具有改變的特性的α-淀粉酶變體的制作方法

專利名稱：具有改變的特性的α-淀粉酶變體的制作方法
具有改變的特性的α-淀粉酶變體序列表 本文附帶包含SEQ ID NO :1_30的序列表，其中所述每個序列通過引用的方式完整 并入本文。與相關申請的交叉參照本文要求2007年11月5日提交的美國臨時申請60/985，619、2008年2月6日提 交的美國臨時申請61/026，579、2008年3月31日提交的美國臨時申請61/041，075和2008 年6月6日提交的美國臨時申請61/059，411的權益，每份文件的公開內容均通過引用方式 完整地并入本文用于全部目的。本公開的領域本公開涉及新的α -淀粉酶。特別地，它涉及使用某些變體α -淀粉酶的活性以 及其摻合物用于污漬去除和作為洗滌劑組合物的組分用于洗滌。
背景技術：
α -淀粉酶(α -1，4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶，Ε. C. 3. 2. 1. 1)構成一組催化淀粉 及相關的線型或分支1，4_糖苷寡糖和多糖水解的酶。淀粉酶可以用于各種目的。例如，淀粉酶商業地用于淀粉加工的初始階段(例如， 液化)中；濕磨工藝中；和從糖類生產醇中。它們也用作洗滌劑基質中的清潔劑或輔料，在 紡織工業中用于淀粉退漿；用在焙烘用途中；用于飲料工業；用于油田的鉆井工藝中；用于 再循環過程，例如用于紙張脫墨，和用于動物飼料中。已經試圖構建具有針對特定用途如淀粉液化和紡織品退漿的改良特性的α “淀 粉酶變體。需要創造和改善這樣的淀粉酶，所述淀粉酶例如為包括商業退漿以及清潔/洗 滌和污漬或淀粉去除過程的多種用途提供了優于工業標準酶(例如來自地衣芽孢桿菌 (Bacillus Iicheniformis))的制造和/或性能優點。還需要包含改良的淀粉酶和額外組 分如表面活性劑、螯合劑等的洗滌劑和清潔助劑或制劑。發明簡述在一個方面，本公開尤其涉及親本α _淀粉酶(如AmyS樣α -淀粉酶)的新α -淀 粉分解酶變體，特別是展示在清潔或洗滌過程或去除淀粉(例如織造材料退漿中)方面有 利的改變特性的變體。例如，與親本AmyS樣α -淀粉酶或參考淀粉酶相比，該變體在以下任意一個或多 個特性方面改變凈電荷、底物特異性、底物切割、底物結合、熱穩定性、在一個或多個PH處 的活性、在一個或多個PH處的穩定性、氧化條件下的穩定性、Ca2+需求、比活性、催化速率、 催化效率、在螯合劑存在下的活性、在螯合劑存在下的熱或PH穩定性、退漿用途或清潔過 程的用途、或在蛋白質表達系統中的表達量和其他目的特性。例如，一個或多個改變可以產 生這樣的變體，其與親本α-淀粉酶(如AmyS樣淀粉酶)相比較具有降低的Ca2+依賴性和 /或改變的PH/活性特征和/或改變的熱穩定性。在一個方面，本文提供了親本嗜熱脂肪土芽孢桿菌(Geobaci 1 lusstearothermophilus) α -淀粉酶的變體，其中該變體具有與親本嗜熱脂肪土 芽孢桿菌α -淀粉酶具有至少約95%同源性并包含第242位氨基酸替換的氨基酸序列，其 中肽序列中的氨基酸位置相對于參考淀粉酶(例如SEQ ID Ν0:1或2)進行編號，并且其中 該變體具有α-淀粉酶活性。
在另一方面，提供了組合物，其包含a)至少一種變體α-淀粉酶，其包含與親本 AmyS樣α-淀粉酶的氨基酸序列至少約95%同一的氨基酸序列并在與參考α -淀粉酶第 242位置相對應的氨基酸位置處具有替換，所述變體具有可檢測的α-淀粉酶活性，和b)至 少一種以下物質額外的酶、洗滌劑、表面活性劑、螯合劑、氧化劑、酸化劑、堿化劑、過氧化 物源、硬度源、鹽、洗滌絡合劑、聚合物、穩定劑或織物調理劑。在優選的實施方案中，參考淀 粉酶是SEQ ID NO :1或2，并且該組合物是用于衣物、餐具或硬表面清潔、退漿、或者織物或 污漬處理的產品的組分。在一個實施方案中，該組合物包含額外的酶是蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、纖維素酶、 過氧化物酶、氧化酶、果膠酶、裂合酶、角質酶、漆酶、或它們的組合。在多個實施方案中，表面活性劑是非離子的、陰離子的、陽離子的或兩性離子的。 變體 α -淀粉酶優選地是 S242A、S242D、S242E、S242F、S242G、S242H、S242L、S242M、S242N、 S242Q或S242T變體。在一些實施方案中，該變體具有針對氧化作用的改變穩定性并且該變 體α-淀粉酶還包括一個或多個甲硫氨酸殘基的缺失或替換，包括位于親本AmyS樣α-淀 粉酶第8、9、96、200、206、284、307、311、316和438氨基酸位置處的殘基，其中參考α -淀粉 酶是 SEQ ID NO :2ο在其他實施方案中，該變體α-淀粉酶還在與參考α-淀粉酶第97、179、180、193、 319、349、358、416、428或443氨基酸位置相對應的一個或多個氨基酸位置處包含序列修 飾。仍在其他實施方案中，該變體包含一個或多個在如下位置處的替換在第349氨基酸位 置處的半胱氨酸、在第428氨基酸位置處的半胱氨酸、在第97氨基酸位置處的谷氨酸、在第 97氨基酸位置處的精氨酸、在第319氨基酸位置處的谷氨酸、在第319氨基酸位置處的精氨 酸、在第358氨基酸位置處的谷氨酸、在第358氨基酸位置處的精氨酸、在第443氨基酸位 置處的谷氨酸或在第443氨基酸位置處的精氨酸。