Bc@金屬氧化物復合納米纖維的制備方法
【專利摘要】本發明提供了一種BC@金屬氧化物復合納米纖維的制備方法，包括以下步驟：(a)制備BC納米纖維；(b)在BC納米纖維的表面包覆金屬氧化物顆粒層，并自然堆積形成介孔結構，得到包覆有金屬氧化物顆粒的BC@金屬氧化物復合納米纖維；(c)用堿催化步驟(b)中得到的BC@金屬氧化物復合納米纖維，得到可用于富集磷酸化蛋白或多肽的BC@金屬氧化物復合納米纖維。本發明還提供了BC@金屬氧化物復合納米纖維富集磷酸化蛋白或多肽的方法。本發明制備的復合納米纖維能夠靈敏、快速地富集磷酸化蛋白或多肽，實用性強，分離效果好，環境友好，具有良好的應用前景。
【專利說明】
80@金屬氧化物復合納米纖維的制備方法
技術領域
[0001]本發明涉及磷酸化蛋白及多肽的特異性富集技術領域，特別涉及一種以細菌纖維素(Bacterial Cellulose，BC)為基底的BCO金屬氧化物復合納米纖維的制備方法。
【背景技術】
[0002]蛋白質磷酸化作為一種重要的蛋白質翻譯后修飾，在調節細胞活動中扮演著不可取代的角色，比如:信號傳導、細胞骨架調節、基因表達、細胞周期、細胞凋亡等。蛋白質磷酸化的不平衡引起的細胞過程的失調是眾多疾病的根源所在。因此，為了達到早期診斷疾病的目的，很多研究者把焦點放在了研究細胞內磷酸化蛋白含量的變化。然而，磷酸化蛋白在細胞內的存在形式是動態變化的，而且含量極低，加之大量的非磷酸化蛋白的影響，使直接研究分析磷酸化蛋白的任務極其艱巨。因此，檢測分析前磷酸化蛋白的富集變得尤為重要和迫切。最近，有很多相關文獻報道了各種各樣的富集材料和相應的富集效果。其中，很多都是金屬氧化物，例如，T12，ZrO2，Fe2O3和Al2O3，其中，四族元素的金屬氧化物T12，ZrO2最常用而且效果最佳。同時，還有很多方法可用來提高材料的靈敏性，通過制成介孔結構來增加比表面積從而提高靈敏性是其中之一。大的比表面積和適當的孔徑可以為蛋白質和多肽在富集過程中提供充分的活性位點和進出空間。
[0003]另外，包括基質輔助激光解析串聯飛行時間質譜(MALD1-T0F-MS)和納升液相色譜電離串聯質譜(Nan0-LC-ES1-MS)在內的質譜技術已成為分析磷酸化蛋白與多肽的不可或缺的工具。
[0004]現如今，由醋酸菌，如:木醋桿菌，生物合成的細菌纖維素(BC)引起了研究者的極大興趣。不僅僅因為這種細菌纖維是環境友好型材料，具有可降解性能，還因為其具有前途廣闊的屬性，包括:良好的生物相容性，較高的機械和化學穩定性，良好的持水性和親水性，大的表面積和多孔性，合成過程可控等特性，這使得細菌纖維素或其改性后的纖維素形成的纖維擁有多種用途。BC纖維通常被用于生物醫藥，食品及先進的聲膜片等，而對于改性的BC纖維，BC纖維經常作為極好的基底來負載有特性的部分，從而拓展BC纖維的性能，最好的例子就是擁有很高的光催化能力的BCOT12。
[0005]最近，不同結構的T12復合材料被廣泛的用于磷酸化蛋白或磷酸化多肽的富集過程中。而且，很多研究者盡其所能去增加材料的比表面積來提升材料的富集能力和靈敏度，并且還收獲了一定的成效。另外，納米級的T12顆粒擁有比微米級甚至更大的顆粒更大的比表面積，這一特點很吸引人，但是過于細小的粒徑讓他們的分離成為問題，因此，只有固定或包裹在其他成分外形成殼層，這樣才可以使其大的比表面積在生物分離中擁有意義。
【發明內容】
