專利名稱：人干細胞生長因子脂質體及其制備方法與應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于藥物制劑及化妝品領域，特別涉及一種人干細胞生長因子脂質體及其制備方法與應用。
背景技術：
人干細胞生長因子(humanstem cell growth factor，hSCGF，又名 LSLCL)是一種在骨髓造血微環境中起作用的早期造血刺激因子，具有多種生物學活性，主要分布于腦、肝臟、骨髓、胎盤、睪丸、腎臟等，由這些組織(尤其骨髓)中的基質細胞、成纖維細胞、內皮細胞、卵細胞、足細胞、肝細胞產生。其基因定位于人染色體19ql3. 3，由4個外顯子和3個內含子組裝成。已知人干細胞生長因子具有兩種形式，全長分子hSCGF-α (成熟mRNA完全開放讀碼框972bp，編碼323個氨基酸，表達蛋白大小約為45KDa)和在C端保守的Ca2+依賴糖 i只另Il結構域(calcium dependent carbohydrate recognition domain, CRD)內缺失 78 M 基酸(erythropoietin，Epo)、協同作用對紅細胞系有紅細胞爆發促進活性的的截短型分子 hSCGF-β (成熟mRNA長73^ρ，編碼245個氨基酸)，因此屬于C型凝集素(C_type lectin) 超家族成員。研究證實，SCGF在各種組織的損傷修復，傷口的愈合過程中有顯著的作用，SCGF 可促進血管生成、創傷愈合。hSCGF-β在維持肥大細胞生理狀態下的存活中發揮作用，參與慢性炎癥時血管形成、纖維化、白細胞歸巢等病理過程；hSCGF-α通過促進肥大細胞增殖與活化，參與各種應急病理反應如超敏反應或急性炎癥反應，并促進組織纖維化的形成過程。在皮膚細胞衰老的過程中，SCGF可通過作用于真皮層的成纖維干細胞，使處于休眠、損傷的成纖維干細胞被激活和修復并成熟分化大量的成纖維細胞。SCGF作為一種生物活性蛋白，具有常溫穩定性差、易降解、易失活；生物利用度低、半衰期短、代謝迅速等特點，在常規藥品制劑和化妝品劑型制備過程中存在劑型單一、 穩定性差、生物利用度低等缺點。將其應用于化妝品中的關鍵問題是在制備化妝品過程中必須要保持SCGF的活性。
發明內容
本發明的首要目的在于克服現有技術的缺點與不足，提供一種人干細胞生長因子脂質體。本發明的另一目的在于提供所述的人干細胞生長因子脂質體的制備方法。本發明的再一目的在于提供所述的人干細胞生長因子脂質體的應用。本發明的目的通過下述技術方案實現一種人干細胞生長因子脂質體，用作透皮藥物制劑，包含質量百分比2. 0 4. 0%的人干細胞生長因子、質量百分比8. 0 10. 0%的磷脂、質量百分比2. 5 3. 5%的膽固醇和質量百分比10 25%的保護劑。所述的人干細胞生長因子可以用基因工程發方法制備的重組人干細胞生長因子， 也可以是應用細胞培養液天然分離的人源人干細胞生長因子；
所述的人干細胞生長因子為hSCGF-α或hSCGF-β ；所述的磷脂為天然大豆磷脂、氫化磷脂、雙肉豆蔻磷脂酰膽堿(DMPC)、二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(DMPG)、二棕櫚酰磷脂酰甘油(DPPG)、二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二硬脂酸磷脂酰乙醇胺(DSPE)、二棕櫚酰磷脂酸(DPPA)或聚乙二醇 