專利名稱：一種靜電紡多壁碳納米管含糖納米纖維膜的制備的制作方法
技術領域：
本發明屬于納米纖維膜的制備領域，特別涉及一種靜電紡多壁碳納米管含糖納米纖維膜的制備方法。
背景技術：
自從1991年Iijima發現碳納米管以來，由于其獨特的物理和化學性質受到了人們的廣泛關注。碳納米管是由類似石墨結構的六邊形網格卷繞而成的、同軸中空“微管”，兩端的“碳帽”由五邊形或七邊形網格參與封閉。根據石墨層片數的不同，可以分為單壁碳納米管(SWCNT)、雙壁碳納米管(DWCNT)和多壁碳納米管(MWNT)。碳納米管具有良好的導電性，若將其加入到高分子材料中，可使高聚物的電阻降低三個數量級以上。碳納米管的尖端具有納米尺度的曲率，是極佳的發射電極。研究表明碳納米管不僅對多巴胺、NADH以及 抗壞血酸具有良好的電催化活性，而且對蛋白質和各種酶也具有良好的電子傳遞作用。靜電紡纖維膜是一種優良的酶固定化載體，碳納米管的摻入會進一步提高這種載體的性能，如機械性能、化學穩定性和導電性等。在電化學生物傳感器中，碳納米管被用于修飾電極表面以加快酶活性中心與電極之間的電子傳遞速率。因此纖維載體中的碳納米管也有可能會促進固定化氧化還原酶與底物之間的電子轉移，從而提高酶的催化活性。
發明內容
本發明提供一種靜電紡多壁碳納米管含糖納米纖維膜的制備。本發明的Poly(AN-Co-OVAG)/碳納米管復合纖維膜作為載體將會有利于氧化還原酶的固定化，載酶量及酶活性、熱穩定性、儲存穩定性均高于不含多壁碳納米管的固定化酶膜，因為其表面的羥基可為酶的化學固定提供活性位點，碳納米管會促進催化過程中的電子傳遞，而聚合物鏈與碳納米管強的界面粘合力保證了這種載體的穩定性。本發明的一種靜電紡多壁碳納米管含糖納米纖維膜的制備方法，包括(I)將己二酸、乙酸汞以及醋酸銅混合，溶于乙酸乙烯酯中，己二酸與乙酸乙烯酯的質量比為1:2-1:5，乙酸汞與乙酸乙烯酯的質量比為1:60-1:70 ;醋酸銅與乙酸乙烯酯的質量比為1:1395-1:2790。在60°C下加熱并攪拌5min，加入3-4滴濃硫酸，反應至溶液變得藍色澄清，層析分離產物己二酸二乙烯酯；(2)將摩爾比為1:1 4:1己二酸二乙烯酯和葡萄糖混合，溶于吡啶中，己二酸二乙烯酯與吡啶的質量比為1:6-1:8 ;葡萄糖與吡啶的質量比為1:18-1:25。以堿性蛋白酶為催化劑，40-60°C下振蕩反應4-5天，過濾、旋蒸后層析分離產物6-0-乙烯己二酰-D-葡萄糖OVAG ；以堿性蛋白酶為催化劑，40-60°C下振蕩反應4-5天，過濾、旋蒸后層析分離產物
6-0-乙烯己二酰-D-葡萄糖OVAG ；(3)在上述OVAG中加入丙烯腈AN，OVAG = AN摩爾比為1:20，以過硫酸銨作為引發齊U，H2O作溶劑，然后于氮氣保護下攪拌反應4-5h，聚合反應結束后得到Poly(AN-Co-OVAG)共聚物；
(4)用強氧化性的摩爾比為1:4的硫酸和硝酸的混合酸在40°C下對多壁碳納米管進行表面功能化處理，并將其超聲分散進DMF溶劑中；(5)將Poly(AN-Co-OVAG)在常溫下溶解于多壁碳納米管的DMF分散液中，通過靜電紡絲制備了 Poly (AN-co-OVAG)/MWCNTs復合納米纖維膜。 所述步驟(I)中的己二酸二乙烯酯，其粗產物用硅膠層析柱分離提純，洗脫劑與展開劑的化學組成相同，為石油醚 和乙酸乙酯的混合物，石油醚與乙酸乙酯的體積比9:1，用I2顯色。所述步驟(2)中的0VAG，其粗產物用硅膠層析柱分離提純，洗脫劑為乙酸乙酯，展開劑為乙酸乙酯、甲醇和水的混合物，乙酸乙酯、甲醇、水的體積比為17:3:1，用I2顯色。所述步驟(2)中的振蕩速率為150r/min。所述步驟(3)中的聚合反應結束后，產物反復經丙酮沉淀、DMF溶解，洗除沒反應的 OVAG。所述步驟(3)中OVAG的質量分數占Poly(AN-co-OVAG)共聚物質量的
