一種漂白復合酶及其制備方法
【專利摘要】本發明公開了一種漂白復合酶及其制備方法，以耐高溫堿性木聚糖酶為主要原料，科學復配嗜熱芽孢桿菌培養物、漆酶及其介質、葡聚糖酶、EDTA、保護劑、激活劑、甘露糖酶、脂肪酶、單寧酶、果膠酶、白度穩定劑、非離子表面活性劑、抗氧化劑等，在完全保留紙漿纖維素的同時，最大限度地溶出木質素并將其降解，制備了一種酶系全、漂白效果好、易保存、儲存穩定性好的漂白復合酶，對闊葉木、針葉木和蘆葦黃漿可顯著提高紙漿產量和質量，白度分別提高10.94％、11.97％和11.10％；返黃值分別降低39.84％、37.31％和24.32％；可節約常規化學用品量50-60％；最終達到降低成本和保護環境的目的。
【專利說明】一種漂白復合酶及其制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及造紙用復合酶，具體涉及一種漂白復合酶及其制備方法。
【背景技術】
[0002] 在工業生產中，制漿過程是在堿性的條件下，用高溫蒸煮的方法除去木質素，為使 溶解制漿纖維素純度達到98%，這就需要大量的氫氧化鈉處理紙漿，造成了嚴重的環境污 染，為此許多學者轉而嘗試生物處理制漿，而用于制漿漂白的木聚糖酶應是耐熱和耐堿的。 馮建良等（Kimura et al. 2000)用木聚糖酶預處理麥草與常規化學法制漿進行了比較試 驗，木聚糖酶預處理提高了原料的脫木素程度，還可以降低制漿的卡伯值。木聚糖酶在輔 助漂白方面有較廣泛而深入的研宄，且取得了很大成果。研宄發現，無論是針葉木漿、闊葉 木漿或是竹漿、草漿，木聚糖酶均可以降解紙漿中殘余的木質素，提高了白度（AL BALAA et al, 2006 ;Meek and Lipman, 1922)。用于紙衆漂白的木聚糖酶必須具有耐高溫特點，Khasin 等得到了一個來源于堿性菌株Bacillus sterarothermophilus T26木聚糖酶，該木聚糖酶 在pH 9.0及65°C時對紙漿有最好的漂白效果（Khasin et al，1993)，很多木聚糖酶不具備 這樣的特點，限制了商業化應用。全世界每年產生的廢紙數量是驚人的，廢紙回收后再利用 工作就變得尤為重要了，可以使在資源重復利用的同時也保護了環境。1991年，由韓國學者 首次報道了應用木聚糖酶能將油墨從新聞廢紙漿中脫除。此后，人們開始研宄利用木聚糖 酶進行廢紙脫墨，以減輕或消除化學脫墨帶來的環境污染（曹軍衛等，2004)。
[0003] 目前，以無元素氯和全無氯漂白工藝為代表的紙漿綠色清潔漂白已經成為世界各 國造紙業紙漿漂白發展的必然趨勢，木聚糖酶酶法助漂新工藝已在歐洲和北美洲的30余 家大型紙廠得到應用，成為生物技術在造紙工業應用最成功的一例。其中加拿大有約10% 的硫酸鹽法紙漿廠采用了該項新工藝。丹麥諾維信公司和美國山道斯化學公司等多家酶制 劑廠商，紛紛推出了專門用于制漿處理的木聚糖酶和纖維素酶新產品，但到目前為止，工業 上應用于紙漿漂白的木聚糖酶大多是中性偏酸的，最適反應溫度大多在50°C左右，眾所周 知，紙漿蒸煮和漂白基本都是在高溫和強堿的條件下進行的，使得現有的低溫酸性木聚糖 酶產品在此領域的應用受到極大的限制。
[0004] 但是，由于木聚糖酶處理工藝是通過降解除去紙漿表面再沉積的半纖維素等方式 來幫助化學漂劑漂白的，木聚糖酶只能起到助漂的作用，不能真正替代化學漂劑。因此，生 物預漂白并不能完全替代化學漂白，能減少污染卻不能最終消除污染，要從根本上消除有 氯漂白液的污染，需最終實現生物漂白，即完全采用生物手段除去紙漿中殘留的木質素，因 為木質素的存在是紙漿返黃的根本原因，化學漂白可直接作用木質素而破壞紙漿中的發色 基團。木素酶可直接作用于木質素，對木質素進行降解，主要為白腐菌分泌的木素過氧化物 酶、錳過氧化物酶、漆酶和纖維二糖脫氫酶等，近幾年研宄的熱點主要集中在漆酶的生物漂 白上，漆酶是一種多銅氧化酶，也稱多酚氧化酶，主要氧化含酚的木質素結構單位，但天然 木材木質素只有少于20%的含酚結構單位，另通常真菌漆酶分子量較大（約為70000Da)難 以穿入木頭中作用木質素分子，要想充分發揮其酶活性，必須添加漆酶介質，通常為紫尿 酸（VA)和1-羥基苯并三氮唑（HBT)，視不同漂白工藝而選用，并且漆酶的產量較小、穩定性 較差。
