專利名稱：膠原溶解及再生方法
技術領域：
本發明涉及一種溶解膠原(collagen)的方法，以及進一步利用水或其他凝固浴 將溶解的膠原再生為多種形態的方法。
背景技術：
膠原是動物體內含量最多、分布最廣的蛋白質之一，廣泛存在于動物的結締組織、 皮膚、骨骼、肌腱、內臟、細胞間質、韌帶、血管、鞏膜等部位，占動物體內蛋白質總量的25 30%，是動物體內主要的結構蛋白。作為一種優良的可再生天然高分子資源，膠原具有優異 的生物相容性和可降解性，已在生物醫學材料、皮革化學與工程、日化工業、食品工業等領 域得到廣泛的應用或具有廣闊的應用前景。近年來，由于石油資源短缺、環境惡化及可持續 發展的挑戰，具有來源豐富、可再生、可生物降解等優良特性的膠原已成為最為重要的有機 天然資源之一。膠原具有完整的四級結構膠原的每一條肽鏈形成左手α-螺旋結構，每三條左 手螺旋多肽鏈相互纏繞，形成一個右手超螺旋結構(原膠原)，多肽鏈內和鏈間由數量眾多 的氫鍵、離子鍵、疏水鍵、范德華力等相互作用以保持螺旋結構穩定。由于三股螺旋的旋轉 方向與構成它們的多肽鏈的旋轉方向相反，因而不易解旋，使膠原具有極高的強度和結構 穩定性。原膠原首尾相接，按規則平行排列成束，首尾錯位1/4，通過共價鍵搭接交聯，形成 穩定的膠原微纖維(microfibril)，并進一步聚集成束，形成難溶的膠原纖維(fiber)。和 其他許多天然高分子材料(纖維素、甲殼素等)一樣，膠原不具有熱塑性，不能被熔融加工， 也很難溶解在普通溶劑中，限制了膠原在許多領域的應用。中性鹽或稀醋酸溶液能夠從動物皮膚、肌腱、骨骼等富含膠原纖維的組織中提取 出部分未能共價交聯或未成熟的膠原，即可溶性膠原。然而動物體內大部分為難溶性膠 原，這部分膠原以膠原纖維形式存在，彼此相互交叉形成網狀。對于難溶性膠原，可先用胃 蛋白酶消化水解，去除末端非螺旋型區域，再用稀醋酸溶液提取；膠原粗制品經反復透析、 離心等純化處理后，經冷凍干燥可得膠原制品。以從豬皮中提取I型膠原為例首先，從豬 皮組織中分離皮膚，去除毛發和表皮，脫脂，用絞肉機絞碎；以2. 5g/L的質量濃度懸浮在 0. 5mol/L醋酸中進行胃蛋白酶水解，連續攪拌消化48h，超速低溫離心30min ；去除沉淀后， 在上清液中加入NaCl至最終濃度為4. 4mol/L,充分攪拌后再離心沉淀；將沉淀溶解在醋酸 中后，繼續加入NaCl至最終濃度為1. 7mol/L，離心后收集沉淀；將沉淀溶解在醋酸中，通過 0. 45 μ m的濾膜過濾，在4°C對0. 001mol/L醋酸溶液透析24h。可以看出，膠原的整個提取 過程相當繁瑣，且該過程會產生很多廢棄物，提取率也非常低。同時，冷凍干燥的方法需要 特殊的儀器，耗時長，成本高。尋求膠原天然高分子材料的環保加工技術一直是科學工作者 不懈努力的目標。如果能找到一種溶劑，直接將皮膠原溶解在其中，并用簡單的方法將膠原 再生成膜、纖維、微球狀、粉狀等各種形態的制品，必將極大地促進膠原產業的發展。離子液體是近年來興起的一類極具應用前景的環保型溶劑，它不揮發，對水和空 氣穩定，對無機、有機化合物以及高分子材料具有良好的溶解性，在電化學、有機合成、化工分離、材料制備等領域有著廣泛的應用。離子液體是指在室溫或接近室溫下呈現液態的、完全由陰陽離子所組成的鹽，也稱為低溫熔融鹽。與傳統有機溶劑、水、超臨界流體等相比，離 子液體具有許多優良的性能對很多化學物質，包括有機物和無機物具有良好的溶解性能； 具有較高的離子傳導性；熱穩定性較高；液態溫度范圍較寬；極性較高，溶劑化性能較好； 幾乎不揮發、不氧化、不燃燒；粘度低、熱容大；對水和空氣均穩定；易回收，可循環使用；設 備簡單、易于制造。
