專利名稱：具有強力的抵抗酪氨酸酶活性的葡萄種子提取物及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及葡萄種子提取物和它作為抵抗酪氨酸酶的強力抑制活性的用途。更具體地說，本發明涉及葡萄種子提取物的用途，該提取物是用水，乙醇，甲醇或丙酮萃取葡萄種子制備的，該提取物可以作為美白化妝品，治療色素和預防食物變黑。
現有技術的說明黑色素是苯酚類型的大分子，由黑色色素和蛋白質的復合物組成。這一多聚體色素可以在動物的皮膚，眼睛，毛發，鳥的皮毛和當蘋果，土豆和香蕉的切面與空氣接觸產生的棕色表面中看到。在身體中的過量黑色素可以導致面部變色，在皮膚上形成雀斑，促進皮膚老化，甚至可能是皮膚癌的起因。另外，對于食物，如蔬菜，水果和魚，如果合成了較多的黑色素，它們的質量就下降了。
據報道，黑色素是通過酪氨酸酶的作用生物合成的。酪氨酸酶，一種與銅結合的單加氧酶，廣泛存在于動物，植物，微生物和人，催化酚化合物如單羥基苯丙氨酸和二羥基苯丙氨酸(DOPA)的需氧氧化。當皮膚在紫外線下過度暴露時，酪氨酸酶的作用是在暴露的區域儲存melanintorth，損壞或老化皮膚。另外，在蔬菜和水果中的變黑現象是由多酚氧化酶如酪氨酸酶引起的。
動物黑色素，是由酪氨酸酶催化合成的，可以分為黃色-微紅棕色pheomelanin和棕黑色真黑色素。
黑色素的生物合成取決于酪氨酸酶的活性。將L-酪氨酸羥化成L-3，4-二羥基苯丙氨酸(DOPA)，后者氧化成多巴醌，進一步成為隱色素，最后成為多巴色素。將多巴色素轉換成為5，6-二羥基吲哚(DHI)，然后，氧化聚合化，最后與蛋白質結合。除了將多巴色素轉換成DHI，已報道的一個可替代的途徑是其中的多巴色素是5，6-二羥基吲哚羧酸(DHICA)，作用的酶是多巴色素互變異構酶。
最近對與皮膚癌相關的黑色素的生物合成代謝進行了廣泛的研究。結果是，開發了各種黑色素合成抑制劑，并用于醫學作為皮膚病的治療劑，用于化妝品工業作為皮膚美白劑，以預防和治療面部的變黑和雀斑和在食品工業中用作變色防護劑。最近，在與環境問題的關聯中，對這些黑色素合成抑制劑的需求已經大大提高。
所以，迄今為止對黑色素合成抑制劑的主要研究集中在酪氨酸酶抑制劑的開發上。代表性的酪氨酸酶抑制劑是用于形成酪氨酸酶的協同因子的螯合物的物質，即銅離子，還原劑，如抗壞血酸，用于將醌還原成酚，和重硫酸鹽用于變性酪氨酸酶本身。
這種酪氨酸抑制劑現在被開發為各種美白劑，但存在著各種問題。例如，4-羥基苯甲醚和羥基醌，它們現在用于局部治療色素疾病如變色，雀斑，斑點和懷孕期間的色素沉著，這兩種物質具有強力的抵抗黑色素形成的抑制活性，但具有的副作用是引起色素細胞的變性或死亡，和損壞細胞的內部功能。特別是，羥基醌化合物被開發為黑色素生物合成的美白乳液抑制劑，但羥基醌化合物的用途現在只在幾個國家允許使用，因為據報道由于它們的細胞毒性，它們能引起皮膚刺激或皮膚疾病。所以，已經進行了更多的努力選擇對身體安全的天然物質，如酪氨酸酶抑制劑。
本發明人通過對酪氨酸酶深入和完全的研究，發現濃縮的鞣酸或原花色素，一種多酚化合物，具有強力的抵抗酪氨酸酶的活性，以致能抑制黑色素的生物合成并且以相當大的量包含在葡萄種子中。