2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE-PEG2000)；所述的保護劑優選為抗壞血酸、維生素E、右旋糖苷、蔗糖、乳糖或海藻糖中的至少一種；所述的人干細胞生長因子脂質體的平均粒徑為50 500nm ；優選為50 200nm ；所述的人干細胞生長因子脂質體還包含助懸劑，助懸劑為高分子材料，如PVP等；所述的人干細胞生長因子脂質體還包含甘露醇，在制備人干細胞生長因子脂質體凍干品時，甘露醇對人干細胞生長因子的活性提供有效保護；所述的人干細胞生長因子脂質體的制備方法，優選包括以下步驟(1)用有機溶劑將磷脂和膽固醇溶解，在惰性氣體的保護下，于冰浴上超聲處理， 得到超聲脂質體；(2)在步驟(1)得到的超聲脂質體中加入有機溶劑，于35 45°C水浴中旋轉蒸發，除盡有機溶劑；再加入含有人干細胞生長因子和保護劑的磷酸鹽緩沖溶液，在惰性氣體保護下超聲處理；(3)在步驟( 得到的產物中加入甘露醇，抽真空冷凍干燥，使水分完全升華后用磷酸緩沖鹽溶液水化脂質，再加入水充分渦旋攪拌，擠出，得到人干細胞生長因子脂質體；其中，人干細胞生長因子脂質體包含質量百分比2. 0 4. 0%的人干細胞生長因子、質量百分比8. 0 10. 0%的磷脂、質量百分比2. 5 3. 5%的膽固醇和質量百分比10 25%的保護劑。所述的惰性氣體優選為氮氣；所述的有機溶劑優選為氯仿；步驟(1)中所述的超聲處理的條件優選為于100W超聲lOmin，每30s超聲1次；步驟O)中所述的有機溶劑的體積用量優選為相當于所述的超聲脂質體體積的 2 6倍；步驟⑵和(3)中所述的磷酸鹽緩沖溶液優選為pH6. 8、10mmol/L的磷酸鹽緩沖溶液；步驟⑵中所述的超聲處理的條件優選為于IOOW超聲lOmin，每30s超聲1次；所述的人干細胞生長因子脂質體在化妝品中的應用；所述的化妝品包括護膚類及抗皺類產品、清潔類化妝品、功能性化妝品和美容化妝品；所述的清潔類化妝品包括清潔霜、洗面乳、沐浴液和剃須用品；所述的功能性化妝品包括美白護膚品、抗皺護膚品、保濕護膚品、祛痘護膚品和抗汗護膚品；所述的美容化妝品包括粉底霜、香粉、面膜、唇膏和胭脂。本發明相對于現有技術具有如下的優點及效果本發明首次將人干細胞生長因子制備為脂質體應用于化妝品中。人干細胞生長因子(SCGF)制備成脂質體，有效地保持人干細胞生長因子活性，可顯著提高干細胞生長因子穩定性，促進皮膚對干細胞生長因子的吸收和利用，具有親和力強、無毒副作用，適用范圍廣的優點。經過脂質體包裹的人干細胞生長因子的化妝品抗皺性能經過三個月穩定性考察仍然保持良好。將其作為原料，輔以其他的活性物質及輔料，制備成常用的藥劑形態發揮 SCGF的藥效，從而提高其生物利用度。將其與其他生物活性物質如抗壞血酸等一起，通過相應的制備工藝，制成水劑、霜劑、乳劑等護膚品，達到皮膚損傷的快速修復，皺紋的修復與祛皺等功效。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限于此。實施例1稱取Ig干燥大豆磷脂、0. Ig維生素E和0.35g膽固醇置于茄形燒瓶內，用5 20ml無水乙醇溶解，將茄形燒瓶置50°C恒溫水浴減壓旋轉蒸發，抽至無水乙醇揮盡，形成均勻薄膜，加入含有400mg SCGF(hSCGF-a，購自P印rotech公司)、質量體積比蔗糖的磷酸鹽緩沖溶液(PH6. 8U0mmol/L) IOml旋轉洗膜，最后振搖水化溶液30 60分鐘，即得 SCGF磷脂混懸液(為人干細胞生長因子脂質體)。實施例2稱取0. 9g干燥大豆磷脂、0. Ig維生素E和0. 