專利名稱：利用共溶劑進行酶催化法過酸的制備的制作方法
技術領域：
下文涉及利用多組分系統進行酶催化法過酸合成和原位酶催化領域。具體地講， 提供了利用酶的過水解活性和多組分系統(即，在本發明的背景下，涉及利用至少兩種在期望的反應時間前分開貯存的反應組分進行過氧羧酸制備的系統)進行過氧羧酸制備和有效遞送的方法，其中酶在結構上歸類為屬于糖酯酶CE-7家族，而該家族包括先鋒霉素乙酰基水解酶(CAH，E. C. 3. 1. 1. 41)和乙酰木聚糖酯酶(AXE，E. C. 3. 1. 1. 72)。針對以下用途， 能以足夠有效的濃度制備至少一種過氧羧酸表面消毒或衛生處理、醫療器械滅菌、食品加工設備滅菌，以及適用于衣物洗滌護理應用如消毒、漂白、脫色、除臭、和衛生處理。
背景技術：
過酸組合物已報道是有效的抗微生物劑。針對不希望有的微生物生長，對硬質表面、肉制品、活植物組織和醫療設備進行清潔、消毒、和/或衛生處理的方法已有所描述(如美國專利6，545，047、美國專利6，183，807、美國專利6，518，307、美國專利5，683，724、和美國專利申請公布2003/0026846)。過酸可用于制備衣物洗滌劑所用的漂白組合物也有所報道(美國專利3，974，082、美國專利5，296，161、和美國專利5，364，554)。過氧羧酸可通過羧酸烷基酯和過氧化物試劑，例如過氧化氫的化學反應制備(參見"Organic Peroxides，，,Daniel Swern編輯，第 1 卷，第313-516頁；Wiley Interscience, New York, 1971)。然而，在弱堿性至酸性pH值(約8至約4)條件下，反應通常不能足夠快地進行，以至于不能制備出適于許多商業消毒和/或漂白應用的過氧羧酸濃度。克服過氧羧酸化學法制備缺點的一種方法是使用具有過水解活性的酶催化劑。美國專利申請11/638, 635以及美國專利申請公布2008/0176783、2008/0176299、和 2009/0005590 (授予DiCosimo等人)公開了在結構上歸類為糖酯酶CE-7家族的成員(如先鋒霉素C脫乙酰酶[CAH]和乙酰木聚糖酯酶[ΑΧΕ])的酶，它們的特征在于具有顯著的過水解活性，可將羧酸酯轉化(在合適的過氧源存在下，如過氧化氫)為過氧羧酸，濃度足以用作消毒劑和/或漂白劑。已證實，糖酯酶CE-7家族的一些成員具有足夠的過水解活性，一旦將反應組分混合后，能在1分鐘內由一元醇、二醇和甘油的乙酰酯生成4000至 5000ppm的過乙酸，并在5分鐘至30分鐘內生成高達9000ppm的過乙酸(DiCosimo等人， U. S. 2009/0005590)。在各引用的專利申請公布中，DiCosimo等人描述的酶催化法過酸生成系統可基于多反應組分的使用，這些反應組分在需要形成過酸溶液前保持分離。據觀察，當使用包含第一酶催化劑/底物組分和第二組分(含有水性過氧源)的多組分系統時，一種或多種不溶于水或部分不溶于水底物的使用會在混合兩種組分后導致至少以下三種情況，它們會影響有效地制備和遞送過氧羧酸產物的能力首先，酶催化劑/
5底物組分的粘度會過高，而不能與含有過氧源的第二組分有效地混合，這會降低過氧羧酸的生成速率；其次，酶催化劑/底物組分的粘度會過高，而不能以某些方式遞送包含酶催化劑/底物組分與過氧源的混合物的產物，如不能通過噴霧方式遞送；第三，與在水溶液中含有過氧源的第二組分混合后，酶/底物組分中底物的溶解速率過低，而不能獲得令人滿意的過氧羧酸生成速率。在需要按特定的比率使用含有水性過氧源的組分與含有酶催化劑/ 底物的組分時，這些問題也會變得明顯。就此而論，涉及在進行所需時間的反應前對具有過水解活性的酶催化劑和底物與過氧源分開貯藏的商用多組分系統仍無法用于某些應用。需要解決的問題是提供一種在使用多組分生成系統時通過酶催化法制備過酸的方法，該系統的特征在于具有至少一種第一組分，其包含羧酸酯底物和酶催化劑制劑，該酶催化劑包含具有過水解活性的CE-7糖酯酶，其中羧酸酯底物(1)部分或基本上不溶于含水基質，和/或(2)緩慢溶于含水反應基質和/或(3)具有不利于在某些商業應用(如使用雙室噴霧瓶，其設計用于混合兩種具有不同粘度和/或溶解度的液體組分)中實現方便混合的粘度；并且該系統的特征還在于具有至少一種第二組分，其包含具有過氧源的水溶液 (如過氧化氫的含水制劑)。