[0006]為解決上述技術問題，本發明的目的是提供一種BCO金屬氧化物復合納米纖維的制備方法，該方法能夠制備出重復性較好，均一穩定性較高和生物相容性較好的復合納米纖維。該方法所制備的復合納米纖維檢測磷酸化蛋白或多肽的靈敏度高，選擇富集性和重復性均較好。
[0007]本發明采用了以下技術方案:
[0008]在一方面，本發明提供了一種BCO金屬氧化物復合納米纖維的制備方法，包括以下步驟:
[0009](a)制備BC納米纖維，該BC納米纖維具有穩定的化學機械性能；
[0010](b)在BC納米纖維的表面包覆金屬氧化物顆粒層，并自然堆積形成介孔結構，得到包覆有金屬氧化物顆粒的BCO金屬氧化物復合納米纖維；
[0011](C)用堿催化步驟(b)中得到的BCO金屬氧化物復合納米纖維，得到可用于富集磷酸化蛋白或磷酸化多肽的BCO金屬氧化物復合納米纖維，該復合納米纖維具有有序的介孔結構。用堿催化可改進復合納米纖維的介孔結構，進而形成對磷酸化蛋白或多肽富集有用的改良型BCO金屬氧化物復合納米纖維。
[0012]進一步地，在步驟(C)之后還包括步驟(d):
[0013]將BCO金屬氧化物復合納米纖維填充于移液槍槍頭中，形成呈移液槍槍頭形狀的BCO金屬氧化物復合納米纖維。即，將改良后的復合納米纖維制成Tip。
[0014]優選地，將改良后的復合納米纖維填充于200yL的移液槍槍頭中，形成特異性富集用Tip。
[0015]優選地，金屬氧化物選自二氧化鈦、二氧化錯、三氧化二鋁、三氧化二鐵、二氧化錫中的一種或幾種。
[0016]優選地，在步驟(a)中，采用細菌纖維素產生菌經生物合成法制備BC納米纖維。
[0017]具體地，木醋桿菌在發酵條件下制備BC納米纖維。
[0018]在一具體實施例中，更優選地，在步驟(a)中，BC納米纖維為由細菌纖維素產生菌木醋桿菌(Acetobacter xylinum)NUST5.2在發酵條件下生物合成的細菌納米纖維。細菌纖維素具有生物相容性好、物理化學性質穩定、比表面積大、機械強度好及有利于操作等優點。另外，細菌纖維素表面富含羥基，這為表面溶膠-凝膠過程提供了合適的目標基團。
[0019]優選地，在步驟(a)中，BC納米纖維的直徑為15_80nm。
[0020]優選地，在步驟(b)中，通過原位生長法在BC納米纖維表面包覆金屬氧化物顆粒層。
[0021]更優選地，在步驟(b)中，金屬氧化物顆粒的粒徑為5_15nm。
[0022]進一步地，在步驟(b)中，介孔結構的介孔孔徑為6-10nm。
[0023]優選地，在步驟(c)中，堿選自氨水、N，N_二甲基甲酰胺和四甲基氫氧化銨中的一種或幾種。
[0024]在另一方面，本發明還提供了一種BCO金屬氧化物復合納米纖維富集磷酸化蛋白或磷酸化多肽的方法，包括以下步驟:
[0025](e)用不同pH值的緩沖液洗滌BCO金屬氧化物復合納米纖維，使其處于富集最佳狀態；
[0026](f)將磷酸化蛋白或磷酸化多肽加入BCO金屬氧化物復合納米纖維中進行富集；
[0027](g)用不同pH值的緩沖液洗滌步驟(f)中得到的富集有磷酸化蛋白或磷酸化多肽的BCO金屬氧化物復合納米纖維，以除去非特異性吸附的蛋白或多肽;及
[0028](h)用堿洗脫富集在BCO金屬氧化物復合納米纖維上的特異性磷酸化蛋白或多肽。
[0029]進一步的，在步驟(e)中，緩沖液包括緩沖液A和緩沖液B，其中緩沖液A為體積分數計含有0.4 %三氟乙酸(TFA)和80 %乙腈(ACN)的水溶液，緩沖液B為以體積分數計，25 %的乳酸和75 %的緩沖液A的混合液。