7.17%-29. 78%ο所述步驟(3)中的最佳聚合條件為引發劑濃度為1%，單體OVAG濃度為20g/100mLH2O,聚合溫度為60°C。所述步驟(5)中多壁碳納米管的質量分數為占Poly(AN-co-OVAG)/MWCNTs復合納米纖維膜的1%_30%。所述步驟(5)中靜電紡絲參數為注射器規格為5ml，直徑14mm，流速O. 5-1. 5ml/h，靜電壓12-17Kv，接收器為接地鋁箔，接收距離15-20cm。通過本發明的方法制備的一種靜電紡多壁碳納米管含糖納米纖維膜應用于酶的固定化，包括(I)將空白纖維膜用環氧氯丙烷活化后，浸入新鮮配制的過氧化氫酶溶液中，在4°C水浴中振蕩活化3-4h后取出，用PBS反復沖洗，收集洗液和原酶液以測定載酶量；膜保存于4°C的PBS (pH=7. 4)緩沖液中待測活性。(2)將O. lmg/mL的酶溶液置于一定溫度的水浴中恒溫，每間隔一段時間，用移液槍取出O. 03mL測定其活性。將多份相同質量的固定化酶膜分別儲存于PBS中，置于一定溫度的水浴中恒溫，每間隔一段時間，取出一份固定化酶膜測定其活性。以未經溫度處理的酶活性為100%，通過考察酶殘留活性隨時間的變化，研究酶的熱穩定性。(3)選用不同pH值的緩沖溶液配制底物溶液，測定游離酶和固定化酶的活性。以最高活性為100%，得出相應的酶活(enzyme activity) (%)。其中，pH為4. O和5. O的緩沖體系為酯酸/酯酸鈉溶液，pH為6. 5,7. 0,7. 5,8. O的緩沖體系為PBS，pH為9. O的緩沖體系為硼砂/磷酸二氫鉀溶液。(4)將游離酶溶液(O. lmg/mL)和一批處于濕態的固定化酶膜置于4°C下保存，間隔一段時間取出一份樣品測定其活性。以未經保存處理的酶活性為100%，通過考察酶殘留活性隨時間的變化，研究酶的儲存穩定性。步驟(I)中固定化所用的過氧化氫酶的濃度為O. lmg/mL,固定化酶膜保存于4°C、pH為7.4的PBS緩沖液中。步驟(2)中在20-70 °C測定固定化酶與游離酶的熱穩定性，分別在O,20，40，60，80，100，120min 測定酶的活性。步驟(3)中pH范圍在4-9，其中，pH為4. O和5. O的緩沖體系為醋酸/醋酸鈉溶液，pH為6. 5,7. 0,7. 5,8. O的緩沖體系為PBS，pH為9. O的緩沖體系為硼砂/磷酸二氫鉀溶液。步驟 (4)中通過測定固定化酶與游離酶在30d中的殘留活性來測定酶的儲存穩定性。碳納米管具有良好的導電性和生物相容性，可促進催化過程中的電子傳遞，有利于過氧化氫酶的固定；Poly (AN-co-OVAG)/MWCNTs復合納米纖維膜中，Poly (AN-co-OVAG)共聚物表面的羥基可為酶的化學固定提供活性位點，聚合物鏈與碳納米管強的界面粘合力保證了這種膜載體的穩定性。有益.效果本發明在固定化氧化還原酶方面具有特殊意義，本發明制備的Po I y (AN-CO-OVAG) /MWCNTs復合納米纖維固定化酶膜載酶量及酶活性、熱穩定性、儲存穩定性均高于不含多壁碳納米管的固定化酶膜，PH耐受性高于游離酶，這主要是由于多碳納米管良好的導電性能和良好的生物相容性，碳納米管的加入增加了催化反應中的電子傳遞率，并且提高了膜生物相容性，使得固定化酶的催化活性大大提高；本發明的Poly (AN-co-OVAG) /MWCNTs復合納米纖維膜還具有較好的穩定性。
