石質文物表面防護用微生物材料的制備方法

專利名稱：：石質文物表面防護用微生物材料的制備方法
技術領域：
：本發明涉及石材及石質文物的防護方法，特別涉及利用一株具有碳酸鹽礦化特性的土壤細菌，利用其生命過程中的酶化作用在石質材料表面礦化沉積出連續致密的碳酸鈣層，對石材及石質文物進行防護的方法。
背景技術：
：暴露于自然界中的各種石質文物古跡，長期以來由于受到物理、化學和生物等因素的影響，其基體的性能逐漸遭到破壞。對于建筑和藝術雕刻中常用的碳酸鹽類石材，這種現象尤其普遍，常常會出現表面疏松，微裂縫等現象，導致其內部孔隙率增加，力學性能不斷下降。而且，隨著現代工業的飛速發展，由環境污染造成的對石質材料的侵蝕更加嚴重，因此，對石質材料進行防護和修復顯得迫在眉睫。石材的修復和防護研究己經有很悠久的歷史。早在公元前一世紀就開始用固體石蠟修復建筑物被風化石材，但它吸附灰塵、易泛黃，難以滲入石材內部形成耐久性保護；十九世紀前無機石材和修復材料曾廣泛使用，如石灰水、鋅和鋁的硬脂酸鹽等，然而許多應用實例表明，由于其所含鹽份形成的結晶膨脹，無機防護劑的使用反而加劇了石材的風化腐蝕；現在，利用有機聚合物，如環氧樹脂、丙烯酸樹脂，尤其是有機硅或有機氟類聚合物防護修復石質文物發展很快，取得了很好的效果，但也存在致命的缺陷，有機高分子的長期耐候性，與基材相容性較差等都是不容忽視的問題。生物礦化作用是自然界廣泛發生的一種作用，它是生物形成礦物的作用，是在生物的特定部位，在一定物理化學條件下，在生物有機物質的控制或影響下，將溶液中的離子轉變為固相礦物的作用。幾乎每一種生物都能合成礦物，許多類型的有機體在其細胞和組織位置形成沉積礦物，并且此過程在細胞的生命活動中不斷得以精確重復，這些細胞包括了細菌、海藻、原生物、乃至骨的成骨細胞。至今人類已在生物中發現了30多種不同的生物礦物，而這其中近三分之二是鈣礦，四分之一是膠體材料，碳酸鹽和磷酸鹽更是幾乎遍及了整個生物世界。生物礦化往往能形成有序排列的、結構非常優異的天然有機——無機復合材料。
發明內容技術問題本發明的目的就是提供一種石質文物表面防護用微生物材料的制備方法，利用自然界中某些微生物在其生命活動過程中不斷產生的酶化作用礦化生成生物碳酸鈣，利用此生物碳酸鈣對石質材料的表面進行防護和加固。技術方案本發明的石質文物表面防護用微生物材料的制備方法在于，將巴氏芽胞桿菌Bacilluspasteurii接種至新鮮培養基中，在恒溫培養箱中振蕩培養，當菌株生長至穩定期，獲得穩定期的細菌液后，在菌液中加入Ca(N03)2和尿素，并將石質試樣浸泡于此混合溶液中，液面高出試件上表面510cm，室溫下靜置，7天后試樣表面生成連續致密堅硬的碳酸鈣保護層，且與基材表面結合緊密。或獲得穩定期的細菌液后，將菌液離心(500(T8000rpm，5~8min)，將所得的高濃縮菌液涂抹于試樣表面，待表面風干之后，輕輕涂抹一層海藻酸鈉溶液，并向海藻酸鈉表面滴加以新鮮培養基為溶劑，尿素和硝酸鈣為溶質配制而成的混合液，混合液中尿素和硝酸鈣濃度分別為廣4mol/L和0.52mol/L，多次重復滴加混合液，7d后試樣表面生成連續致密堅硬的碳酸鈣保護層，且與基材表面結合緊密。所述的新鮮培養基是經過高溫蒸汽滅菌后的牛肉膏蛋白胨培養基，培養基中牛肉膏的含量為36g/L，蛋白胨的含量為5~10g/L。振蕩培養的條件是3CTC，170r/min。所述的菌株生長至穩定期是指對照所測菌株生長的標準曲線，用分光光度計測定菌液混濁度OD值(混濁度與菌液濃度成正比)，當其OD值在曲線上的穩定期范圍內時，認為此時的菌株處于穩定生長期。所用的Ca(N03)2和尿素混合溶液中，Ca(亂)2濃度是0.5mol/L，尿素的濃度是2mol/L。