發明內容
本發明的目的是為了提供一種簡便的膠原溶解方法，同時還提供了將膠原再生成 膜、纖維、微球或粉狀等各種形態的膠原制品的方法。基于上述目的，本發明采用了如下技術方案膠原溶解方法，是利用離子液體做溶 劑溶解膠原。所述離子液體為烷基咪唑類離子液體。所述離子液體1-甲基-3-丁基鹵代咪唑、1-丁基-3-甲基鹵代咪唑、1-乙 基-3-甲基鹵代咪唑、1-烯丙基-3-甲基鹵代咪唑或二鹵二(3，3' - 二甲基)咪唑基亞砜鹽。取干燥的膠原投入到離子液體中，85 140°C下攪拌0. 5 6h。膠原與離子液體的重量比為1 15 100。膠原再生的方法，步驟為將膠原溶解于離子液體中得到膠原/離子液體溶液后， 用凝固劑洗去溶液中的離子液體，得到再生膠原。所述凝固劑選自去離子水、乙醇、甲醇、丙酮中的一種或任意組合。將所述膠原/離子液體溶液鋪膜，然后置于凝固劑中，膠原再生為薄膜形態。使所述膠原/離子液體溶液自細孔(噴絲孔)噴入凝固劑中，膠原再生為纖維形 態。將所述膠原/離子液體溶液直接滴入凝固劑中，膠原再生為球狀或粉末形態。本發明所提供的膠原溶解及再生方法步驟簡單、無毒無害、安全性高，能大幅度簡 化膠原制品的制備過程。離子液體可以破壞膠原分子間或分子內的作用力，進而將其溶解， 溶解條件溫和，易于控制，獲得膠原/離子液體溶液具有良好的可再生性；再生過程簡單， 所用的凝固劑價格低廉、易于回收，為膠原制品的研究和推廣應用奠定了良好的基礎。
圖1是在皮粉纖維溶解過程中拍攝的顯微照片，其中圖Ia對應的是70°C，圖Ib對 應 120 0C ；圖2是在皮粉纖維的溶解過程中，于701、1001、1101及120°C拍攝的偏光顯微 照片；圖3是在II型膠原纖維的溶解過程中，于70°C、110°C、120°C、125°C拍攝的偏光顯 微照片。
具體實施例方式實施例1 稱取0. 56g皮粉纖維和5. 03g離子液體1_甲基_3_ 丁基氯代咪唑放入燒杯中，邊 磁力攪拌邊升溫至100°c;皮粉纖維在離子液體中逐漸溶解，1. 5h后溶液呈均勻分散的渾濁 狀態，繼續攪拌，溶液逐漸變得澄清，直至皮粉纖維完全溶解。取少量制備的皮粉纖維離子液體溶液，均勻鋪在玻片上，將玻片浸入去離子水中 靜置，皮膠原再生成膜。將膜用去離子水反復浸泡，徹底洗去離子液體，將膜在室溫下通風 處自然晾干，得到再生皮膠原膜。實施例2稱取0. 25g皮粉纖維和3. OOg離子液體1_ 丁基_3_甲基氯代咪唑，加入0. 30g去 離子水，于油浴中加熱至120°C，并進行磁力攪拌；皮粉纖維在含水離子液體中逐漸溶解， Ih后溶液呈均勻分散的渾濁狀態，繼續攪拌，溶液逐漸變得澄清，直至皮粉纖維完全溶解。用注射器取少量制備的真皮層纖維離子液體溶液，將溶液注射入丙酮中，皮膠原 再生成纖維。將纖維用丙酮反復浸泡，徹底洗去離子液體，將纖維在室溫下通風處自然晾 干，得到再生皮膠原纖維。