[0030]優選地，在步驟(e)中，緩沖液A洗滌兩次后，緩沖液B再洗滌兩次。
[0031]進一步地，在步驟(f)中，磷酸化蛋白或多肽與緩沖液B以1:2的體積比混合得到混合液，將該混合液加入移液槍槍頭(Tip)中進行富集。
[0032]優選地，在步驟(f)中，借助于離心機使得混合液在復合納米纖維材料中進行富集。
[0033]進一步地，在步驟(g)中，分別用緩沖液B和緩沖液A依次洗滌富集有磷酸化蛋白或多肽的BCO金屬氧化物復合納米纖維。
[0034]優選地，在步驟(g)中，緩沖液B洗滌兩次后，緩沖液A洗滌兩次。
[0035]本發明的BCO金屬氧化物復合納米纖維所富集的磷酸化蛋白或多肽可用堿洗脫下來，并進行基質輔助激光解析串聯飛行時間質譜(MALD1-T0F-MS)檢測。
[0036]本發明的質譜輔助型BCO金屬氧化物復合納米纖維包括細菌纖維(BC)和金屬氧化物(二氧化鈦、二氧化鋯等)納米顆粒層，并在此基礎上改進復合納米纖維比表面積及介孔孔徑。細菌纖維表面富含羥基，金屬氧化物納米顆粒經水熱法原位生長于細菌纖維(BC)表面。在本發明中，利用堿催化改性表面金屬氧化物晶體性質，特異性富集磷酸化蛋白及多肽，本發明基于金屬氧化物(二氧化鈦)可與磷酸化蛋白或磷酸化多肽的磷酸根形成雙配位鍵的原理。
[0037]借由上述方案，與現有技術相比，本發明至少具有以下優點:
[0038]本發明通過生物合成方法制備出細菌纖維素，隨后通過原位生長法制備出規整的、具有粒徑均勻的金屬氧化物(二氧化鈦等)納米顆粒，并通過適量堿(氨水等)催化，促進生長的金屬氧化物(二氧化鈦)等納米顆粒重新組裝和晶體進一步生長、晶化，從而結晶度增強，從而使無規則的二氧化鈦顆粒減少，使復合納米纖維表面介孔結構優化至富集磷酸化蛋白及多肽的最優孔徑，從而提高富集的靈敏性及縮短富集過程的時間。本發明提供的質譜輔助型BCO金屬氧化物復合納米纖維具有實用性強、利于分離、比表面積和孔徑較好的特點，從而提供了一種新型靈敏的輔助質譜分析的材料。
[0039]上述說明僅是本發明技術方案的概述，為了能夠更清楚了解本發明的技術手段，并可依照說明書的內容予以實施，以下以本發明的較佳實施例并配合附圖詳細說明如后。
【附圖說明】
[°04°]圖1為本發明實施例1的BC@mTi02復合納米纖維的制備及其富集磷酸化蛋白的示意圖；
[0041]圖2為本發明實施例1的細菌纖維素(BC)的透射電子顯微鏡形貌圖；
[0042]圖3為本發明實施例1的包覆有二氧化鈦納米顆粒的BCOmT12復合納米纖維的透射電子顯微鏡形貌圖；
[0043]圖4為本發明實施例1的細菌纖維素(BC)的掃描電子顯微鏡形貌圖；
[0044]圖5為本發明實施例1的包覆有二氧化鈦納米顆粒的BCOmT12復合納米纖維的掃描電子顯微鏡形貌圖；
[0045]圖6為本發明實施例1中β-酪蛋白酶解液與BSA酶解液的混合溶液(摩爾比1:10)經BCOmT12復合納米纖維富集前的質譜圖；
[0046]圖7為本發明實施例1中β-酪蛋白酶解液與BSA酶解液的混合溶液(摩爾比1:10)經BCOmT12復合納米纖維富集后的質譜圖；
[0047]圖8為本發明實施例2中β-酪蛋白酶解液與磷酸化多肽樣品的混合溶液(摩爾比1:10)經BCOmZrO2富集前的質譜圖。