在本文中也有用的是這樣的變體α -淀粉酶，其包含附93或V416或這二者的替 換，例如，N193F或V416G或這二者的替換。在某些實施方案中，該變體以一個或多個氨基 酸(例如在位置？178、附79、6180、1181、6182和1(183處氨基酸)的缺失為特征。優選地，在某些實施方案中，該變體α -淀粉酶在不存在添加的鈣或在螯合劑存 在下具有改變的金屬離子依賴性或改變的穩定性或活性。變體α-淀粉酶優選地與SEQ ID NO 2具有至少95%、98%或99%或甚至更多同 源性，并且相對于包含SEQ ID Ν0:1的參考α-淀粉酶中的編號而言包含第242位氨基酸 替換，并且其中該變體α-淀粉酶具有α-淀粉酶活性。在一個實施方案中，親本AmyS樣α-淀粉酶是SEQ ID NO :1、2、6、7、8、9、10、11、 12、15或16，并且參考α-淀粉酶是SEQ ID Ν0:1或2。優選地，該變體α -淀粉酶相對于親本AmyS樣α -淀粉酶在ρΗ >約8的洗滌過 程中具有改善的性能。該變體α-淀粉酶可以在多個實施方案中以a) Q97E、Q319E、Q358E、Q443E ；b)Q97E、Q319R、Q358E、Q443R ；c)Q97E、Q319R、Q358E ；d)Q97E、Q319R、Q443E ；e)Q97E、Q319R、 Q443R ；f)Q97E、Q358R ；g) Q97E、Q443E ；h) Q319R、Q358E、Q443E ；或 i) Q319R、Q358R、Q443E 的
成組替換為特征。 在本公開幾個方面的另一個方面，本公開提供了作為洗滌劑或清潔制劑的組合 物，所述組合物包含至少一種變體淀粉酶，所述變體淀粉酶包含與親本AmyS樣α -淀粉酶 的氨基酸序列至少約95%同一的氨基酸序列并在與參考α -淀粉酶第242位置相對應的氨 基酸位置處具有替換，其中所述變體具有可檢測的α-淀粉酶活性；其中參考淀粉酶是SEQ ID Ν0:1或2。在一些實施方案中，該變體是至少包含S242A、S242D、S242E、S242F、S242G、 S242H、S242L、S242M、S242N、S242Q 或 S242T 替換的 S242 變體。在本公開幾個方面的另一個方面，本公開提供了織造工藝后織造材料退漿的方 法，所述方法包括織造材料與變體α-淀粉酶接觸，所述變體α-淀粉酶包含與親本AmyS 樣α-淀粉酶的氨基酸序列至少約95%同一的氨基酸序列并在與參考α-淀粉酶第242位 置相對應的氨基酸位置處具有替換。該變體優選地具有可檢測的α-淀粉酶活性。接觸過 程在有效用于至少部分地從織造材料去除漿料的條件和時間下進行。在多個實施方案中，與親本AmyS樣α -淀粉酶或參考α-淀粉酶相比較，該變體 α-淀粉酶在以下任意一個或多個方面改變(a)凈電荷、(b)底物特異性、(c)底物切割、 (d)底物結合、(e)熱穩定性、(f)在一個或多個pH處的活性、(g)在一個或多個pH處的穩 定性、(h)氧化條件下的穩定性、(i)Ca2+需求、(j)比活性、(k)催化速率、(1)催化效率、 (m)在螯合劑存在下的活性、(η)在螯合劑存在下的熱或PH穩定性、(ο)退漿效能或(ρ)在 蛋白質表達系統中的表達量。在多個實施方案中，親本AmyS樣α-淀粉酶是SEQ ID NO :1、2、6、7、8、9、10、11、 12、15或16，并且參考α-淀粉酶是SEQ ID NO :1或2。優選地，該變體α -淀粉酶是S242A、 S242D、S242E、S242F、S242G、S242H、S242L、S242M、S242N、S242Q 或 S242T 變體。在某些實施方案中，該α-淀粉酶變體還包含一個或多個在如下位置處的替換 在第349位置處的半胱氨酸、在第428位置處的半胱氨酸、在第97位置處的谷氨酸、在第97 位置處的精氨酸、在第319位置處的谷氨酸、在第319位置處的精氨酸、在第358位置處的 谷氨酸、在第358位置處的精氨酸、在第443位置處的谷氨酸或在第443位置處的精氨酸， 其中參考α -淀粉酶是SEQ ID NO 1或2。也提供了洗滌或清潔的方法。所述方法包括將待洗滌或清潔的一個或多種物品與 包含變體α -淀粉酶的組合物接觸，其中所述變體α -淀粉酶包含與親本AmyS樣α -淀粉 酶的氨基酸序列至少約95%同一的氨基酸序列并在與參考α -淀粉酶第242位置相對應的 氨基酸位置處具有替換。接觸過程在有效用于至少部分地洗滌或清潔所述一種或多種物品 的條件和時間下進行。該變體具有可檢測的α-淀粉酶活性。在示例性方法中，至少一種 物品用至少一種含淀粉材料弄臟，所述含淀粉材料的去除受變體淀粉酶輔助。在這些方法 的多個實施方案中，該組合物還包含一種或多種以下物質額外的酶、洗滌劑、表面活性劑、 螯合劑、氧化劑、酸化劑、堿化劑、過氧化物源、硬度源、鹽、洗滌絡合劑、聚合物、穩定劑或織 物調理劑。在所述方法的一個實施方案中，親本AmyS樣α-淀粉酶是SEQ ID N0:l、2、6、7、 8、9、10、11、12、15或16，并且參考α-淀粉酶是SEQ IDN0:1或2。