圖I為實施例I中時間對Poly (AN-co-OVAG) /MWCNTs復合納米纖維膜載酶量及酶活性的影響。圖2為對比例中時間對Poly (AN-co-OVAG)/OVAG超細納米纖維膜載酶量及酶活性的影響。圖3為對比例、實施例2中，在60°C條件下120min內游離酶和固定化酶的熱穩定性。圖4為對比例、實施例3中，在pH=4_9條件下對游離酶和固定化酶的影響。圖5為對比例、實施例4中，在4°C條件下30day中游離酶與固定化酶的殘留活性。
具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發明講授的內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。實施例I載酶量與固定化酶活性的測定，具體步驟如下(I)稱取0. 36mol己二酸、2. Ig乙酸汞、0. 07g醋酸銅于250mL圓底燒瓶中，加入150mL乙酸乙烯酯，置于60°C油浴鍋中加熱并攪拌，約5min后加入3_4滴濃硫酸，反應至溶液變得藍色澄清，硅膠柱層析分離產物己二酸二乙烯酯，洗脫劑與展開劑的化學組成相同，為石油醚和乙酸乙酯的混合物，石油醚與乙酸乙酯體積比為9:1，用I2顯色。
(2)稱取12g己二酸二乙烯酯、4g葡萄糖，溶于75-100mL吡啶中，1.5g堿性蛋白酶為催化劑，50°C搖床中反應4-5天，過濾、旋蒸后硅膠柱層析分離產物6-0-乙烯己二酰-D-葡萄糖(OVAG)，洗脫劑為乙酸乙酯，展開劑為乙酸乙酯、甲醇與水的混合物，乙酸乙酯、甲醇與水的體積比為17:3:1，用I2顯色。(3)在反應瓶中加入丙烯腈AN和0VAG，以過硫酸銨(占葡萄糖乙烯脂質量分數的1%)作為引發劑，H2O作溶劑(OVAG濃度為20g/mL H2O),然后于60°C氮氣保護下攪拌反應4h，聚合反應結束后得到Poly (AN-co-OVAG )共聚物；(4)用強氧化性的混合酸(硫酸/硝酸)在40°C下處理多壁碳納米管，并將其超聲分散進DMF溶劑中；(5)將Poly(AN-Co-OVAG)在常溫下溶解于多壁碳納米管的分散液中，通過靜電紡絲制備了 Poly (AN-co-OVAG)/MWCNTs復合納米纖維膜，其中多壁碳納米管的質量分數為占Poly (AN-co-OVAG) /MWCNTs 復合納米纖維膜的 30% ；(6)將5. OOmg的空白纖維膜用環氧氯丙烷活化后，浸入新鮮配制的O. lmg/mL的過氧化氫酶溶液中，在4°C水浴中振蕩活化3. 5h后取出，每反應I. 5h取出固定化酶膜，用PBS反復沖洗，收集洗液和原酶液以測定載酶量(Enzyme loading) (mg enzyme/mg mesh);固定化酶膜保存于4°C的PBS (pH=7. 4)緩沖液中以測定其活性，以最高活性為100%，得出相應的酶活(enzyme activity) (%)，如圖 I。實施例2固定化酶熱穩定性的測定，具體步驟如下(I)將5. OOmg的空白纖維膜用環氧氯丙烷活化后，浸入新鮮配制的O. lmg/mL的過氧化氫酶溶液中，4°C水浴中振蕩活化3. 5h后取出，用PBS反復沖洗，最后將膜保存到40C的PBS (pH=7. 4)緩沖液中。(2)將O. I mg/mL的過氧化氫酶溶液置于60°C的水浴中恒溫，以未經溫度處理酶活性為100%，每間隔20min，用移液槍取出0. 03mL測定其殘留活性。