[0048]圖9為本發明實施例2中β-酪蛋白酶解液與磷酸化多肽樣品的混合溶液(摩爾比1:10)經BCOmZrO2富集后的質譜圖。
【具體實施方式】
[0049]下面結合附圖和實施例，對本發明的【具體實施方式】作進一步詳細描述。應理解的是，以下實施例僅用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。
[0050]實施例1
[0051 ] BC@mTi02(介孔二氧化鈦包裹的細菌纖維素)復合納米纖維的制備及其在生物質譜中的應用。
[0052]實施例1提供一種BCO金屬氧化物復合納米纖維的制備方法，其中金屬氧化物為二氧化鈦，如圖1所示，該方法依次包括以下步驟:
[0053](a)通過細菌纖維素產生菌的生物合成法制備BC納米纖維
[0054]BC納米纖維由細菌纖維素產生菌木醋桿菌(Acetobacter xylinum)NUST5.2在29°C的條件下培養發酵7天產生。整個培養過程用的是動態培養方法，這種方法可以有效地提高生產率。其間，21g蔗糖，1g酵母提取物，20g D-葡萄糖，4g硫酸銨(NH4)2S04，2g磷酸二氫鉀(KH2PO4)和0.4g硫酸鎂(MgSO4)溶于I升的水中，用2.5M氫氧化鈉(NaOH)調PH至6.1左右配制成培養基，提供細菌生長所需營養。獲得的BC納米纖維浸入去離子水中洗滌凈化，然后用千分之三的氫氧化鈉(NaOH)和千分之三的過氧化氫(H2O2)水浴加熱6小時，除去細菌殘余。最后用去離子水漂洗幾次，除去纖維上的堿試劑，使其接近中性，并于4°C冰箱保存。用之前使用凍干機將纖維凍干使用，所制備的纖維的直徑約為15_40nm。
[0055](b)通過水熱法形成均勻的T12層。
[0056]水熱法是指在密封的壓力容器中，水為溶劑，在高溫高壓的條件下進行的化學反應。水熱法是利用高溫高壓的水溶液使那些在大氣條件下不溶或難溶的物質溶解，或反應生成該物質的溶解產物，通過控制高壓釜內溶液的溫差使產生對流，以形成過飽和狀態而析出生長晶體的方法。
[0057]具體制備方法為:將干燥的BC納米纖維分散于乙醇和水(1:1，v:V)的混合溶液中，接著，用不同濃度的乙醇對其進行梯度脫水，直至濃度達到99%。然后，離心去除上清溶劑，并加入200毫升Ti(OBu)4的乙醇溶液，作為鈦源。同時，加入2毫升乙酰丙酮防止水解。3小時機械攪拌后，將反應液轉入聚四氟乙烯不銹鋼高溫反應釜中(最大體積為200毫升)，加熱至180°C，在密閉條件下保溫8小時。待反應完畢，溫度降至室溫后，用去離子水和乙醇分別洗滌3次。最后，在真空干燥箱中，60°C干燥過夜。其中，所得到的BCO金屬氧化物復合納米纖維表面的T12的粒徑為5nm。
[0058](C)BCOmT12復合納米纖維的改性。
[0059]將50mg上述獲得的納米纖維再次分散于60mL乙醇和水的混合溶液中(乙醇:水，2:1，v: V)，并加入適量氨水(3mL)，混勻后轉入聚四氟乙烯不銹鋼高溫反應釜中(容量為10mL)，加熱至160°C，保溫20小時。反應完畢后，待溫度至室溫，所得的納米纖維用水和乙醇分別洗滌幾次，離心收集纖維，利用凍干機干燥備用。所得到的BCO金屬氧化物復合納米纖維的介孔結構的孔徑為6nm。
[0060](d)BC@mTi02復合納米纖維Tip(移液槍槍頭形狀)的制備。
[0061 ] 200yL移液槍槍頭選作容器來支撐BCOmT12復合納米纖維，形成移液槍槍頭形狀的BC@mTi02復合納米纖維Tip。
