一種即刻交聯技術用于制備大孔三維納米纖維支架的制作方法

一種即刻交聯技術用于制備大孔三維納米纖維支架的制作方法
【專利摘要】本發明提供一種利用即刻交聯技術結合靜電紡絲技術制備三維納米支架的方法，本發明得到的支架具有三維立體的結構，厚度為0.05-10mm，結構蓬松，纖維間空隙為0-30μm，孔隙大小可調，本發明操作簡便、所涉及的即刻交聯的方法解決了機械和加工性能稍差的天然生物分子進行靜電紡絲后再交聯所產生的纖維溶解、結構破壞的問題，可以獲得結構穩定、三維立體、疏松多孔的納米纖維支架，為組織再生修復中提供運載細胞、細胞因子及藥物的平臺。
【專利說明】一種即刻交聯技術用于制備大孔三維納米纖維支架
【技術領域】
[0001]本發明屬于植入性醫療器械領域，具體涉及一種即刻交聯技術用于制備大孔三維納米纖維支架。
【背景技術】
[0002]疾病和創傷常引起組織器官的損傷和功能障礙，是威脅人類健康和生命的危險因素之一。目前，對于缺損修復首選自體組織或器官移植，但這種方法供區有限。而同種異體組織器官又存在免疫排斥，異種的某些組織也被用來修復，例如骨，但存在感染的危險。在此基礎上，組織工程學發展起來了，這是一門致力于尋找修復、維持和改進組織的生物替代物的學科。它的三要素包括種子細胞、組織工程支架和生長因子。其中，支架是組織工程化組織最基本的構架。它相當于細胞外基質的作用，所以，最理想的支架是能模擬細胞外環境的，從而促進細胞的生長和定向分化。細胞外基質主要由膠原、非膠原糖蛋白、氨基聚糖與蛋白聚糖、彈性蛋白組成。膠原和彈性蛋白為結構蛋白，決定不同組織細胞外基質結構的特異性，他們大多以納米纖維的形式存在。
[0003]目前，得到納米纖維的方法主要有相分離、自組裝和靜電紡絲，在這些方法中，運用靜電紡絲的方法，可以得到IOnm到微米級的纖維絲，和其他方法比較，它具有操作簡便、效率高、可用的原材料廣泛，纖維和支架性能可調、可制作有序性結構等優點(K.Jayaraman, et al., Recent advances in polymer nanofibers, Journal ofNanoscience and Nanotechnology4(2004)52 - 65.X
[0004]在靜電紡絲過程中，高壓電源在噴射裝置及收集裝置之間形成一個高壓電場，噴射裝置可將高分子溶液推出形成液滴或液線，液滴和液線在其尖端形成泰勒錐，在合適的高壓電場的作用下形成突破液體表面張力形成射流，向著具有相反電勢的收集裝置運動。在運動過程中，溶劑揮 發，形成高分子納米線。堆積的納米線形成膜，在發射和收集裝置間形成不導電屏障，消弱了高壓電場，到一定程度時，溶液中的分子不能克服表面張力形成射流，而出現火花和滴液現象，纖維膜便不再增厚。同時，因為新到達的纖維不斷擠壓已經沉積的纖維，使得最后形成的纖維膜非常致密，越是堆積的多，越致密。這些都限制了對于其在組織工程中的運用。因而靜電紡絲支架存在的最大的問題是孔徑不夠，通常不超過 IOum,限制了細胞的擴散(Carletti, E., A.Motta, et al.(2011).Scaffoldsfor Tissue Engineering and3D Cell Culture.3D Cell Culture.J.ff.Haycock, HumanaPress.695:17-39.)。另外，傳統靜電紡絲支架難以形成三維結構，即使增設增強電場裝置，也最多能形成厚度不超過5mm的纖維團，而這樣做的代價是增大操作難度，進一步增加了纖維團的密度。
