為布氏桿菌病的檢測方法；CFT則操作繁瑣，實驗條件和技術水平要求高，無法在基層單位開展。因此，迫切需要建立新型的快捷、簡便的檢測方法。酶聯免疫吸附試驗(ELISA)具有很高的特異性和敏感性，用于檢測布氏桿菌特異性抗體，但不能將疫苗免疫與致病菌感染的抗體相區別。在病原檢測方面，針對布氏桿菌保守基因(如BCSP31、16SrRNA)的PCR檢測方法相繼建立，但多限于對布氏桿菌純培養物或提純染色體DNA的實驗室檢測，并顯示不同的敏感性(20-100CFU/mL或8fg-20pg)，尚未建立對臨床樣品(特別是牛奶及其制品)的檢測技術，遠不能滿足動物布氏桿菌病檢驗檢疫和監控的實際需求。由于牛奶及其制品中存在大量乳脂和蛋白質等多種非特異性影響因素，嚴重影響牛奶樣品細菌染色體DNA的提取效率，因此直接從牛奶樣品檢測布氏桿菌DNA存在較大難度。
發明內容本發明的目的是提供直接從牛奶樣品中直接檢測布氏桿菌的套式PCR檢測方法，為奶牛布氏桿菌病普査和監測，以及牛奶制品的食品安全監控提供新的技術手段。本發明所建立的牛奶樣品布氏桿菌套式PCR檢測方法，可以套式PCR引物直接從牛奶樣品中檢測布氏桿菌特異性DNA片段。用3.4n/。十二垸基磺酸鈉(SDS)裂解牛奶樣品沉淀，經1mg/mL蛋白酶K和RNaseA消化，以優化的CTAB-NaCl法提取牛奶樣品細菌染色體DNA，以套式PCR引物直接從牛奶樣品中檢測布氏桿菌特異性DNA片段。套式PCR引物的外向引物為5'-TCGAGCGCCCGCAAGGGG-3，和5'-AACCATAGTGTCTCCACTAA-3'，內向引物為5'-ATCGGCAAATGATCGGCC-3，和5'-TACTCCCCAGGCGGAATGTT-3'，分別擴增903bp和628bp布氏桿菌16SrRNA特異性DNA片段。本發明的詳細步驟如下(1)將牛奶樣品沉淀用NET溶液懸浮，在懸浮液中加入10。/。十二烷基磺酸鈉(SDS)，至終濃度為SDS重量占懸浮液體積的3.4o/。(w/v),裂解牛奶樣品沉淀，獲牛奶樣品裂解液；(2)在每毫升牛奶樣品裂解液中加入1毫克蛋白酶K和1毫克RNaseA消化，獲牛奶樣品裂解消化液；(3)以CTAB-NaCl法從牛奶樣品裂解消化液中提取牛奶樣品細菌染色體DNA;(4)用套式PCR引物直接從牛奶樣品細菌染色體DNA中檢測布氏桿菌特異性DNA片段。套式PCR引物的夕卜向引物為5，-TCGAGCGCCCGCAAGGGG-3，和5，國AACCATAGTGTCTCCACTAA-3，，內向引物為5'-ATCGGCAAATGATCGGCC-3'和5，-TACTCCCCAGGCGGAATGTT-3'，分別擴增903bp和628bp布氏桿菌16SrRNA特異性DNA片段。以上步驟(3)所述CTAB-NaCl法提取牛奶樣品細菌染色體DNA的具體步驟為在每毫升牛奶樣品裂解消化液中加入5M的NaCl溶液0.14毫升，混合后加入含10%十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)和0.7MNaCl的預熱至65°C的CTAB-NaCl水溶液，使CTAB在提取液中的終濃度的重量體積比為CTAB3.4%(w/v)，NaCl在提取液中的終濃度為0.7M;再經氯仿抽提和異丙醇沉淀，沉淀物用超純水溶解，獲牛奶樣品細菌染色體DNA。本發明具體敘述如下1、根據布氏桿菌16SrRNA基因序列，設計合成布氏桿菌套式PCR的外向引物5'-TCGAGCGCCCGCAAGGGG-3'和5'-AACCATAGTGTCTCCACTAA-3，，以及內向引物5，-ATCGGCAAATGATCGGCC-3，和5，-TACTCCCCAGGCGGAATGTT-3，，分別擴增903bp和628bp布氏桿菌16SrRNA特異性DNA片段。2、離心新鮮牛奶，取牛奶樣品沉淀用NET溶液懸浮，用3.4e/。十二烷基磺酸鈉(SDS)裂解，經1mg/mL蛋白酶K和RNaseA消化，力口5MNaCl溶液，混后加入含10%十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)和0.7MNaCl的CTAB-NaCl溶液(CTAB和NaCl終濃度為3.4%禾卩0.7M)處理牛奶樣品裂解液，經氯仿抽提和異丙醇沉淀，以超純水溶解DNA，用于套式PCR檢測。