[0005] 中國專利CN 102978986 A公開了一種生物酶法制備紙漿的方法，所述生物酶制備 液中生物酶組分的質量百分比含量為：纖維素酶20%，半纖維素酶10%，木素降解酶10%， 淀粉酶20%，脂肪酶5%，果膠酶和漆酶20% ;其中的纖維素酶會降解紙漿中的有效成分纖 維素，不易控制，嚴重影響成紙的物理機械性能，同時，上述生物酶適用于制漿工藝，而非漂 白工藝，并且，單一使用漆酶，其酶活力很難發揮，不能很好作用于木質素，紙漿返黃可能性 增大。中國專利CN 103555701 A公開了一種紙漿漂白用復合酶液的生產方法，其特征是將 各組份酶經稱量、復配罐混合配制、防腐、檢驗、包裝后存放于5°C庫房中，所述各組份酶為 堿性果膠酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶和木質素酶；上述復合酶液酶種類和特性單一、木質素 酶活力低且沒有公開木質素酶的具體種類，工業化難于實現，還是不能從根本上徹底消除 木質素，漂白效果仍不理想，并且不易保存、儲存穩定性差，商品化應用受限。
[0006] 綜上，制備一種酶系全、漂白效果好、易保存、儲存穩定性好的紙漿漂白酶具有廣 闊的市場前景和巨大的市場潛在價值。
【發明內容】
[0007] 本發明所解決的技術問題是克服現有紙漿漂白酶的缺陷，以耐高溫堿性木聚糖酶 為主要原料，科學復配嗜熱芽孢桿菌培養物、漆酶及其介質、葡聚糖酶、EDTA、保護劑、激活 劑、甘露糖酶、脂肪酶、單寧酶、果膠酶、白度穩定劑、非離子表面活性劑、抗氧化劑等，制備 一種酶系全、漂白效果好、易保存、儲存穩定性好的紙漿漂白酶，在完全保留紙漿纖維素的 同時，最大限度地溶出木質素并將其降解，從根本上降低紙漿中木質素含量，增強脫木素效 果，同時適度復配白度穩定劑，可彌補生物漂白的不足，力爭達到永久漂白，防止紙漿返黃， 提高成紙的產量和質量，以推進生物漂白在造紙工業的應用進程，最終達到降低成本和保 護環境的目的。
[0008] 為了達到上述目的，本發明采用以下技術方案：
[0009] 一種漂白復合酶，由以下重量份數的原料制備：
[0010] 堿性木聚糖酶10-20份，嗜熱芽孢桿菌培養物8-10份，漆酶8-10份，葡聚糖酶5-8 份，1-羥基苯并三氮唑3-8份，EDTA 3-8份，保護劑4-7份，激活劑4-7份，甘露糖酶4-6 份，脂肪酶3-5份，單寧酶3-5份，果膠酶3-5份，白度穩定劑2-5份，非離子表面活性劑2-4 份，抗氧化劑1 _3份。
[0011] 所述堿性木聚糖酶和嗜熱芽孢桿菌培養物是由產耐高溫堿性木聚糖酶的嗜熱芽 孢桿菌（Bacillus thermophilus) 701 (保藏編號為CCTCC M 2013537)為出發菌株，并通過 優化培養基組成和發酵工藝而制備；
[0012] 所述堿性木聚糖酶耐高溫、耐堿性強、作用條件寬泛、不具有纖維素酶活性，更加 適合紙漿的生物漂白和化學助漂；
[0013] 所述耐高溫堿性木聚糖酶的酶學性質如下：
[0014] (1)溫度：該酶溫度適應范圍較寬，適用溫度范圍為40-75°C，最適反應溫度65°C， 在75 °C酶活完全穩定；
[0015] (2) pH :該酶適用反應pH值范圍為5. 0-11. 0,在pH值為11. 0時酶活完全穩定，最 適反應pH值為10. O ;
[0016] (3)酶活性：發酵液堿性木聚糖酶酶比活力較高，為350-420IU/ml ;
[0017] (4)熱穩定性：該酶在70°C條件下保存Ih后仍能保持80 %以上酶活，75°C條件下 保存Ih后保持70%以上酶活；
[0018] (5)存儲穩定性：該酶在室溫下保存12個月后酶活損失小于3. 0%。
[0019] 優選地，所述耐高溫堿性木聚糖酶的制備方法如下：將保存完好的嗜熱芽孢桿 菌CCTCC M 2013537的斜面菌種經活化和逐級擴大培養（包括一、二、三級種子培養以及 一級種子罐培養）得到種子液，以6%接種量接入發酵罐，培養溫度37-45°C，攪拌速度 200-700rpm，通風量（V/V)l:l-3,培養時間25-30h ;然后以1-2°C /h降溫速率緩慢降溫至 15-20°C，恒溫培養10_12h ;繼續以1-2°C /h降溫速率緩慢降溫至8-10°C，此時，將一級種 子罐發酵液以4%接種量追加接入發酵罐，恒溫培養7-12h ;最后以1-2°C /h升溫速率緩慢 升溫至15-20°C，恒溫培養10_12h ;繼續以1-2°C /h升溫速率緩慢升溫至37-45°C，恒溫培 養20-30h ;發酵液經過濾、濃縮、調配、精濾、干燥得耐高溫堿性木聚糖酶，所述調配過程加 入濃縮酶液總重量0. 5-5%中草藥粉劑；