[0005]近幾年來靜電紡絲支架研究非常多，很多都是研究如何解決這幾個問題。目前研究者們主要通過光刻蝕法、浙濾法、超聲法和微-納米纖維復合法等來挺高孔徑。但這些方法有些破壞了纖維原有結構，有些使得材料內部結構不均一，甚至引入較粗的微米纖維。而研究發現，納米纖維較微米纖維更有利于細胞的生長(Shabani I, Haddad1-Asl V, Seyedjafari E.et al.1mproved infiltration of stemcells on electrospunnanofibers[J].Biochemical and Biophysical ResearchCommunications, 2009, 382 (I): 129—133.)。另外一些研究者用改變接收裝置的方法來提高孔徑，力求在不破壞靜電紡絲纖維結構的前提下提高孔徑。Blakeney等將接收裝置改成一個插著不銹鋼針的泡沫空心半球，在不銹鋼針之間得到了一種集中的、低密度、不受擠壓的棉花團樣靜電紡絲支架。對這種材料進行物理性能測試及細胞實驗，發現這種方法得到的纖維支架和傳統方法比較，孔徑和厚度都有所提高。但我們使用這種方法制作天然材料支架時發現，支架剛剛紡好時是蓬松而且較厚的，但在進行交聯處理時，發生了孔隙坍塌，材料收縮(Blakeney, B.A.，A.Tambralli, et al.(2011) ,Cell infiltration and growthin a low density, uncompressed three-dimensional electrospunnanofibrous scaffold."Biomaterials32(6):1583-1590.)。
[0006]SeemaAgarwal等介紹了一種反應靜電紡絲的方法,透明質酸在被噴出前發生交聯，靜電紡絲完畢后，得到的纖維可不用再進行交聯處理(Agarwal, S.，J.H.Wendorff, etal.(2009)."Progress in the Field of Electrospinning for Tissue EngineeringApplications."Advanced Materials21 (32-33):3343-3351.)。這種即刻交聯可發生在靜電紡絲前，也可發生在靜電紡絲時。Xu等就是通過加入光交聯劑，紫外照射噴射中的絲，在沉積前發生交聯反應(Xu, X.，J.-F.Zhang, et al.(2010)."Fabrication of Cross-LinkedPolyethyleneimine Microfibers by Reactive Electrospinning with In SituPhoto-Cross-Linking by UV Radiation.^Biomacromoleculesll (9):2283-2289.)。若將可得到蓬松結構的收集裝置加上反應靜電紡絲的方法，即可避免后期交聯導致的結構坍塌，但是這種方法所用技術較為復雜。

【發明內容】