3、初次PCR反應體系為10xPCRBuffer(含Mg"2.5|iL、2.5mMdNTP0.5pL、外向引物(12mM)各0.5pL、Taq酶0.15nL、細菌染色體DNA5^L，超純水15.85擴增程序為95。C預變性2min，94。C變性30sec、55。C退火30sec、72。C延伸1min，共30個循環，最后72。C延伸1min。4、二次PCR反應體系為1OxPCRBuffer(含Mg2+)2.5^L、2.5mMdNTP0,5nL、內向引物(12mM)各0.5^L、Taq酶0.15pL、初次PCR產物1^L,超純水19.85擴增程序為95。C預變性2min,94。C變性30sec、55。C退火30sec、72。C延伸1min,共20個循環，最后72i:延伸lmin。5、PCR產物以1%瓊脂糖凝膠電泳檢查，觀察903bp或628bp的初次、二次擴增條帶。本發明的優點是(1)本發明提供的套式PCR檢測方法特異性強，有效擴增出牛奶中污染布氏桿菌16SrRNA的特異性DNA片段，與大腸桿菌、溶血性鏈球菌、沙門氏菌、克雷伯氏桿菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌和螺旋桿菌等細菌不存在非特異擴增；(2)套式PCR檢測方法敏感性高，對牛奶樣品中布氏桿菌檢測下限達3.3CFU/mL;(3)套式PCR檢測方法實用性強，可直接檢測牛奶樣品中污染的布氏桿菌。圖1為套式PCR引物的特異性鑒定圖，圖中A是套式PCR外向引物F4/R2擴增結果，B是套式PCR內向引物F2D/R1U擴增結果；M是100bpDNALadder,1是布氏桿菌M5疫苗株，2是大腸桿菌，3是溶血性鏈球菌，4是沙門氏菌，5是克雷伯氏桿菌，6是金黃色葡萄球菌，7是綠膿桿菌，8是螺旋桿菌，C是純水對照。圖2為布氏桿菌初次PCR擴增的敏感性鑒定圖，圖中A是套式PCR外向引物F4/R2擴增結果，B是套式PCR內向引物F2D/R1U擴增結果；M是100bpDNALadder,1是1000CFU/1.5mL，2是250CFU/1.5mL,3是100CFU/1.5mL，4是5CFU/1.5mL，C是純水對照。圖3為布氏桿菌二次PCR擴增的敏感性鑒定圖，圖中M是100bpDNALadder,1是1000CFU/1.5mL，2是250CFU/L5mL，3是100CFU/1.5mL，4是5CFU/1.5mL，C是純水對照。圖4為臨床牛奶樣品的套氏PCR檢測結果圖，圖中M是100bpDNALadder，1-16是臨床牛奶樣品，C是純水對照。具體實施例方式本發明所建立的牛奶樣品布氏桿菌套式PCR檢測方法，可以套式PCR中物直接從牛奶樣品中檢測布氏桿菌特異性DNA片段，包括布氏桿菌套式PCR引物設計合成、牛奶樣品細菌染色體DNA提取、初次PCR擴增，二次PCR擴增和凝膠電泳檢查等過程，其具體的實施方式如下。1、布氏桿菌套式PCR引物設計合成根據布氏桿菌16SrRNA基因序列，設計合成特異性套式PCR引物，其中外向引物為5'-TCGAGCGCCCGCAAGGGG-3'和5'-AACCATAGTGTCTCCACTAA-3'，擴增產物大小為903bp;內向引物為5，-ATCGGCAAATGATCGGCC-3'禾口5'-TACTCCCCAGGCGGAATGTT-3',擴增產物大小628bp。以適量無菌水溶解上述套式PCR引物，濃度為12mM。2、牛奶樣品細菌染色體DNA提取以優化的CTAB-NaCl法提取牛奶樣品的細菌染色體DNA，包括牛奶樣品離心沉淀，十二烷基磺酸鈉(SDS)裂解，蛋白酶K和RNaseA消化，CTAB-NaCl溶液處理，氯仿抽提，異丙醇沉淀，超純水溶解DNA等。具體步驟如下(1)取1.5mL新鮮牛奶樣品，10,000r/min離心10min，棄上清(2)用NET溶液(50mMNaCl,125mMEDTA,50mMTris-HCl,pH7.6)懸浮沉淀至400HL，力n200nL10%(w/v)SDS溶液至終濃度3.4%(w/v)，置80。