3g膽固醇置于茄形燒瓶內，用5 20ml無水乙醇溶解，將茄形燒瓶置50°C恒溫水浴減壓旋轉蒸發，抽至無水乙醇揮盡，形成均勻薄膜，加入含有300mg SCGF(hSCGF-a，購自P印rotech公司)、質量體積比10%蔗糖的磷酸鹽緩沖溶液(pH6. 8U0mmol/L) IOml旋轉洗膜，水化溶液通過高壓均質機(100MPa，5 次)，即得粒徑在100 200范圍的半透明脂質體膠體溶液(為人干細胞生長因子脂質體)。實施例3精密稱取磷脂800mg，膽固醇250mg，置于25ml茄形瓶中，加入氯仿使其溶解并定容至10ml，注入氮氣，于冰浴上100W超聲lOmin，每間隔30s超聲一次，共超聲10次，制得超聲脂質體。然后加入相當于超聲脂質體體積2 6倍的氯仿使之溶解，35 45°C水浴中旋轉蒸發，除盡所有的有機溶劑，再加入含有200mg SCGF(hSCGF-a，購自P印rotech公司)、 2. Og右旋糖苷和1. 5g蔗糖的磷酸緩沖鹽溶液(pH6. 8U0mmol/L)適量，充入氮氣，冰浴下水化12h，間歇超聲IOmin (超聲功率100W，每間隔30s超聲一次)。用0. 22 μ m微孔濾膜超濾后加入質量體積比10%的甘露醇，抽真空冷凍干燥，使水分完全升華后立即用適量磷酸緩沖鹽溶液(PH6. 8，10mmol/L)重新水化脂質，用等量遞加法加入少量水(開始兩次先加1ml， 再相續增加至2ml)，接下來補加水至10ml。每次加水都要充分渦旋攪拌，用孔徑200nm的聚碳酸酯膜擠出，收集樣品，即得粒徑在50nm 200nm范圍的脂質體溶液(為人干細胞生長因子脂質體)。效果實施例(I)SCGF脂質體的包封率和穩定性的測試采用超速離心法分離未包封的部分。 將制備完畢的SCGF脂質納米粒在4°C過夜，傾入Iml離心管中，使用高速冷凍離心機在 40C 15000r/min離心30min。再于溫度37°C、相對濕度75%條件下密閉放置，分別取放置 0、1、3、5、10、30、60、90天的樣品上清液，用HPLC方法測定。
包封率=(DT-DS)/DT X 100% ；DT——SCGF的投料總量；DS——是離心后上清液檢測到的SCGF量。HPLC方法測定條件為C8色譜柱(4mmX 250mm)，流動相A為體積百分比0. 1 % 三氟乙酸(TFA)水溶液，流動相B為含體積百分比0.1% TFA的乙腈溶液；梯度洗脫，0 50min, 100 10% A，0 90% B ；流速 0. 5ml/min。SCGF脂質體的包封率和穩定性的檢測結果如表1所示，結果表明經溫度37°C、相對濕度75%條件下，SCGF標準品(即原料藥)僅能放置10天，實施例1 3制備的人干細胞生長因子脂質體可放置60天甚至更長，可見本發明制備的人干細胞伸張因子脂質體能顯著提高藥物的穩定性。表1. SCGF脂質體的包封率及物理穩定性(％ )考察結果
權利要求
1.一種人干細胞生長因子脂質體，其特征在于包含質量百分比2. 0 4. 0%的人干細胞生長因子、質量百分比8. 0 10. 0%的磷脂、質量百分比2. 5 3. 5%的膽固醇和質量百分比10 25%的保護劑。
2.根據權利要求1所述的人干細胞生長因子脂質體，其特征在于所述的人干細胞生長因子為基因工程發方法制備的重組人干細胞生長因子或是是應用細胞培養液天然分離的人源人干細胞生長因子。
3.根據權利要求1所述的人干細胞生長因子脂質體，其特征在于所述的人干細胞生長因子為hSCGF- α或hSCGF- β。