[0007]針對現有技術的以上缺陷或技術需求，本發明的目的是提供一種利用即刻交聯技術結合靜電紡絲技術制備大孔三維納米支架的方法，本發明操作簡便、所涉及的即刻交聯的方法解決了機械和加工性能 稍差的天然生物分子進行靜電紡絲后再交聯所產生的纖維溶解、結構破壞的問題，可以獲得結構穩定、三維立體、疏松多孔的納米纖維支架。為組織再生修復中提供運載細胞、細胞因子及藥物的平臺。
[0008]本發明的具體技術方案如下:
[0009]一種制備大孔三維納米纖維支架的方法，其特征在于:步驟如下:
[0010](I)將生物大分子材料溶于有機溶劑中，配制成質量濃度為6-20%的靜電紡絲溶液，其中生物大分子為絲素蛋白和/或殼聚糖；
[0011](2)將上步所得的靜電紡絲溶液進行靜電紡絲，然后在甲醇和/或乙醇溶液中收集，得到大孔三維納米纖維粗品；
[0012](3)對上步所得粗品進行中和、清洗，除去樣品中殘留的有機溶劑，干燥得到大孔三維納米纖維支架。
[0013]所述步驟I中有機溶劑為三氟乙酸、二氯甲烷、六氟異丙醇的一種或幾種的混合物。
[0014]所述步驟I中絲素蛋白與殼聚糖可按任意比例混合。[0015]所述步驟2中靜電紡絲的電壓為16-30kv，給液速度為0.0005-0.003mm/s，收集距離為 7_15cm。
[0016]所述步驟2中甲醇和/或乙醇溶液中還可包括交聯劑。
[0017]所述交聯劑為京尼平和/或戊二醛，其中京尼平在甲醇和/或乙醇溶液中的濃度為0.l-10mg/ml，戊二醛在甲醇和/或乙醇溶液中的濃度為0.25-2.5w/v%，或者兩者之間在上訴濃度范圍內按任意比例混合的混合物。
[0018]所述步驟2中靜電紡絲溶液中的絲素蛋白和/或殼聚糖與甲醇和/或乙醇溶液的比例為 Ig:300-1500ml。
[0019]所述步驟2中收集方法可以是:在現有靜電紡絲裝置的噴射裝置下方放置不導電容器，容器中盛有配置好的具有交聯效應的乙醇和/或甲醇溶液。不導電容器放在導電平臺上。通過這種收集方法，可得到無序取向性的大孔三維納米纖維支架。
[0020]所述步驟2中收集還可以方法是:在配置好的具有交聯效應的乙醇和/或甲醇溶液的氛圍下用滾筒收集法收集樣品；所述滾筒收集法中滾筒筒體水平放置，滾筒體積的1/3-1/2浸沒在乙醇中。通過這種收集方法，可得到有序取向性的大孔三維納米纖維支架。
[0021]本發明主要以運用廣泛、經濟實用的靜電紡絲技術為基礎，對靜電紡絲制作組織工程支架過程中產生的問題進行改進。
[0022]最基本的靜電紡絲裝置包括:高壓電源、噴射裝置及收集裝置，高壓電源在噴射裝置及收集裝置之間形成一個高壓電場，噴射裝置可將高分子溶液推出形成液滴或液線，液滴和液線在其尖端形成泰勒錐，在合適的高壓電場的作用下形成突破液體表面張力形成射流，向著具有相反電勢的收集裝置運動。在運動過程中，溶劑揮發，形成高分子納米線。
[0023]這些納米線經過各種巧妙的收集裝置可獲得組織工程所需的蓬松立體纖維團。但當使用組織工程中常用的生物大分子制作蓬松立體纖維團后，對其進行交聯處理時，其結構沒法維持。例如本發明選用的殼聚糖及絲素蛋白，在靜電紡絲所用溶液中時主要以不穩定的結構存在，分子和分子間結合力量很弱，對于絲素蛋白來說主要存在無規卷曲和α-螺旋結構兩種不穩定構象。靜電紡絲是個物理力學的作用的過程，噴出的射流中，分子和分子相互纏繞形成纖維，所以纖維內部結構不牢固。交聯是讓分子內部和分子間形成穩定的結合，如醇溶液可將絲素蛋白中的無規卷曲和α_螺旋結構變成穩定的β_折疊結構，戊二醛、京尼平可通過化學反應使殼聚糖與殼聚糖之間、絲素蛋白與絲素蛋白之間以及殼聚糖與絲素蛋白之間形成穩定而牢固的化學結合，使其在組織工程的運用中保持一定的穩定性。但對蓬松立體的纖維進行交聯時，纖維內部分子的緊密結合，導致了孔隙及支架整體的收縮。而靜電紡絲中的即刻交聯是避免這種現象的一種方法。