本發明的概要本發明的目的是為克服現有技術中遇到的上述問題，提供一種葡萄種子提取物，該提取物具有對酪氨酸酶的強力的抑制劑活性，所以能預防黑色素的生物合成。
本發明的另一目的是提供一種葡萄種子提取物，它被用作需要抑制黑色素合成的產物的有效成分。
根據本發明，通過提供一種葡萄種子提取物可以達到上面的目的，該葡萄種子提取物具有對酪氨酸酶的抑制活性。通過利用水或60-90％有機溶劑如乙醇，甲醇或丙酮在熱水條件或加熱條件下萃取可以制備葡萄種子提取物。
根據本發明的另一方面，提供了一種化妝品物質，其中含有作為有效成分的葡萄種子提取物，該提取物具有抑制黑色素生物合成，預防皮膚老化，保護皮膚和美白皮膚的功能。
根據本發明的另一方面，提供了一種抑制黑色素生物合成的藥物組合物，該藥物組合物含有葡萄種子提取物作為藥物有效成分。該藥物組合物是變色，雀斑，斑點和懷孕過程中的色素沉著的治療劑。
根據本發明的另一方面，提供了一種食物添加劑，其中含有作為預防變黑的有效成分的葡萄種子提取物，如在水果，蔬菜和魚中。
附圖的簡要說明
圖1顯示了相對與葡萄種子提取物和羥基醌的樣品濃度劃出的酪氨酸酶的抑制百分數，其中符合◆表示利用70％的乙醇(30℃)獲得的葡萄種子提取物，符號■表示利用70％的丙酮獲得的葡萄種子提取物，符號Δ是羥基醌，符號●是利用熱水獲得的葡萄種子提取物，符號□是利用70％乙醇(90℃)獲得的葡萄種子提取物，符合0是利用70％甲醇(90℃)獲得的葡萄種子提取物。
圖2顯示了葡萄種子提取物在Streptomyces bikiniensis中抵抗黑色素生物合成的作用形成的抑制區。
本發明的詳細說明本發明涉及葡萄種子提取物對酪氨酸酶的活性的抑制。為了制備葡萄種子提取物，利用水和有機溶劑在各種溫度提取脫脂葡萄種子粉末。在這點上，首先考慮溶劑和溫度，因為它們在干燥后影響多酚，即本發明的有效成分，的產量和含量。優選利用60-90％的丙酮在熱水條件下和60-90％乙醇或60-90％甲醇在加熱條件下進行提取，更優選地是利用70-80％在熱水條件下或70-80％或70-80％甲醇在加熱條件下進行。
從蘑菇酪氨酸酶與L-二羥基苯丙氨酸(L-DOPA)的反應獲得的葡萄種子提取物對酪氨酸酶的抑制活性的吸收資料證明在酪氨酸酶的抑制活性上，葡萄種子提取物比常規化學物質如曲酸，羥基醌，熊果苷，4-羥基茴香醚，抗壞血酸，松香油和氫化可的松優越。特別是，利用70-80％的丙酮在熱水條件下或利用70-80％乙醇或甲醇在加熱條件下制備的葡萄種子提取物顯示優選的抑制活性。
利用生物合成黑色素的微生物，如Streptomyces bikiniensis測量葡萄種子提取物對黑色素生物合成的抑制活性。葡萄種子的提取物形成的抑制區相對于曲酸，羥基醌，熊果苷和4-羥基茴香醚形成的那些更大和更清晰。
所以，本發明的葡萄種子提取物，酪氨酸酶活性的抑制劑，可以用于預防和治療變色，雀斑，斑點和懷孕過程中的色素沉著。另外，葡萄種子提取物可以用作化妝品物質，該物質可以加入柔潤的皮膚洗液，營養皮膚洗液，營養乳液，按摩乳液，精華乳液和化妝品包裝中，以便發揮抑制黑色素生物合成，預防皮膚老化，保護皮膚和美白皮膚的功能。另外，葡萄種子提取物可以用作預防變黑的食物添加劑，如在水果，蔬菜和魚中，并能維持食物的新鮮。