[0020] 所述斜面培養基組成為：牛肉膏3-10g，氯化鈉5-12g，蛋白胨10-20g，葡萄糖 2_5g，瓊脂 15-20g，中草藥粉劑 5-10g，蒸餾水 lOOOmL，pH 值 5-11，121°C滅菌 20min ;
[0021] 所述中草藥粉劑的制備方法如下：以重量份數計，稱取黃芪20-30份，黨參10-18 份，柴胡10-15份，黃芩10-15份，魚腥草8-12份，當歸8-10份；分別將上述中草藥粉碎至 粒徑為2毫米以下，然后于容器中均勻混合并添加3-6倍重量的水，控制溫度70°C?90°C 保持2?4h，然后降溫至45-60 °C，加入混合酶進行酶解，用乳酸調節pH值為5. 5-6. 8,酶解 2_4h，最后添加混合物料0. 5-3倍重量乙醇和丙醇的混合物，控制溫度至60°C?78°C保持 3?4h，過濾；濾液真空濃縮后冷凍干燥獲得中草藥粉劑；
[0022] 所述混合酶添加量為混合物料總重量的5-10% ;
[0023] 所述混合酶的重量份數組成為：內β -葡聚糖酶10-20份，夕卜β -葡聚糖酶10-20 份，β -葡萄糖苷酶10-15份，木聚糖酶15-20份，戊聚糖酶15-20份，普魯蘭酶20-30份， β -淀粉酶10-15份，中性蛋白酶10-15份，酸性蛋白酶10-15份，超氧化物歧化酶5-10份， 葡萄糖氧化酶5-10份，酸性磷酸酶5-10份；
[0024] 所述乙醇和丙醇的質量比例為I :1-1. 5 ;
[0025] 所述一級、二級、三級種子培養基重量組成為：
[0026] 酵母粉0. 3-0. 5%，葡萄糖1-1. 5%，蛋白胨0. 3-0. 5%，牛肉膏0. 5-0. 8%，磷酸氫 二鉀0.8-1. 5%，中草藥粉劑1.5-2%，海藻糖1-3%，硫酸鈣0. 1%，氯化鎂0.2%，檸檬酸 鈉0· 1-0. 3%，不足部分純凈水補足，pH值5-11，121-123°C滅菌30-40min ;
[0027] 所述種子罐培養基重量組成為：
[0028] 麥芽糊精5-15%，酵母粉0.4-0. 8%，中草藥粉劑1.5-2%，海藻糖1-3%，蛋白 胨0. 1-0. 5%，玉米漿0. 1-0. 5%，磷酸氫二鉀0.8-1. 5%，硫酸鎂0.05-0. 1%，檸檬酸 鈉0. 1-0. 5%，樺木木聚糖0. 1-0. 8%，不足部分純凈水補足，pH值5-11，121-123°C滅菌 3〇-40min ；
[0029] 所述種子罐發酵液菌體濃度為7. Ox 108-8. Ox IO8個/ml ;
[0030] 所述發酵培養基組成為：麥芽糊精50-150g，玉米粉50-60g，豆餅粉15-25g，中草 藥粉劑30-50g，海藻糖30-40g，樺木木聚糖5-15g，酵母粉4-8g，玉米漿l-5g，硫酸銨l-3g， 磷酸氫二鉀l_2g，磷酸二氫鉀l_2g，梓檬酸鈉 l-5g，消泡劑0. 1-lg,純凈水lOOOmL，pH值 5-11，121°C 滅菌 20min ;
[0031] 所述發酵培養基的調配方法為：按比例準確稱取原料，將原料中的純凈水、玉 米粉、豆餅粉投入配料罐中，調節pH值5-11，加入中溫淀粉酶（3u/g玉米粉）與高溫淀 粉酶（30u/g玉米粉），同時邊攪拌邊升溫至70°C保溫15-30min，然后緩慢升溫至90°C 保溫15-30min進行液化，最后加入其它原料，攪拌均勻，調初始pH5-ll，121-123°C滅菌 30_40min 備用。
[0032] 所述嗜熱芽孢桿菌培養物含有較強的生物活性，在生物漂白過程中通過發酵一方 面可產生耐高溫堿性木聚糖酶，為體系持續提供，另一方面是通過發酵的動態反應可使嗜 熱芽孢桿菌均勻、充分地分散到紙漿纖維素、半纖維素和木質素間質，充分柔化纖維素和降 解半纖維素（木聚糖、葡聚糖、甘露糖等），使復合酶的其它成分（如漆酶、介質等酶制劑、螯 合劑、保護劑、激活劑、白度穩定劑等）均勻、充分地滲透到紙漿植物細胞間質，充分發揮組 份的作用，以提高紙漿收得率和質量，縮短漂白時間，并去除雜質和增強生物漂白效果；
[0033] 優選地，所述嗜熱芽孢桿菌培養物的制備方法為上述制備堿性木聚糖酶的發酵液 經減壓濃縮、冷凍干燥、低溫粉碎而得到的；