C水浴10min，冰上冷卻3min;(3)分別加入3蛋白酶K(200mg/mL)和RNaseA(200mg/mL)至終濃度1mg/mL，50°C水浴2h;(4)加100nL5MNaCl溶液，混勻后加入300pL預熱至65'C的含10%(w/v)CTAB和0.7MNaCl的CTAB-NaCl溶液(稱取4.1gNaCl溶于80mL水中，緩慢加入10gCTAB，加熱溶解，定容至100mL)，CTAB和NaCl在提取液中的終濃度分別為3.4。/。(w/v)和0.7M，65°C水浴10min;(5)加入600nL氯仿:異戊醇(24:l)，室溫震蕩2min，10，000r/min離心5min;小心將上清轉移到干凈離心管中，加600nL氯仿:異戊醇(24:1)重復抽提1次；(6)在上清中加入2/3體積異丙醇，混勻，室溫放置5min，10,000r/min離心10min，棄上清；沉淀用70%乙醇洗2次，37。C干燥10min;(7)以5超純水溶解DNA沉淀，用于PCR擴增。3、初次PCR擴增PCR反應體系(25iaL)為10xPCRBuffer(含Mg2+)2.5nL、2.5mMdNTP0.5|iL、外向引物(12mM)各0.5pL、Taq酶0.15|nL、細菌染色體DNA5^L，超純水15.85^L;擴增程序為95。C預變性2min，94。C變性30sec、55。C退火30sec、72。C延伸1min，共30個循環，最后72'C延伸lmin。4、二次PCR擴增PCR反應體系(25^L)為10xPCRBuffer(含Mg2、2.5nL、2.5mMdNTP0.5^L、內向引物(12mM)各0.5pL、Taq酶0.15^L、初次PCR產物1^L，超純水19.85擴增程序為95。C預變性2min，94。C變性30sec、55。C退火30sec、72。C延伸1min，共20個循環，最后72。C延伸1min。5、凝膠電泳檢査取10pLPCR產物，以1。/。瓊脂糖凝膠進行電泳檢査，在凝膠圖像分析儀上觀察903bp和628bp的初次和二次擴增條帶。實施例1布氏桿菌的細菌培養與計數1、細菌培養稱取Triptosa20g、NaCl5g和葡萄糖1g，以1000mL蒸餾水溶解，調pH至6.7-7.0，試管分裝，11(TC滅菌20min;在液體培養基中加入1.5%瓊脂粉，加熱溶化后高壓滅菌，傾倒平板，制備瓊脂平板。以接種環在瓊脂平板上劃線接種布氏桿菌M5疫苗株，置37'C溫箱培養24h，挑取單菌落接種到液體培養基，37'C溫箱培養至OD600"0.5。2、細菌計數取50nL細菌培養物，以液體培養基進行連續10倍的倍比稀釋，取1(T5、10—6、10—7稀釋的菌液各100pL均勻涂布于瓊脂平板，置37'C溫箱培養24h，對各稀釋度進行菌落計數，測定培養物的細菌含量，即每毫升培養物的菌落形成單位數(CFU/mL)。實施例2套式PCR引物設計與篩選從GenBank數據庫收集布氏桿菌以及相關細菌的基因組序列，選取布氏桿菌編碼的31kDa、25kDa外膜蛋白基因和16SrRNA基因的特異性保守區段，設計布氏桿菌的PCR外向引物(表l)，引物由上海生物工程公司合成；以PCR擴增布氏桿菌M5疫苗株染色體DNA，檢測不同引物對的擴增效率。結果引物F4/R2和B4/B5分別從10—3稀釋的染色體DNA中擴增出903bp和223bp目的片段，其擴增效率優于引物F3/R3和B25F/B25R，后兩者僅能從1(^稀釋的染色體DNA中擴增出640bp或470bp目的片段；而引物B31F/B31R均未3個稀釋度的染色體DNA中擴增出預期的534bp目的片段，因此選取擴增較長片段的F4/R2為一次擴增外向引物。根據F4/R2擴增片段序列分別設計套式PCR內向引物(表1)，結果內向引物F2D/R1U能有效從l(T3稀釋的染色體DNA中擴增628bp目的片段，為最佳二次擴增內向引物。序列測定表明，弓l物F4/R2和F2D/R1U的擴增產物為布氏桿菌16SrRNA的特異性DNA片段。