因為葡萄種子提取物是來自水果的提取物，已經證明是無害的，它可以用作醫學治療劑。對于用它制備藥物，可以使用本領域已知的方法。例如，單獨或與藥物可接受載體，構成試劑，稀釋劑和諸如此類組合，可以將葡萄種子提取物配制進各種制劑，包括軟膏，粉末，顆粒，片劑，錠劑，膠囊，用于注射的液體和諸如此類。它們可以口服或腸胃外或包衣在皮膚上給藥。
根據它的吸收效率，失活深度，和揮發速度，病人的年齡，性別和癥狀，和疾病的嚴重性，來確定藥物有效成分的劑量。通常，以5-300毫克一天，優選地25-200毫克一天給藥葡萄種子提取物。至于這些配制的制劑的給藥途徑，如果需要，可以按照專家的建議。該制劑可以施用或以一定規律的間隔包覆在皮膚上。
通過下面的實施例可以更好地理解本發明，這些實施例只是為了說明，不是對本發明的限制。實施例1制備葡萄種子提取物用水洗滌葡萄種子，利用碾磨機粉碎，利用己烷脫脂并干燥。將這樣得到的葡萄種子的粉末的等分試樣100克在不同的溫度下加入各0.5-3升水，乙醇，甲醇和丙酮，根據溫度，利用振搖溫育器(30℃)或裝備溫度控制器的回流提取器(60-95℃)12小時內提取。在減壓下，利用旋轉蒸發器在50℃濃縮得到的粗提取物，然后，在真空中干燥得到粉末狀葡萄種子提取物。根據提取溶劑和溫度，從葡萄種子和粉末葡萄種子提取物的重量的測量計算葡萄種子提取物的干產量。對于葡萄種子的多酚含量，利用了FollinDennis方法。考慮到根據提取溶劑和溫度的干產量和多酚含量，發現最有效的提取是利用70-80％丙酮在熱水條件下和利用70-80％乙醇或甲醇在加熱條件下獲得的。
表1
實施例II葡萄種子提取物對酪氨酸酶的抑制活性將蘑菇酪氨酸酶(Sigma，E.C.1.14.18.1)用于研究實施例I制備的粉末葡萄種子提取物的抑制活性。將酪氨酸酶溶解于1/15摩爾的磷酸緩沖液(pH6.8)，使給出的酶溶液的濃度為1560單位/毫升，將酶溶液儲存在冰箱中。在冰上融化酶溶液以便使用。作為底物，在1/15摩爾磷酸緩沖液中，在稍微屏蔽的瓶中溶解L-3，4-二羥基苯丙氨酸(L-DOPA)。在使用前即時制備這一溶液。
在25℃，與1.4615毫升1/15摩爾磷酸緩沖液一起，預溫育0.0625毫升(78單位)的酪氨酸酶溶液5分鐘，然后加入0.476毫升L-DOPA溶液。在475納米測量吸光值10分鐘。這一實驗進行了對照組(A)(酪氨酸酶+1/15摩爾磷酸緩沖液)，空白組(B)(1/15摩爾只有磷酸緩沖液)，樣品組(C)(酪氨酸酶+葡萄種子提取物)和酶對照組(D)(1/15摩爾磷酸緩沖液)。每組制備三份進行實驗。從吸光值的測量，根據下面的方程計算酶抑制％。作為對照，使用的是曲酸，羥基醌，熊果苷，4-羥基茴香醚，抗壞血酸，松香油和羥基可的松。
資料顯示利用70-80％丙酮在熱水條件下和利用70-80％乙醇或甲醇在加熱條件下獲得的含有最高含量多酚的葡萄種子提取物與任何對照相比具有強力的抑制活性。方程I
其中，A沒有GSE的對照在475納米處的吸光值B既沒有GSE也沒有酶的對照在475納米處的吸光值C含有GSE和酶的測試樣品在475納米處的吸光值D沒有酶的對照在475納米處的吸光值。
表2GSE對酪氨酸酶活性的抑制
表3對照對酪氨酸酶活性的抑制