[0062]具體步驟如下:首先，將適量脫脂棉放于Tip底端來延長液體通過時間，從而使樣品與BCOmT i02復合納米纖維充分接觸。接著，將Img的BCOmT i02復合納米纖維填充在脫脂棉上形成完整的BCOmT12復合納米纖維Tip。放置于室溫待后續富集使用。為了方便離心，用微量離心管制成適配器輔助離心(參考圖1)。
[0063]BCimT i02復合納米纖維對磷酸化蛋白的富集。
[0064]標準蛋白溶液的制備
[0065]β-酪蛋白和牛血清蛋白分別溶于25mM碳酸氫銨水溶液中，形成終濃度為2mg/mL的蛋白標準液，并用IM Tris溶液調pH至8.0。然后100°C變性10分鐘。待溫度降至室溫后，加入胰蛋白酶以1:2.5(酶:底物)的比例進行酶解，37°C過夜，同時加入5%的乙腈提高胰蛋白酶的活性。酶解后的標準蛋白溶液儲存于-20 V冰箱中，備用。
[0066]BQgmT12富集磷酸化蛋白具體包括以下步驟:
[0067](e)上樣
[0068]在富集前，上述制成的復合納米纖維Tip用兩種不同pH的緩沖液處理達到最優富集狀態，這兩種緩沖液分別是:緩沖液A為以體積分數計含有0.4%三氟乙酸(TFA)和80%乙腈(ACN)的水溶液，緩沖液B為以體積分數計，25%的乳酸和75%的緩沖液A的混合液。其中，緩沖液B也作為接下來的上樣緩沖液。前處理過程及接下來洗滌過程均借助離心機在5000rpm轉速下離心2分鐘，其中每種緩沖液洗滌2次。
[0069](f)前處理完畢后，將緩沖液B與蛋白溶液以2:1的體積比混勻，加入移液槍槍頭(T i P)中進行富集。該過程借助離心機使混合液經過富集材料，并以3 500rpm的轉速離心8分鐘，將離心得到的樣品重新移到Tip中，重復3次。
[0070](g)接著，分別用緩沖液B和緩沖液A先后洗滌復合納米纖維Tip，目的是除去粘在纖維表面的非磷酸化多肽及試劑，每種緩沖液洗滌2次。
[0071](h)洗滌完畢后，用50yL 5%的氨水洗脫特異性吸附的磷酸化蛋白，離心速度、時間及次數與富集過程一致。最后將洗脫液凍干，并放于-20°C保存備用。
[0072]基質輔助激光解析串聯飛行時間質譜分析(MALD1-T0F-MS)
[0073]MALDI的原理是用激光照射樣品與基質形成的共結晶薄膜，激光照射時基質從激光中吸收能量，傳遞給樣品分子使其瞬間汽化，并將質子轉移到樣品分子使其離子化，然后進入飛行時間質量分析器，再根據它們各自的質荷比(m/z)進行檢測。
[0074]具體過程為:將凍干的樣品用3yL緩沖液C(乙腈/三氟乙酸/水，50%/0.1%/49.9%, v/v/v)復溶，然后與等體積的飽和CHCA基質混勻。CHCA基質是由α-氰基-4-羥基肉桂酸溶于ΤΑ30溶液中形成的飽和溶液，其中，ΤΑ30是含有體積分數為30 %乙腈和0.1 %三氟乙酸的水溶液。然后，用微量移液槍將混合液體滴于靶板上，待自然風干后再滴一層CHCA基質，干燥并結晶后進行MALD1-TOF質譜分析。
[0075]其中，本實施例1的輔助質譜型BCOmT12復合納米纖維，包括細菌纖維(BC)和包覆在其表層的二氧化鈦納米顆粒，該復合納纖維由移液槍槍頭支撐，輔助質譜型BCOmT12復合納米纖維Tip由上述步驟a-d制成。輔助質譜特異性富集磷酸化蛋白或多肽的過程包括前處理、上樣富集及洗脫分析過程，輔助質譜特異性富集磷酸化蛋白或多肽過程由上述步驟e-h完成。