實施例3將浸酸山羊皮的真皮層刮下，中和，于室溫下在真空烘箱中充分干燥，得到真皮層 纖維。稱取0. 6g真皮層纖維和5. 03g離子液體1- 丁基-3-甲基溴代咪唑，在油浴中加熱至 85°C，并進行磁力攪拌；纖維在離子液體中逐漸溶解，6h后，溶液呈均勻分散的渾濁狀態， 繼續攪拌，溶液逐漸變得澄清，直至纖維完全溶解。用注射器取少量制備的真皮層纖維離子液體溶液，將溶液逐滴滴入丙酮中，皮膠 原再生成微粉狀。抽濾后得到微粉，將微粉在室溫下通風處自然晾干，得到再生皮膠原粉。實施例4稱取0. 05g皮粉纖維和5. 03g離子液體1_乙基_3_甲基溴代咪唑放入燒杯中，邊 磁力攪拌邊升溫至90°C ；皮粉纖維在離子液體中逐漸溶解，3h后，溶液呈均勻分散的渾濁狀 態，繼續攪拌，溶液逐漸變得澄清，直至皮粉纖維完全溶解。用注射器取少量制備的皮粉纖維離子液體溶液，將溶液逐滴滴入甲醇中，皮膠原 再生成微粉狀。抽濾后得到微粉，用甲醇反復浸泡并抽濾，在室溫下通風處自然晾干，得到 再生皮膠原粉。實施例5將浸酸山羊皮的真皮層刮下，中和，于室溫下在真空烘箱中充分干燥，得到真皮層 纖維。稱取0. 75g真皮層纖維和5. OOg離子液體1-烯丙基-3-甲基氯代咪唑，加入0. 30g 去離子水，于油浴中加熱至120°C，并進行磁力攪拌；纖維在含水離子液體中逐漸溶解，Ih 后，溶液呈均勻分散的渾濁狀態，繼續攪拌，溶液逐漸變得澄清，直至皮粉纖維完全溶解。取少量制備的真皮層纖維離子液體溶液，均勻鋪在玻片上，將玻片浸入丙酮中，用 丙酮將離子液體洗去，使皮膠原再生成膜。將膜在室溫下通風處自然晾干后揭下，得到再生 皮膠原膜。實施例6稱取0. 50g皮粉纖維和5. OOg離子液體二氯二(3，3' - 二甲基)咪唑基亞砜鹽，加入0. 30g去離子水，于油浴中加熱至140°C，并進行磁力攪拌；皮粉纖維在含水離子液體 中逐漸溶解，0. 5h后，溶液呈均勻分散的渾濁狀態，繼續攪拌，溶液逐漸變得澄清，直至皮粉 纖維完全溶解。取少量制備的皮粉纖維離子液體溶液，均勻鋪在玻片上，將玻片浸入去離子水中 靜置，皮膠原再生成膜。將膜用去離子水醇反復浸泡，徹底洗去離子液體。將膜在室溫下通 風處自然晾干，得到再生皮膠原膜。溶解實驗1取一根皮粉纖維(生牛皮經水洗、脫脂、浸灰、片皮、脫灰后，進行脫水干燥處理， 然后進行研磨，即可得到皮粉纖維)置于載玻片上，將一滴離子液體[Bmim]Cl滴在皮粉纖 維上，將其完全覆蓋，蓋上蓋玻片。將載玻片置于LEICAMPS 30熱臺偏光顯微鏡的熱臺上， 自室溫緩慢升溫至140°C，撤去起偏鏡能觀察到皮粉在溫度升至70°C之前(圖la) —直呈 現纖維狀，但隨著溫度的升高，皮粉逐漸溶解，升溫至120°C時(圖lb)皮粉幾乎完全溶解， 視野中滿是小液滴(若不加離子熱體，則能觀察到皮粉隨溫度升高逐漸褐變、碳化)。升溫 過程中，于關鍵溫度點拍攝偏光照片，如圖2所示，發現70°C時皮粉纖維在偏光顯微鏡下呈 現大片亮區，表明纖維中有大量結晶區域；升溫至100°C時，體系中亮區區域減少，表明部 分結晶結構已被破壞；升溫至110°C時，體系中的亮區區域進一步減少；升溫至120°C，體系 中亮區完全消失，此時皮粉纖維溶解在離子液體中。