[0024]絲素蛋白及殼聚糖作為組織工程常用原材料，具有來源廣、生物相容性好、機械加工性能佳的優勢，絲素蛋白在醇溶液中可發生物理交聯。京尼平及戊二醛是常用生物材料交聯劑，具有低毒的特性。絲素蛋白和殼聚糖都可被上述兩種交聯劑交聯。
[0025]在殼聚糖和/或絲素蛋白的納米纖維浸入到具有交聯作用的甲醇和/或乙醇溶液之中后，納米纖維中的大分子會在液體的作用下即刻交聯，使得納米纖維中的大分子變成穩定的空間構象。
[0026]例外，在利用靜電紡絲取得有序取向性的納米纖維時，為了取得更有序的纖維，通常需要提高滾筒速度來提高牽拉力，達到拉得更直的目的，但對于很多生物大分子來說，交聯變成更穩定牢固的結構之前，其機械性能通常非常差。對于傳統的靜電紡絲，滾筒收集的纖維常常由未交聯的分子形成，當速度提高到一定的時候，這些纖維很容易被拉斷。而把滾筒置于具有交聯作用的甲醇和/或乙醇溶液之中后，落在其中的纖維即刻被交聯，纖維內部分子形成穩定牢固的結合，纖維的機械性能提高，一定范圍內，即使提高轉速提高滾筒對其的牽拉力量，也不容易被拉斷。同時，因為醇溶液的存在，使得這種方法收集的有序纖維變得蓬松，纖維的厚度也因此提高，最終形成的納米纖維支架不但有序而且具有穩定的大孔三維結構。
[0027]綜上所述，本領域中存在著提供簡易的即刻交聯技術以獲得大孔三維納米纖維支架用于組織工程領域的技術需求。
[0028]本方法收集得到的纖維支架特點是纖維直徑在IOnm到10 μ m之間，可以是有取向性的纖維也可以是無取向性的纖維。在紡絲浸入具有交聯作用的甲醇和/或乙醇溶液的同時被即刻交聯，最終形成的支架具有三維立體的結構，厚度為0.05-10mm，結構蓬松，纖維間空隙為0-30 μ m,平均孔隙大小可調，經過漂洗干燥處理后，結構基本能維持。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0029]圖1為實施例1制備大孔三維無序納米纖維支架的過程示意圖；
[0030]圖2為使用液體浴即刻交聯技術制備的再生絲素蛋白支架的傅立葉紅外光譜圖；
[0031]圖3為實施例2使用滾筒收集法制備大孔三維有序取向性納米纖維支架的過程示意圖；
[0032]1-靜電紡絲設備，2-裝有甲醇和/或乙醇的器皿，3-滾筒。
【具體實施方式】
[0033]實施實例一:
[0034]1、將蠶繭剪成Icm2的小塊，用質量分數為0.5%的碳酸鈉溶液500mL煮沸1.5小時，用去離子水清洗干凈，再在500mL去離子水中煮沸0.5h，用去離子水洗凈后烘干。往處理后的蠶絲中加入約60mL氯化鈣/水/乙醇三相溶液(三種物質的摩爾比為1/8/2)，在70°C水浴攪拌I小時使得蠶絲完全溶解，再對所得的溶液透析48小時。透析完畢后的溶液在8000r/min的條件下離心30min后過濾，過濾得到的溶液進行液氮冷凍后干燥48小時，最后得到再生絲素蛋白。
[0035]2、將2g再生絲素蛋白溶解在Sg質量比為3:7的二氯甲烷和三氟乙酸的混合溶液中，配制再生絲素蛋白質量分數為20%的靜電紡絲所用溶液。
