一種適用于含綠色熒光蛋白繭絲的脫膠方法
【專利摘要】本發明公開了一種適用于含綠色熒光蛋白繭絲的脫膠方法，包括如下步驟：將繭絲烘至恒重，在浴比為1：50的預處理液中浸泡，然后在堿性蛋白酶濃度為0.5～3g·L-1、溫度為40～60℃條件下脫膠30～120分鐘，水洗、烘干，得脫膠繭絲，其中預處理液為pH＝10的含1g/L純堿和0.5g/L滲透劑JFC的溶液，該方法適用于含綠色熒光蛋白繭絲的脫膠，脫膠率高，并且能夠最大限定保持繭絲的熒光特性，該方法脫膠后對繭絲的力學性能損失較小，手感柔軟，絲光好，可滿足轉基因綠色繭蠶絲脫膠的要求。
【專利說明】-種適用于含綠色巧光蛋白雖絲的脫膠方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于化學領域，具體涉及一種適用于含綠色英光蛋白雖絲的脫膠方法。
【背景技術】
[0002] 紡織印染行業一直被認為是一個大的污染源，其中染整業的染化藥品是重要的 "貢獻者"。該些染化藥品除對操作工人的健康有影響，還會給消費者帶來長期危害，甚至某 些染料還有致癌性。近年來，蠶絲染色主要采用酸性染料和活性染料。就染色效果來說，酸 性染料色彩鮮艷，但染色牢度差；活性染料雖然染色牢度好，但染料的利用率不高，染色的 重現性差，改色困難；又由于蠶絲絲素在堿性過高時易損傷，因此蠶絲的染色存在很多局限 性。
[0003] 隨著piggyBac介導的轉基因技術在家蠶中的建立和廣泛應用，各種轉基因家蠶 絲腺表達系統如Fib-H，Fib-L，P25和Seri相繼被建立起來的用于外源基因在轉基因家蠶 絲腺中的精確與高量表達，該些表達系統不僅可W用來大規模生產具有高附加值的重組外 源蛋白。同時也能利用其在蠶絲中表達具有不同生物學功能的蛋白，進而遺傳改良蠶絲的 機械，賦予蠶絲新生物學功能和用途，具有非常廣闊的應用前景。化ao等將綠色英光蛋白 GFP至于家蠶的絲素基因啟動子的控制之下實現在蠶絲絲素層中的表達，育成含有天然綠 色英光蛋白成分的新型蠶雖。GFP是一種能夠自身催化形成生色團并在藍光或紫外光激發 下發出綠色英光的蛋白，其具有英光穩定、易于檢測、生物安全性好等優點。隨著轉基因技 術的進一步發展，會有更多天然彩色雖誕生，為蠶絲帶來一場顏色革命。
[0004] 但是，新型彩色雖的誕生同時也帶來了新的問題；絲膠的存在會影響蠶絲的手感、 色澤W及后續的印染加工，因此蠶絲必須進行精練。該些新型彩色雖要想工業化，也必須進 行縷絲、精練等一系列的加工。蠶絲的精練主要是脫去絲膠的過程，其原理是將絲膠在酸、 堿、酶、高溫高壓等條件下通過膨化而溶解，強酸強堿、高溫高壓等條件都極易使蛋白質變 性，因此脫膠的過程即伴隨著蛋白的變性過程。而綠色雖絲中的英光蛋白由于本質上仍具 有蛋白質的特性，不耐高溫，對酸堿的敏感度仍有待確定（一旦產生變性，則英光消失）。生 絲固膠軟化的生產方法一文中采用低溫固膠的技術將蠶絲中的絲膠固著，此種固膠工藝溫 和，可保持綠色雖絲的色彩，但該種方式處理的雖絲手感較差，其使用也受到限制。
[0005] 因此，急需尋找一種不影響英光蛋白活性，脫膠率高的脫膠方法。
【發明內容】
[0006] 有鑒于此，本發明的目的在于提供一種適用于含綠色英光蛋白雖絲的脫膠方法， 脫膠率高，并能最大限定保持雖絲的英光特性，該方法脫膠后對雖絲的力學性能損失較小， 手感柔軟，絲光好。
[0007] 為實現上述發明目的，本發明提供如下技術方案：
[0008] -種適用于含綠色英光蛋白雖絲的脫膠方法，包括如下步驟；將雖絲烘干至恒重， 在浴比為1 ;50的預處理液中浸泡，然后在堿性蛋白酶濃度為0. 5?3g ? [1、溫度為40? 6(TC條件下脫膠30?120分鐘，水洗、烘干至恒重，得脫膠雖絲，所述預處理液為抑=10 的含Ig/L純堿和0. 5g/L滲透劑JFC的溶液。
[0009] 優選的，所述浸泡的條件是在溫度為5(TC條件下浸泡0. 5小時。
[0010] 優選的，所述脫膠中，堿性蛋白酶濃度為3g/L。
[0011] 優選的，所述脫膠的溫度為5(TC。
[0012] 優選的，所述脫膠的時間為120分鐘。
[0013] 優選的，所述水洗的條件是依次用溫度為8(TC、5(TC和18?25C的水洗5分鐘。
[0014] 更優選的，所述烘干的溫度為105?iicrc。
[0015] 本發明的有益效果在于；本發明公開通過采用皂堿法、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶分 別對綠色雖絲進行脫膠，在保持絲素中的綠色英光蛋白活性的前提下，最大程度的脫除絲 膠。通過比較H種脫膠方法的正交實驗結果可知，H種方法在適當的條件下均可完全脫膠， 但堿性蛋白酶完全脫膠的條件明顯更加溫和，并且顯微鏡下的照片顯示，在達到最大脫膠 率時，皂堿法和木瓜蛋白酶脫膠后的綠色雖絲英光消失，而堿性蛋白酶脫膠后的綠色雖絲 仍保持較強的英光特性。對脫膠雖絲的力學性能檢測顯示，采用此法脫膠獲得的雖絲力學 性能損失較小，手感柔軟、絲光好，可W滿足含綠色英光蛋白雖絲脫膠的要求。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0016] 為了使本發明的目的、技術方案和有益效果更加清楚，本發明提供如下附圖：
