支架材料的制作方法

專利名稱：：支架材料的制作方法
技術領域：
：本發明涉及細胞增殖所使用的支架材料。本發明涉及包括纖維集合體、適于修復材料或細胞培養基材的支架材料。
背景技術：
：近年來，作為嚴重損傷的生物組織的治療方法，活躍地進行利用細胞的分化、增殖能力在原本生物組織上再次構建的再生醫療研究。當生物體內細胞分化、增殖時，細胞外基質作為支架發揮功能，進行組織的構建。但是，當組織嚴重地損傷時，在細胞本身產生基質之前有必要用人工和天然材料補充。即，支架材料(修復材料)是在組織構建方面產生最佳環境的重要因素。作為該支架材料所要求的特性，可以舉出1)生物吸收性、2)細胞黏附性、3)多孔性、4)力學強度等。為了創造滿足這些特性的材料，之前研究了合成高分子(多醇酸、聚乳酸、聚己內酯等)、天然高分子(膠原、明膠、彈性硬蛋白、透明質酸、藻酸、脫乙酰殼多糖等)、無機材料(羥基磷灰石、p—磷酸三鈣)、它們的復合物等。如上所述，作為支架材料(修復材料)所要求的重要特性之一為多孔性。這在向使組織再生所必需細胞補充充分氧和營養、迅速地排出二氧化碳或老棄物的意義上很重要。因此，為了達成支架材料的多孔性，提出了冷凍干燥法、相分離法、發泡法等。通過冷凍干燥法或相分離法獲得的結構體的孔形狀為鱗片狀，細胞難以侵入，具有作為支架材料不充分的課題。另外，通過發泡法獲得的結構體也由于孔單獨地存在，因此也具有細胞難以侵入的課題。另外，還報告了作為由熱塑性聚合物構成的纖維的集合體、平均纖維徑為0.120i!m、且該纖維的任意橫截面為異形、平均表觀密度為10~95kg/cnr^的無紡布(專利文獻1)。但是，作為支架材料需要進一步的厚度和強度。另外，還提出了在制備含有蔗糖等水溶性物質的聚氨酯聚合物后，在水浴中溶解所含的水溶性物質形成孔結構的軟骨塞(專利文獻2)。但是，通過該方法形成的孔并非連續孔，細胞增殖有限。另外，提出了通過靜電紡絲法制造納米纖維平面狀地堆積的支架材料，使用其培養細胞(非專利文獻1)。該方法由于將纖維捕獲在平面狀的捕獲電極上，因此纖維堆積至一定厚度以上時，電極被堆積物覆蓋，具有難以維持一定的電位差、纖維的堆積物密度在堆積方向上變化的缺點。另外，堆積物在垂直于堆積方向的面方向上也會發生堆積密度不均。因此，使用該堆積物作為細胞增殖的支架材料時，有必要的是使堆積密度均勻、改良機械強度。(專利文獻1)WO2004/88024號公報(專利文獻2)特表2004-520855號公報(非專利文獻1)Pubilishedonline25March2002inWileyInterScience(www.Interscience.wiley.com)
發明內容本發明的目的在于提供纖維高密度地集合的適于細胞增殖的支架材料。本發明的目的還在于提供機械強度優異的用于細胞增殖的支架材料。本發明的目的還在于提供能夠使細胞良好地增殖的支架材料。本發明的目的還在于提供該支架材料的制造方法。本發明的目的還在于提供使用該支架材料的細胞增殖方法。另外，本發明的目的在于提供使使用該支架材料的生物組織再生的方法。本發明人發現當用靜電紡絲法制造纖維、使所得纖維堆積在旋轉的巻軸上時，可以獲得在堆積方向上具有均勻堆積密度的纖維堆積物。另外發現當將纖維堆積在旋轉的巻軸上時，可以獲得即便相對于平行于巻軸的平面也均勻的纖維堆積物。而且發現當將纖維巻繞在旋轉軸時，在纖維上施加一定張力，可以獲得高密度的纖維堆積物。另外發現所得纖維堆積物作為細胞增殖的支架材料具有適度的強度、纖維密度。