專利名稱：一種新型脂肪酶基因和脂肪酶生產菌株及應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及酶法脫墨領域，具體涉及一種新型脂肪酶基因和生產該酶的畢赤酵母菌株及該基因和畢赤酵母菌株在廢舊新聞紙脫墨中的應用。
背景技術：
制漿造紙行業是國民經濟的支柱產業，近年來為了緩解資源、能源及環保方面的壓力，紛紛將目光轉向二次纖維的再利用，而隨著在紙循環中最終消費者的更多參與，提供了更多的舊報紙(ONP)。ONP回收再利用的關鍵是脫墨。傳統的化學脫墨由于采用大量強堿性化學藥品，使脫墨廢水COD值高，污染負荷大；另外化學脫墨效率低，纖維強度損失大、脫墨漿品質差等弊端隨著廢紙使用量的大幅提高及廢紙種類的復雜化日趨明顯。生物酶法脫墨是利用纖維素酶、木聚糖酶、脂肪酶的一種或多種酶制劑替代化學藥品處理廢紙，實踐證明此法可有效提聞油墨脫除效率，提聞脫墨楽■的白度和得率，改善脫墨楽■的物理性能，更 為重要的是可有效降低廢水的污染負荷，屬當前制漿造紙行業急需的綠色環保型項目。目前，國內僅有少數專利提出了酶法脫墨，大部分提出的生物脫墨劑主要成分均為纖維素酶、木聚糖酶。這兩種酶用于脫墨，由于本身直接作用纖維素本身，引起紙漿纖維分解，所以存在降低紙漿難度和得率的不足。1998 年，Ming Chuan Hong 等學者從抗福射不動桿菌 CMC-1 (Achetobacterradioresistens CMC-I lipase)中發現了一種喊性脂肪酶，它的分子量 45kDa (SDS-PAGE測定)，等電點約5. 2，最適反應條件為中溫堿性環境，以三油酰甘油酯為底物時表現出1，3位特異性。在堿性環境中，這種脂肪酶表現出很高的PH適性和穩定性，并且不受Fe2+、Ca2+、Mg2+、Ni2+、Cu2+、Mn2+、Cd2+等金屬離子的影響，在以及EDTA、2_巰基乙醇、二硫蘇糖醇等有機溶劑中顯示出高穩定性。1998年，TA-JUNG WANG等以抗輻射不動桿菌作為生產菌株進行批次發酵生產ARL，產量為30U/mL。2001年，Chen-You Li等以吐溫80為碳源進行抗輻射不動桿菌補料批次發酵實驗，ARL產量也僅達到120U/mL。但此后并沒有看到關于更多該酶應用于生產的報道，其原因可能在于在原始菌株的表達量低因而限制了其作為工業用酶制劑的進一步開發。
發明內容
本發明的目的之一在于克服現有技術的缺點與不足，提供一種新型脂肪酶基因，該新型脂肪酶基因能夠在畢赤酵母中高效表達。本發明的另一目的在于提供一種含上述新型脂肪酶基因的質粒。本發明的再一目的在于提供一種攜帶上述新型脂肪酶基因的菌株。本發明的又一目的在于提供一種脂肪酶生產菌株。本發明的目的還在于提供上述新型脂肪酶基因的應用。本發明的目的通過下述技術方案實現一種新型脂肪酶基因，其核苷酸序列如SEQID NO. I 所示。
所述的新型脂肪酶基因的核苷酸序列是以美國國立生物技術信息中心(NCBI，http://www. ncbi. nlm. nih. gov/)上公布的 Achetobacter radioresistens CMC-Ilipase(GenBank:AF073953. I)基因序列為基礎，對該序列進行優化，替換成畢赤酵母偏好的密碼子，再通過全基因合成得到。該新型脂肪酶基因能夠在畢赤酵母中高效表達。一種含新型脂肪酶基因的質粒pPICZ a A-ARL，通過將新型脂肪酶基因連入到畢赤酵母表達質粒pPICZ a中得到。一種攜帶新型脂肪酶基因的菌株大腸桿菌T0P10/pPICZaA-ARLEscherichiacoli TOPlO/pPICZ a A-ARL，該菌株于2012年8月14日在中國典型培養物保藏中心保藏，保藏號為CCTCC NO M 2012309，保藏地址為湖北省武漢市武漢大學(430072)。所述的菌株Escherichia coli TOPlO/pPICZ a A-ARL 攜帶質粒 pPICZ a A-ARL。