[0076]本發明實施例1中的BCOmT12復合納米纖維，對不同濃度的β_酪蛋白酶解液(10—5Μ、10—6Μ、10—7M)做質譜檢測結果，靈敏度達到1.7pmol。
[0077]圖1展示了實施例1的BCOmT12復合納米纖維的制備及富集磷酸化蛋白的示意圖。圖2、圖3分別為實施例1中細菌纖維素(BC)和BCOmT12復合納米纖維的透射電子顯微鏡的形貌圖。圖4、圖5分別為實施例1中細菌纖維素(BC)和BCOmT12復合納米纖維的掃描電子顯微鏡的形貌圖。圖6、圖7分別為β-酪蛋白酶解液與BSA酶解液的摩爾比為1:1O的混合溶液經BCOmT12復合納米纖維富集前、富集后的質譜圖。
[0078]實施例2
[0079]BCOZrO2復合納米纖維的制備及其生物質譜中的應用。
[0080]實施例2提供一種BCO金屬氧化物復合納米纖維的制備方法，其中金屬氧化物為二氧化鋯，該方法依次包括以下步驟:
[0081 ] (a)實施例2中BC納米纖維的制備方法與實施例1相同，參照實施例1制備的BC纖維的直徑為50-80nmo
[0082](b)通過水熱法形成均勻的ZrO2層，其中用正丁醇鋯做為鋯源。
[0083]具體制備方法為:將干燥的BC納米纖維分散于乙醇和水(1:1，v:V)的混合溶液中，接著，用不同濃度的乙醇對其進行梯度脫水，直至濃度達到99%。然后，離心去除上清溶劑，并加入250毫升正丁醇鋯的乙醇溶液，作為鋯源。同時，加入2.5毫升乙酰丙酮防止水解。3小時機械攪拌后，將反應液轉入聚四氟乙烯不銹鋼高溫反應釜中(最大體積為200毫升)，加熱至180°C，在密閉條件下保溫8小時。待反應完畢，溫度降至室溫后，用去離子水和乙醇分別洗滌3次。最后，在真空干燥箱中，60°C干燥過夜。其中，所得到的BCO金屬氧化物復合納米纖維表面Zr02的粒徑為15nm。
[0084](C)BCOmZrO2復合納米纖維的改性。
[0085]將50mg上述獲得的納米纖維再次分散于60mL乙醇和水的混合溶液中(乙醇:水，2:1，v: V)，并加入適量四甲基氫氧化銨(3.5mL)，混勻后轉入聚四氟乙烯不銹鋼高溫反應釜中(容量為10mL)，加熱至160°C，保溫20小時。反應完畢后，待溫度至室溫，所得的納米纖維用水和乙醇分別洗滌幾次，離心收集纖維，利用凍干機干燥備用。改性后所得BCOmZrO2復合納米纖維的介孔結構孔徑為I Onm。
[0086](d) BCOmZrO2復合納米纖維Tip (移液槍槍頭形狀)的制備。
[0087]200yL移液槍槍頭選作容器來支撐BCOmZrO2復合納米纖維，形成移液槍槍頭形狀的BC@mZr02復合納米纖維Tip。
[0088]具體步驟如下:首先，將適量脫脂棉放于Tip底端來延長液體通過時間，從而使樣品與BC@mZr02復合納米纖維充分接觸。接著，將Img的BC@mZr02復合納米纖維填充在脫脂棉上形成完整的BCOmZrO2復合納米纖維Tip。放置于室溫待后續富集使用。為了方便離心，用微量離心管制成適配器輔助離心。
[0089]BC@mZr02復合納米纖維對磷酸化蛋白的富集。
[0090]磷酸化多肽樣品的制備
[0091 ]從A549細胞提取磷酸化多肽樣品，提取步驟包括:
[0092 ] (I)利用胰蛋白酶將細胞處理后，用4 °C的PBS洗滌3次。
[0093](2)將細胞分散于提前配制好的裂解液(參照商品說明書配制)中，冰浴20min。
