專利名稱：：Slc39a7基因作為豬脂肪沉積性狀的遺傳標記及應用的制作方法
技術領域：
：本發明涉及豬育種與豬的分子輔助選擇
技術領域：
，具體涉及一種與豬的脂肪沉積性狀相關基因虹C3A47DNA片段的克隆以及作為豬脂肪沉積性狀的遺傳標記的應用，為豬的標記輔助選擇提供一種新標記和新方法。
背景技術：
：通過生產性狀的表型值估算出的育種值進行動物選擇性育種，已大大促進了家畜生產性狀的遺傳改良。九十年代以來，隨著分子生物學技術的進步以及在豬領域中的應用，逐步出現了以分子標記為核心的分子標記輔助選擇和滲入等分子育種技術，這些技術與常規育種相結合，大大加速了豬育種進程。能夠應用于分子標記輔助選擇的基因或標記必須對目標性狀具有較大的遺傳貢獻率，即主效基因或標記，因此尋找這些主效基因和與之緊密連鎖的分子標記成為分子標記輔助選擇的前提和基礎，也是當前和今后一段時間豬分子生物學領域的研究重點和急需解決的問題。目前己有多個位于功能基因內部的與生產性狀緊密連鎖的分子標記被發現并申請專利。例如，在傳統的豬育種計劃中，由于消費者對瘦肉的興趣，因此選擇主要強調降低脂肪。脂肪降低主要以背膘厚降低來衡量。然而，背膘厚下降同樣導致了肌內脂肪的下降，脂肪最后的沉積部位是肌肉，因此肌內脂肪與味道以及肌肉的接受程度呈正相關。為防止肌內脂肪進一步的下降，必須找到影響此性狀的分子標記，因為肌內脂肪是很難在活體中度量的。Gerbens等證實了位于豬6號染色體上肌肉組織特異候選基因心臟脂肪酸結合蛋白與豬中肌內脂肪含量和其它生產性狀的關系，該基因已被申請專利，其專利號為WO97/35878;另外，Rothschild等發現了leptin受體基因內與瘦肉率有關的分子標記，其專利號為U.S.Pat.Nos.5972621。在整個生命活動過程中，鋅具有多種作用，它不僅參與了蛋白質、核酸、碳水化合物和脂類代謝，而且還參與了基因轉錄控制、生長、發育和分化。鋅不僅是300多種酶的輔助因子，而且是多種鋅指和環指蛋白的結構成分。鋅離子不能被動的擴散穿過細胞膜，必須要有鋅轉運蛋白轉運鋅進入細胞液，因此鋅轉運蛋白在保持細胞調亡和細胞生長間的平衡具有至關重要的作用。鋅轉運蛋白家族39成員7(見C3A47)屬f鋅轉運蛋白家族，該基因主要定位于細胞的內質網、髙爾基體等亞細胞結構膜上，表達該基因重組蛋白的中國倉鼠卵巢細胞可以提高自由鋅離子的含量，該基因主要從髙爾基體細胞器到細胞質中進行鋅的轉運。許多報道表明，在具有中國地方豬血緣的梅山豬和其它豬種雜交F2資源群體中，7號染色體存在顯著影響豬背膘厚等脂肪沉積性狀的QTL(BidanelJP等,.Cuirentstatusofquantitativetraitlocusmappinginpigs,戶igiVewsand/"_/brma/io",2002，2:39-54;SatoS等，QuantitativetraitlocianalysisforgrowthandcarcasstraitsinaMeishanXDurocF2resourcepopulation.J乂w加5W,2003，81(12):2938-2949:ZuoB(左波)等(2004)Mappingofquantitativetraitlocionporcinechromosome7usingcombineddataanalysis.爿w'an國Jus/ra/!'anJoMmfl/o/^H'imi/Sc紐nce17,1350-1354)。有趣的是，該QTL區域均位于豬主要組織相容性復合體位置區域，并且該QTL中降低背腺厚的等位基因來源于梅山豬群體，而不是大白豬群體。因此，在該區域很有可能存在同一個來源于梅山豬的隱性有利QTL。目前有關該區域BAC庫己經被構建和測序，覓CA47基因就是被定位到該QTL區域的一個功能基因，其基因結構有8個外顯子和7個內含子組成。迄今為止，尚未見關于與豬的脂肪沉積性狀相關基因SZC3A47DNA遺傳標記及其在多態性分析中應用的報道。