本發明根據這些發現而完成。即，本發明為包括纖維的集合體、具有由2個底面和側面構成的3維結構、(1)纖維在面方向上取向、(2)纖維的直徑為0.05~50^im、(3)纖維主要由生物配伍聚合物構成、(4)表觀密度為95~350kg/m3的支架材料。另外，本發明為包括以下工序的支架材料的制造方法(1)從噴嘴向在電極間形成的靜電場中噴出含有生物配伍聚合物的紡絲原液，形成纖維、(2)將所得纖維以巻軸為中心巻繞，形成纖維在平行于巻軸的面的方向上取向的巻形物(roll)、(3)由所得巻形物切出3維結構體。本發明包含使用該支架材料使細胞分裂增殖的方法。另外還包含將該支架材料埋入損傷的患部、使生物組織再生的方法。圖1為靜電紡絲法中所用裝置的一例。圖2為靜電紡絲法中所用裝置的一例。圖3為防靜電法中所用裝置的一例。圖4為防靜電法所用裝置的一例。圖5為本發明的制造方法中切出支架材料的方法之一例。圖6為實施例2所得支架材料的上底面圖像。圖7為實施例2所得支架材料的下底面圖像。圖8為使用實施例2的支架材料的培養第1天的染色圖像。圖9為使用實施例2的支架材料的培養第12天的染色圖像。圖10為實施例3所得支架材料的上底面圖像。圖il為實施例3所得支架材料的下底面圖像。圖12為實施例3所得支架材料的截面圖像之一例。圖13為使用實施例3的支架材料的培養第1天的染色圖像。圖14為使用實施例3的支架材料的培養第12天的染色圖像。符號說明1.噴嘴2.紡絲原液3.紡絲原液保持槽4.正電^L5.負電才及6.高電壓產生器7.巻繞裝置8.除靜電裝置9.巻軸方向10.平行于巻軸方向切出的支架材料11.相對于巻繞垂直的方向12.在垂直于巻軸的方向上切出的支架材料具體實施方式以下if細說明本發明。<支架材料〉本發明的支架材料具有由2個底面和側面構成的3維結構。底面的形狀為圓、橢圓、四邊形等任意的形狀。底面可以是具有凹凸的曲面。2個底面的形狀、大小可以不同。底面的面積優選為0.05~8cm2、更優選為0.1~lcm2。側面可以是連續的曲面、還可以由多個面形成。即，本發明支架材料的形狀優選為圓筒體、多棱柱等3維結構。本發明的支架材料具有3維結構、即橫方向(x軸)、縱方向(y軸)和高度方向(z軸)的延伸。在這點上，與具有橫方向(x軸)和縱方向(y軸)延伸的平面狀無紡布不同。本發明的支架材料中，高度方向是指相對于一個底面垂直的方向。支架材料的高度優選為0.5mm以上、更優選為2mm以上。高度的上限并無限定，可以說依賴于作為修復材料使用的部位。高度低于0.5mm時，機械強度低，作為膝關節等負荷高的組織的修復材料不優選。還可以將本發明的支架材料例如埋入生物的損傷部位，用在修復材料表面用于使細胞增殖。支架材料可以對應于所需形狀提供。本發明的支架材料包括纖維的集合體。本發明中，在面方向上取向是指纖維的朝向與特定平面基本平行。纖維只要與該特定平面平行，則可以朝向—黃方向、縱方向和斜方向的任何方向。纖維的朝向與圖5的10或12所示圓筒體中虛線所示平面基本平行。另外，圖5的10或12中所示的點線部可以形成同心圓狀的曲面。該平面上的纖維的取向隨意。纖維優選如圖5的IO所示，在平行于高度方向的方向上取向。或者優選如圖5的12所示，纖維在垂直于高度方向的面方向上取向。纖維的直徑為0.05~50nm。纖維的直徑小于0.05|um時，由于無法7保證支架材料的強度，因此不優選。另外，纖維的直徑大于50|iim時，纖維的比表面積小、生著的細胞數減少。