優選地，該變體α-淀粉酶是 S242A、S242D、S242E、S242F、S242G、S242H、S242L、S242M、S242N、S242Q 或 S242T 變 體。在多個實施方案中，該變體α -淀粉酶相對于親本AmyS樣α -淀粉酶在ρΗ >約 8的洗滌過程中具有改善的性能 。在一個實施方案中，該α-淀粉酶變體包含一個或多個在如下位置處的替換在 第349氨基酸位置處的半胱氨酸、在第428氨基酸位置處的半胱氨酸、在第97氨基酸位置 處的谷氨酸、在第97氨基酸位置處的精氨酸、在第319氨基酸位置處的谷氨酸、在第319氨 基酸位置處的精氨酸、在第358氨基酸位置處的谷氨酸、在第358氨基酸位置處的精氨酸、 在第443氨基酸位置處的谷氨酸或在第443氨基酸位置處的精氨酸。在其他實施方案中，該 變體 α _ 淀粉酶包含 a)Q97E、Q319E、Q358E、Q443E ；b) Q97E、Q319R、Q358E、Q443R ；c)Q97E、 Q319R、Q358E ；d)Q97E、Q319R、Q443E ；e)Q97E、Q319R、Q443R ；f)Q97E、Q358R ；g)Q97E、Q443E ； h)Q319R、Q358E、Q443E ；或 i) Q319R、Q358R、Q443E 的成組替換。該方法也可以包括在位置F178、R179、G180、1181、G182或K183處包含一個或多 個氨基酸缺失的變體α-淀粉酶的用途。在某些實施方案中，該變體α-淀粉酶在不存在添加的鈣或在螯合劑存在下具有 改變的金屬離子依賴性或改變的穩定性或活性。本文中也提供了試劑盒，其包含a) —種或多種變體α _淀粉酶，所述變體α -淀 粉酶包含與親本AmyS樣α -淀粉酶的氨基酸序列至少約95%同一的氨基酸序列并在與參 考α-淀粉酶第242位置相對應的氨基酸位置處具有替換，所述變體具有可檢測的α-淀 粉酶活性，和b)至少一種以下物質額外的酶、洗滌劑、表面活性劑、螯合劑、氧化劑、酸化 劑、堿化劑、過氧化物源、硬度源、鹽、洗滌絡合劑、聚合物、穩定劑或織物調理劑。在一個實施方案中，該試劑盒還包含使用說明書，例如，在織造材料退漿或洗滌或 清潔用含淀粉物質弄臟的一種或多種物品的方法中使用該試劑盒組分的使用說明書。在下文更詳細地描述本公開的這些和其他特征。附圖簡述

圖1顯示用于本文中的幾種候選親本α -淀粉酶(AmyS樣淀粉酶)之間氨基酸 序列的比對結果。可以輕易地確定與來自嗜熱脂肪土芽孢桿菌的淀粉酶(SEQ ID NO 1) 的任意氨基酸位置(例如1至520)相對應的位置。SEQID NO :1，來自嗜熱脂肪土芽孢 桿菌“BSG”的α-淀粉酶；SEQ ID NO :2，來自嗜熱脂肪土芽孢桿菌的截短淀粉酶(AmyS， SPEZYME XTRA) ；SEQID NO :3，嗜熱脂肪土芽孢桿菌(S242A 變體淀粉酶)；SEQ ID NO 4, 嗜熱脂肪土芽孢桿菌(S242Q變體淀粉酶)；SEQ ID NO :5，嗜熱脂肪土芽孢桿菌(S242E變 體淀粉酶)；SEQ ID NO 6, Yamane 707 淀粉酶；SEQ ID NO :7，成熟的 LAT 淀粉酶；SEQ ID NO :8，地衣芽孢桿菌野生型淀粉酶[TERMAMYL(NOVOZYMES) =TO 02/10355A2中的SEQ ID NO 8] ；SEQ ID NO :9，解淀粉芽孢桿菌淀粉酶，BAN ;SEQ ID NO 10，STAINZYME =作為 WO 0060060 中 SEQ ID NO :2 或 US 6，528，298 中 SEQID NO :24 的 AA560 ;SEQ ID NO: 11，鹽 敏芽孢桿菌(B. halmapalus)淀粉酶(NATALASE) ；SEQ ID NO 12, KSM_1378(KA0 CORP., ΕΡ1199356 中的 SEQ ID NO 3) ；SEQ ID NO :13，芽孢桿菌屬某些物種 KSM-K38 (ΚΑ0 CORP.， US 6，403，355B1 中的 SEQ ID NO 4) ；SEQ ID NO 14，芽孢桿菌屬某些物種 KSM-K36 (ΚΑ0 CORP.，US 6，403，355B1 中的 SEQID NO 2) ；SEQ ID NO :15，LIQU0ZYME SC (N0V0ZYMES)；禾口SEQID N0:16，親本α-淀粉酶共有序列#1。圖 2 顯示 pHPLT-AmyS 質粒。 圖3顯示S242變體在95°C熱應激30分鐘后的殘余活性百分數。變異位置P、S、 W和γ丟失并且被野生型AmyS(Spezyme xtra(標記“ζ”))替代。還顯示了具有羧基 端截短29個氨基酸的Δ 179-180的嗜熱脂肪土芽孢桿菌陽性對照(即SEQ ID NO 2)。線 指示在野生型酶的殘余活性百分數的標準差之上2倍和3倍。S242A和S242Q清晰地顯示 比野生型更高的殘余活性。圖4 圖4Α、B、C、D、Ε、F、G、H和I分別顯示來自圖1的幾個序列的逐對比對結果 和共有序列及特征，分別顯示共有序列2、3、4、5、6、7、8、9和10或SEQ ID NO :22、23、24、25、 26、27、28、29 和 30。