[0094](3)利用細胞破碎儀徹底破碎細胞，冰浴下進行。
[0095](4)在4°C14800rmp離心 lOmin，取上清。
[0096](5)將上清用50mM碳酸氫銨溶液稀釋，與胰酶孵育37 °C 12h。
[0097 ] BC@mZr02富集磷酸化蛋白具體包括以下步驟:
[0098](e)上樣
[0099]在富集前，上述制成的復合納米纖維Tip用兩種不同pH的緩沖液處理達到最優富集狀態，這兩種緩沖液分別是:緩沖液A為以體積分數計含有0.4%三氟乙酸(TFA)和80%乙腈(ACN)的水溶液，緩沖液B為以體積分數計，25%的乳酸和75%的緩沖液A的混合液。其中，緩沖液B也作為接下來的上樣緩沖液。前處理過程及接下來洗滌過程均借助離心機在5000rpm轉速下離心2分鐘，其中每種緩沖液洗滌2次。
[0100](f)前處理完畢后，將緩沖液B與蛋白溶液以2:1的體積比混勻，加入移液槍槍頭(T i P)中進行富集。該過程借助離心機使混合液經過富集材料，并以3 500rpm的轉速離心8分鐘，將離心得到的樣品重新移到Tip中，重復3次。
[0101](g)接著，分別用緩沖液B和緩沖液A先后洗滌復合納米纖維Tip，目的是除去粘在纖維表面的非磷酸化多肽及試劑，每種緩沖液洗滌2次。
[0102](h)洗滌完畢后，用50yL的5%氨水洗脫特異性吸附的磷酸化蛋白，離心速度、時間及次數與富集過程一致。最后將洗脫液凍干，并放于-20°C保存備用。
[0103]基質輔助激光解析串聯飛行時間質譜分析(MALD1-TOF-MS)
[0104]MALDI的原理是用激光照射樣品與基質形成的共結晶薄膜，激光照射時基質從激光中吸收能量，傳遞給樣品分子使其瞬間汽化，并將質子轉移到樣品分子使其離子化，然后進入飛行時間質量分析器，再根據它們各自的質荷比(m/z)進行檢測。
[0105]具體過程為:將凍干的樣品用3yL緩沖液C(乙腈/三氟乙酸/水，50%/0.1%/49.9%, v/v/v)復溶，然后與等體積的飽和CHCA基質混勻。CHCA基質是由α-氰基-4-羥基肉桂酸溶于ΤΑ30溶液中形成的飽和溶液，其中，ΤΑ30是含有體積分數為30 %乙腈和0.1 %三氟乙酸的水溶液。然后，用微量移液槍將混合液體滴于靶板上，待自然風干后再滴一層CHCA基質，干燥并結晶后進行MALD1-TOF質譜分析。
[0106]其中，本實施例2的輔助質譜型BCOmZrO2復合納米纖維，包括細菌纖維(BC)和包覆在其表層的二氧化鋯納米顆粒，該復合納纖維由移液槍槍頭支撐，輔助質譜型BCOmZrO2復合納米纖維Tip由上述步驟a-d制成。輔助質譜特異性富集磷酸化蛋白或多肽的過程包括前處理、上樣富集及洗脫分析過程，輔助質譜特異性富集磷酸化蛋白或多肽過程由上述步驟e-h完成。
[0107]本發明實施例2中的BCOZrO2復合納米纖維對β_酪蛋白酶解液(來自實施例1中所制備的)與磷酸化多肽樣品(1: 1、1:10、1:100)的不同摩爾比的混合溶液做質譜檢測，特異性達到1:100。
[0108]實施例2的BCOmZrO2復合納米纖維的制備及富集磷酸化蛋白的過程及示意圖與實施例I相似。
[0109]圖8、圖9分別為β-酪蛋白酶解液與磷酸化多肽樣品的摩爾比為1:10的混合溶液經BCOmZrO2復合納米纖維富集前和富集后的質譜圖。