發明內容本發明的目的在于克隆豬SLC3M7基因的特異DNA片段，作為豬脂肪沉積性狀的遺傳標記及其在豬脂肪沉積性狀多態性的檢測方面的應用，為豬的標記輔助選擇提供一種新標記和新方法。本發明提供了歐洲血緣豬品種"大白豬"和中國地方血緣豬品種"梅山豬"包括豬SZC3a47基因第3外顯子的402bp的基因組核苷酸序列，其DNA序列如序列表SEQIDNO:1(大白豬)，SEQIDNO:2(梅山豬)；通過2個豬種(大白豬和梅山豬)的上述序列進行ClusterW比對提供了位于該402bp擴增片段內部的2處單核苷酸多態性(SNP),其SNP位點如圖1所示。制備該基因片段的步驟如下選擇中國地方豬種梅山豬和外來的歐洲豬大白豬為試驗材料，從豬血液中提取DNA,根據豬SZC3M7基因的基因組序列(參照GeneBank登錄號CT737383)設計引物，序列如下正向引物F:ATCCTGCTGAGTTTTGCTTCG，反向引物R:TGGGGATGGACACATTGAGAC,利用該引物進行PCR擴增，PCR產物純化、克隆測序，序列比較分析。本發明提供了鑒定上述序列250bp處A/G變異的^3al1—RFLP(限制性內切酶酶切片段長度多態性)基因型分型方法。其步驟包括根據豬MC3M7基閑基因組序列(Gen出ank登錄號CT737383)設計引物，其引物序列如上所示，在豬基因組DNA中進打PCR擴增，PCR擴增片段及/wn酶切分型及檢測。進一步,本發明提供了利用〃諷n—RFLP方法確定的不同基因型個體與脂肪沉積性狀間的相關關系的關聯分析的應用。序列表序列表SEQIDNO:1:是歐洲血緣豬品種"大白豬"的核苷酸序列；序列表犯QIDNO:2:是中國地方豬血緣品種"梅山豬"的核苷酸序列；其中序列表SEQIDNO:1:是實施豬S丄C3SU7基因第3外顯于A/G變異幼旭II—RFLP(限制性內切酶酶切片段長度多態性)基因型分型方法的特異核苷酸序列-.序列表SEQIDNO:2:是實施豬S￡C3M7基因第3外顯于A/G變異腸11—RFLP(限制性內切酶酶切片段長度多態性)基因型分型方法的特異核苷酸序列。圖1:分別是大白豬和梅山豬fflTJM7基因序列比對結果和SNP位點。圖2:見C3M7基因HpaII-RFLP檢測結果瓊脂糖膠濃度為1.5%;圖中泳道M為DL2000Markers:3、4泳道為^4基因型，402bp:1泳道為M基因型，402bp,250bp,152bp:2泳道為￡￡基因型，250bp，152bp。具體實施方式實施例l:S丄CJPJ7基因片段的獲得及多態性檢測方法的建立選擇具有歐洲血緣的"大白豬"和具有中國地方豬血緣的"梅山豬"兩種不同基因型豬品種為試驗材料，根據豬5tCJA47基因基因組序列(GeneBank登錄號CT737383),設計以下引物，引物序列如下正向引物F:ATCCTGCTGAGTTTTGCTTCG反向引物R:TGGGGATGGACACATTGAGAC用上述引物在大白豬和梅山豬基因組DNA中進行PCR擴增，PCR反應體系為25^1,其中模板DNA為50ng,dNTPs濃度為200junol/L,每條引物濃度為0.4jimo1/L，3U的2bgDNA聚合酶(購自BiostarInternational,Canada),加去離子水至總體積25jd:PCR反應程序941C預變性4min;然后94*0變性50s、64TC退火50s、721C延伸lmin,共35個循環；最后72TC延伸10min。對上述兩種基因型豬種的PCR產物經純化(參見武漢生工公司UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒說明書)、克隆后，進行序列測定，序列測定由上海生工生物技術公司完成。上述兩種基因型豬種的PCR產物序列經ClusterW軟件進行序列比對，序列間比對結果見圖l。上述擴增片段大小為402bp，共存在2個堿基變異，其中位于該片段的250bp處的A/G變異導致了相應氨基酸的突變，并引起了W/wII酶切位點UCCGG)多態性。取8.5^1101產物加入0.5|11(10U/|il)限制性內切酶和ljillOxbuffer(含10xBSA),37TCi/;fln瞎切4h，取5nl酶切產物用瓊脂糖或聚丙烯酰胺膠電泳檢測，在紫外燈下或銀染后觀察并記錄酶切結果。此擴增片段大小為402bp,/^wll酶切多態性位點位于該片段的250bp處，若250bp處的堿基為A則不存在///wll酶切位點，用H/wII酶切檢測結果只有一條402bp片段C4等位基因)，當該位點為G時，結果導致—個/^fllI酶切位點的產生，酶切得到兩個片段，長度分別為250bp和152bp(5等位基因)，結果如圖2所示。實施例2:本發明克隆的遺傳標記在不同基因型豬群中的多態性檢測的應用利用本發明的遺傳標記檢測了來自歐洲血緣的兩個外來豬群(大白豬、K:白豬)和6個來自中國地方豬血緣的豬群(皖南花豬、八眉豬、監利豬、陽新豬、梅山豬、鄂西黑豬)中檢測豬S丄C3A47第3外顯于的母wn-RFLP多態性，檢測結果如表l所示。