殘留活性(Residualactivity)的計算公式如下Ra=At/A0X 100% ;其中Ra :殘留活性(%)，At t時間后所測的酶的活性(U) ,Atl:酶的初始活性(U)。通過考察酶的殘留活性隨時間的變化，研究酶的熱穩定性。(3)將多份相同質量的固定化酶膜分別儲存于PBS中，置于60°C的水浴中恒溫，以未處理酶活性為100%，每間隔20min，取出一份固定化酶膜測定其殘留活性。殘留活性(Residual activity)的計算公式如下Ra=At/A0X 100% ;其中 Ra :殘留活性(%), At :t 時間后所測的酶的活性(U) ,Atl:酶的初始活性(U)。通過考察酶的殘留活性隨時間的變化，研究酶的熱穩定性。如圖3。實施例3固定化酶pH耐受性的測定，具體步驟如下(I)將5. OOmg的空白纖維膜用環氧氯丙烷活化后，浸入新鮮配制的0. lmg/mL的過氧化氫酶溶液中，在4°C水浴中振蕩活化3. 5h后取出，用PBS反復沖洗，最后將膜保存至IJ 40C的PBS (pH=7. 4)緩沖液中。(2)選用pH=4_9的緩沖溶液配制底物溶液，測定游離酶和固定化酶的活性，以最高活性為100%,得出相應的酶活(enzyme activity) (%),如圖4。從圖4中可以看出，經Poly (AN-co-OVAG)和Poly (AN-co-OVAG) /MWCNTs復合納米纖維膜膜固定的過氧化氫酶對pH的耐受性相差不大,但經固定化后pH穩定范圍變寬(pH6. 0-8. O)，而游離酶只在PH6. 5-7. 5之間具有較高的穩定性。實施例4固定化酶儲存穩定性的測定，具體步驟如下(I)將5. OOmg的空白纖維膜用環氧氯丙烷活化后，浸入新鮮配制的0. lmg/mL的過氧化氫酶溶液中，4°C水浴中振蕩活化3. 5h后取出，用PBS反復沖洗，最后將固定化酶膜保存到40C的PBS (pH=7. 4)緩沖液中。(2)將游離酶溶液(0. lmg/mL)和一批處于濕態的固定化酶膜置于4°C下保存，以 未經保存處理酶活性為100%，每隔2. 5天取出一份樣品測定其活性。殘留活性(Residualactivity)的計算公式如下Ra=At/A0X 100% ;其中Ra :殘留活性(%)，At t時間后所測的酶的活性(U) ,Atl:酶的初始活性(U)。通過考察酶的殘留活性隨時間的變化，研究酶的儲存穩定性，如圖5。對比例(I)將5. OOmg Poly (AN-CO-0VAG)/OVAG超細納米纖維膜用環氧氯丙烷活化后，浸入新鮮配制的0. lmg/mL的過氧化氫酶溶液中，在4°C水浴中振蕩活化3. 5h后取出，用PBS反復沖洗，最后將膜保存到4°C的PBS (pH=7. 4)緩沖液中。(2)方法同測定固定于Poly (AN-co-OVAG)/MWCNTs復合納米纖維膜上的酶，測定固定到對比例(I)中提到的膜上的酶的載酶量與酶活力、熱穩定性、PH耐受性、儲存穩定性，如圖2，3,4,50
權利要求
1.一種靜電紡多壁碳納米管含糖納米纖維膜的制備方法，包括下列步驟 (1)將己二酸、乙酸汞以及醋酸銅混合，溶于乙酸乙烯酯中，己二酸與乙酸乙烯酯的質量比為1:2-1:5，乙酸汞與乙酸乙烯酯的質量比為1:60-1:70 ;醋酸銅與乙酸乙烯酯的質量比為1:1395-1:2790。在60°C下加熱并攪拌5min，加入3_4滴濃硫酸，反應至溶液變得藍色澄清，層析分離產物己二酸二乙烯酯； (2)將摩爾比為1:1 4:1己二酸二乙烯酯和葡萄糖混合，溶于吡啶中，己二酸二乙烯酯與吡啶的質量比為1:6-1:8 ;葡萄糖與吡啶的質量比為1:18-1:25。