纖維的直徑優選為0.2~50pm、更優選為0.2~40)iim。纖維的直徑例如可以用掃描型電子顯微鏡(倍率200倍左右)觀察支架材料而求得。另外，纖維的任意橫截面可以為大致正圓，也可以為異形。纖維的任意橫截面為異形時，由于纖維的比面積增大，因此在細胞培養時，可以獲得細胞黏附在纖維表面上的充分面積。這里，纖維的任意橫截面為異形是指纖維的任意橫截面并非大致正圓形狀的任何形狀，包括纖維表面同樣地具有凹部和/或凸部、經粗面化的情況。異形形狀優選為選自纖維表面的微細凹部、纖維表面的微細凸部、面的纖維軸方向的凸部和纖維表面微細孔部中的至少l種，它們可以單獨地形成、還可以混存多種。這里，上述"微細的凹部"、"微細的凸部"是指纖維表面上形成0.1lpm的凹部或凸部，"微細孑L"是指纖維表面存在具有0.1~lpm直徑的細孔。另外，上述條紋狀地形成的凹部和/或凸部是指在纖維軸方向上形成0.1~寬度的棱紋形狀。支架材料的表觀密度為95~350kg/m3、優選為100~300kg/m3、更優選為100~250kg/m3。表觀密度低于95kg/m3時，雖然細胞侵入性良好，但機械強度低。超過350kg/m"時，細胞難以侵入，作為支架材料不優選。表觀密度可以測定所得集合體的體積(面積x高度)和質量而計算。將支架材料用于移植時，有必要的是耐受移植初期的加重壓縮的機械強度。通過使本發明支架材料的纖維取向方向朝向加重壓縮方向，可以賦予相對于壓縮的形狀穩定性。本發明的支架材料的壓縮彈性率優選為0.5MPa~5MPa、更優選為1.5MPa~5MPa。本發明的支架材沖牛的多孔度優選為75~90%、更優選為78~88%。多孔度通過從多孔體的容積減去聚合物容積的比例而求得。構成本發明支架材料的纖維主要由生物配伍聚合物構成。優選纖維的重復單元的優選80~100摩爾％、更優選90~100摩爾％包括生物配伍單體來源的重復單元。生物配伍的單體可以舉出乙醇酸、乳酸、己內酯、二氧雜環已酮等。另外，還可以是生物配伍聚合物的摻混物。8生物配伍聚合物優選為生物吸收性聚合物。生物吸收性聚合物優選主要由脂肪族聚酯構成。脂肪族聚酯可以舉出聚乙醇酸、聚乳酸、聚己內酯、聚二氧雜環已酮、聚三亞甲基碳酸酯、聚丁二酸丁二醇酯、聚丁二酸乙二醇酯和它們的共聚物等。其中，作為脂肪族聚酯優選為選自聚乙醇酸、聚乳酸、聚己內酯和它們的共聚物的至少1種。其中，優選乳酸和乙醇酸的共聚物。共聚比優選為前者/后者(摩爾)-20/80-80/20、更優選為40/60~75/25。除了生物吸收性聚合物之外，聚酯、尼龍、聚砜、聚氨酯、聚乙烯、聚丙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸羥乙酯、聚氯乙烯、聚硅氧烷等生物聚合物也可作為構成多孔體的聚合物使用。生物配伍聚合物的固有粘度為0.1~1.4dL/g、優選為0.04~1.3dL/g、更優選為0.6~1.2dL/g(30°C、六氟異丙醇)。另外，本發明支架材料中還可以含有生物配伍聚合物以外的第2成分。該成分優選為選自磷脂類、糖質類、糖脂類、甾類、聚氨基酸類、蛋白質類和聚烯化氧類、FGF(纖維母細胞生長因子)、EGF(上皮生長因子)、PDGF(血小板來源生長因子)、TGF-p(p型轉化生長因子)、NGF(神經生長因子)、HGF(肝細胞生長因子)、BMP(骨形成因子)等細胞生長因子中的至少1種。