[0036]通過靜電紡絲設備進行靜電紡絲，利用液體浴收集法進行收集。如圖1所示，此實例中的液體浴收集方法可以得到無取向性的納米纖維支架粗品。
[0037]本實例所述液體浴收集法的實現方式是將600ml乙醇加入直徑為20cm，高3cm的底部鋪有導電錫箔紙的玻璃皿，使得再生絲素蛋白與乙醇的比例為lg:300ml，乙醇的低表面張力特性可以使得靜電紡絲所產生的紡絲可以浸入乙醇當中，在進入乙醇的同時乙醇可以即刻轉變再生絲素蛋白的構象以進行即刻交聯，使得蠶絲蛋白所構成的紡絲變成穩定的狀態，如2所示，采用液體浴即 刻交聯技術所制備的再生絲素蛋白支架的紅外光譜圖顯示，再生絲素蛋白的構象已經是可以穩定存在的β-折疊結構。[0038]同時調節靜電紡絲使用電壓為16kv、給液速度為0.0005mm/s、收集距離為7cm。在上述條件下進行不同時間的靜電紡絲，可以收集不同厚度的樣品。
[0039]3、取下粗品，放入7%的氨水溶液中浸泡30min，再用去離子水漂洗3_6遍，最后進行冷凍干燥。
[0040]4、將無取向性納米纖維支架用紫外光、75%乙醇或環氧乙烷消毒。培養基浸泡后接種骨髓基質干細胞、IPS細胞、胰細胞、肝細胞、軟骨細胞等，進行誘導、培養數周。將長有細胞的支架植入胰臟、肝臟、椎間盤、關節軟骨等處。
[0041]實施例二
[0042]1、將蠶繭剪成Icm2的小塊，用質量分數為0.5%的碳酸鈉溶液500mL煮沸1.5小時，用去離子水清洗干凈，再在500mL去離子水中煮沸0.5h，用去離子水洗凈后烘干。往處理后的蠶絲中加入約60mL氯化鈣/水/乙醇三相溶液(三種物質的摩爾比為1/8/2)，在70°C水浴攪拌I小時使得蠶絲完全溶解，再對所得的溶液透析48小時。透析完畢后的溶液在8000r/min的條件下離心30min后過濾，過濾得到的溶液進行液氮冷凍后干燥48小時，最后得到再生絲素蛋白。
[0043]2、將0.5g再生絲素蛋白及0.5g殼聚糖混合溶解在9g質量比為3:7的二氯甲烷和三氟乙酸的混合溶液中，配制混合物質量分數為10%的靜電紡絲所用溶液。
[0044]通過靜電紡絲設備進行靜電紡絲，利用液體浴收集法進行收集。如圖1所示，此實例中的液體浴收集方法可以得到無取向性的納米纖維支架粗品。
[0045]其具體操作方法是:將直徑20cm，高3cm的玻璃皿盛300ml甲醇和300ml乙醇，加入京尼平使其濃度為0.lmg/ml,最終絲素蛋白殼聚糖混合物和混合醇溶液的比例為lg:600ml，在培養皿底部鋪一層錫紙；混合醇溶液的低表面張力特性可以使得靜電紡絲所產生的絲素蛋白殼聚糖混合絲浸入當中，在進入溶液的同時即刻交聯，使得絲素蛋白本身構象改變成穩定的β_折疊， 同時蠶絲蛋白與絲素蛋白、殼聚糖與殼聚糖、以及絲素蛋白與殼聚糖之間形成穩固的化學結合。
[0046]同時調節靜電紡絲使用電壓為16kv、給液速度為0.0005mm/s、收集距離為7cm。在上述條件下進行不同時間的靜電紡絲，可以收集不同厚度的樣品。
[0047]3、取下粗品，放入7%的氨水溶液中浸泡30min，再用去離子水漂洗3_6遍，最后進行冷凍干燥。
[0048]4、將無取向性納米纖維支架用紫外光、75%乙醇或環氧乙烷消毒。培養基浸泡后接種骨髓基質干細胞、IPS細胞、胰細胞、肝細胞、軟骨細胞等，進行誘導、培養數周。將長有細胞的支架植入胰臟、肝臟、椎間盤、關節軟骨等處。