溶解實驗2取一根不溶性II型膠原纖維(Sigma，C-8886)置于載玻片上，將一滴離子液體 [Bmim] Cl滴在膠原纖維上，將纖維完全覆蓋，蓋上蓋玻片。將載玻片置于LEICA MPS 30熱 臺偏光顯微鏡的熱臺上，從室溫緩慢升溫至140°C，撤去起偏鏡能觀察到皮粉在70°C以下 一直呈現纖維狀，但隨著溫度的升高，皮粉逐漸溶解，升溫至125°C時皮粉幾乎完全溶解，視 野中滿是小液滴。在關鍵溫度點拍攝偏光照片，如圖3所示。從圖中可以看出，在70°C時II 型膠原纖維在偏光顯微鏡下呈現大片亮區，表明纖維中有大量結晶區域；升溫至110°C時，體系中亮區縮減，表明其中部分結晶結構已被破壞；升溫至120°C時，體系中的亮區區域進 一步減少；在125°C下停留5min，體系中亮區完全消失，此時膠原纖維完全溶解在離子液體 中。
權利要求
膠原溶解方法，其特征是，利用離子液體做溶劑溶解膠原。
2.如權利要求1所述的膠原溶解方法，其特征是，所述離子液體為烷基咪唑類離子液體。
3.如權利要求2所述的膠原溶解方法，其特征是，所述離子液體為1-甲基-3-丁基鹵 代咪唑、1-丁基-3-甲基鹵代咪唑、1-乙基-3-甲基鹵代咪唑、1-烯丙基-3-甲基鹵代咪唑 或二鹵二(3，3' - 二甲基)咪唑基亞砜鹽。
4.如權利要求1-3任一所述的膠原溶解方法，其特征是，取干燥的膠原投入到離子液 體中，85 140°C下攪拌0. 5 6h。
5.如權利要求4所的膠原溶解方法，其特征是，膠原與離子液體的重量比為1 15 100。
6.利用權利要求1-5任一所述膠原溶解方法進行膠原再生的方法，其特征是，將膠原 溶解于離子液體中得到膠原/離子液體溶液后，用凝固劑洗去溶液中的離子液體，得到再 生膠原。
7.如權利要求6所述膠原再生的方法，其特征是，所述凝固劑選自去離子水、乙醇、甲 醇、丙酮中的一種或任意組合。
8.如權利要求7所述膠原再生的方法，其特征是，將所述膠原/離子液體溶液鋪膜，然 后置于凝固劑中，膠原再生為薄膜形態。
9.如權利要求7所述膠原再生的方法，其特征是，使所述膠原/離子液體溶液自細孔噴 入凝固劑中，膠原再生為纖維形態。
10.如權利要求7所述膠原再生的方法，其特征是，將所述膠原/離子液體溶液直接滴 入凝固劑中，膠原再生為微球或粉末形態。
全文摘要
膠原溶解及再生方法，其目的是為了提供一種簡便的膠原溶解方法，同時還提供了將溶解后的膠原再生成膜、纖維、微球或粉狀等各種形態的膠原制品的方法。為實現這一目的，本發明采用的技術方案為膠原溶解方法，是利用離子液體做溶劑溶解膠原，所述離子液體為為烷基咪唑類離子液體1-甲基-3-丁基鹵代咪唑、1-丁基-3-甲基鹵代咪唑、1-乙基-3-甲基鹵代咪唑、1-烯丙基-3-甲基鹵代咪唑或二鹵二(3，3′-二甲基)咪唑基亞砜鹽。膠原再生方法，是利用所述膠原溶解方法制備膠原/離子液體溶液，然后用凝固劑洗去溶液中的離子液體后得到再生膠原。本發明的膠原溶解及再生方法步驟簡單、無毒無害、安全性高，為膠原制品的研究和推廣應用奠定了良好的基礎。
文檔編號D01F4/00GK101838397SQ201010173659
公開日2010年9月22日 申請日期2010年4月27日 優先權日2010年4月27日
發明者孟卓君, 湯克勇, 鄭學晶 申請人:鄭州大學