4.根據權利要求1所述的人干細胞生長因子脂質體，其特征在于所述的磷脂為天然大豆磷脂、氫化磷脂、雙肉豆蔻磷脂酰膽堿、二棕櫚酰磷脂酰膽、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油、二棕櫚酰磷脂酰甘油、二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺、二硬脂酸磷脂酰乙醇胺、二棕櫚酰磷脂酸或聚乙二醇2000- 二硬脂酰磷脂酰乙醇胺。
5.根據權利要求1所述的人干細胞生長因子脂質體，其特征在于所述的保護劑為抗壞血酸、維生素Ε、右旋糖苷、蔗糖、乳糖或海藻糖中的至少一種。
6.根據權利要求1所述的人干細胞生長因子脂質體，其特征在于所述的人干細胞生長因子脂質體包含甘露醇。
7.權利要求1 6任一項所述的人干細胞生長因子脂質體的制備方法，其特征在于包括以下步驟(1)用有機溶劑將磷脂和膽固醇溶解，在惰性氣體的保護下，于冰浴上超聲處理，得到超聲脂質體；(2)在步驟(1)得到的超聲脂質體中加入有機溶劑，于35 45°C水浴中旋轉蒸發，除盡有機溶劑；再加入含有人干細胞生長因子和保護劑的磷酸鹽緩沖溶液，在惰性氣體保護下超聲處理；(3)在步驟( 得到的產物中加入甘露醇，抽真空冷凍干燥，使水分完全升華后用磷酸緩沖鹽溶液水化脂質，再加入水充分渦旋攪拌，擠出，得到人干細胞生長因子脂質體；其中，人干細胞生長因子脂質體包含質量百分比2. 0 4. 0%的人干細胞生長因子、質量百分比8. 0 10. 0%的磷脂、質量百分比2. 5 3. 5%的膽固醇和質量百分比10 25% 的保護劑。
8.根據權利要求7所述的人干細胞生長因子脂質體的制備方法，其特征在于所述的惰性氣體為氮氣；所述的磷酸鹽緩沖溶液為PH6. 8、10mmol/L的磷酸鹽緩沖溶液；步驟(1)中所述的超聲處理的條件為于100W超聲lOmin，每30s超聲1次；步驟O)中所述的氯仿的體積用量為相當于所述的超聲脂質體體積的2 6倍；步驟⑵中所述的超聲處理的條件為于IOOW超聲lOmin，每30s超聲1次。
9.權利要求1 6任一項所述的人干細胞生長因子脂質體在化妝品中的應用，其特征在于所述的化妝品為護膚類及抗皺類產品、清潔類化妝品、功能性化妝品或美容化妝品。
10.根據權利要求9所述的人干細胞生長因子脂質體在化妝品中的應用，其特征在于所述的清潔類化妝品為清潔霜、洗面乳、沐浴液或剃須用品；所述的功能性化妝品為美白護膚品、抗皺護膚品、保濕護膚品、祛痘護膚品或抗汗護膚所述的美容化妝品為粉底霜、香粉、面膜、唇膏或胭脂。
全文摘要
本發明公開了一種人干細胞生長因子脂質體及其制備方法與應用。該人干細胞生長因子脂質體包含2.0～4.0％的人干細胞生長因子、8.0～10.0％的磷脂、2.5～3.5％的膽固醇和10～25％的保護劑。本發明通過將人干細胞生長因子制備成脂質體，有效地保持人干細胞生長因子活性，可顯著提高干細胞生長因子穩定性，促進皮膚對干細胞生長因子的吸收和利用，具有親和力強、無毒副作用，適用范圍廣的優點。經過脂質體包裹的人干細胞生長因子的化妝品抗皺性能經過三個月穩定性考察仍然保持良好。將其作為原料，輔以其他的活性物質及輔料，制備成常用的藥劑形態發揮SCGF的藥效，從而提高其生物利用度。
文檔編號A61Q1/12GK102512370SQ20111044957
公開日2012年6月27日 申請日期2011年12月28日 優先權日2011年12月28日
發明者任哲, 劉薇, 楊珂, 王一飛, 舒輝萍, 陳海佳 申請人:廣州賽萊拉生物科技有限公司