圖5顯示在沒有鈣添加的情況下野生型和淀粉酶變體的熱熔融曲線和熔點。圖6顯示在2mM添加的鈣存在下野生型和淀粉酶變體的熱熔融曲線和熔點。圖7顯示Spezyme Xtra和兩種變體相對于Liquozyme SC在4、10和20分鐘的活 性斷面圖。圖8顯示4種變體相對于S242Q變體在3個時間點的活性斷面圖。圖9是這樣的圖，其描述使用S242Q組合電荷文庫，在20°C于2倍Tide中清潔稻 淀粉微量樣品時，S242Q(實心圓圈)及其變體(空心圓)在北美洗衣條件下稻淀粉微量樣 品測定法中作為電荷之函數的性能。參考實施例10。圖10是這樣的圖，該圖描述了使用TS23t組合電荷文庫，在40°C于Persil中清潔 稻淀粉微量樣品時，具有以下突變Q98R、M201L、S243Q、R309A、Q320R、Q359E和K444E的芽 孢桿菌屬物種截短TS-23淀粉酶(實心圓)及其電荷變體(空心圓)(見2008年6月6日 提交的共同待決美國專利申請PCT/US2008/007103)在西歐洗衣條件下稻淀粉微量布樣測 定法中作為電荷之函數的性能。參考實施例10。圖11是這樣的圖，該圖描述S242Q(實心圓)及其變體(空心圓)在BODIPY-淀粉 測定法中作為電荷之函數的性能。S242Q組合電荷文庫(CCL)、對BODIPY-淀粉的比活性、 標準測試條件參考實施例10。圖12 圖片A是描述作為相對振搖管表達之函數的相對BODIPY-淀粉水解作用 (即相對BODIPY-淀粉水解作用與相對振搖管表達)的圖；圖片B是描述作為相對振搖管 表達之函數的相對微量樣品_淀粉水解作用(即相對微量樣品_淀粉水解與相對振搖管表 達)的圖。參考實施例13。圖13 圖片A是描述作為電荷之函數的相對振搖管表達的圖；圖片B是描述作為 電荷之函數的相對BODIPY-淀粉水解作用的圖。參考實施例13。圖14 圖片A是描述作為電荷之函數的相對振搖管表達的圖；圖片B是描述作為 電荷之函數的相對微量樣品清潔活性的圖。參考實施例13。圖15顯示與LAUNDER-0-METER中85°C持續30分鐘的條件下0. Olppm有效蛋白質 的Ethyl和Xtra的退漿性能相比，添加的Ca2+對變體S242Q的退漿性能的影響。退漿過程 在存在0或5ppm CaCl2下進行。見實施例14。圖16顯示與LAUNDER-0-METER中97°C持續30分鐘的條件下0. Olppm有效蛋白質 的Ethyl和Xtra的退漿性能相比，添加的Ca2+對變體S242Q的退漿性能的影響。退漿過程在存在O或5ppm CaCl2下進行。見實施例14。發明詳述
1.定義和縮寫根據該公開，以下縮寫和定義適用。應當指出如本文中所用，單數形式“一個”、“一 種”和“該”包括復數稱謂，除非上下文另外清楚地說明。因此，例如，對“一種多肽”的提及 包括多種此類多肽，并且對“該制劑”的提及包括對本領域技術人員已知的一種或多種制劑 和其等同物的提及等。除非另外定義，本文中所用的全部技術及科學術語具有與本領域普通技術人員通 常所理解的相同意義。下文提供了以下術語。1. 1.縮寫除非另外說明，使用以下縮寫AATCC美國紡織化學師與印染師協會；ADff 自動餐具洗滌；AE 脂肪醇乙氧基化物；AEO 脂肪醇乙氧基化物；AEOS 乙氧基化脂肪醇醚硫酸鹽；AES 乙氧基化脂肪醇醚硫酸鹽；AFAU 酸性真菌α -淀粉酶單位；AGU 葡糖淀粉酶活性單位；AOS α-烯基磺酸鹽；AS醇硫酸鹽；BAA 細菌α -淀粉酶；V攝氏度；CCL 組合電荷文庫；cDNA 互補性 DNA ；CMC 羧甲基纖維素；dE 如CIE-LAB顏色空間所定義的總色差；dH20 去離子水；dIH20 Milli-Q 過濾去離子水；DE 右旋糖當量；DNA 脫氧核糖核酸；dNTP 三磷酸脫氧核糖核苷酸；DO 溶解氧；DP3 具有3個亞單元的聚合程度；DPn 具有η個亞單元的聚合程度；DS (或ds)干固體含量；DSC 差示掃描量熱法；DTMPA 二乙三胺五乙酸；EC 酶分類酶學委員會；
EDTA乙二胺四乙酸；EDTMPA 乙二胺四甲叉膦酸；EO環氧乙烷； eq當量；ETOH乙醇；F&HC織物和家居用品護理FTU“植酸酶(fitase)”單位，植酸鹽水解單位；g (或 gm)克；GAU葡糖淀粉酶單位；gpg格令/加侖；g/Ι克 / 升；Genencor Danisco US Inc, Genencor Division, Palo Alto, CA ；H2O7jC ；HDG重垢顆粒洗滌劑；HDL重垢液體洗滌劑；HFCS高果糖玉米糖漿；HFSS基于高果糖淀粉的糖漿；HPAEC-PAD具有脈沖安培檢測的高效陰離子交換色譜；hr小時；IKA北卡萊羅納州威爾明頓SE North Chase公園大街2635號IKA Works Inc ；IPTG異丙基β -D-硫代半乳糖苷；JPN日本；kg千克；LALuria 瓊月旨；LAS直鏈烷基苯磺酸鹽；LBLuria 肉湯；LU脂肪酶單位；M摩爾；MBD培養基基于MOPS的定義培養基；MES2-(N-嗎啉基)乙磺酸mg毫克；min分鐘；mL (或 ml)毫升；mm毫米；mM毫摩爾；MOPS3- (N-嗎啉基)-丙磺酸MW分子量；NA北美洲；