具體地可以舉出磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油等磷脂類和/或多聚半乳糖醛酸、肝素、硫酸軟骨素、透明硬脂酸、硫酸皮膚素、軟骨素、硫酸葡聚糖、硫酸化纖維素、藻酸、葡聚糖、羧曱基殼多糖、半乳甘露聚糖、阿拉伯膠、黃荒膠、結冷膠、硫酸結冷膠、卡拉牙膠、瓊脂、黃原膠、可得然膠、普魯蘭多糖、纖維素、淀粉、羧甲基纖維素、曱基纖維素、葡甘露聚糖、殼多糖、殼聚糖、木糖葡聚糖、香菇多糖等糖質類和/或半乳糖腦苷、葡萄糖腦苷脂、紅細胞糖苷脂、乳糖神經鞘脂質、三己糖神經鞘氨醇、paragloboside、半乳糖基二酰基甘油、硫代奎諾糖二酰基甘油、磷脂酰肌醇、磷酸多辟醇糖脂等糖脂類和/或膽固醇、膽酸、皂苷、洋地黃毒苷等甾類和/或聚天冬氨酸、聚谷氨酸、聚賴氨酸等聚氨基酸和/或膠原、明膠、纖維粘連蛋白、纖維蛋白、層粘蛋白、酪素、角蛋白、絲膠、凝血酶等蛋白質類和/或聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯丙烯烷基醚、聚氧乙烯山梨聚糖醚等聚烯化氧類等。作為第2成分的優選含量相對于生物配伍聚合物100重量份為0.01~50重量份。<制造方法>本發明的支架材料可以利用第1~第3工序制造。(第1工序)第1工序為所謂的靜電紡絲法。第1工序為從噴嘴將含有生物配伍聚合物的紡絲原液噴出至在電極間形成的靜電場中，形成纖維的工序。靜電場在一對或多個電極間形成。電極可以是金屬、無機物或有機物的任一種，只要顯示導電性即可。另外，還可以是在絕緣物上具有顯示導電性的金屬、無機物或有機物薄膜者。可以對任何電極施加高電壓。這例如包括使用電壓值不同的高電壓的電極為2個(例如15kV和10kV)、接地的電極共計3個電極的情況，或者還包括使用超過3根數目電極的情況。優選一個電極為噴嘴、其它電極為捕獲電極。電極間的距離依賴于帶電量、噴嘴尺寸、紡絲液流量、紡絲液濃度等，優選在10kV左右時為1520cm的距離。所施加的靜電電位優選為3100kV、更優選為550kV、進一步優選為5~30kV。紡絲原液含有生物配伍聚合物和溶劑。生物配伍聚合物如上所述。紡絲原液中的生物配伍聚合物的濃度優選為1~30重量％、更優選為2~20重量％。生物配伍聚合物的濃度低于1重量％時，由于濃度過低，因此難以形成纖維，不優選。另外，超過30重量％時，所得纖維的直徑變大，不優選。溶劑優選溶解生物配伍聚合物、常壓下沸點為20(TC以下、室溫下為液體的物質。溶劑例如可以舉出二氯曱烷、氯仿、丙酮、曱醇、乙醇、丙醇、異丙醇、甲苯、四氫呋喃、1,1,1,3，3,3-六氟異丙醇、水、1,4-二噁烷、四氯化碳、環己烷、環己酮、N,N-二曱基曱酰胺、乙腈等。其中，生物配伍聚合物特別從脂肪族聚酯的溶解性等出發，特別優選二氯曱烷、氯仿、丙酮。這些溶劑可以單獨使用，還可以組合多個溶劑。另夕卜，本發明中，還可以在不損害本發明目的的范圍內并用其它溶劑。噴嘴的口徑優選為0.6-1.5mm。當將紡絲原液從噴嘴供于靜電場中時，還可以使用多個噴嘴提高纖維狀物質的生產速度。噴出可以通過利用注射器等具有活塞的注射管擠出紡絲原液而進行。另外，還可以是前端具有細孔(噴嘴)的管。此時，紡絲原液通過靜電電位差被牽引，被拉向電極。纖維不僅是蒸餾除去溶劑的狀態，還包括仍含有溶劑的狀態。10優選在噴嘴和電極之間使用除靜電裝置。除靜電裝置是指使離子氣接觸于纖維、均勻地保持離子平衡，在到達電極之前緩和纖維的帶電狀態，從而分散在空氣中的裝置。