發明概述通過提供過酸的酶催化法制備方法和系統，上述問題已得到解決，該方法包括在兩組分系統的第一組分中使用至少一種共溶劑，其中所述第一組分為羧酸酯和至少一種酶催化劑的基本上無水的制劑，所述至少一種酶催化劑包含具有過水解活性的CE-7糖酯，其中加入所述至少一種共溶劑可改善第一組分的粘度以便在兩組分系統中遞送和混合，并允許根據需要調整第一組分的體積，以便按所需的兩組分比率與第二組分混合，以及在與含水第二組分(即提供過氧源的含水制劑)混合以形成含水過酸制劑時可提高第一組分的溶解度和/或溶解速率。據發現，加入含log P小于約2的有機溶劑的共溶劑，按可通過常規的或換句話講適于消費品、工業、和醫療背景的方法進行遞送的形式，解決了前述會影響過氧羧酸產物有效制備和遞送能力的情況，其中log P定義為物質在辛醇與水之間的分配系數的對數，所述分配系數表示為log P= log[[溶質][溶質]#]，。優選地，制劑中的共溶劑是惰性的、無反應性的，并可與羧酸酯底物混溶，其中共溶劑不是所述酶催化劑的底物。優選地，共溶劑是一種有機醇，其不含可發生酶催化過水解的酯基。如本文所用，“醇”是含有至少一個羥基部分的分子。優選地，在混合或接觸多組分系統的組分后，共溶劑在其終濃度下也是可溶的。然而，據報道，在log P小于約2的有機溶劑中的生物催化通常會對酶的活性產生不利影響(例如，通過使酶組分失活(參見例如C. Laane等人，Biotechnol. Bioeng. 30 81-87 (1987)以及 Cowan, D. Α.禾口 Plant, Α. , Biocatalysis in Organic Phase Systems, Biocatalysis at Extreme Temperatures 第 7 章，Kelly, R. W. W.禾口 Adams, Μ·編輯，Amer. Chem. Soc. Symposium Series, Oxford University Press, New York, NY,第 86-107 頁 (1992)) 0因此，通過加入包含醇的共溶劑，將帶來出乎意料的積極效果。本發明方法和系統的這些和其他有益效果將在下文中更全面地討論。在一個實施方案中，提供了一種制備過氧羧酸的方法，包括(a)提供第一組分，所述第一組分包含(i)羧酸酯底物；
(ii)具有過水解活性的酶催化劑，其中所述酶催化劑包括具有糖酯酶家族 7 (CE-7)特征基序的酶，所述特征基序通過CLUSTALW與SEQ ID NO 2比對，并包含；(1)與SEQ ID NO 2的118至120對應的氨基酸位置處的RGQ基序；(2)與SEQ ID NO 2的179至183對應的氨基酸位置處的GXSQG基序；和(3)與SEQ ID NO 2的298至299對應的氨基酸位置處的HE基序；所述酶包含與SEQ ID NO 2至少30%的氨基酸同一性；以及(iii)至少一種共溶劑，所述共溶劑包含log P小于約2的有機溶劑，其中log P 定義為物質在辛醇與水之間的分配系數的對數，所述分配系數表示為P =[溶質]^l/[溶質]&并且其中所述至少一種共溶劑不是所述酶催化劑的底物；其中所述第一組分為(i)至(iii)的基本上無水的混合物；(b)提供第二組分，所述第二組分包含過氧源的水溶液；以及(c)將所述第一組分和所述第二組分混合以形成含水的反應混合物，其中所述共溶劑使含水反應混合物中的羧酸酯底物溶解，而不會使酶催化劑實質上喪失過水解活性，從而制備過氧羧酸。在另一方面，提供了一種表面消毒的方法，其包括實施上述方法，還包括將所述含有過氧羧酸的含水反應混合物施用到表面上以進行消毒或漂白的步驟。在另一方面，提供了一種處理衣物的方法，其包括實施上述方法，還包括將所述含有過氧羧酸的含水反應混合物施用于衣物以進行漂白、脫色、除臭、衛生處理、消毒、或其組合的步驟。