[0110]從以上實施例可以看出:在磷酸化蛋白或多肽的富集及檢測方面，本發明的BCO金屬氧化物復合納米纖維不僅具有較高的特異性和靈敏性，質譜檢測圖譜也具有較高的信噪比，本發明為生物檢測領域提供了可行的新方法。在材料方面，本發明的BCO金屬氧化物復合納米纖維不僅具有大的比表面積、有序的介孔結構，還具有操作簡單、環境友好等優點。
[0111]以上所述僅是本發明的優選實施方式，并不用于限制本發明，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明技術原理的前提下，還可以做出若干改進和變型，這些改進和變型也應視為本發明的保護范圍。
【主權項】
1.一種BCO金屬氧化物復合納米纖維的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: (a)制備BC納米纖維; (b)在BC納米纖維的表面包覆金屬氧化物顆粒層，并自然堆積形成介孔結構，得到包覆有金屬氧化物顆粒的BCO金屬氧化物復合納米纖維； (c)用堿催化步驟(b)中得到的BCO金屬氧化物復合納米纖維，得到可用于富集磷酸化蛋白或磷酸化多肽的BCO金屬氧化物復合納米纖維。2.根據權利要求1所述的BC O金屬氧化物復合納米纖維的制備方法，其特征在于，在步驟(c)之后還包括步驟(d):將BCO金屬氧化物復合納米纖維填充于移液槍槍頭中，形成呈移液槍槍頭形狀的BCO金屬氧化物復合納米纖維。3.根據權利要求1所述的BCO金屬氧化物復合納米纖維的制備方法，其特征在于:所述金屬氧化物選自二氧化鈦、二氧化鋯、三氧化二鋁、三氧化二鐵、二氧化錫中的一種或幾種。4.根據權利要求1所述的BC O金屬氧化物復合納米纖維的制備方法，其特征在于:在步驟(a)中，采用細菌纖維素產生菌經生物合成法制備BC納米纖維。5.根據權利要求4所述的BCO金屬氧化物復合納米纖維的制備方法，其特征在于:在步驟(a)中，木醋桿菌在發酵條件下制備BC納米纖維。6.根據權利要求1所述的BCO金屬氧化物復合納米纖維的制備方法，其特征在于:在步驟(b)中，通過原位生長法在BC納米纖維表面包覆金屬氧化物顆粒層。7.根據權利要求1或6所述的BCO金屬氧化物復合納米纖維的制備方法，其特征在于:在步驟(b)中，金屬氧化物顆粒的粒徑為5-15nm。8.根據權利要求1所述的BC O金屬氧化物復合納米纖維的制備方法，其特征在于:在步驟(b)中，介孔結構的介孔孔徑為6-10nmo9.根據權利要求1所述的BCO金屬氧化物復合納米纖維的制備方法，其特征在于:在步驟(c)中，堿選自氨水、N，N-二甲基甲酰胺和四甲基氫氧化銨中的一種或幾種。10.—種權利要求1所述的BCO金屬氧化物復合納米纖維富集磷酸化蛋白或磷酸化多肽的方法，其特征在于，包括以下步驟: (e)用緩沖液洗滌BCO金屬氧化物復合納米纖維，使其處于富集最佳狀態； (f)將磷酸化蛋白或磷酸化多肽加入BCO金屬氧化物復合納米纖維中進行富集； (g)用緩沖液洗滌步驟(f)中得到的富集有磷酸化蛋白或磷酸化多肽的BCO金屬氧化物復合納米纖維，以除去非特異性吸附的蛋白或多肽； (h)用堿洗脫富集在BCO金屬氧化物復合納米纖維上的特異性磷酸化蛋白或多肽。
【文檔編號】G01N27/62GK105862391SQ201610185965
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年3月29日
【發明人】劉堅, 高瑞芳, 陳嘯, 孫東平
【申請人】蘇州大學