Ncm牛頓厘米；NEO新霉素；ng納克； nm納米；NOBS壬酰氧苯磺酸鹽；N正常；NTA氨三乙酸；PAHBAH對羥基苯甲酰胼；PCR聚合酶鏈反應；PEG聚乙二醇；pi等電點；ppm每百萬之···份；PVA聚(乙烯醇)；PVP聚(乙烯吡咯烷酮)；RAU參考淀粉酶單位；RMS均方根；RNA核糖核酸；rpm轉 / 分鐘SAPU分光光度酸性蛋白酶單位；SAS仲烷基磺酸鹽；IX SSC0. 15M NaCl，0. 015M 檸檬酸鈉，pH 7.0;sec秒；%SRI百分污漬去除指數；SSF同時糖化和發酵；TAED四乙酰乙二胺；TfflDSC曲線的熱中點或蛋白質的熔融溫度；TNBS三硝基苯磺酸；μ g微克；μ1，(μυ 微升;μ Nm微牛頓米；μπι微米；μπι微摩爾；U單位；V/V體積比體積；WE西歐；wt %重量百分數；w/v (或W/V)重量 / 體積；w/v (或w/w)重量 / 重量；wt野生型。
1.2.定義在一些方面，本公開依賴于遺傳工程和分子生物學中使用的常規技術和方法。以 下資源包括對根據本文中所公開內容有用的一般方法學的描述=Sambrook等人，MOLECULAR CLONING :A LABORATORYMANUAL (第二版，1989) ；Kreigler, GENE TRANSFER ANDEXPRESSION ； A LABORATORY MANUAL (1990)和 Ausubel 等人，編著.CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(1994)。 這些通用參考文獻提供了本領域技術人員已知的定義和方法。除非本文另外定 義，本文中所用的全部術語及科學術語具有與本公開所屬領域的技術人員通常理解的相同 意義。Singleton等人，DICTIONARY OFMICROB10L0GY AND MOLECULAR BIOLOGY，第2版，John Wileyand Sons, New York(1994)禾口 Hale 與 Markham，THE HARPERCOLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY,Harper Perennial,NY(1991)向技術人員提供了本公開中所使用的眾多術語的通 用字典。“分離的”意指分離的物質(例如一種化合物或序列)借助人工相對于如自然界中 存在的該化合物或序列而言被修飾。例如，分離的序列至少部分地不含或甚至基本上不含 如自然界中存在的與該序列天然關聯的至少一種其他組分。當用來描述材料或物質時，“純化的”意指該材料或物質處于相對純的狀態，例如， 至少約90%純度，至少約95%純度、至少約98%純度或至少約99%純度。如本文中所用，術語“淀粉”指包含復雜多糖的任意糖組合物，其包含具有式 (C6H10O5) x的直鏈淀粉和/或支鏈淀粉，其中X可以是任意數字。優選地，淀粉指在包括但不 限于谷粒、牧草、根狀莖或根的植物中天然存在并且更具體來自小麥、大麥、谷物、燕麥、稻、 高粱、木薯(cassava)、谷子、馬鈴薯、甘薯和木薯的任意碳水化合物。淀粉也可以指合成性 淀粉或改性淀粉，如用作酶測定法的可檢測底物的化學改性淀粉或者旨在改善一種或多種 使用特性的化學改性或酶改性淀粉。如本文中所用，“植酸”(或肌醇六磷酸(IP6))是磷在多種植物組織如麩、種子等 中的主要貯藏形式。植酸在本文中也稱作“植酸鹽”，尤其處于鹽形式時。多種其他肌醇磷 酸如肌醇五磷酸(IP5)、肌醇四磷酸(IP4)和肌醇三磷酸(IP3)在本文中也稱作植酸鹽。植 酸鹽通常是人和大多數單胃動物可消化的。降解植酸鹽的酶在本文中稱作“植酸酶”或“植酸酶(fytase)，，并且一般是六 磷酸肌醇磷酸水解酶。植酸酶活性定義為植酸酶單位(FTU或U)，其中一個FTU定義為 在pH 5.5和37°0每分鐘從0.0015!1101/1植酸鈉中釋放1微摩爾無機磷的酶量。該定義 提供了對植酸酶活性量的有用測量并代表一種簡單的基準度量。已經鑒定并表征了酵母 (例如西方許旺酵母(Schwanniomyces occidentalis)、異常畢赤酵(Pichia anomala)、 Arxulaadeninivorans)、革蘭氏陰性細菌(例如大腸桿菌(Escherichia coli)、假單胞菌 屬的物種(Pseudomonas spp.)、克雷伯菌屬某些物種(Klebsiella spp.))和革蘭氏陽性 (例如芽孢桿菌屬的某些物種(Bacillus spp.))的植酸鹽降解酶。來自許多植物和來自 絲狀真菌如青霉屬某些物種(Penicillium spp.)、曲霉屬某些物種(Aspergillus spp.)、 木霉屬某些物種(Trichoderma spp.)、梨形毛霉(Mucor piriformis)和枝孢霉屬某些物 種(Cladosporium spp.)的植酸酶也是已知的。已經根據啟動水解的位點表征了 3-植酸 酶(EC 3.1.3.8)和6-植酸酶(EC 3.1.3.26)。另外，植酸酶已經基于它們的“最適pH”表征為酸性(最適PH約5)或堿性(最適pH約9)。多種商業植酸酶是可獲得的，包括 ROVABIO(Genencor International)。 “淀粉酶”指能夠催化淀粉底物的切割，從而導致淀粉降解或部分降解的 酶。淀粉酶通常是切割淀粉中糖苷鍵的水解酶。如本文中所用，淀粉酶包括任意的葡 糖淀粉酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶，例如芽孢桿菌屬的某些物種、尤其地衣芽孢桿菌 (B. Iicheniformis)的野生型 α -淀粉酶。通常，α -淀粉酶(EC 3. 2. 1. 1 ； α _D_(1 —4)-葡 聚糖葡聚糖水解酶)定義為以隨機方式切割淀粉分子內部—4)0-糖苷鍵的內切 作用酶。相反，外切作用解淀粉酶，如β-淀粉酶(EC 3.2. 1.2;和a-D-(l —4)-葡聚糖 麥芽糖水解酶)和一些產物特異性淀粉酶如生麥芽糖α-淀粉酶(EC 3.2. 1. 133)從非 還原末端切割底物淀粉分子。β-淀粉酶、α-葡糖苷酶(EC 3. 2. 1. 20 ； a-D-葡糖苷葡 萄糖水解酶)、葡糖淀粉酶(EC 3.2. 1.3 ;a -D-(1 — 4)-葡聚糖葡萄糖水解酶)和產物特 異性淀粉酶可以從淀粉產生特定長度的麥芽低聚糖。來自嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus)的野生型α -淀粉酶或“AmyS”淀粉酶在本文中有時候稱作XTRA或 SPEZYME XTRA，它們是來自 GenencorInternational 的商業 AmyS 產物。如本文中所用，“AmyS樣α -淀粉酶”用作本文中的親本淀粉酶。AmyS樣α-淀 粉酶基于它們之間存在的實質同源性而構成本文中的一類α-淀粉酶。“AmyS樣α _淀粉 酶”意圖指在氨基酸水平針對本文中具有SEQ ID NO :2中所示氨基酸序列的α-淀粉酶顯 示實質同一性的α-淀粉酶類，特別地指芽孢桿菌屬α-淀粉酶，尤其指嗜熱脂肪土芽孢桿 菌(Geobaci 1 lusstearothermophilus) ct-淀粉酶。從 Genencor 分公司 Danisco US Inc 可商業地獲得Spezyme Xtra0嗜熱脂肪土芽孢桿菌已經在文獻中稱作嗜熱脂肪芽孢桿菌并 且這二者可以在本文中互換地使用。具有本文中分別作為SEQ IDNO :1、6、7、8、9、10、11、12、 15和16所提供的氨基酸序列的全部α-淀粉酶視為AmyS樣α-淀粉酶并且因而適合作為 親本α-淀粉酶。AmyS樣α -淀粉酶也包括這樣α-淀粉酶，其i)具有與SEQ ID NO=U 6、7、8、9、10、11、12、15和16中所示氨基酸序列至少約之一具有至少約60 %同源性(同一 性)，如至少約70 %、至少約75 %或至少約80 %、至少約85 %、至少約90 %、至少約95 %、至 少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%同一性的氨基酸序列和/或ii)由這樣 的DNA序列編碼，其中所述DNA序列與編碼以上所述任意α -淀粉酶的DNA序列或明顯來自 W006/002643 的 SEQ ID NO :9 (BAN)、5 (BSG)、3 (SP722)、1 (SP690)、7 (LAT)、11 (ΑΑ560)中或 本說明書的那些DNA序列雜交，其編碼本文分別在SEQ ID NO :1、6、7、8、9、10、11、12、15和 16中所示的任意氨基酸序列。用作AmyS樣α -淀粉酶并因而用作產生本文變體的親本酶 的其他同源α-淀粉酶還包括由EP 0252666中描述的地衣芽孢桿菌菌株產生的α -淀粉 酶和WO 91/00353和WO 94/18314中鑒定的α -淀粉酶；商業AmyS樣α -淀粉酶被包含于 在以下商品名下出售的產品Spezyme AA和ultraphlow(從Genencor分公司 Danisco US Inc 可獲得)和 Keistase (從 Daiwa 可獲得)和 LIQUEZYME SC (從丹麥 Novozymes 可 獲得)。本文以下1.5部分提供了關于AmyS樣淀粉酶的進一步信息。其中的表A提 供了幾種有用AmyS樣α-淀粉酶的名單以及比較彼此之間氨基酸序列同一性的便利方法。 技術人員會理解可以對其他α-淀粉酶構建相似表格以確定它們作為親本酶在本文中的 適用性。如本文中所用，“分光光度酸性蛋白酶單位”(“SAPU”)是蛋白酶酶活性的單位，其中ISAPU是在測定法的條件下每分鐘從酪蛋白底物中釋放1微摩爾酪氨酸的蛋白酶酶活性