[0034] 所述嗜熱芽孢桿菌培養物活菌含量為7Χ101(ι-9 Χ101(^Ρυ/^。
[0035] 所述1-羥基苯并三氮唑可激活大分子漆酶的活力，形成強氧化作用的復合介體， 提高漆酶的酶解效力，充分發揮漆酶對木質素的降解作用，從根本上消除木質素，防止紙漿 返黃。
[0036] 所述EDTA可螯合紙漿中大部分過渡金屬離子（銅離子、二價鐵離子、三價鐵離子、 二價錳離子、二價鎳離子等）和微量重金屬，以排除其對生物酶酶活力的抑制和消除作用， 使酶組份充分、有效地發揮作用；
[0037] 所述白度穩定劑具有漂白和穩定白度的雙重作用，既可有效提高紙漿白度，又可 防止紙漿返黃，并且不會受紙漿中氧氣和過渡金屬離子（銅離子、二價鐵離子、三價鐵離 子、二價錳離子、二價鎳離子等）的影響，白度穩定劑的使用可有效彌補生物漂白后殘留木 質素引起的紙漿返黃；
[0038] 所述白度穩定劑為硫醇、硫醚、三羥甲基磷酸（ΤΗΡ)、四羥甲基磷酸鹽（THPC)、三 羥甲基磷酸的雙磷衍生物（BBHPE)中的一種或幾種以任意比例均勻混合；
[0039] 優選地，所述白度穩定劑為三羥甲基磷酸的雙磷衍生物（BBHPE);
[0040] 所述非離子表面活性劑在酶漂白過程中可促進復合酶組份滲透，充分游離木質 素、半纖維素、果膠、單寧、脂肪、等底物，促進和延長各組份酶與底物的作用時間，使紙漿中 的有害成分充分降解，提高紙漿纖維的柔滑性和漂白均勻度；
[0041] 優選地，所述非離子表面活性劑為環保型非離子表面活性劑，容易生物降解，無殘 留，對人體、生物及環境無任何毒副作用；
[0042] 更優選地，所述非離子表面活性劑的質量組份為：烷基多苷（APG) 30-40份，烷基 葡萄糖酰胺（AGA) 15-20份，N-十二烷基乙二胺三乙酸鈉（ED3A) 10-15份，異構醇醚羧酸鹽 AEC-110710-15份，月桂酰胺醚羧酸鹽（LAEC) 8-10份，平平加 c-1253-5份，JFC 3-5份；上 述原料均為市購固體粉狀商品。
[0043] 所述激活劑是由如下質量組份的無機鹽均勻混合而成：硫酸鈉15-18份，氯化鋅 6-8份，氯化儀5_8份，氯化1? 3_5份。
[0044] 所述保護劑由以下重量份數的原料組成：海藻糖30-50份，靈芝多糖12-18份， NaCl 10-15 份，（NH4)2S045-9 份，半胱氨酸 3-5 份。
[0045] 所述抗氧化劑為葡萄籽原花青素、迷迭香提取物和杏葉提取物中的任一一種或幾 種組合；
[0046] 優選地，所述抗氧化劑為葡萄籽原花青素、迷迭香提取物和杏葉提取物按質量比 3-5:1-3:1-2均勻混合；
[0047] 所述葡萄籽原花青素、迷迭香提取物和杏葉提取物均為市購商品
[0048] 上述漂白復合酶的制備方法，包括如下步驟：
[0049] 首先將所述保護劑、激活劑分別超微粉碎，均勻混合，隨后立即依次加入非離子表 面活性劑、嗜熱芽孢桿菌培養物均勻混合20-30min，然后依次加入堿性木聚糖酶、漆酶、葡 聚糖酶、甘露糖酶、脂肪酶、單寧酶、果膠酶均勻混合，最后依次加入1-羥基苯并三氮唑、 EDTA、白度穩定劑、抗氧化劑，混合均勻后密封包裝即得漂白復合酶。
[0050] 本發明另一目的是所述漂白復合酶在造紙生物漂白工藝中的應用。
[0051] 使用方法：
[0052] 1.復合酶在黃漿氯化前或氯化后或堿化后加入被漂黃漿中；
[0053] 2.復合酶作用條件：適應pH值5-11，最適pH值7-9,適應溫度40-70°C，最適反應 溫度 45-55 °C ;
[0054] 3.使用方法：1)將復合酶與50°C水按質量比1:10均勻混合，調整pH值為7-9,活 化20-30min，通過計量泵加入被漂黃漿中，使其與黃漿混合均勻進行酶解反應；
[0055] 2)復合酶的添加量占絕干黃漿質量的0. 05-0. 3 % ;
[0056] 3)黃漿的濃度為5-15 % ;
[0057] 4)酶解時間35-60min，酶解完成后，其化學漂白按常規工藝步驟進行，各步驟化 學品用量為常規用量的40-50 %。
[0058] 所述的黃漿為造紙原料經備料、制漿、洗滌、篩選后制成的黃漿；
[0059] 所述的黃漿為木漿或非木漿中的一種或組合；
[0060] 所述的非木漿由原料麥草或稻草或蘆葦或蔗渣制備；