一種脂肪酶生產菌株Pichia Pastoris X33/pPICZ a A-ARL,通過將質粒·pPICZ a A-ARL轉化畢赤酵母宿主菌Pichia Pastoris X33得到。上述新型脂肪酶基因、質粒pPICZ a A-ARL、菌株 Escherichia coli T0P10/pPICZ a A-ARL或菌株Pichia Pastoris X33/pPICZ a A-ARL在廢舊新聞紙脫墨中的應用。畢赤酵母是甲醇營養型酵母中的一類酵母菌，可以利用甲醇作為唯一碳源和能源。作為真核表達系統，具有許多其它蛋白表達系統所不具備的優點具有強有力的乙醇氧化酶(A0X1)基因啟動子，可嚴格調控外源蛋白的表達；酵母生長繁殖速度快、營養要求低、培養基廉價；外源基因能通過質粒整合到畢赤酵母基因組上，外源基因不會發生隨生長繁殖而丟失；表達量高，許多蛋白可達到每升克級以上；同時，畢赤酵母自身分泌的蛋白(背景蛋白)非常少，有利于純化。本發明相對于現有技術具有如下的優點及效果(I)本發明提供的新型脂肪酶基因經密碼子優化后在畢赤酵母中可實現高表達，活力為2500U/mL,表達的脂肪酶具有耐中聞溫、耐喊性質。(2)本發明提供的菌株Pichia Pastoris X33/pPICZ a A-ARL生產的脂肪酶用于廢舊新聞紙(ONP)脫墨，試驗證明，所得紙漿白度為51. 49%IS0，殘余油墨值472. 06mg/kg,撕裂度14. 32mN. m2/g，耐破度2. 41KPa. m2/g，抗張強度30. 52N. m/g。同時，使用該脂肪酶脫墨，大大減少廢水中的化學需氧量(Chemical Oxygen Demand, COD)等污染物的排放,脫墨廢水中，固體懸浮物 SS (suspend solid)為 187. 69mg/L,COD 為 269. 50mg/L,總有機碳 TOC(Total organic carbon) 3. 24g/L,廢水負荷指標低于化學法脫墨50%以上。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限于此。實施例I新型脂肪酶基因的合成以美國國立生物技術信息中心(NCBI, http://www. ncbi. nlm. nih. gov/)上公布的 Achetobacter radioresistens CMC-Ilipase (GenBank:AF073953. I)基因序列為基礎，對該序列進行優化，替換成畢赤酵母偏好的密碼子得到新型脂肪酶基因，其序列如SEQ IDNO. I所示，再通過生物技術公司(金斯瑞生物科技有限公司)全基因合成將新型脂肪酶基因克隆到PUC57質粒上得到質粒pUC57-ARL。實施例2含新型脂肪酶基因的質粒pPICZ a A-ARL及攜帶新型脂肪酶基因的菌株Escherichia coli TOPlO/pPICZ a A-ARL 的構建(I)根據新型脂肪酶基因的序列設計擴增該基因的引物上游引物Fl 5 -CGGAATTCTGTAATGACGACCACGACGA-3，,含 EcoRI 酶切位點(以下劃線示出)以及保護堿基；下游引物Rl :5 ’ -ATTAAATAGCGGCCGCCTGAATTGGCATAAGACT-3，，含 NotI 酶切位點(以下劃線示出)以及保護堿基。(2)以實施例I中的質粒PUC57-ARL為模板、Fl和Rl為引物進行PCR擴增；PCR擴增程序94°C預變性2min ;94°C變性30s，55。。退火30s, 68°C延伸90s，共30個循環；第30個循環68°C延伸7min。(3)將 PCR 產物和質粒 pPICZ a A (購自 Invitrogen)用 EcoR I 和 Not I 雙酶切，16°C下用T4連接酶連接過夜。 (4)連接產物轉化大腸桿菌宿主菌T0P10，經Zecoin (博萊霉素)抗性平板篩選陽性轉化子，轉化子提取質粒經雙酶切(EcoR I和Not I雙酶切)鑒定正確后得到重組質粒pPICZa A-ARL。