有益效果與現有技術相比，本發明具有如下優點1)耐候性好由本發明生成的保護層主要由方解石型生物碳酸f5組成，是非常穩定的無機材料，不存在有機防護劑的老化問題；2)相容性好許多石材本身由碳酸鹽組成，因此利用碳酸鈣作為防護層很好的相容性，即使防護層失效后，對基材造成的影響很小；3)利用自然界中微生物資源，環境友好，成本低廉，工藝非常簡單。圖l為微生物浸泡覆膜工藝示意圖。圖2為菌液浸泡后石材表面沉積物的XRD圖譜(C:方解石)。圖3為菌液浸泡后石材表面微生物沉積出的碳酸鈣的形貌。圖3a為300倍的顯微圖，圖3b為1000倍的顯微圖。圖4為海藻酸鈉固載菌株覆膜工藝示意圖。圖5為海藻酸鈉固載菌株法所得碳酸鈣的形貌。圖5a為300倍的顯微圖，圖5b為IOOO倍的顯微圖。圖6為菌液浸泡法所得碳酸鈣層的厚度。具體實施例方式為達到上述目的本發明采用如下兩種技術措施一是將菌株巴氏芽胞桿菌Bacilluspasteurii接種至經高溫蒸汽滅菌后的牛肉膏蛋白胨培養基中，在恒溫培養箱中振蕩培養，待菌株生長至穩定期時，取出菌液，在菌液中加入Ca(N03)2和尿素，并將試件浸泡于其中，室溫下靜置。二是將如措施一中所述方法得到的穩定期的細菌液離心，得到的高濃縮菌體涂抹于試樣的表面，再輕輕涂抹一層海藻酸鈉溶液，30min后，在海藻酸鈉表面滴加混合液(新鮮培養基，尿素和硝酸鈣組成)，前12h每隔3h滴加一次，后12h每隔6h滴加一次，其后三天每隔12h滴加一次。受自然界中生物礦化現象和微生物成巖的啟示，利用微生物礦化沉積出的碳酸鈣對石質文物進行防護。本發明的關鍵是在石材表面生成一層連續致密且與基材結合緊密的碳酸鈣防護層。其中涉及到的主要的生物化學過程如式(1)式(3)所示。(NH2)2C0+2H20=C032—+2NH4+(1)Cell+Ca2+=Cell-Ca2+(2)Cell-Ca2++CO/—=Cell-CaC03(3)菌株生長繁殖達到一定階段(如穩定期)后，加入底物尿素和Ca2+，在底物尿素的誘導下，細菌產生脲酶(脲酶是一種誘導酶)，繼而發生酶化反應分解尿素逐漸生成C0/—和肌+，CO/—與溶液中的Ca2+碰撞，在細菌分泌的有機質的調控下，緩慢礦化生成碳酸鈣顆粒。生成的碳酸鈣逐漸沉積附著于石材的表面，并且由于有機質膠粘作用使碳酸鈣與基材表面粘結更緊密。結合實施例對本發明詳細說明如下實施例1——菌液浸泡法將菌株巴氏芽胞桿菌Bacilluspasteurii接種至經高溫蒸汽滅菌后的牛肉膏蛋白胨培養基中(菌種液與培養基的體積比是l:50,培養基成分見表1)，在恒溫培養箱中振蕩培養(3(TC，170r/min)，待菌株生長至穩定期時(約1624小時后，用分光光度計測菌液的吸光度OD值在1.21.5左右)，取出菌液，在菌液中加入Ca(N03)2和尿素，最終混合溶液中Ca(N0》2和尿素的濃度均為0.5mol/L，并將試件(3cmX3cmX3cm)浸泡于其中，液面高出試件上表面5~10cm左右，室溫下靜置。7d后試樣表面生成一層連續致密堅硬的物質，且與基材表面結合緊密。取樣經XRD分析可得，這層物質主要由方解石型碳酸鈣組成(如圖2所示)。在金相顯微鏡下觀察，并利用Photoshop和ImagePrcDplus軟件可以測得膜層的平均厚度為184.13um(圖7)。在電子掃描顯微鏡下觀察發現，生成的碳酸鈣顆粒呈球形，直徑約30um，顆粒尺寸分布較均勻(如圖3所示)。表1培養基成分<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>實施例2——海藻酸鈉固載菌株法菌株培養至穩定期后，50008000rpm離心58min，將菌液濃度濃縮為1(Tcell/mL左右，涂刷于試件表面。待試件表面風干后，將2%的海藻酸鈉溶液輕輕涂抹于其表面固載菌株。30min后，在海藻酸鈉表面滴加混合液(由新鮮培養基，尿素和硝酸鈣組成)，尿素和硝酸鈣濃度分別為2mol/L和0.5mol/L。