本發明的另一方面是一種用于制備過氧羧酸的多組分系統，包括(a)提供第一組分，所述第一組分包含⑴羧酸酯底物；(ii)具有過水解活性的酶催化劑，其中所述酶催化劑包括具有CE-7特征基序的酶，所述特征基序通過CLUSTALW與SEQ ID NO 2比對，并包含；(1)與SEQ ID NO 2的118至120對應的氨基酸位置處的RGQ基序；(2)與SEQ ID NO 2的179至183對應的氨基酸位置處的GXSQG基序；禾口(3)與SEQ ID NO 2的四8至299對應的氨基酸位置處的HE基序；所述酶包含與SEQ ID NO 2至少30%的氨基酸同一性；以及(iii)至少一種共溶劑，所述共溶劑包含log P小于約2的有機溶劑，其中log P 定義為物質在辛醇與水之間的分配系數的對數，所述分配系數表示為P =[溶質]￠￠/[溶質]P并且其中該共溶劑不是所述酶催化劑的底物；其中所述第一組分為(i)至(iii)的基本上無水的混合物；以及(b)提供第二組分，所述第二組分包含過氧源的水溶液；其中混合所述第一組分和所述第二組分以制備包含過氧羧酸的含水反應混合物， 并且其中所述共溶劑使含水反應混合物中的羧酸酯底物溶解，而不會使酶催化劑實質上喪失過水解活性。用于分離和組合本文所述的第一和第二組分的多組分包裝/遞送系統的設計通常將取決于各反應組分的物理形式。在一個實施方案中，可使用任何適于液-液體系的遞送系統。在另一個實施方案中，本發明的兩組分過酸生成系統包括含有本發明的第一組分的第一容器和含有本發明的第二組分的第二容器。舉例來說，容器和/或包裝系統的典型實例可包括單獨的瓶子、單獨的瓶子包裝成的單個套件、雙室分配瓶(如擠壓瓶、噴霧瓶等)、剛性或非剛性雙室分配包、單獨的包、以及可溶性或可降解性雙室分配包(參見美國專利 4，678，103,4, 585，150,6, 223，942,5, 954，213,6, 758，411,5, 862，949,5, 398，846、 6，995，125、和 6，391，840，已公布的美國專利申請 2005/0139608 和 2002/0030063，以及PCT 公開W000/61713、W002/22467、和W02005/035705)。在一個實施方案中，遞送系統為雙室噴霧瓶。在另一個實施方案中，酶催化劑包含選自SEQ ID N0:2、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO: 6,SEQ ID NO :8,SEQ ID NO :10、SEQ ID NO : 12、SEQ ID NO :14,SEQ ID NO :16,SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO :20、SEQ ID NO :22、SEQ ID NO :24、SEQ ID NO :26、SEQ ID NO :54、SEQ ID NO :60, SEQ ID NO :64、SEQ ID NO :68、SEQ ID NO :72、SEQ ID NO :73、和 SEQ ID NO :74 的
氨基酸序列或通過所述氨基酸序列一個或多個氨基酸的置換、刪除、和增加得到的具有過水解酶活性的基本上類似的酶。在另一個實施方案中，所述具有過水解酶活性的基本上類似的酶包含與選自SEQ ID NO 2,SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :10、SEQ ID NO :12,SEQ ID NO :14, SEQ ID NO :16、SEQ ID NO :18、SEQ ID NO :20、SEQ ID NO :22、SEQ ID NO :24、SEQ ID NO :26, SEQ ID NO :54、SEQ ID NO :60、SEQ ID NO :64、SEQ ID NO :68、SEQ ID NO :72、 SEQ ID N0:73、和SEQ ID NO :74的一種或多種氨基酸序列至少30%、優選地至少33%、更優選地至少40 %、更優選地至少50 %、甚至更優選地至少60 %、甚至還更優選地至少70 %、 甚至還更優選地至少80 %，甚至還更優選地至少90 %、91 %、92 %、93%、94%、95%、96 %、 97%、98%、或 99%的同一性。在一個方面，用于本發明方法和多組分系統的羧酸酯底物選自(a) 一種或多種具有下列結構的酯[XJmR5其中X為由式Ii6C(O)O表示的酯基；R6為任選地由羥基或Cl至C4烷氧基取代的Cl至C7直鏈、支鏈或環狀烴基部分，其中&任選地包含一個或多個醚鍵，其中&為C2至C7 ；R5為任選地由羥基取代的Cl至C6直鏈、支鏈或環狀烴基部分，其中&中的每個碳原子各自包含不超過一個羥基或不超過一個酯基，并且其中&任選地包含一個或多個醚鍵；m為1至&中的碳原子數，在25°C下，所述一種或多種酯在水中具有至少5ppm的溶解度；(b) 一種或多種具有下列結構的甘油酯