實施例IIIGSE對黑色素生物合成的抑制活性為了研究實施例1得到的粉末葡萄種子提取物對黑色素生物合成的抑制活性，利用了Streptomyces bikiniensis。在papavizas’s VDYA(15)斜面培養基中接種這一菌株，該培養基含有200毫升V-8汁(Cambell Soup公司，美國)，2克葡萄糖，2克酵母提取物，1克CaCO3，2克細菌培養瓊脂，和800毫升蒸餾水。在28℃溫育2星期后，在斜面培養基中加入2毫升蒸餾水，用金屬針刮下氣生的菌絲形成的孢子，得到孢子懸浮液，然后在冷凍溫度儲存在無菌試管中。
將含有葡萄糖1.5％，L-酪氨酸0.05％，L-精氨酸0.1％，K2HPO40.05％，MgSO4，7H2O 0.05％，NaCl 0.05％，FeSO4.7H2O 0.001％，細菌酵母提取物0.2％和細菌瓊脂2％的酪氨酸瓊脂(ISP號7)高壓滅菌，在每盤(90毫米i.d.)注入40毫升的量，并固化。在這樣制備的各個瓊脂平板上，加入0.4毫升S.bikiniensis孢子懸浮液，利用玻璃彎曲棒均一地涂布。干燥固體培養基的表面。在浸泡在測試組后，將直徑8毫米的紙片(Toyo Roshi Kasha有限公司，日本)放在培養基上。在28℃溫育48小時導致出現抑制區。在平板的背面測量黑色素合成的抑制區的大小。作為對照，使用的是曲酸，羥基醌，熊果苷和4-羥基茴香醚。
利用熱水，70-80％丙酮，70-80％乙醇和70-80％甲醇獲得的葡萄種子提取物形成相對大而清楚的抑制區，如圖2所示。
表4在S.bikiniesis中GSE對黑色素生物合成的抑制
<p>表5在S.bikiniensis中對照對黑色素生物合成的抑制百分數
制備實施例I如下給出含有葡萄種子提取物的柔潤洗液的配方。利用75％乙醇在實施例I的加熱條件下獲得用于這一目的的葡萄種子提取物。重量份葡萄種子提取物 0.01甘油3.0丁二醇 12.0丙二醇 12.0羧基乙烯基聚合物0.1乙醇 10.0三乙醇胺0.1防腐劑 痕量色素 痕量香料 痕量蒸餾水加到100重量份制備實施例II如下給出含有葡萄種子提取物的柔潤洗液的配方。用于這一目的的葡萄種子提取物與制備實施例I的相同。重量份葡萄種子提取物0.01石蠟4.0聚溶劑合物60 1.5Sorbi tance squiolate 0.5液體石蠟 5.0角鯊烯 5.0辛基/葵基甘油三酯5.0甘油3.0丁二醇 13.0丙二醇 13.0羧基乙烯基聚合物 0.1三乙醇胺 0.2防腐劑 痕量色素痕量香料痕量蒸餾水加到100重量份制備實施例III如下給出了含有葡萄種子提取物的營養乳液的配方。用于這一目的的葡萄種子提取物與制備實施例I的相同。重量份葡萄種子提取物 0.005蠟 10.0聚溶劑合物 601.5Sorbitance squiolate 0.5液體石蠟 10.0角鯊烯5.0辛基/葵基甘油三酯 5.0甘油 5.0
丁二醇 13.0丙二醇 13.0三乙醇胺 0.2防腐劑 痕量色素 痕量香料 痕量蒸餾水加到100重量份制備實施例IV如下給出含有葡萄種子提取物的按摩乳液的配方。用于這一目的的葡萄種子提取物與制備實施例I相同。重量份葡萄種子提取物0.005蠟 10.0聚溶劑合物60 0.8Sorbi tance squiolate0.5液體石蠟 40.0角鯊烯 5.0辛基/葵基甘油三酯 4.0甘油 5.0丁二醇 13.0丙二醇 13.0三乙醇胺 0.2防腐劑 痕量色素痕量香料痕量蒸餾水加到100重量份。