前12h每隔3h滴加一次，后12h每隔6h滴加一次，其后三天每隔12h滴加一次，7d后試樣表面生成連續致密堅硬的碳酸鈣保護層，且與基材表面結合緊密。工藝操作如圖4所示。7d后試件表面生成一層連續堅硬的白色物質，經XRD測試得出這層物質仍主要由方解石型碳酸鈣組成，但是還含有少量球霰石型碳酸鈣。膜層平均厚度約為144.09um。電子掃描電鏡下觀測所形成的碳酸鈣顆粒呈兩種形態:一是橢球形，粒徑為612um;其它的碳酸鈣顆粒以一種無定形聚集在一起，如圖6所示。從圖6(b)還可明顯看到多孔網絡狀物質，此為海藻酸鈣。海藻酸是天然有機高分子電介質，其一價鹽(Na+、K+、NH4+)為水溶性鹽，而二價以上的鹽(Ca"、Al3+)為水不溶性鹽，因此可形成耐熱的凝膠或被膜，這是海藻酸鈉經Ca2+溶液鈣化后形成固定化凝膠的內在機理。海藻酸鈉溶液具有良好的生物相容性和傳質性，常常被用作微生物和酶的載體。本發明利用海藻酸鈉固定菌株于材料表面，可以防止菌體的流失，而且海藻酸鈉可以與反應混合液中的(^2+生成海藻酸鈣凝膠，凝膠內部多孔網絡結構有利于后續礦化反應物和營養物質的傳輸，因此可以為菌株后續酶解礦化沉積碳酸鈣提供良好的微環境，在較長時間內保證菌株胞內酶的活性，使其在材料表面持續礦化沉積出碳酸鈣，有效地起到防護作用。此項技術可應用于文物建筑的原位修復與防護。權利要求1.一種石質文物表面防護用微生物材料的制備方法，其特征在于將巴氏芽胞桿菌Bacilluspasteurii接種至新鮮培養基中，在恒溫培養箱中振蕩培養，當菌株生長至穩定期，獲得穩定期的細菌液后，在菌液中加入Ca(NO3)2和尿素，并將石質試樣浸泡于此混合溶液中，液面高出試件上表面5～10cm，室溫下靜置，7天后試樣表面生成連續致密堅硬的碳酸鈣保護層，且與基材表面結合緊密。2.根據權利要求1中所述的石質文物表面防護用微生物材料的制備方法，其特征在于獲得穩定期的細菌液后，將菌液離心，將所得的高濃縮菌液涂抹于試樣表面，待表面風干之后，輕輕涂抹一層海藻酸鈉溶液，并向海藻酸鈉表面滴加以新鮮培養基為溶劑，尿素和硝酸鈣為溶質配制而成的混合液，混合液中尿素和硝酸鈣濃度分別為14mol/L和0.52mol/L，多次重復滴加混合液，7d后試樣表面生成連續致密堅硬的碳酸鈣保護層，且與基材表面結合緊密。3.根據權利要求1所述的石質文物表面防護用微生物材料的制備方法，其特征在于所述的新鮮培養基是經過高溫蒸汽滅菌后的牛肉膏蛋白胨培養基，培養基中牛肉膏的含量為36g/L，蛋白胨的含量為510g/L;振蕩培養的條件是30°C，170r/min。4.根據權利要求1所述的石質文物表面防護用微生物材料的制備方法，其特征在于所述的菌株生長至穩定期是指對照所測菌株生長的標準曲線，用分光光度計測定菌液混濁度OD值，當其OD值在曲線上的穩定期范圍內時，認為此時的菌株處于穩定生長期。5.根據權利要求1所述的石質文物表面防護用微生物材料的制備方法，其特征在于所用的Ca(N03)2和尿素混合溶液中，Ca(N0》2濃度是0.5mol/L，尿素的濃度是2mol/L。全文摘要石質文物表面防護用微生物材料的制備方法涉及石材及石質文物的防護方法，特別涉及利用一株具有碳酸鹽礦化特性的土壤細菌，利用其生命過程中的酶化作用在石質材料表面礦化沉積出連續致密的碳酸鈣層，對石材及石質文物進行防護的方法，該方法將巴氏芽胞桿菌Bacilluspasteurii接種至新鮮培養基中，在恒溫培養箱中振蕩培養，當菌株生長至穩定期，獲得穩定期的細菌液后，在菌液中加入Ca(NO₃)₂和尿素，并將石質試樣浸泡于此混合溶液中，液面高出試件上表面5～10cm，室溫下靜置，7天后試樣表面生成連續致密堅硬的碳酸鈣保護層，且與基材表面結合緊密。文檔編號C04B41/45GK101475401SQ20091002801公開日2009年7月8日申請日期2009年1月5日優先權日2009年1月5日發明者亮成,王劍云,王瑞興,錢春香申請人:東南大學