[0017] 圖1為綠色英光雖絲英光觀察（A-B ;綠色英光雖絲的白光圖和英光圖；C-D ;正常 雖絲的白光圖和英光圖）。
[0018] 圖2為皂堿法脫膠綠色雖絲對綠色英光特性的影響。
[0019] 圖3為木瓜蛋白酶脫膠綠色雖絲對綠色英特性的影響。
[0020] 圖4為堿性蛋白酶脫膠綠色英光雖絲英光特性的影響（A :白光圖；B ;綠色英光 圖）。
[0021] 圖5為沈M觀察結果W及雖絲在斷裂時的應力數和行變數擬合分析結果（A ;SEM 觀察結果；B ;應力數和行變數擬合分析結果）。
【具體實施方式】
[0022] 下面將結合附圖，對本發明的優選實施例進行詳細的描述。實施例中未注明具體 條件的實驗方法，通常按照常規條件或按照制造廠商所建議的條件。
[0023] W下實施例使用的材料、主要試劑及儀器如下：
[0024] 材料；含綠色英光蛋白雖絲（簡稱"綠色雖絲"）由西南大學家蠶基因組生物學 國家重點實驗室提供，其制備方法參見化ao A，化ao T，化ang Y，et al.New and hi曲ly efficient expression systems for expressing selectively foreign protein in the silk glands of transgenic silkworm. Transgenic Res. 2010 ; 19:29-44。分別取綠色雖 絲和正常雖絲，切片后置于英光顯微鏡下觀察，結果如圖1所示。結果顯示本發明實施例中 使用的綠色雖絲在絲素層散發出強烈的綠色英光信號。
[00巧]試劑；工業皂片購自重慶重陵日化廠；木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶和中性蛋白酶購 自南寧鹿博生物工程有限公司，滲透劑JFC，無水碳酸軸，冰己酸均為分析純。
[0026] 儀器；H孔電熱恒溫水槽購自上海齊欣科學儀器有限公司，熱機械分析儀DMA Q800購自美國TA Instruments公司。
[0027] 實施例1、綠色雖絲英光觀察及含膠率測定
[002引取6g綠色雖絲，放入恒溫烘箱內，W 105?11(TC烘至恒重，即為試驗前干重W。， 再將試樣在下列條件下進行處理：
[0029] 純堿 1 g 磯酸H鑰 2g 軟水量 lOOOg 溫度 loor 時間 比
[0030] 試樣經上述條件處理后，用軟水充分洗涂，再于105?iicrc烘至恒重，即為試驗 后干重Wi，然后按下述公式計算含膠率，精確至0. 01 %。
[003。含膠率=(Wg-Wi)/WgX100%
[0032] 重復H個平行試驗，取H次平均值作為含膠率的最終結果。計算得到含膠率為 26. 86%。將此含膠率作為脫膠效果的評判標準，脫膠率越接近含膠率，說明脫膠越充分。
[0033] 實施例2、皂堿法脫膠綠色雖絲的方法
[0034] 取綠色雖絲樣品在105?11(TC烘箱中烘至恒重，并記錄綠色雖絲干重，記為m。， 在浴比為1:50的皂堿溶液中浸泡0. 5小時，其中皂堿溶液含濃度為3?7g ?。的工業皂 和濃度為1?5g ?。的純堿，然后在溫度為60?95C條件下脫膠20?60分鐘（具體按 表1條件脫膠），接著依次在溫度為8(TC、5(rC和18?25C的水中水洗5分鐘，最后置于 105?llCrC烘箱中烘至恒重，記錄脫膠雖絲干重，記為叫。根據脫膠率=(mu-mi)/V)X100% 計算脫膠率，結果見表1所示。
[0035] 表1、皂堿法脫膠綠色雖絲的正交方法及結果
[0036]
【權利要求】
1. 一種適用于含綠色熒光蛋白繭絲的脫膠方法，其特征在于，包括如下步驟：將繭絲 烘干至恒重，在浴比為1:50的預處理液中浸泡，然后在堿性蛋白酶濃度為0. 5?3g ? L' 溫度為40?60°C條件下脫膠30?120分鐘，水洗、烘干至恒重，得脫膠繭絲，所述預處理液 是pH = 10的含lg/L純堿和0. 5g/L滲透劑JFC的溶液。
2. 根據權利要求1所述的脫膠方法，其特征在于：所述浸泡的條件是在溫度為50°C條 件下浸泡0.5小時。
3. 根據權利要求1所述的脫膠方法，其特征在于：所述脫膠中，堿性蛋白酶濃度為3g/ L〇
4. 根據權利要求1所述的脫膠方法，其特征在于：所述脫膠的溫度為50°C。
5. 根據權利要求1所述的脫膠方法，其特征在于：所述脫膠的時間為120分鐘。
6. 根據權利要求1所述的脫膠方法，其特征在于：所述水洗的條件是依次用溫度為 80°C、50°C和18?25°C的水洗5分鐘。
7. 根據權利要求1所述的脫膠方法，其特征在于：所述烘干的溫度為105?110°C。
【文檔編號】D01C3/02GK104389032SQ201410805499
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2014年12月22日 優先權日:2014年12月22日
【發明者】席星航, 楊佩, 王峰, 趙萍, 夏慶友 申請人:西南大學