的量。 “葡糖淀粉酶單位”(“GAU”)是解淀粉活性的度量，其定義為在pH 4. 2和60°C每 小時將從可溶性淀粉底物產生Ig還原性糖(計算為葡萄糖)的酶活性的量。本文中所用，術語“變體”可以與術語“突變體”互換地使用。“變體”可以指多肽 或核酸。變體包括相對于參考序列在一個或多個位置處替換、插入、缺失、截短、顛換和/或 倒位。變體核酸包括與能夠同本文中所呈現核苷酸序列雜交的序列互補的序列。例如，本 文的變體核酸序列可以與能夠同本文中所呈現核苷酸序列在嚴格條件(例如50°C和0. 2X SSCdX SSC = 0. 15M NaCl，0. 015M檸檬酸鈉，pH 7.0))下雜交的序列互補。更優選地，術 語“變體”包括與能夠在高度嚴格條件(例如65°C和0. IX SSC)下同本文中所呈現核苷酸 序列雜交的序列互補的序列。當用來描述酶時，“熱穩定的”意指該酶比參考酶更為熱穩定。在本申請中，如果 α -淀粉酶變體在相同實驗條件(例如相同的溫度、底物濃度等)下特定時間間隔后具有相 對更高的酶活性，則該變體比野生型地衣芽孢桿菌α-淀粉酶更為熱穩定。備選地，與參考 酶相比，更為熱穩定的酶具有由差示掃描量熱法確定的更高熱容量。多肽的“熔融溫度”(Tm)是該多肽的構象發生可測量的溫度依賴性變化的溫度。蛋 白質構象和Tm可以例如通過圓二色譜法(一種最通用和最基礎的研究蛋白質折疊的工具) 分析。圓二色譜測量圓偏振光的吸收。在蛋白質中，結構如α螺旋和β折疊通常具有手 性并且因而吸收圓偏振光。光吸收作用提供了蛋白質折疊程度的度量。這種吸收作用的變 化作為溫度或變性劑濃度的函數可以用來研究蛋白質的平衡解折疊過程。這種類型的光譜 學也可以與裝置如截流混合儀(stopped flow mixer)組合來測量蛋白質折疊/解折疊的 動力學。“鈣依賴的”意指特定酶需要鈣以實質地展示催化活性。一般如本文中所用，”鈣 依賴的”包括嚴格要求雙價金屬離子以展示催化活性的任何酶的特性并且也包括在鈣或另 一種雙價陽離子存在下實質(例如超過20% )提高其催化活性的酶。如本文中所用，”pH穩定的”就酶而言可以涉及酶活性或酶的蛋白質構象。在第一 種意義下，“PH穩定的”意指酶在特定pH或在特定pH范圍內保留催化活性。在第二種意義 下，酶可以視為在該蛋白質沒有不可逆變性的PH處是“穩定的”。在這種情況下，該酶在回 轉至能夠支持催化活性的PH時會變得有催化活性。pH穩定性也可以以相對或比較性方式 使用，如相對于參考酶。在本申請中，α-淀粉酶變體可以比野生型地衣芽孢桿菌α-淀粉 酶更為PH穩定，當該變體比野生型具有相對更高的活性時，例如當維持在給定的pH處或在 包括PH在內的相同條件下分析時。最感興趣的pH—般是實際使用的條件或是處在或接近 該酶保持催化活性的天然能力的界限或極限處的ΡΗ。“pH范圍”意指pH值的范圍，例如，從更酸至更堿或反之亦然。就酶活性而言，pH 范圍表明該酶展示特定活性水平(例如最小活性、特定百分數的最大活性或特定水平的底 物轉化或產物形成)的PH值上限和下限。當涉及細胞、核酸、蛋白質或載體使用時，“重組” 是導入異源序列或改變天然序列的結果或已經因導入異源序列或改變天然序列而被修飾 的細胞、核酸、蛋白質或載體，或細胞從如此修飾或改變的細胞衍生。因而，例如，重組細胞 可以表達在該細胞的天然(非重組)形式中不存在的基因或可以表達本來差異性表達(例如不足表達或過量表達)、異常表達或根本不表達的天然基因。
如本文中所用，“核苷酸序列”或“核酸序列”指兩個或更多個核苷酸、核糖核苷酸 等或其衍生物的任意序列。核苷酸序列包括寡核苷酸和多核苷酸序列，以及其變體、片段、 同源物和衍生物。核苷酸序列可以是單鏈、雙鏈或多鏈的。核苷酸序列可以來自任何來源 或起源，例如是基因組的、合成的或重組的，并且包括基因組DNA，cDNA、合成DNA和RNA等 以及其雜合體。核苷酸序列可以包含一個或多個密碼子并且可以編碼一種或多種多肽。核 苷酸序列可以偏好地采取一種或多種能量優選的三維結構。“載體”指經常用于體外實驗用途或用于將核酸導入一種或多種細胞類型的核苷 酸序列。載體包括克隆載體、體內或體外表達載體、穿梭載體、質粒、噬菌粒、粘粒、噬菌體顆
粒、盒等ο如本文中所用的“表達載體”意指包含與適宜調控序列有效連接的DNA序列的DNA 構建體，其中所述的調控序列能夠引起該DNA在合適宿主中的表達。此類調控序列可以包 括實施轉錄的啟動子、控制轉錄的任選操縱基因序列、編碼mRNA上的合適核糖體結合位點 的序列、增強子和控制轉錄及翻譯終止的序列。多核苷酸或多肽與另一個序列具有某個序列同一性百分數(例如至少約80%、 85%、90%、95%或99% )意指當比對時，在比較的這兩個序列中堿基或氨基酸殘基是相 同的時的百分數。可以使用本領域已知的任意合適軟件程序例如⑶RRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(F. Μ.等人(編著)1987，附錄30，第7. 7. 18部分)中描述的那些軟 件程序確定這種比對結果和同源性或同一性百分數。此類程序可以包括GCGPileup程序、 FASTA (Pearson 等人(1988) Proc. Natl，Acad. Sci USA 85:2444-2448)和 BLAST (BLAST Manual，Altschul 等人，Natl Cent. Biotechnol. Inf. , Natl Lib. Med. (NCIB NLM NIH)， Bethesda，Md.和 Altschul 等人，(1997) NAR 25:3389-3402)。另一種比對程序是使用默認 參數的 ALIGN Plus (Scientific and Educational Software，PA)。可使用的另一種序列 軟件程序是在序列軟件包6. 0版(Sequence Software PackageVersion 6. 