通過使用該裝置，可以增加巻形物的厚度。通過增加巻形物的厚度，可以獲得直徑大的支架材料。(第2工序)第2工序是將所得纖維以旋轉的巻軸為中心巻繞、堆積，獲得纖維在平行于巻軸的面上取向的巻形物的工序。以處于噴嘴和捕獲電極之間的巻繞裝置的巻軸為中心堆積纖維。巻軸的形狀可以為圓柱狀，還可以為棱柱狀。支架材料的平均表觀密度由于依賴于巻軸的旋轉數，因此通過控制巻軸的旋轉數，可以獲得具有所需平均表觀密度的支架材料。具體地說，在旋轉數高時，所得支架材料的平均表觀密度高。與此相對，在旋轉數低時，所得支架材料的平均表觀密度低。巻軸的旋轉速度優選為1~1000次/分鐘、更優選為5~200次/分鐘。所得巻形物基本取向在平行于巻軸的面上。巻形物的形狀為圓柱狀、紡錘狀等任意形狀。第2工序后，優選對所得巻形物進行熱處理。熱處理溫度優選為40~90°C。通過進行熱處理，可以獲得纖維之間熱熔融、具有優異壓縮強度的支架材料。通過圖1~4說明第1和第2工序。圖1為使用注射管、圖2為使用細管狀噴出器的例子。圖l中，紡絲原液(2)填充于具有噴嘴(1)的注射管的紡絲原液保持槽(3)。利用高電壓發生器(6)向噴嘴(1)施加電壓時，在正電極(4)和負電極(5)之間形成靜電場。當從噴嘴(1)擠出紡絲原液(2)時，帶有電荷的紡絲原液在靜電場中向負電極(5)移動，形成纖維。另外，還可以利用圖2所示的方法形成纖維。紡絲原液(2)填充于具有噴嘴(1)的細管狀噴出器的紡絲原液保持槽(3)。在紡絲原液保持槽(3)內插入正電極(4),利用高電壓發生器(6)施加電壓時，在與負電極(5)之間形成靜電場。當調節噴出器前端的噴嘴(1)和負電極(5)的距離時，從噴嘴(l)中噴出帶電荷的紡絲原液，在靜電場中向負電極(5)移動，形成纖維。纖維被處于負電極(5)前面的巻繞裝置(7)巻繞。ii本發明中，在將紡絲原液(2)拉向負電極(5)的期間，溶劑蒸發，形成纖維。為通常的室溫時，在被捕獲到巻繞裝置(7)之前溶劑完全地蒸發，但在溶劑蒸發不足時也可以在減壓條件下拉絲。另外，拉絲的溫度依賴于溶劑的蒸發行為或紡絲液的粘度，通常為0~50°C。圖3和圖4為設置除靜電裝置(8)的例子。可以在噴嘴(1)和負電極(5)之間設置除靜電裝置(8)進行紡絲，利用巻繞裝置(7)捕獲纖維。(第3工序)第3工序為從所得巻形物切出3維結構體的工序。3維結構體例如可以使用圓筒形的穿孔器如圖5所示地挖通。圖5中，優選平行地挖通3維結構體的高度方向和纖維的取向方向(10)。另外，優選按照3維結構體的高度方向和纖維的取向方向達到垂直而挖通(12)。支架材料(10)與支架材料(12)相比，壓縮強度優異。<細胞的分化增殖〉可以使用本發明的支架材料使細胞分化增殖。細胞的分化增殖可以在生物體外、生物體內的任一者中進行。在生物體外可以作為用于分化增殖細胞的培養基材使用。在生物體內可以作為本發明的支架材料的修復材料使用。特別是，可以通過將本發明的支架材料埋入損傷的患部使生物組織再生。或者，還可以將生物體外在本發明支架材料中培養有細胞的物質作為修復材料埋入患部。生物組織例如可以舉出軟骨組織。實施例實施例中使用的材料、測定方法如下所述。