[0061] 所述復合酶在氯化前加入時，復合酶的添加量占絕干黃漿質量的0. 15-0. 3 % ;復 合酶在氯化后加入時，復合酶的添加量占絕干黃漿質量的〇. 1-0. 15 % ;復合酶在堿化后加 入時，復合酶的添加量占絕干黃漿質量的〇. 05-0. 1 %。
[0062] 有益效果：
[0063] 本發明漂白復合酶以耐高溫堿性木聚糖酶為主要原料，科學復配嗜熱芽孢桿菌培 養物、漆酶及其介質、葡聚糖酶、EDTA、保護劑、激活劑、甘露糖酶、脂肪酶、單寧酶、果膠酶、 白度穩定劑、非離子表面活性劑、抗氧化劑等，制備一種酶系全、漂白效果好、易保存、儲存 穩定性好的紙漿漂白酶，在完全保留紙漿纖維素的同時，最大限度地溶出木質素并將其降 解，從根本上降低紙漿中木質素含量，增強脫木素效果，同時適度復配白度穩定劑，可彌補 生物漂白的不足，以達到永久漂白，防止紙漿返黃，提高成紙的產量和質量，與市售紙漿漂 白專用酶相比，本發明漂白復合酶對闊葉木、針葉木和蘆葦黃漿可顯著提高紙漿產量和質 量：得率分別提高8. 94%、8. 80%和10. 05% ; α -纖維素含量分別提高8. 58%、9. 49%和 16. 41% ;白度分別提高10. 94%、11. 97%和11. 10% ;返黃值分別降低39. 84%、37. 31 %和 24. 32%;粘度分別降低I. 20%、1. 18%和1. 43%;灰分分別降低25%、26%和28%，可節約 常規化學用品量50-60% ;從而推進生物漂白在造紙工業的應用進程，最終達到降低成本和 保護環境的目的，其有益效果是復合酶各組份協同作用的綜合體現，具體表現在：
[0064] 1.本發明的堿性木聚糖酶耐高溫、耐堿性強、作用條件寬泛、不具有纖維素酶活 性，更加適合紙漿的生物漂白和化學助漂。
[0065] 2.本發明的嗜熱芽孢桿菌培養物含有較強的生物活性，在生物漂白過程中通過發 酵一方面可產生耐高溫堿性木聚糖酶，為體系持續提供，另一方面是通過發酵的動態反應 可使嗜熱芽孢桿菌均勻、充分地分散到紙漿纖維素、半纖維素和木質素間質，充分柔化纖維 素和降解半纖維素（木聚糖、葡聚糖、甘露糖等），使復合酶的其它成分（如漆酶、介質等酶 制劑、螯合劑、保護劑、激活劑、白度穩定劑等）均勾、充分地滲透到紙漿植物細胞間質，充 分發揮組份的作用，以提高紙漿收得率和質量，縮短漂白時間，并去除雜質和增強生物漂白 效果。
[0066] 3.本發明將漆酶及其介質1-羥基苯并三氮唑科學復配，形成強氧化作用的復合 介體，提高漆酶的酶解效力，充分、有效地實現漆酶對木質素的降解作用，從根本上消除木 質素，防止紙漿返黃。
[0067] 4.本發明使用EDTA可螯合紙漿中大部分過渡金屬離子（銅離子、二價鐵離子、三 價鐵離子、二價錳離子、二價鎳離子等）和微量重金屬，以排除其對生物酶酶活力的抑制和 消除作用，使酶組份充分、有效地發揮作用。
[0068] 5.本發明白度穩定劑具有漂白和穩定白度的雙重作用，既可有效提高紙漿白度， 又可防止紙漿返黃，并且不會受紙漿中氧氣和過渡金屬離子（銅離子、二價鐵離子、三價鐵 離子、二價錳離子、二價鎳離子等）的影響，白度穩定劑的使用可有效彌補生物漂白后殘留 木質素引起的紙漿返黃。
[0069] 6.本發明非離子表面活性劑主要科學復配了環保型性能優越的非離子表面活性 劑，容易生物降解，無殘留，對人體、生物及環境無任何毒副作用；可在酶漂白過程中可促進 復合酶組份滲透，充分游離木質素、半纖維素、果膠、單寧、脂肪、等底物，促進和延長各組份 酶與底物的作用時間，使紙漿中的有害成分充分降解，提紙漿纖維的柔滑性和漂白均勻度。
[0070] 7.本發明漂白復合酶抗氧化劑的科學復配，可有效防止復合酶酶分子結構氧化而 造成酶活性損失，提高酶活力穩定性。在〇°C和40°C條件下儲存12個月，復合酶中單酶酶 活損失分別為〇. 41 %和0. 56%，比對比例分別降低18. 0%和65%，有效防止在包裝、儲存、 運輸、使用等環節因環境改變、操作方法不當而造成酶的失活，尤其可防止高溫造成的酶失 活。
[0071] 8.本發明漂白復合酶中保護劑的科學復配，有效減緩了復合酶制劑的回潮；同時 可增強復合酶的耐凍、耐熱性能，保持相同的酶活力，其耐熱溫度可提高20_30°C，耐冷凍溫 度可降低10-15攝氏度，有效防止了復合酶在運輸、保存和使用過程中酶活力的損失，延長 了復合酶的保質期，達到同樣的酶活力，比同類產品保質期可延長2-3年。