實施例3牛奶樣品中細菌染色體DNA的提取將100pL已知濃度稀釋布氏桿菌M5疫苗株菌液加入2.0mL離心管中，再加入1.4mL滅菌新鮮牛奶，混勻后10000r/min離心10min，棄上清保留沉淀，將樣品分組分別加NET緩沖液(50mMNaCl,125mMEDTA，50mMTris-HClpH7.6)或者TE緩沖液(lmMEDTA,10mMTris-HClpH7.6)至400ixL,再加入50^L2.6NNaOH或200uL10%SDS，將樣品分別置室溫、37°C、80°C、IO(TC孵育10min，然后將樣品置冰上3min，然后分別加入不同濃度蛋白酶K(IOO、200或400mg/mL)和RNaseA(lOO、200、400或800mg/mL)，然后置5(TC分別孵育0.5、1、1.5、2或3h，取出用CTAB-NaCl方法進行DNA抽提力n100pL5MNaCl溶液，混勻后加入300)iL預熱至65°C的含10°/。(w/v)CTAB和0.7MNaCl的CTAB-NaCl溶液(稱取4.1gNaCl溶于80mLtR中，緩慢加入10gCTAB，加熱溶解，定容至100mL)，CTAB和NaCl在提取液的終濃度分別為3.4n/。(w/v)和0.7M，65'C水浴10min;加入600氯仿:異戊醇(24:1)，室溫間或震蕩2min，10000r/min離心5min，小心將上清轉移到干凈的離心管中，再次加600^L氯仿:異戊醇(24:1)，10000r/min離心5min，小心將上清轉移到干凈的離心管中，加入2/3體積異丙醇，混勻，室溫放置5min，10000r/min離心10min，沉淀用70%的乙醇洗一次，再離心一次，37'C干燥10min,沉淀用5fiLTE或超純水溶解。以PCR檢測布氏桿菌染色體DNA提取效果，建立并優化牛奶樣品布氏桿菌染色體DNA提取方法。結果以NET緩沖液重懸沉淀的PCR效果優于TE溶液，SDS的裂解效率高于NaOH，最佳裂解條件為80'C作用10min;蛋白酶K和RNaseA的最適工作濃度均為1mg/ml，反應條件為5(TC水浴2h。實施例4套式PCR反應體系和擴增程序的建立1、初次PCR擴增的反應體系與擴增程序優化以提取的牛奶樣品細菌染色體DNA為模板，分別以5對外向引物構成25jiL的初次PCR反應體系，體系由10xPCRBuffer(含Mg2+)2.5nL、2.5mMdNTP0.5nL、上下游引物(12mM)各0.5nL、Taq酶0.15pL、牛奶樣品細菌染色體DNA5(iL，超純水15.85pL組成。擴增程序為95。C預變性2min、94。C變性30sec、40-60。C退火30sec、72'C延伸1min，共30個循環，最后72T:延伸lmin。1%瓊脂糖凝膠電泳檢査PCR擴增片段。梯度PCR擴增結果顯示，布氏桿菌初次PCR擴增的最適外向引物為F4/R2，最佳退火溫度為55'C。2、二次PCR擴增的反應體系與擴增程序優化根據最佳外向引物F4/R2擴增目的片段序列設計內向引物，構成25的二次PCR擴增體系，體系由10xPCRBuffer(含Mg2+)2.5pL、2.5mMdNTP0.5(aL、上下游引物(12mM)各0.5hL、Taq酶0.15^L、初次PCR擴增產物1jiL，超純水19.85^L。反應條件為95'C預變性2min，94。C變性30sec、40-60'C退火30sec、72。C延伸1min,共20個循環；最后72'C延伸1min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢查PCR擴增片段。梯度PCR擴增結果顯示，布氏桿菌二次PCR擴增的最適外向引物為F2D/R1U，最佳退火溫度為55。C。實施例5套式PCR引物的特異性鑒定分別培養布氏桿菌M5疫苗株、大腸桿菌、溶血性鏈球菌、沙門氏菌、克雷伯氏桿菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌和螺旋桿菌，用煮沸法提取細菌培養物的染色體DNA，分別以外向引物F4/R2和內向引物F2D/R1U進行PCR擴增，檢測套式PCR引物的特異性。結果引物F4/R2和F2D/R1U從布氏桿菌M5疫苗株的染色體DNA中分別擴增出903bp和628bp特異性目的片段，但對大腸桿菌、溶血性鏈球菌、沙門氏菌、克雷伯氏桿菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌和螺旋桿菌的染色體DNA均未見非特異性擴增條帶(圖1)，說明套式PCR的外向引物F4/R2和內向引物F2D/R1U具有強的特異性。