(1)乳酸-乙醇酸共聚物LACTEL(DL乳酸/乙醇酸共聚物、摩爾比=50/50、固有粘度1.05dL/g、30°C、六氟異丙醇、AbsorbabelPolymersInternational-土制)(2)二氯曱烷、乙醇、甲醛和光純藥工業(抹)制(3)大鼠間葉系干細胞大日本住友制藥(抹)制(4)MEM(MinimumEssentialMedium)、FBS(胎牛血清)、PBS(磷酸緩沖鹽)、抗生素-抗真菌劑(Antibiotic-Antimycotic)、0.05%胰蛋白酶-EDTA溶液Invitrogen制(5)L-抗壞血酸2-磷酸鎂鹽n水合物(含水量26.7%)、P-磷酸甘油二鈉n水合物、地塞米松、TritonX-lOO、甲苯胺藍；Sigma制(6)PicoGreen(注冊商標)dsDNAQuantitiationKit:MolecularProbe制<實施例1>(紡絲原液的調制)將乳酸-乙醇酸共聚物(摩爾比=50/50)溶解在二氯曱烷和乙醇的混合溶劑中，調制15重量％的紡絲原液。(紡絲)使用圖4所示的裝置，利用靜電紡絲法獲得包括纖維集合體的圓筒體狀巻形物。噴嘴(1)的內徑為1.3mm。噴嘴(1)至巻繞裝置(7)的距離為20cm、噴嘴(1)至除靜電裝置(8)的距離為35cm。施加電壓為15kV。在噴嘴(1)和負電極(5)之間設置巻繞裝置(7)和春日電機(抹)制的除靜電裝置(8)。在紡絲原液保持槽(3)內插入正電極(4)。巻繞裝置(7)的旋轉數設定為100rpm。將紡絲原液放入紡絲原液保持槽(3),調整噴嘴(1)和負電極(5)的距離，將纖維從噴嘴(1)中噴出。噴出持續120分鐘，用旋轉的巻繞裝置(7)巻繞纖維，獲得圓筒體狀的巻形物。將巻形物放入恒溫器內，在8(TC下保持10分鐘，進行熱處理。(切出)以圖5所示要領，使用活檢環鉆(力447夕'只卜卩一X(抹)制)從所得巻形物切出圖5中10所示的直徑5mmx高5mm的圓筒狀支架材料。(特性評價)利用以下的方法測定所得支架材料的特性。結果示于表1。(1)纖維的直徑纖維的直徑為^吏用凄t字顯樣i鏡(4朱式會岸土KEYENCEVHXDIGITALMICROSCOPE)或掃描型電子顯微鏡(日本電子制、倍率200倍)進行目一見觀察。電子顯微鏡，見察中，每個碎見野選擇任意10根進行測定，對于5個視野實施該操作，計算共計50根的平均值。測定對象物中除了纖維形成過程中產生的塊狀異物、纖維之間熔融成為束狀者。(2)支架材料的表觀密度利用下式計算支架材料的表觀密度。13(p:多孔體的表觀密度、m:質量、i直徑、h:高度)(3)支架材料的多孔度支架材料的多孔度利用下述式計算。(s:支架材料的多孔度、p:多孔體的表觀密度、po:聚合物的固有密度)(4)壓縮強度壓縮強度對于圖5(IO)相應的支架材料而言，根據JISK7220測定。即，對于纖維在平行于圓筒體高度方向的方向上取向的支架材料進行測定。將試驗片放置在材料試驗機的加壓面之間，確認使試驗片的中心線與加壓面的中心線一致、且試—驗片的上面和下面與加壓面平^亍。以試一驗速度10mm/mm的一定速度對試-驗片施加荷重，進行測定直至達到壓縮限度。<實施例2〉(紡絲原液的調制)與實施例1同樣使用乳酸-乙醇酸共聚物進行調制，使得達到10重量％。(紡絲)除了4吏噴出時間為90分鐘、在7(TC下進^f亍熱處理IO分鐘以外，通過與實施例1相同的方法獲得包括纖維集合體的圓筒體狀的巻形物。(切出)利用與實施例1相同的方法，從所得巻形物切出對應于圖5的10的直徑5mmx高度5mm圓筒狀支架材料。將平行于對應圖5的10的支架材料底面的截面的顯微鏡照片(倍率15倍)示于圖6(上底面)和圖7(下底面)。可知纖維層狀地堆積。(特性評價)利用與實施例1同樣的方法測定特性。將結果示于表1。