[0072] 9.本發明漂白復合酶添加無機鹽作為激活劑，創造了酶催化作用的最佳條件，充 分發揮了植物酶和微生物酶的活力，提高了復合酶作用效力。
【具體實施方式】
[0073] 下面通過具體的實施方案敘述本發明。除非特別說明，本發明中所用的技術手段 均為本領域技術人員所公知的方法。另外，實施方案應理解為說明性的，而非限制本發明的 范圍，本發明的實質和范圍僅由權利要求書所限定。對于本領域技術人員而言，在不背離本 發明實質和范圍的前提下，對這些實施方案中的物料成分和用量進行的各種改變或改動也 屬于本發明的保護范圍。
[0074] 實施例1原料制備
[0075] 1.堿性木聚糖酶的制備：包括如下步驟
[0076] (1)菌種活化
[0077] 將保存完好的嗜熱芽孢桿菌CCTCC M 2013537的斜面菌種接種于斜面培養基， 45°C培養36h進行菌種活化，如此活化3次；
[0078] 所述斜面培養基組成為：牛肉膏10g，氯化鈉12g，蛋白胨20g，葡萄糖5g，瓊脂 20g，中草藥粉劑10g，蒸餾水1000mL，pH值10,121°C滅菌20min ;
[0079] 所述中草藥粉劑的制備方法如下：
[0080] 以重量份數計，稱取黃芪25份，黨參15份，柴胡12份，黃芩12份，魚腥草10份， 當歸9份；分別將上述中草藥粉碎至粒徑為2毫米以下，然后于容器中均勻混合并添加5倍 重量的水，控制溫度80°C保持3h，然后降溫至55°C，加入混合物料總重量8%的混合酶進行 酶解，用乳酸調節PH值為6,酶解3h，最后添加混合物料2倍重量乙醇和丙醇的混合物，乙 醇和丙醇的質量比例為I : 1. 5,控制溫度至70°C保持4h，過濾；濾液真空濃縮后冷凍干燥獲 得中草藥粉劑；
[0081] 所述混合酶的重量份數組成為：內β-葡聚糖酶15份，外β-葡聚糖酶15份， β -葡萄糖苷酶12份，木聚糖酶18份，戊聚糖酶18份，普魯蘭酶25份，β -淀粉酶12份， 中性蛋白酶12份，酸性蛋白酶12份，超氧化物歧化酶8份，葡萄糖氧化酶8份，酸性磷酸酶 8份；
[0082] (2)液體種子擴大培養
[0083] ①一級種子培養：將步驟（1)活化后的斜面菌種2環接入500毫升搖瓶中，培養基 裝量100毫升，旋轉式搖床180轉/分，培養溫度43°C，培養時間15h ;
[0084] ②二級種子培養：將一級種子按照10%的接種量接入500毫升二級種子搖瓶中， 培養條件與一級種子相同；
[0085] ③三級種子培養：將二級種子以10%接種量接入5000暈升三級種子搖瓶中，培養 基裝量1000毫升，旋轉式搖床100轉/分，培養溫度43°C，培養時間15h ;
[0086] ④一級種子罐培養：將三級種子以10 %接種量接入總容積為150L的一級種子罐， 發酵培養基裝量100L，培養溫度45°C，攪拌速度400rpm，通風量（V/V) 1:2,罐壓0. 05Mpa， 培養時間20h ;
[0087] 所述一級、二級、三級種子培養基重量組成為：
[0088] 酵母粉0. 5%，葡萄糖1. 5%，蛋白胨0. 5%，牛肉膏0. 8%，磷酸氫二鉀1. 5%，中草 藥粉劑2 %，海藻糖3 %，硫酸鈣0. 1 %，氯化鎂0. 2 %，檸檬酸鈉0. 3 %，不足部分純凈水補 足，pH 值 10,123°C滅菌 40min ;
[0089] 所述種子罐培養基重量組成為：
[0090] 麥芽糊精15%，酵母粉0. 8%，中草藥粉劑2%，海藻糖3%，蛋白胨0. 5%，玉米漿 0. 5 %，磷酸氫二鉀1. 5 %，硫酸鎂0. 1 %，檸檬酸鈉0. 5 %，樺木木聚糖0. 8 %，不足部分純凈 水補足，pH值10,123°C滅菌40min ;
[0091] 所述種子罐發酵液菌體濃度為8. Ox IO8個/ml ;
[0092] (3)發酵罐發酵
[0093] 將步驟（2)中一級種子罐發酵液以6%接種量接入發酵罐，培養溫度45°C，攪拌速 度700rpm，通風量（V/V) 1:3,培養時間30h ;然后以2°C /h降溫速率緩慢降溫至20°C，恒溫 培養12h ;繼續以2°C /h降溫速率緩慢降溫至10°C，此時，將步驟（2)中一級種子罐發酵液 以4%接種量追加接入發酵罐，恒溫培養12h ;最后以2°C /h升溫速率緩慢升溫至20°C，恒 溫培養12h ;繼續以2°C /h升溫速率緩慢升溫至45°C，恒溫培養30h ;