權利要求
1.制備過氧羧酸的方法，所述方法包括(a)提供第一組分，所述第一組分包含(i)羧酸酯底物；( )具有過水解活性的酶催化劑，其中所述酶催化劑包括具有糖酯酶家族7 (CE-7)特征基序的酶，所述特征基序通過CLUSTALW與SEQ ID NO 2比對并包含(1)與SEQID NO 2的118-120對應的氨基酸位置處的RGQ基序；(2)與SEQID NO 2的179-183對應的氨基酸位置處的GXSQG基序；以及(3)與SEQID NO 2的298-299對應的氨基酸位置處的HE基序；所述酶包含與SEQ ID NO 2至少30%的氨基酸同一性；以及(iii)至少一種共溶劑，所述共溶劑包括log P小于約2的有機溶劑，其中log P被定義為物質在辛醇與水之間的分配系數的對數，所述分配系數表示為P =[溶質]￠￠/[溶質]&并且其中所述至少一種共溶劑不是所述酶催化劑的底物；其中所述第一組分是(i)-(iii)的基本上無水的制劑；(b)提供第二組分，所述第二組分包含過氧源的水溶液；以及(c)將所述第一組分與所述第二組分混合以形成含水的反應制劑，其中所述共溶劑使所述含水反應制劑中的所述羧酸酯底物溶解，而不會使所述酶催化劑實質上喪失過水解活性，從而制備過氧羧酸。
2.對表面進行消毒的方法，所述方法包括將在權利要求1的步驟(c)中形成的所述含水反應制劑施用到所述表面上的步驟。
3.處理衣物或紡織物的方法，所述方法包括將在權利要求1的步驟(c)中形成的所述含水反應制劑施用到所述衣物或紡織物上以進行漂白、脫色、除臭、衛生處理、消毒或它們的組合的步驟。
4.根據權利要求1、2或3的方法，其中通過噴霧將所述含水反應制劑施用到所述表面或所述衣物上。
5.根據權利要求1、2或3的方法，其中所述第一組分與所述第二組分以約1 1至約 1 10的重量比混合。
6.根據權利要求1、2或3的方法，其中所述共溶劑以約20重量％至約80重量％的量存在于所述第一組分中。
7.根據權利要求1、2或3的方法，其中所述底物以所述第一組分的約10重量％至約 60重量％的量存在于該組分中。
8.根據權利要求1、2或3的方法，其中所述第一組分包含約55重量％的羧酸酯底物、 約40重量％的共溶劑、約0. 3重量％的酶催化劑和約2. 5重量％的填料，并且其中所述第二組分包含約95重量％的水、約1. 5重量％的碳酸氫鈉和約1重量％的過氧源。
9.根據權利要求8的方法，其中所述第一組分包含約55.5重量％的甘油三乙酸酯、約 41重量％的三丙二醇甲醚、約0.3重量％噴霧干燥的酶粉、以及約2.5重量％的熱解法二氧化硅，其中所述酶粉包含那不勒斯棲熱袍菌或海棲熱袍菌過水解酶或者那不勒斯棲熱袍菌或海棲熱袍菌過水解酶的變異衍生物，所述變異衍生物具有一個或多個提高所述過水解活性的點突變，并且其中所述第二組分包含約96重量％的水、約0. 2重量％的過氧化氫穩定劑、以及約3. 2重量％的包含30%過氧化氫的溶液。
10.根據權利要求1或2的方法，其中在混合所述第一組分和所述第二組分以形成含水反應制劑時，所述羧酸酯底物的初始濃度為約IOOmM,所述過氧源的初始濃度為約IOOmM, 并且所述酶催化劑的初始濃度為約0. lmg/mL。
11.根據權利要求1或3的方法，其中在混合所述第一組分和所述第二組分以形成含水反應制劑時，所述羧酸酯底物的初始濃度為約10mM，所述過氧源的初始濃度為約10mM，并且所述酶催化劑的初始濃度為約0. 01mg/mL。
12.根據權利要求7的方法，其中所述羧酸酯底物包含甘油三乙酸酯，所述過氧源包含過氧化氫，并且所述酶催化劑包含選自SEQ ID N0:16和SEQ ID NO :74的氨基酸序列。
13.根據權利要求1、2或3的方法，其中所述羧酸酯底物在水中具有小于約lOOmg/mL 的溶解度。
14.根據權利要求1、2或3的方法，其中所述酶還包含在與SEQID NO :2的179-183對應的氨基酸位置處的LXD基序。