鑒定正確的陽性轉化子即為攜帶新型脂肪酶基因的菌株大腸桿菌TOPlO/pPICZ a A-ARL Escherichia coli TOPlO/pPICZ a A-ARL，該菌株于 2012 年 8 月 14 日在中國典型培養物保藏中心保藏，保藏號為=CCTCC NO M 2012309，保藏地址為湖北省武漢市武漢大學(430072)。實施例3脂肪酶生產菌株Pichia Pastoris X33/pPICZ a A-ARL的構建采用氯化鋰(LiCl)法將線性化的實施例2的pPICZ a A-ARL (使用Sac I酶酶切)質粒轉化 Pichia pastoris X33(購自 Invitrogen),在 0. I 2mg/mL 的 Zeocin(博萊霉素)抗性YPD平板進行篩選。以篩選得到的轉化子的基因組DNA作為模板，上游引物Fl和下游引物Rl為引物進行PCR鑒定，PCR鑒定正確的轉化子為脂肪酶生產菌株Pichia PastorisX33/pPICZa A-ARL。實施例4Pichia Pastoris X33/pPICZ a A-ARL 發酵生產脂肪酶挑取Pichia Pastoris X33/pPICZ a A-ARL 單菌落接種到 YI3D 搖瓶中，30 °C、250rpm培養約20h進行菌種活化；將活化的菌液按6% (體積百分比)比例再接種到YPD搖瓶中30°C、250rpm培養約20h ;接著采用火焰接種法按8% (體積百分比)的比例接種到IOL裝有BSM培養基的發酵罐中(初始發酵體積5L)，并加入4. 35mL/L PTMl補充鹽溶液，開始發酵。甘油批式發酵階段，用質量百分濃度25%氨水控制pH為5. 5，通氣約10L/min，培養溫度為30°C。培養約19h時開始流加50% (w/v)甘油(含PTMl 12mL/L),甘油補料速率約
11.lgPh'培養至菌體達一定濃度(OD6tltlS 120 200左右)。甘油補料完后用質量百分濃度25%氨水調節pH至6. 0，溫度降至25°C，饑餓約30min至發酵液中殘余甘油耗盡(以溶氧數值穩定為指標)，開始進行甲醇誘導。誘導初期先用較慢流速(10 15g/h)流加甲醇，待發酵液中細胞適應甲醇后，約每2h適當增加甲醇流加速率，最終甲醇補料約為30±2g/h。發酵液中脂肪酶酶酶活為2500U/mL。該發酵液上清可直接作為脂肪酶酶液應用于后續的ONP脫墨處理。脂肪酶酶活的測定原理脂肪酶在一定條件下水解底物對硝基苯酚酯，生成對硝基苯酚和脂肪酸，在一定范圍內對硝基苯酚的量和反應液顏色深淺成正比，在405nm下測其吸光度，從而計算出脂肪酶酶活。脂肪酶酶活的測定方法酶液加蒸餾水稀釋至適當的稀釋倍數，取50 于900 u LTris-HCl緩沖液(pH9. 0)，加入50 y L50mM的對硝基苯酚辛酸酯，50°C下準確反應5min,立即拿出流水冷卻后,離心后在405nm下測定其吸光度,根據被測液的吸光度，由對硝基苯酚標準曲線計算樣品中的對硝基苯酚的濃度，計算脂肪酶酶活。脂肪酶酶活力的定義為在50°C、pH9. 0的條件下，每分鐘從50mM的對硝基苯酚辛酸酯溶液中降解釋放Imol對硝基苯酚所需要的酶量為一個酶活力單位。實施例5脂肪酶的酶學性質測定本實施例采用的脂肪酶為實施例4發酵后的發酵液上清。(I)脂肪酶的最適pH值·
使用不同pH 緩沖液(6. 0,7. 0,8. 0,9. 0,10. 0,11. 0) (pH 彡 9. 0 用 Tris-HCl 緩沖液，pH>9. 0用甘氨酸氫氧化鈉溶液)分別配制50mM的對硝基苯酚辛酸酯底物溶液和稀釋脂肪酶酶液，測定脂肪酶在各種不同PH值下的相對酶活。脂肪酶在堿性條件有很好的活性，最適作用pH值為9. 0，在pH8. 0酶活均為最大的85%左右。(2)脂肪酶的最適溫度在30°C、35°C、40°C、45°C、5(rC、55°C、6(rC、65°C，pH9. 0 的條件下測定脂肪酶的