[0094] 溶解氧控制：通過調整攪拌轉速及通風量，控制溶解氧30% ;
[0095] pH控制：通過補氨水或稀磷酸，控制發酵過程中pH值保持在10 ;
[0096] 補料控制：當發酵液中的還原糖含量降至3mg/ml-8mg/ml時，開始添加補料培養 基，補料量以維持發酵液還原糖含量為2mg/ml-5mg/ml ;
[0097] 放罐標準：80%菌體衰老自溶，酶活力增長緩慢；
[0098] 所述發酵培養基組成為：麥芽糊精150g，玉米粉60g，豆餅粉25g，中草藥粉劑50g， 海藻糖40g，酵母粉8g，玉米漿5g，硫酸銨3g，磷酸氫二鉀2g，磷酸二氫鉀2g，檸檬酸鈉5g， 樺木木聚糖15,消泡劑lg，純凈水lOOOmL，pH值10,121°C滅菌20min ;
[0099] 所述補料培養基重量組成為：麥芽糊精20-30 %，玉米粉10-20 %，豆粉15-25 %， 中草藥粉劑5-10%，不足部分純凈水補足，pH值5-11，121-123°C滅菌30-40min ;
[0100] 所述發酵培養基的調配方法為：
[0101] 按比例準確稱取原料，將原料中的純凈水、玉米粉、豆餅粉投入配料罐中，調節PH 值10,加入中溫淀粉酶（3u/g玉米粉）與高溫淀粉酶（30u/g玉米粉），同時邊攪拌邊升溫 至70°C保溫30min，然后緩慢升溫至90°C保溫30min進行液化，最后加入其它原料，攪拌均 勾，調初始pH值10,123°C滅菌40min備用。
[0102] (4)發酵液經過濾、濃縮、調配、精濾、干燥得耐高溫堿性木聚糖酶；
[0103] 所述調配過程不添加任何防腐劑，加入濃縮酶液總重量5%中草藥粉劑。
[0104] 2.嗜熱芽孢桿菌培養物的制備：所述嗜熱芽孢桿菌培養物的制備方法為上述 1中制備堿性木聚糖酶的發酵液經減壓濃縮、冷凍干燥、低溫粉碎而制得，其活菌含量為 9xl010CFU/g〇
[0105] 實施例2耐高溫堿性木聚糖酶酶活力的測定（3, 5-二硝基水楊酸比色法，簡稱 DNS 法）
[0106] 1.試劑和溶液
[0107] I. 1所用水除特別要求外，均為符合GB/6682-1992規定的三級水，化學藥品除 特別要求外，均為分析純。
[0108] 1.2DNS 試劑
[0109] 稱取3, 5-二硝基水楊酸IOg加入500ml水中，分多次加入氫氧化鈉16g，攪拌 溶解（溫度< 45°C )，再分多次加入酒石酸鉀鈉300g，攪拌至全溶，冷卻后用水定容至 1000ml。室溫下棕色瓶儲存暗處放置，一周后使用（如有沉淀過濾后使用）。
[0110] 1. 30. lmol/L，pH5. 0醋酸一醋酸鈉緩沖液
[0111] 吸取冰醋酸I. 8ml，加適量水，加醋酸鈉5. 78g，溶解，定容至1000ml，調節PH至 5. 00 ±0.01后使用。室溫下存放2個月有效。
[0112] L 40. 1 %即lmg/ml木糖標準溶液
[0113] 無水木糖于80°C烘至恒重，稱取0. IOOOg于燒杯中，加適量水溶解，轉入容量瓶 中并定容至l〇〇ml。
[0114] 1.51.0%木聚糖溶液
[0115] 稱取木聚糖I. OOg于燒杯中，用2ml 0. 5mol/L氫氧化鈉潤濕成糊狀，加40ml緩沖 液，于60?70°C水浴中加熱溶解，冷涼后用0. 5mol/L醋酸（約2ml)調pH5. 0,轉入容量瓶 中，加緩沖液（4. 3)定容至100ml。如果冰箱中放置時間長了出現沉淀，使用前應在熱水浴 中熱溶。
[0116] 1.6木糖標準曲線的繪制
[0117] 吸取lmg/ml木糖溶液0, 0· 2,0· 4,0· 6,0· 8,1. Oml于試管中，補水至2ml，加 DNS試 劑3ml，混合后于沸水中煮IOmin,冷卻后定容至15ml，于分光光度計540nm波長下測吸光 度（A)。以吸光度為縱坐標，木糖量為橫坐標，繪制標準曲線，三次重復試驗的均值用最小 二乘法擬合一元線性方程y = ax + b，求出吸光度與木糖量的關系。
[0118] 2.待測酶樣品的處理
[0119] 直接吸取酶液做適當稀釋，使測定光吸收值在0. 25 - 0. 4范圍內。
[0120] 3.酶活力測定
[0121] 取15ml具塞刻度試管按下面的反應順序進行操作，在反應過程中，從加入底 物（吸取前搖勻）（1. 5)開始，向每支試管中加入試劑的時間間隔要絕對一致，50°C水解 IOmin.