[0049]實施例三
[0050]1、將蠶繭剪成Icm2的小塊，用質量分數為0.5%的碳酸鈉溶液500mL煮沸1.5小時，用去離子水清洗干凈，再在500mL去離子水中煮沸0.5h，用去離子水洗凈后烘干。往處理后的蠶絲中加入約60mL氯化鈣/水/乙醇三相溶液(三種物質的摩爾比為1/8/2)，在70°C水浴攪拌I小時使得蠶絲完全溶解，再對所得的溶液透析48小時。透析完畢后的溶液在8000r/min的條件下離心30min后過濾，過濾得到的溶液進行液氮冷凍后干燥48小時，最后得到再生絲素蛋白。
[0051]2、將0.75g再生絲素蛋白及0.25g殼聚糖混合溶解在9g質量比為3:7的二氯甲烷和三氟乙酸的混合溶液中，配制混合物質量分數為10%的靜電紡絲所用溶液。
[0052]通過靜電紡絲設備進行靜電紡絲，利用液體浴收集法進行收集。如圖1所示，此實例中的液體浴收集方法可以得到無取向性的納米纖維支架粗品。
[0053]其具體操作方法是:將直徑20cm，高3cm的玻璃皿盛300ml甲醇和600ml乙醇，加入戊二醛使其濃度為2.5w/v%，最終絲素蛋白殼聚糖混合物和混合醇溶液的比例為lg:900ml，在培養皿底部鋪一層錫紙；混合醇溶液的低表面張力特性可以使得靜電紡絲所產生的絲素蛋白殼聚糖混合絲浸入當中，在進入溶液的同時即刻交聯，使得絲素蛋白本身構象改變成穩定的β_折疊，同時蠶絲蛋白與絲素蛋白、殼聚糖與殼聚糖、以及絲素蛋白與殼聚糖之間形成穩固的化學結合。
[0054]同時調節靜電紡絲使用電壓為25kv、給液速度為0.0Olmm/s、收集距離為10cm。在上述條件下進行不同時間的靜電紡絲，可以收集不同厚度的樣品。
[0055]3、取下粗品，放入7%的氨水溶液中浸泡30min，再用去離子水漂洗3_6遍，最后進行冷凍干燥。
[0056]4、將無取向性納米纖維支架用紫外光、75%乙醇或環氧乙烷消毒。培養基浸泡后接種骨髓基質干細胞、IPS細胞、胰細胞、肝細胞、軟骨細胞等，進行誘導、培養數周。將長有細胞的支架植入胰臟、肝臟、椎間盤、關節軟骨等處。
[0057]實施例四
[0058]1、將蠶繭剪成Icm2的小塊，用質量分數為0.5%的碳酸鈉溶液500mL煮沸1.5小時，用去離子水清洗干凈，再在500mL去離子水中煮沸0.5h，用去離子水洗凈后烘干。往處理后的蠶絲中加入約60mL氯化鈣/水/乙醇三相溶液(三種物質的摩爾比為1/8/2)，在70°C水浴攪拌I小時使得蠶絲完全溶解，再對所得的溶液透析48小時。透析完畢后的溶液在8000r/min的條件下離 心30min后過濾，過濾得到的溶液進行液氮冷凍后干燥48小時，最后得到再生絲素蛋白。
[0059]2、將0.3g再生絲素蛋白及0.3g殼聚糖混合溶解在9.4g六氟異丙醇溶劑中，配制混合物質量分數為6%的靜電紡絲所用溶液。
[0060]3、通過靜電紡絲設備進行靜電紡絲，利用液體浴滾筒收集法進行收集。如圖3所示，此實例中的液體浴滾筒收集方法可以得到有取向性的納米纖維支架粗品。
[0061]其中液體浴滾筒收集法的具體操作方法是:將直徑20cm，高2cm的玻璃皿盛600ml乙醇，加入京尼平使其濃度為10mg/ml,最終絲素蛋白殼聚糖混合物和乙醇溶液的比例為lg: 1000ml，在玻璃皿底部鋪一層錫紙；所用滾筒是直徑為3cm，高5cm的滾筒，其表面包裹一層錫箔紙，利用馬達旋轉驅動滾筒旋轉。將滾筒放置于培養皿中，滾筒的浸沒體積為1/2。混合醇溶液的低表面張力特性可以使得靜電紡絲所產生的絲素蛋白殼聚糖混合絲浸入當中，在進入溶液的同時即刻交聯，使得絲素蛋白本身構象改變成穩定的β_折疊，同時蠶絲蛋白與絲素蛋白、殼聚糖與殼聚糖、以及絲素蛋白與殼聚糖之間形成穩固的化學結合。