15.根據權利要求1、2或3的方法，其中所述酶催化劑包含選自SEQID NO 14和SEQ ID NO 73的氨基酸序列。
16.根據權利要求1、2或3的方法，其中所述共溶劑包括三丙二醇甲醚、二丙二醇甲醚、 丙二醇甲醚、二乙二醇丁醚、二丙二醇、三乙二醇、1，2-丙二醇、N-乙基-2-吡咯烷酮、異丙醇、乙醇、乳酸乙酯、1，3-丙二醇、或它們的任何組合。
17.根據權利要求16的方法，其中所述共溶劑包括三丙二醇甲醚。
18.根據權利要求1、2或3的方法，其中所述過氧羧酸為C3-Cltl過氧羧酸。
19.根據權利要求1、2或3的方法，其中所述過氧羧酸包括過乙酸、過丙酸、過丁酸、過乳酸、過乙醇酸、過甲氧基乙酸、過β -羥基丁酸、或它們的任何組合。
20.根據權利要求1、2或3的方法，其中所述酶催化劑以微生物細胞、透化的微生物細胞、微生物細胞提取物、部分純化的酶或純化的酶的形式提供。
21.權利要求20的方法，其中所述酶催化劑被固定在可溶或不溶解的支持體之中或之上。
22.根據權利要求1、2或3的方法，其中所述酶催化劑沒有過氧化氫酶活性。
23.用于制備過氧羧酸的多組分系統，所述多組分系統包括(a)提供第一組分，所述第一組分包含(i)羧酸酯底物；( )具有過水解活性的酶催化劑，其中所述酶催化劑包括具有CE-7特征基序的酶，所述特征基序通過CLUSTALW與SEQ ID NO 2比對并包含(1)與SEQID NO 2的118-120對應的氨基酸位置處的RGQ基序；(2)與SEQID NO 2的179-183對應的氨基酸位置處的GXSQG基序；以及(3)與SEQID NO 2的298-299對應的氨基酸位置處的HE基序；所述酶包含與SEQ ID NO 2至少30%的氨基酸同一性；以及(iii)至少一種共溶劑，所述共溶劑包括log P小于約2的有機溶劑，其中log P被定義為物質在辛醇與水之間的分配系數的對數，所述分配系數表示為P =[溶質]￠￠/[溶質]&并且其中所述共溶劑不是所述酶催化劑的底物；其中所述第一組分是(i)-(iii)的基本上無水的制劑；以及(b)提供第二組分，所述第二組分包含過氧源的水溶液；其中混合所述第一組分和所述第二組分以制備包含過氧羧酸的含水反應制劑，并且其中所述共溶劑使所述含水反應制劑中的所述羧酸酯底物溶解，而不會使所述酶催化劑實質上喪失過水解活性。
24.根據權利要求23的系統，所述系統還包括用于儲存所述第一組分的第一隔室和用于儲存所述第二組分的第二隔室。
25.根據權利要求M的系統，所述系統還包括混合隔室，其用于接納來自所述第一隔室的所述第一組分中的至少一些和來自所述第二隔室的所述第二組分中的至少一些，從而允許形成包含所述第一組分中的至少一些和所述第二組分中的至少一些的混合物。
26.根據權利要求25的系統，其中所述第一組分中的所述至少一些與所述第二組分中的所述至少一些以約1 1至約1 10的重量比混合。
27.根據權利要求沈的系統，所述系統還包括用于從所述混合隔室分配所述含水反應制劑的噴嘴。
28.根據權利要求27的系統，所述系統還包括噴嘴，所述噴嘴用于接納來自所述第一隔室的所述第一組分中的至少一些和來自所述第二隔室的所述第二組分中的至少一些，并用于同時分配所述第一組分中的至少一些和所述第二組分中的至少一些。
29.根據權利要求23的系統，其中用噴嘴將所述第一組分和所述第二組分遞送到表面上，從而允許所述第一組分與所述第二組分在所述表面上混合。
全文摘要
本文公開了雙組分酶法過酸生成系統以及此類系統的使用方法，其中所述第一組分包含由至少一種具有過水解活性的酶催化劑、羧酸酯底物和共溶劑組成的制劑，并且其中所述第二組分包含在過氧源的水溶液。所述兩種組分混合可生成可用作如消毒劑或漂白劑的含水過酸制劑。具體地講，有機共溶劑用于控制含底物組分的粘度，并提高所述底物在含水反應制劑中的溶解度，而不會使所述酶催化劑實質上喪失過水解活性。
文檔編號C11D3/00GK102239256SQ200980148575
公開日2011年11月9日 申請日期2009年10月1日 優先權日2008年10月3日
發明者D·G·迪皮特羅, E·C·罕, R·A·雷諾, R·迪科西莫, W·R·卡希爾 申請人:納幕爾杜邦公司