制備實施例V如下給出含有葡萄種子提取物的包裝的配方。用于這一目的的葡萄種子提取物與制備實施例I的相同。重量份葡萄種子提取物0.005聚乙烯基乙醇 13.0羧甲基纖維素鈉0.2尿囊素0.1壬基苯醚 0.3防腐劑痕量色素 痕量香料 痕量蒸餾水加到100重量份實驗實施例I抑制皮膚上的色素將所有20個健康男人和婦女測試者的手臂包裹起來，除了前臂上2×2厘米2的預定面積，接著在每塊暴露的皮膚離兩個光源10厘米的距離輻射紫外光，光源如Toshiba，Japan銷售的“FL20S BLB”和“FL20S E-30”，能量為0.8×107erg/厘米2。輻射每天進行一次，總共3天。在輻射之前，暴露的皮膚用70％異丙基乙醇溶液清潔。在輻射后，將制備實施例I-V的制劑用于紫外輻射的皮膚3次一天，總共3星期。然后，肉眼觀察確定色素的變化，并與那些對照比較(不用制劑的)。本發明的制劑對色素的抑制效果分成良好，有效和無效級別。下面的表6給出了結果。
表6<
<p>在表6的數據中可以看到本發明的制劑顯示了對色素的良好的抑制活性，因為至少65％的測試者的結果是“有效”或“良好”。
正如本文前面所述，從天然物質制備的本發明的葡萄種子提取物具有對酪氨酸酶的強力的抑制活性而沒有副作用，以致在葡萄種子提取物的影響下，可以良好的效果抑制黑色素的生物合成。所以，葡萄種子提取物可用作化妝品，具有抑制黑色素生物合成，預防皮膚老化，保護皮膚和美白皮膚的功能，可用作藥物試劑用于預防和治療變色，雀斑，斑點和懷孕期間的色素沉著，和用作防止食物變黑的食物添加劑。
本發明已經通過說明的方式進行了敘述，所使用的術語應被理解為用于敘述而不用于限制。
基于上面的陳述，可以對本發明進行許多的修改和變化。所以在權利要求的范圍內，可以通過具體描述的方式以外的方式實施本發明。
權利要求
1.一種具有針對酪氨酸酶的抑制活性的葡萄種子提取物，它是通過用水或有機溶劑萃取葡萄種子制備的。
2.如權利要求1所述的葡萄種子提取物，其中所述的有機溶劑是60-90％乙醇，甲醇或丙酮，并在熱水條件下或加熱條件下用于提取。
3.如權利要求1所述的葡萄種子提取物，其中它被用作化妝品的有效成分用于抑制黑色素生物合成，預防皮膚老化，保護皮膚或美白皮膚。
4.如權利要求1所述的葡萄種子提取物，其中它被用作抑制黑色素生物合成的藥物組合物的有效成分。
5.如權利要求4所述的葡萄種子提取物，其中它是變色，雀斑，斑點或懷孕期間的色素沉著的治療劑。
6.一種食品添加劑，含有作為有效成分的權利要求1所述的葡萄種子提取物，以預防食物包括水果，蔬菜和魚的變色。
全文摘要
本發明公開了一種葡萄種子提取物和它的應用。利用水,乙醇,甲醇或丙酮作為提取溶劑在熱水條件或加熱條件下制備葡萄種子提取物。葡萄種子提取物具有對酪氨酸酶的強力的抑制活性而沒有副作用。所以,葡萄種子提取物可以用作化妝品,該化妝品具有抑制黑色素生物合成,預防皮膚老化,保護皮膚和皮膚美白的功能。
文檔編號A61Q19/00GK1255357SQ9910316
公開日2000年6月7日 申請日期1999年3月24日 優先權日1998年11月27日
發明者李允衡, 李承載, 張在權, 樸時鏞, 李鉉國 申請人:海太制果株式會社