[0062]調節電壓為25kv、給液速度為0.001mm/s、收集距離為IOcm,滾筒在液體浴中以20Hz的頻率轉動。在上述條件下進行不同時間的靜電紡絲，可以在滾筒上收集不同厚度的粗品。
[0063]4、取下粗品，用去離子水漂洗3-6遍，最后進行冷凍干燥。
[0064]5、將有取向性 納米纖維支架用紫外光、75%乙醇或環氧乙烷消毒。培養基浸泡后接種骨髓基質干細胞、IPS細胞、骨細胞、神經細胞、肌腱細胞、牙周膜干細胞、肌細胞等，進行誘導、培養數周。將長有細胞的支架植入骨、神經、肌腱、牙周膜、肌肉等缺損處。
[0065]實施例五
[0066]1、將蠶繭剪成Icm2的小塊，用質量分數為0.5%的碳酸鈉溶液500mL煮沸1.5小時，用去離子水清洗干凈，再在500mL去離子水中煮沸0.5h，用去離子水洗凈后烘干。往處理后的蠶絲中加入約60mL氯化鈣/水/乙醇三相溶液(三種物質的摩爾比為1/8/2)，在70°C水浴攪拌I小時使得蠶絲完全溶解，再對所得的溶液透析48小時。透析完畢后的溶液在8000r/min的條件下離心30min后過濾，過濾得到的溶液進行液氮冷凍后干燥48小時，最后得到再生絲素蛋白。
[0067]2、將0.2g再生絲素蛋白及0.4g殼聚糖混合溶解在9.4g六氟異丙醇溶劑中，配制混合物質量分數為6%的靜電紡絲所用溶液。
[0068]3、通過靜電紡絲設備進行靜電紡絲，利用液體浴滾筒收集法進行收集。如圖3所示，此實例中的液體浴滾筒收集方法可以得到有取向性的納米纖維支架粗品。
[0069]其中液體浴滾筒收集法的具體操作方法是:將直徑20cm，高3cm的玻璃皿盛900ml甲醇，加入戊二醛使其濃度為0.25w/v%，最終絲素蛋白殼聚糖混合物和甲醇溶液的比例為lg: 1500ml，在玻璃皿底部鋪一層錫紙；所用滾筒是直徑為3cm，高5cm的滾筒，其表面包裹一層錫箔紙，利用馬達旋轉驅動滾筒旋轉。將滾筒放置于盛滿乙醇的玻璃皿中，滾筒的浸沒體積為1/2。
[0070]調節電壓為30kv、給液速度為0.003mm/s、收集距離為15cm,滾筒在液體浴中以20Hz的頻率轉動。在上述條件下進行不同時間的靜電紡絲，可以在滾筒上收集不同厚度的粗品。混合醇溶液的低表面張力特性可以使得靜電紡絲所產生的絲素蛋白殼聚糖混合絲浸入當中，在進入溶液的同時即刻交聯，使得絲素蛋白本身構象改變成穩定的β_折疊，同時蠶絲蛋白與絲素蛋白、殼聚 糖與殼聚糖、以及絲素蛋白與殼聚糖之間形成穩固的化學結合。
[0071]4、取下粗品，用去離子水漂洗3-6遍，最后進行冷凍干燥。
[0072]5、將有取向性納米纖維支架用紫外光、75%乙醇或環氧乙烷消毒。培養基浸泡后接種骨髓基質干細胞、IPS細胞、骨細胞、神經細胞、肌腱細胞、牙周膜干細胞、肌細胞等，進行誘導、培養數周。將長有細胞的支架植入骨、神經、肌腱、牙周膜、肌肉等缺損處。
[0073]實施例六
[0074]1、將0.6g殼聚糖溶解在六氟異丙醇溶劑中，配制質量分數為6%的靜電紡絲所用溶液。