[0122] 反應步驟及試劑、溶液用量見表1 :
[0123] 表1反應步驟及試劑、溶液用量
[0124]
【權利要求】
1. 一種漂白復合酶，由以下重量份數的原料制備：堿性木聚糖酶10-20份，嗜熱芽孢桿 菌培養物8-10份，漆酶8-10份，葡聚糖酶5-8份，1-羥基苯并三氮唑3-8份，EDTA 3-8份， 保護劑4-7份，激活劑4-7份，甘露糖酶4-6份，脂肪酶3-5份，單寧酶3-5份，果膠酶3-5 份，白度穩定劑2-5份，非離子表面活性劑2-4份，抗氧化劑1-3份； 所述堿性木聚糖酶和嗜熱芽孢桿菌培養物均由產耐高溫堿性木聚糖酶的嗜熱芽孢桿 菌CCTCC M 2013537為出發菌株，并通過優化培養基組成和發酵工藝而制備； 所述激活劑是由如下質量組份的無機鹽均勻混合而成：硫酸鈉15-18份，氯化鋅6-8 份，氯化鎂5-8份，氯化1? 3-5份； 所述保護劑由以下重量份數的原料組成：海藻糖30-50份，靈芝多糖12-18份，NaCl 10-15 份，（NH4)2S045-9 份，半胱氨酸 3-5 份。
2. 如權利要求1所述的一種漂白復合酶，其特征在于，所述耐高溫堿性木聚糖酶的 制備方法如下：將保存完好的嗜熱芽孢桿菌CCTCC M 2013537的斜面菌種經活化和一、 二、三級種子培養以及一級種子罐培養得到種子液，以6%接種量接入發酵罐，培養溫度 37-45°C，攪拌速度 200-700rpm，通風量（V/V)l:l-3,培養時間 25-30h;然后以 1-2°C / h降溫速率緩慢降溫至15-20°C，恒溫培養10_12h ;繼續以1-2°C /h降溫速率緩慢降溫至 8-10°C，此時，將一級種子罐發酵液以4%接種量追加接入發酵罐，恒溫培養7-12h ;最后以 1-2°C /h升溫速率緩慢升溫至15-20°C，恒溫培養10_12h ;繼續以1-2°C /h升溫速率緩慢 升溫至37-45°C，恒溫培養20-30h ;發酵液經過濾、濃縮、調配、精濾、干燥得耐高溫堿性木 聚糖酶。
3. 如權利要求1所述的一種漂白復合酶，其特征在于，所述嗜熱芽孢桿菌培養物活菌 含量為 YxKT-gxKTCFU/g。
4. 如權利要求1所述的一種漂白復合酶，其特征在于，所述白度穩定劑為硫醇、硫醚、 三羥甲基磷酸、四羥甲基磷酸鹽、三羥甲基磷酸的雙磷衍生物中的一種或幾種以任意比例 均勻混合。
5. 如權利要求1所述的一種漂白復合酶，其特征在于，所述非離子表面活性劑為環保 型非離子表面活性劑。
6. 如權利要求1所述的一種漂白復合酶，其特征在于，所述抗氧化劑為葡萄籽原花青 素、迷迭香提取物和杏葉提取物中的任一一種或幾種組合。
7. 如權利要求1-6任一所述的一種漂白復合酶的制備方法，其特征在于，包括如下步 驟：首先將所述保護劑、激活劑分別超微粉碎，均勻混合，隨后立即依次加入非離子表面活 性劑、嗜熱芽孢桿菌培養物均勻混合20-30min，然后依次加入堿性木聚糖酶、漆酶、葡聚糖 酶、甘露糖酶、脂肪酶、單寧酶、果膠酶均勻混合，最后依次加入1-羥基苯并三氮唑、EDTA、 白度穩定劑、抗氧化劑，混合均勻后密封包裝即得漂白復合酶。
8. 如權利要求7所述的一種漂白復合酶的制備方法，其特征在于，所述白度穩定劑為 三羥甲基磷酸的雙磷衍生物。
9. 如權利要求7所述的一種漂白復合酶的制備方法，其特征在于，所述非離子表面活 性劑的質量組份為：烷基多苷30-40份，烷基葡萄糖酰胺15-20份，N-十二烷基乙二胺三 乙酸鈉10-15份，異構醇醚羧酸鹽AEC-110710-15份，月桂酰胺醚羧酸鹽8-10份，平平加 c-1253-5 份，JFC 3-5 份。
10.如權利要求7所述的一種漂白復合酶的制備方法，其特征在于，所述抗氧化劑為葡 萄籽原花青素、迷迭香提取物和杏葉提取物按質量比3-5:1-3:1-2均勻混合。
【文檔編號】D21C9/10GK104499337SQ201410715635
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2014年11月30日 優先權日:2014年11月30日
【發明者】邵素英 申請人:邵素英