在所檢測的幾個豬種中，歐洲血緣豬種大白豬、長白豬群占優勢的j等位基因的基因頻率分別為0.734和0.679,中國地方豬血緣豬種皖南花豬、八眉豬、監利豬、陽新豬、梅山豬、鄂西黑豬中優勢的5等位基因的基因頻率分別為0.917、0.667、0.714、1、0.738和0.615，在上述來自于歐洲和中國地方豬種間，它們的等位基因頻率表現顯著差異。表1見C3A47基因母wll酶切多態性在不同豬種中的分布結果<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>實施例3:本發明克隆的遺傳標記在豬脂肪沉積性狀關聯分析中的應用(1)單標記分析為了確定fflC3A47基閑多態性與豬表型差異是否相關,選擇中國湖北省武漢市華中農業大學農業部豬遺傳育種重點開放實驗室組建的293頭大白豬X梅山豬F2代資源群體為試驗材料,采用實施例2所建立的Hpcn-RFLP方法進行多態性檢測，并分析豬StCJA47基閑一H—RFLP不同基R型勾豬胴體性狀的相關關系。釆用SAS統計軟件(SASInstituteInc，Vereion8.0)glm程序進行單標記方差分析'模型如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>3V/為性狀表型值，W為平均值，g,為基因型效應(包括基因加性效應和顯性效應)；A、y,，力為固定效應，分別為性別、年度、家系效應，P為屠宰體重的回歸系數；coVv為屠宰體重作為協變量，《為殘差效應。在所檢測的293頭大白豬X梅山豬F2代個體中，^4基因型有97個，M基因型有143個，55基因型有53個。不同基因型與胴體性狀間的統計分析結果總結于表2。由表2可以看出，H/7an-RFLP基因型不同時，在板油重、內脂率、肩部最厚處背腺厚、胸腰椎結合處背腺厚、臀部平均背膘厚以及平均背膘厚等脂肪沉積性狀存在顯著或極顯著差異，來源于梅山豬品種的等位基因降低脂肪沉積，效應方向與品種間的表型效應并不完全一致。該位點對B艮肌高度、眼肌面積和瘦肉率無顯著效應。表2StC3iU7基因/ftwl1—RFLP基因型與豬胴體性狀的統計分析表<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>(2)連鎖分析利用Crimap2.4軟件對該位點和7號染色體7個微衛星標記進行連鎖分析，該染色體的遺傳圖譜為Svw""—33.7—^/55—36.3—SW&5tf—13.4—5ZC3a47—26.1—ai^—12.9—5W52—33.1—5"w5W—26.7—SWW，采用QTLexpre幼軟件進行QTL定位分析，并進行顯著性檢驗，所采用模型為模型1:="+*'+力+敘+#covatoB十c加fl+c血rf+e咖模型2:="+J,+jf+glt+5Z,+/covvttB+c咖o+c血rf+e,加模型1和2主要區別是是否考慮SLC39A7基因作為固定效應，其中模型1不考慮SLC39A7基因作為6固定效應，模型2考慮了SLC39A7基因作為固定效應通過QTL連鎖分析表明在不考慮SLC39A7基因作為固定效應的前提下(模型l),在該染色體上存在顯著影響板油重、內脂率、肩部最厚處背膘厚、胸腰椎結合處背膘厚、醬部平均背膘厚以及平均背膘厚等脂肪沉積性狀的QTL,同時存在顯著影響眼肌面積和瘦肉率的QTL。當考慮SLC39A7基因作為固定效應的前提下(模型2),影響上述脂肪沉積性狀的QTL的顯著性水平(F值)顯著下降或為不顯著(表3),而對于眼肌面積、眼肌髙以及瘦肉率等肌肉相關性狀，F值變化不大(表3),說明該基因對肌肉相關性狀的影響不大加性效應為正值表明來源于梅山豬的等位基因具有降低背膘厚的效應QTL。表3背膘厚QTL定位結果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>以上兩種方法的應用均有力的支持了S丄C^U7基因作為豬7號染色體隱性有利背膘厚QTL候選基因的證據。序列表<110>華中農業大學<120>SLC39A7基因作為豬脂肪沉積性狀的遺傳標記及應用<130〉<141〉2007-06-12<160〉2<170〉Patentlnversion3,1<210〉1<211>402<212〉艦<213>豬(Susscrofa)<220〉<221〉genb<222〉(l)..(卿<223〉<220〉<221〉e咖<222〉(218).(271)<223〉<220〉<221>mutation<222〉(250),.