(支架材料的生物學評價)(細胞的調制)利用以下的方法進行支架材料的生物學評價。使用含有15。/。FBS和1%抗生素-抗真菌劑的MEM在37°C、5%C02下培養大鼠間葉系干細胞，傳代3代。(細胞接種、培養)在所得支架材料上接種調制的大鼠間葉系干細胞，達到6.0x106個/cm3,4吏用添加有15%FBS和1%抗生素-抗真菌劑、lOiaM地塞米;NK50pML-抗壞血酸2-》粦酸4美鹽n水合物、10mM(3-;岸酸甘油二鈉n水合物的MEM在37。C、5。/。C02下培養12天。培養基更換每周進行3次。(評價)在培養第1天、第6天、第12天取出支架材料，用以下的方法進行DNA量的測定和組織學評價。(1)DNA量DNA量根據PicoGreen(注冊商標)dsDNAQuantitiationKit的測定手冊進行。測定試樣為用0.2。/。Triton-X100重復進行3次冷凍-溶解后，進行超聲波粉碎，獲得細胞懸濁液，由其調制提取液。在96孔板中放入100^1的進行過酶處理的測定試樣，加入用TE(pH7.5)稀釋200倍的PicoGreen(注冊商標)dsDNAQuantitiationReagent,在激發光485nm、熒光535nm的波長進行熒光的測定。,人標準DNA溶液的值制作標準曲線，以其為基礎計算測定試樣的DNA量。結果示于表2。DNA量與增殖的細胞數成比例。(2)組織學評價組織學評價首先在采樣時將支架材料浸漬于10%甲醛中。在染色前用蒸餾水洗滌支架材料，在100%乙醇中浸漬1小時共計2次、在90%乙醇中浸漬l小時、在70%乙醇中浸漬1小時，一邊階l殳地稀釋一邊進行洗滌。將其浸漬于蒸餾水15分鐘進行洗滌后，浸漬在0.4%甲笨胺藍水溶液1分鐘。之后進行1分鐘的流水洗滌，洗脫多余的染色液，使用凄丈字顯微4竟以45(M咅，見察。(3)結果將DNA量的測定結果示于表2。另外將培養第l天、第12天的支架材料的染色照片分別示于圖8和圖9中。培養第12天的支架材料與15第l天比，染色濃度高，另外染色范圍達到支架材料的深部，良好地產生細胞的增殖和軟骨基質。<實施例3〉(支架材料的制造)重復與實施例2同樣的才喿作，獲得對應于圖5的12的直徑5mmx高度5mm的圓筒狀支架材料。將測定其特性的結果示于表1。將垂直于對應圖5的12的支架材料底面的截面的顯微鏡照片(倍率200倍)示于圖10。纖維在面方向上取向。另外，將平行于對應圖5的(12)的支架材料底面的截面的顯微鏡照片(倍率15倍)示于圖11(上底面)和圖12(下底面)。可知纖維如網孔樣致密地堆積。(生物學評價)使用所得的支架材料，利用與實施例2同樣的方法培養細胞、測定DNA量。將其結果示于表2。將培養第1天、第12天的支架材料的染色照片分別示于圖13和圖14中。與實施例2同樣，培養第12天的支架材料與第l天比，染色濃度高，另外染色范圍從支架材料的表面擴展到深部，產生了良好的細胞增殖和基質。表1紡絲條件纖維的直徑(,)表觀密度(kg/m3)多孔度(%)壓縮強度旋轉數(rpm)"時間(分鐘)壓縮彈性率(MPa)10%位移應力(MPa)實施例110012022083.52.610.99實施例2100卯4.621483.74.580.12實施例3100907.822482.01.340.01*1:巻繞裝置的旋轉數(rpm)16表2<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>發明效果本發明的支架材料的機械強度優異、能夠承受移植初期的加重壓縮。