實施例6牛奶樣品布氏桿菌套式PCR檢測方法的敏感性鑒定分別將100nL含1000、250、100和5CFU的布氏桿菌M5疫苗株加入1.4mL新鮮滅菌無布氏桿菌污染的牛奶，以優化的CTAB-NaCl法提取細菌染色體DNA，分別用外向引物F4/R2和內向引物F2D/R1U進行PCR擴增。結果顯示，引物F4/R2和F2D/R1U均從100CFU/1.5mL布氏桿菌陽性牛奶樣品中擴增出特異性目的條帶(圖2)，初次擴增檢出布氏桿菌的敏感性均為66.7CFU/mL。以外向引物F4/R2初次擴增產物為模板，用內向引物F2D/R1U進行二次擴增，從5CFU/1.5tnL布氏桿菌陽性牛奶樣品中擴增出特異性DNA條帶(圖3)，表明牛奶樣品布氏桿菌套氏PCR檢測方法的敏感性為3.3CFU/mL。實施例7套式PCR檢測方法對臨床牛奶樣品的檢測用優化的CTAB-NaCl法提取80份RBT和SAT試驗陽性疑似布氏桿菌病牛奶樣品DNA，并進行套式PCR臨床檢測，并與細菌分離結果進行比較。部分臨床牛奶樣品的套式PCR檢測結果見圖4。結果套式PCR檢測方法能從80份樣品中檢出50份布氏桿菌感染陽性樣品，檢出率為62.5%，較細菌分離的檢出率(56.25%)提高了6.25%，與細菌分離的陽性符合率為訓％。序列表表l牛布氏桿菌套式PCR引物<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>權利要求1.一種牛奶樣品布氏桿菌套式PCR檢測方法，其特征在于以下步驟(1)將牛奶樣品沉淀用NET溶液懸浮，在懸浮液中加入10％十二烷基磺酸鈉(SDS)，至SDS在懸浮液的終濃度的重量體積比為3.4％，裂解牛奶樣品沉淀，獲牛奶樣品裂解液；(2)在每毫升牛奶樣品裂解液中加入1毫克蛋白酶K和1毫克RNaseA消化，獲牛奶樣品裂解消化液；(3)以CTAB-NaCl法從牛奶樣品裂解消化液中提取牛奶樣品細菌染色體DNA；(4)用套式PCR引物直接從牛奶樣品細菌染色體DNA中檢測布氏桿菌特異性DNA片段。2.根據權利要求1所述的牛奶樣品布氏桿菌套式PCR檢測方法，其特征在于套式PCR引物的外向引物為5，-TCGAGCGCCCGCAAGGGG-3，禾口5，-AACCATAGTGTCTCCACTAA-3，，內向引物為5，-ATCGGCAAATGATCGGCC-3，和5，-TACTCCCCAGGCGGAATGTT-3'，分別擴增903bp和628bp布氏桿菌16SrRNA特異性DNA片段。3.根據權利要求1所述的牛奶樣品布氏桿菌套式PCR檢測方法，其特征在于步驟(3)所述CTAB-NaCl法提取牛奶樣品細菌染色體DNA的具體操作為在每毫升牛奶樣品裂解消化液中加入5M的NaCl溶液0.14毫升，混合后加入含10%十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)和0.7MNaCl的預熱至65°C的CTAB-NaCl水溶液，使CTAB在提取液中的終濃度的重量體積比為3.4%,NaCl在提取液中的終濃度為0.7M;再經氯仿抽提和異丙醇沉淀，沉淀物用超純水溶解，獲牛奶樣品細菌染色體DNA。全文摘要本發明牛奶樣品布氏桿菌套式PCR檢測方法涉及基因工程技術。根據布氏桿菌16SrRNA基因序列，設計合成套式PCR的外向引物和內向引物；用優化CTAB-NaCl法提取牛奶樣品細菌染色體DNA，以外向引物和內向引物進行二次PCR擴增，凝膠電泳檢查PCR產物，建立牛奶樣品布氏桿菌套式PCR檢測方法。該方法可直接從牛奶樣品中檢出污染布氏桿菌，對牛奶樣品中布氏桿菌的檢測下限達3.3CFU/mL，與大腸桿菌、溶血性鏈球菌、沙門氏菌、克雷伯氏桿菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌和螺旋桿菌等細菌不存在非特異擴增，具有特異性強、敏感性高和實用性強等優點，可為奶牛布氏桿菌病普查和監測，以及牛奶制品食品安全監控提供新的技術手段。文檔編號C12Q1/04GK101100693SQ200710070130公開日2008年1月9日申請日期2007年7月20日優先權日2007年7月20日發明者周繼勇,杜振昆,郭軍慶申請人:浙江大學