以堿性蛋白酶為催化劑，40-60°C下振蕩反應4-5天，過濾、旋蒸后層析分離產物6-0-乙烯己二酰-D-葡萄糖OVAG ； (3)在上述OVAG中加入丙烯腈AN，OVAG= AN摩爾比為1:20，以過硫酸銨作為引發劑，H2O作溶劑，然后于氮氣保護下攪拌反應4-5h，聚合反應結束后得到Poly(AN-Co-OVAG)共 聚物； (4)用強氧化性的摩爾比為1:4的硫酸和硝酸的混合酸在40°C下對多壁碳納米管進行表面功能化處理，并將其超聲分散進DMF溶劑中； (5)將Poly(AN-Co-OVAG)在常溫下溶解于多壁碳納米管的DMF分散液中，通過靜電紡絲制備了 Poly (AN-co-OVAG)/MWCNTs復合納米纖維膜。
2.根據權利要求I所述的一種靜電紡多壁碳納米管含糖納米纖維膜的制備方法，其特征在于所述步驟(I)中的己二酸二乙烯酯，其粗產物用硅膠層析柱分離提純，洗脫劑與展開劑的化學組成相同，為石油醚和乙酸乙酯的混合物，石油醚與乙酸乙酯的體積比9:1，用I2顯色。
3.根據權利要求I所述的一種靜電紡多壁碳納米管含糖納米纖維膜的制備方法，其特征在于所述步驟(2)中的0VAG，其粗產物用硅膠層析柱分離提純，洗脫劑為乙酸乙酯，展開劑為乙酸乙酯、甲醇和水的混合物，乙酸乙酯、甲醇、水的體積比為17:3:1，用I2顯色。
4.根據權利要求I所述的一種靜電紡多壁碳納米管含糖納米纖維膜的制備方法，其特征在于所述步驟(2)中的振蕩速率為150r/min。
5.根據權利要求I所述的一種靜電紡多壁碳納米管含糖納米纖維膜的制備方法，其特征在于所述步驟(3)中的聚合反應結束后，產物反復經丙酮沉淀、DMF溶解，洗除沒反應的OVAG0
6.根據權利要求I所述的一種靜電紡多壁碳納米管含糖納米纖維膜的制備方法，其特征在于所述步驟(3)中OVAG的質量分數占Poly(AN-co-OVAG)共聚物質量的7. 17%-29. 78%ο
7.根據權利要求I所述的一種靜電紡多壁碳納米管含糖納米纖維膜的制備方法，其特征在于所述步驟(3)中的最佳聚合條件為引發劑濃度為1%，單體OVAG濃度為20g/IOOmLH2O,聚合溫度為60°C。
8.根據權利要求I所述的一種靜電紡多壁碳納米管含糖納米纖維膜的制備方法，其特征在于所述步驟(5)中多壁碳納米管的質量分數為占Poly (AN-co-OVAG)/MWCNTs復合納米纖維膜的1%_30%。
9.根據權利要求I所述的一種靜電紡多壁碳納米管含糖納米纖維膜的制備方法，其特征在于所述步驟(5)中靜電紡絲參數為注射器規格為5ml，直徑14mm，流速O. 5-1. 5ml/h，靜電壓12-17Kv，接收器為接地鋁箔，接收距離15-20cm。
全文摘要
本發明涉及一種靜電紡多壁碳納米管含糖納米纖維膜的制備方法，包括(1)制備Poly(AN-co-OVAG)含糖高聚物；(2)共價法對多壁碳納米管MWCNT進行表面功能化處理，并將其超聲分散進DMF溶劑中；(3)將Poly(AN-co-OVAG)含糖高聚物在常溫下溶解于多壁碳納米管的分散液中，通過靜電紡絲制備得到Poly(AN-co-OVAG)/MWCNTs復合納米纖維膜。本發明的Poly(AN-co-OVAG)/MWCNTs復合納米纖維膜載酶量、酶活性、熱穩定性、儲存穩定性均高于不含多壁碳納米管的固定化酶膜；pH耐受性高于游離酶。
文檔編號D01F1/10GK102776599SQ20121023806
公開日2012年11月14日 申請日期2012年7月10日 優先權日2012年7月10日
發明者劉中青, 朱利民, 權靜, 李艷, 王蕾 申請人:東華大學