(250)<223><咖>1atcctgctgagttttgcttcgggtgggctcttgggagatgccttcctgcacctcattcct60catgctctgggtaagtgacctcaaatcttagagtgttttattcttt卿tgagagggttc120tttcctctttgtgatccctgaccttctagtgtccccccaatacacaccttttgtgtggga180tattcccttatctaaccttttcccccacttcttccagaaccccattetcaccacc235AsnProlieLeuThrThr15etctggageageccagacacggacBttcccacagtggt卿gaagg281LeuTrpSerSerProAspThrAsplieProThrVal1015ggaggatggagataatggtttggggtgctagggaaggtctgtccctccctgttctcctct341acttggggaggaagagtctggaatctatatttctcttaatgtctcaatgtgtccatcccc401a402<210>2<211>402<212>DNA<213>豬(Susscrofa)<220〉<221〉gene<222〉(1)..(402)<223〉〈220〉<221>mutation〈222>(250)..(250)<223〉<220>〈221〉exoii<222>(218)..(271)<223><400〉2atcctgctgagttttgcttcgggtgggctcttgggagatgccttcctgcacctcattcct60catgctctgggtaagtgacctcaaatcttagagtgttttattctttgaatgagagggttc120tttcctctttgtgatccctgaccttctagtgtccccccaatacacaccttttgtgtggga180tattcccttatctaaccttttcccccacttcttccagaaccccattetcaccacc235AsnProlieLeuThrThr15etctgg8gcageccggacBeggac8ttcccacsgtggt肪ggBBBg281LeuTrpSerSerProAspThrAsplieProThrVal1015ggaggatggagataatggtttggggtgctagggaaggtctgtccctccctgttctcctct341acttggggaggaagagtctggaatctatatttctcttaatgtctcaatgtgtccatcccc401a40權利要求1、一種篩選的豬脂肪沉積性狀SLC39A7基因的遺傳標記，其具有如序列表SEQIDNO1和SEQIDNO2所示的核苷酸序列。2、根據權利要求1所述的遺傳標記，其特征在于，序列表SEQIDNO:l的第250bp處有一個A250—G250的錯義突變，導致其編碼的氨基酸由精氨酸(Arg)變成甘氨酸(Gly),并導致處all—RFLP多態性。3、根據權利要求1所述的遺傳標記，其中克隆虹C3A47基因第3外顯子的特異DNA片段所用引物的DNA序列如下所示正向引物F:ATCCTGCTGAGTTTTGCTTCG，反向引物R:TGGGGATGGACACATTGAGAC。4、一種篩選適用于豬脂肪沉積性狀的遺傳標記的方法，按照以下步驟從豬血液中提取基因組DNA，根據豬SLC39A7基因基因組序列設計引物，得到如權利要求3所示的引物，用權利要求3所示的弓l物在豬基因的基因組DNA中進行PCR擴增，PCR產物純化和克隆測序，獲得如序列表SEQIDNO:1和SEQIDN0:2所示的核苷酸序列。5、權利要求1所述的遺傳標記在豬脂肪沉積性狀輔助選擇中的應用。全文摘要本發明屬于豬遺傳育種及分子標記輔助選擇
技術領域：
，具體涉及一種篩選的豬脂肪沉積性狀SLC39A7基因的遺傳標記，該遺傳標記具有有如序列表SEQIDNO1和SEQIDNO2所示的核苷酸序列。在序列表SEQIDNO1的第250bp處有一個A250-G250的錯義突變，導致其編碼的氨基酸由精氨酸(Arg)變成甘氨酸(Gly)，并導致HpaII-RFLP多態性。利用本發明的遺傳標記對來自國外血緣豬和中國地方血緣豬品種進行了脂肪沉積相關性狀的關聯分析。本發明還公開了豬SLC39A7基因第3外顯子的SNP分型的檢測方法，為豬的分子標記輔助選擇提供了新的遺傳標記和檢測方法。文檔編號C12N15/11GK101113470SQ20071005245公開日2008年1月30日申請日期2007年6月13日優先權日2007年6月13日發明者波左,熊遠著,陳朝國,馬志雄申請人:華中農業大學