因此，可以用于軟骨損傷部位等需要機械特性的部位。本發明的支架材料由于由生物配伍聚合物構成，因此不會對生物造成不良影響。本發明的支架材料具有一定的纖維密度，細胞能夠容易地侵入，且能夠迅速地進行氧和營養的補充、二氧化碳或老廢物的排出。因此能夠良好地4吏細胞增殖。另外，通過本發明的制造方法，可以利用簡單的方法制造該支架材料。通過本發明的制造方法，由于將利用靜電紡絲法獲得的纖維堆積在旋轉的巻軸上，因此可以獲得在堆積方向上具有均勻纖維密度的纖維堆且，通過將纖維巻繞至旋轉的巻軸，可以在纖維丄施加一定的張力，獲得高密度的纖維堆積物。通過本發明的細胞增殖方法，可以良好地^l吏細胞增殖。另外，通過本發明的生物組織的再生方法可以良好地使損傷的生物組織再生。產業實用性本發明的支架材料作為再生醫療領域中的細胞培養基材有用。另外，本發明的支架材料作為修復材料優選，其中作為軟骨損傷部位等機械特性重要的部分的修復材料有用。權利要求1.一種支架材料，其為包括纖維的集合體、具有由2個底面和側面構成的3維結構，(1)纖維在面方向上取向、(2)纖維的直徑為0.05～50μm、(3)纖維主要由生物配伍聚合物構成、(4)表觀密度為95～350kg/m3。2.權利要求1所述的支架材料，其中，纖維在平行于高度方向的面方向上取向。3.權利要求1所述的支架材料，其中，纖維在垂直于高度方向的面方向上取向。4.權利要求1所述的支架材料，其中，纖維的直徑為0.2~40pm。5.權利要求1所述的支架材料，其表觀密度為100~250kg/m3。6.權利要求1所述的支架材料，其多孔度為75~90%。7.權利要求1所述的支架材料，其高度為0.5mm以上。8.^f又利要求1所述的支架材料，其底面的面積為0.05~8cm2。9.權利要求1所述的支架材料，其為圓筒體或多棱柱。10.權利要求1所述的支架材料，其高度方向的壓縮彈性率為0.5~5MPa。11.權利要求1所述的支架材料，其中生物配伍聚合物為生物吸收性。12.權利要求1所述的支架材料，其中生物配伍聚合物為脂肪族聚酯。13.權利要求1所述的支架材料，其中脂肪族聚酯為選自聚乙醇酸、聚乳酸、聚己內酯和它們的共聚物的至少1種。14.權利要求1所述的支架材料，其為修復材料或細胞培養基材。15.權利要求112任一項所述支架材料的制造方法，其包括以下工序(1)從噴嘴向在電極間形成的靜電場中噴出含有生物配伍聚合物的紡絲原液，形成纖維、(2)將所得纖維以巻軸為中心巻繞，形成纖維在平行于巻軸的面的方向上取向的巻形物、(3)由所得巻形物切出3維結構體。16.權利要求14所述的制造方法，其使用除靜電裝置形成纖維。17.使用權利要求1所述支架材料使細胞分化增殖的方法。18.將權利要求1所述的支架材料埋入損傷的患部使生物組織再生的方法。全文摘要本發明的目的在于提供機械強度、細胞增殖性優異，適合作為細胞培養基材或修復材料的支架材料。本發明為一種支架材料，其為包括纖維的集合體、具有由2個底面和側面構成的3維結構，(1)纖維在面方向上取向、(2)纖維的直徑為0.05～50μm、(3)纖維主要由生物配伍聚合物構成、(4)表觀密度為95～350kg/m³的用于細胞增殖的支架材料。文檔編號D04H3/07GK101443053SQ20078001646公開日2009年5月27日申請日期2007年3月5日優先權日2006年3月6日發明者中山三由紀,兼子博章,北園英一,福富千秋,茅島美佳申請人:帝人株式會社