[0075]2、通過靜電紡絲設備進行靜電紡絲，利用液體浴滾筒收集法進行收集。如圖3所示，此實例中的液體浴滾筒收集方法可以得到有取向性的納米纖維支架粗品。
[0076]其中液體浴滾筒收集法的具體操作方法是:將京尼平加入450ml乙醇，配置成2mg/ml的京尼平乙醇溶液，將戊二醛加入450ml甲醇，配置成2w/v%的戊二醛醇溶液，將二者混合到直徑20cm，高3cm的玻璃皿中，最終殼聚糖和混合醇溶液的比例為lg:1500ml，在玻璃皿底部鋪一層錫紙；所用滾筒是直徑為3cm，高5cm的滾筒，其表面包裹一層錫箔紙，利用馬達旋轉驅動滾筒旋轉。將滾筒放置于盛有900ml京尼平和戊二醛混合醇溶液的玻璃皿中，滾筒的浸沒體積為1/2。混合醇溶液的低表面張力特性可以使得靜電紡絲所產生的殼聚糖纖維浸入當中，在進入溶液的同 時即刻交聯，使得殼聚糖與殼聚糖分子之間形成穩固的化學結合。
[0077]調節電壓為30kv、給液速度為0.003mm/s、收集距離為15cm,滾筒在液體浴中以20Hz的頻率轉動。在上述條件下進行不同時間的靜電紡絲，可以在滾筒上收集不同厚度的粗品。
[0078]3、取下粗品，用去離子水漂洗3-6遍，最后進行冷凍干燥。
[0079]4、將有取向性納米纖維支架用紫外光、75%乙醇或環氧乙烷消毒。培養基浸泡后接種骨髓基質干細胞、IPS細胞、骨細胞、神經細胞、肌腱細胞、牙周膜干細胞、肌細胞等，進行誘導、培養數周。將長有細胞的支架植入骨、神經、肌腱、牙周膜、肌肉等缺損處。
[0080]本實施例中使用的 靜電紡絲設備為現有技術。
【權利要求】
1.一種制備大孔三維納米纖維支架的方法，其特征在于:步驟如下: (1)將生物大分子材料溶于有機溶劑中，配制成質量濃度為6-20%的靜電紡絲溶液，其中生物大分子為絲素蛋白和/或殼聚糖； (2)將上步所得的靜電紡絲溶液進行靜電紡絲，然后在甲醇和/或乙醇溶液中收集，得到大孔三維納米纖維粗品； (3)對上步所得粗品進行中和、清洗，除去樣品中殘留的有機溶劑，干燥得到大孔三維納米纖維支架。
2.如權利要求1所述的制備大孔三維納米纖維支架的方法，其特征在于:所述步驟I中有機溶劑為三氟乙酸、二氯甲烷、六氟異丙醇的一種或幾種的混合物。
3.如權利要求1所述的制備大孔三維納米纖維支架的方法，其特征在于:所述步驟2中靜電紡絲的電壓為16_30kv，給液速度為0.0005-0.003 mm/s，收集距離為7_15cm。
4.如權利要求1所述的制備大孔三維納米纖維支架的方法，其特征在于:所述步驟2中甲醇和/或乙醇溶液中還包括交聯劑。
5.如權利要求4所述的制備大孔三維納米纖維支架的方法，其特征在于: 所述交聯劑為京尼平和/或戊二醛，其中京尼平在甲醇和/或乙醇溶液中的濃度為0.l-10mg/ml，戊二醛在甲醇和/或乙醇溶液中的濃度為0.25-2.5w/v%，或者兩者之間在上述濃度范圍內按任意比例混合的混合物。
6.如權利要求1所述的制備大孔三維納米纖維支架的方法，其特征在于:所述步驟(2)中靜電紡絲溶液中的絲素蛋白和/`或殼聚糖與甲醇和/或乙醇溶液的比例為Ig:300-1500ml。
【文檔編號】D01D5/00GK103861145SQ201410085109
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2014年3月10日 優先權日:2014年3月10日
【發明者】王家偉, 丁慧芬 申請人:武漢大學