相對酶活。在PH9.0下，最適作用溫度為55°C。在45°C 60°C范圍內，酶活均能維持在85%以上。實施例6脂肪酶在廢舊新聞紙脫墨中的應用本實施例采用的脂肪酶為實施例4發酵后的發酵液上清。首先對二次纖維原料進行預處理舊新聞紙(ONP)發刊在3個月以上，在60°C烘箱陳化兩周、撕碎成20mmX20mm小片。原料在水中浸泡過夜后(漿濃為質量百分比10%)，接著移入碎漿機進行酶處理，漿濃仍控制在10% (質量百分比)，脂肪酶用量為1.5U/g絕干漿，控制pH值為9. 0，溫度50°C，處理時間25min后，轉入12L臥式浮選儀中采用浮選法脫墨。浮選法是運用不同顆粒具有不同的表面性能的機理進行脫墨，酶脫墨時要加入表面活性劑(此處選吐溫80，添加濃度體積百分比1%)。浮選時，稀釋漿濃度為質量百分比1%、溫度提高至60°C (不超過65°C )，浮選儀空氣流量為4 6m3/h，浮選7min后收集漿料，疏解10000轉，然后在抄紙機上抄成片，烘干，放于封口袋，檢測成紙的脫墨效果和紙張性能。經上述脂肪酶處理后，漿白度為5L 49%IS0,殘余油墨值472. 06mg/kg,撕裂度14. 32mN. m2/g，耐破度2. 41KPa. m2/g,抗張強度30. 52N. m/g。同時，使用上述脂肪酶脫墨，大大減少廢水中的化學需氧量(COD)等污染物的排放，脫墨廢水中，固體懸浮物SS (suspendsolid)為 187. 69mg/L, COD 為 269. 50mg/L,總有機碳 TOC (Total organic carbon)3. 24g/L，廢水負荷指標低于化學法脫墨50%以上。這是因為化學法脫墨添加了燒堿、硅酸鈉、雙氧水等化學藥品，導致廢水負荷指標升高較大。上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護范圍之內。
權利要求
1.一種新型脂肪酶基因，其特征在于所述的新型脂肪酶基因的核苷酸序列如SEQ IDNO. I所示。
2.一種含權利要求I所述的新型脂肪酶基因的質粒PPICZ a A-ARL,其特征在于通過將新型脂肪酶基因連入到質粒pPICZ a A中得到。
3.攜帶權利要求I所述的新型脂肪酶基因的菌株Escherichiacoli TOPlO/pPICZa A-ARL，保藏號為 CCTCC NO :M2012309。
4.一種生產脂肪酶的菌株Pichia Pastoris X33/pPICZ a A-ARL，其特征在于通過將權利要求2所述的質粒pPICZ a A-ARL轉化畢赤酵母宿主菌Pichia Pastoris X33得到。
5.權利要求I所述的新型脂肪酶基因、權利要求2所述的質粒pPICZa A- ARL、權利要求3所述的菌株Escherichia coli TOPlO/pPICZ a A-ARL或權利要求4所述的菌株PichiaPastoris X33/pPICZaA_ARL在廢舊新聞紙脫墨中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種新型脂肪酶基因和脂肪酶生產菌株及應用，屬于酶法脫墨領域。新型脂肪酶基因經過密碼子優化得到，該脂肪酶基因在畢赤酵母中可實現高表達。將該基因連接到畢赤酵母表達質粒pPICZα中得到質粒pPICZαA-ARL，再將質粒pPICZαA-ARL轉化畢赤酵母宿主菌Pichia Pastoris X33得到脂肪酶生產菌株Pichia Pastoris X33/pPICZαA-ARL。該菌株能高效表達脂肪酶，所表達的脂肪酶活力為2500U/mL，具有耐中高溫、耐堿性質，可有效應用于廢舊報紙脫墨。
文檔編號D21C5/02GK102965384SQ20121038805
公開日2013年3月13日 申請日期2012年10月12日 優先權日2012年10月12日
發明者林影, 韓雙艷, 趙小蘭, 鄭穗平, 龔艷 申請人:華南理工大學