0)(威斯康星州 麥迪遜威斯康辛大學Genetics Computer Group)中可獲得的TFASTA數據搜索程序。本領域技術人員會認識到由本公開包括的序列也可以通過嚴格條件下與所例舉 的amyS序列(例如WO 06/002643的SEQ ID NO 5)雜交的能力進行定義。當單鏈形式的 核酸可以在適宜的溫度和溶液離子強度條件下與另一種核酸復性時，則該核酸可與另一種 核酸序列雜交。雜交和洗滌條件是本領域熟知的(見，例如上文的Sambrook (1989)，尤其第 9和11章)。在一些實施方案中，嚴格條件對應于65 "CWTn^no. 1XSSC，0. 1% SDS0“基因”指參與產生多肽并包括在編碼區之前及之后的區域以及各個編碼區段(外 顯子)之間間插序列(內含子)的DNA區段。就多核苷酸或蛋白質而言，“異源的”指不天然存在于宿主細胞中的多核苷酸或蛋 白質。在一些實施方案中，該蛋白質是商業重要的工業用蛋白質。意圖該術語包括由天然 存在基因、突變基因和/或合成基因編碼的蛋白質。就多核苷酸或蛋白質而言，“內源的”指天然存在于宿主細胞中的多核苷酸或蛋白 質。如本文中所用，術語“轉化的”、“穩定轉化的”和“轉基因的”就細胞而言使用時， 意指該細胞包含至少一種非天然(例如異源的)核酸序列。穩定轉化的細胞包含至少一種這樣的核酸序列，所述核酸序列整合到細胞的基因組或整合在經多個世代仍保留的附加型 質粒中。如本文中所用，“表達”指基于基因的核酸序列產生多肽的過程。該過程包括轉錄 和翻譯。 “信號序列”意指與蛋白質的氨基端部分共價結合的氨基酸序列，所述氨基酸序列 促進該蛋白質的運輸，例如促進該蛋白質的成熟形式分泌到細胞外。信號序列的定義是功 能性的。胞外蛋白的成熟形式缺少(例如在分泌過程期間)被切除的信號序列。如本文中所用，術語“衍生的”包括術語“源自”、“從......獲得”或“從......可
獲得”和“從......分離”。術語“蛋白質”和“多肽”在本文可互換地使用。本文中使用氨基酸殘基的常規單 字母或三字母代碼。“啟動子”是參與結合RNA聚合酶以啟動基因轉錄的調節序列。啟動子可以是誘導 型啟動子或組成型啟動子。例如，可以在本文中使用來自里氏木霉(Trichoderma reesei) 的一種誘導型啟動子cbhl。“有效連接的”指這樣的接近，其中諸元件處在允許它們功能性地聯系的排列中， 甚至沒有緊密的物理靠近。例如，如果一個啟動子能夠控制編碼序列并且在對于該序列為 允許或誘導的條件下控制該序列轉錄，則該啟動子與此編碼序列有效連接。“選擇標記”指這樣的基因，該基因能夠在宿主中表達并允許選擇表達該標記基因 的那些宿主。選擇標記的例子包括但不限于提供對抗微生物物質(例如潮霉素、博來霉素 或氯霉素)抗性改變的基因和/或賦予宿主細胞代謝選擇性如營養優勢(如在作為唯一碳 水化合物來源的特定底物上生長)的基因。在核酸序列插入細胞的上下文中，“導入”意指“轉染”、“轉化”或“轉導”并且包 括對核酸序列摻入真核或原核細胞的談及，其中所述核酸序列可以摻入該細胞的基因組 (例如，染色體、質粒、質體或線粒體DNA)，被轉化成自主復制子或瞬時表達(例如，轉染的 mRNA)ο“宿主”、“宿主菌株”或“宿主細胞”意指在其中安置包含多核苷酸(例如編碼變 體α-淀粉酶的多核苷酸)的表達載體或DNA構建體的合適細胞。宿主菌株優選地是細菌 細胞。在一個優選的實施方案中，“宿主細胞”意指從微生物株(例如芽孢桿菌屬的某些物 種)的細胞產生的細胞和/或原生質體。術語“培養”指在合適的條件下在能夠支持這種生長的培養基中培育微生物細胞 群體。在一個實施方案中，培養指將含有顆粒淀粉的淀粉底物發酵性生物轉化成終產物 (一般在容器或反應器中)。術語“酶轉化”一般指通過酶作用修飾底物。如本文中所用的該術語也指通過酶 的作用修飾淀粉底物。如本文中所用，術語“糖化”指淀粉經酶轉化成葡萄糖。術語“聚合程度(DP) ”指給定糖中脫水吡喃葡萄糖單元的數目(n)。DPI的例子是 單糖類，如葡萄糖和果糖。DP2的例子是二糖類，如麥芽糖和蔗糖。DP > 3指具有大于3的 聚合程度的聚合物。技術人員會理解具有更大DE的化合物是更為聚合的。“終產物”或“所需終產物”指酶反應的任意預期產物，例如從淀粉底物以酶方式轉化而來的淀粉衍生分子。術語“殘余淀粉”指含淀粉的底物發酵后組合物中留下的任何殘留(可溶性或不 可溶性)淀粉。 如本文中所用，“比活性”意指一種酶單位，其定義為在特定條件下每單位時間由 酶制劑轉換成產物的底物的摩爾數。比活性表示為單位(U)/單位重量的蛋白質，一般是U/ mg蛋白質。“產量”指使用本公開的方法所產生的終產物或所需終產物的量。在一些實施方案 中，該產量大于使用本領域已知方法所產生的產量。在一些實施方案中，該術語指終產物的 體積，并且在其他實施方案中，該術語指終產物的濃度。如本文中所用，“生物學活性的”指對生物系統例如細胞、器官或生物具有可測量 的影響的化合物或序列。“ATCC”指位于弗吉尼亞州Manassas 20108的美國典型培養物保藏中心(ATCC)。“NRRL”指美國伊利諾伊州皮奧里亞縣，國家農業應用研究中心，農業研究培養物 保藏中心(并且以前稱為USDA北部地區研究實驗室)。本文中所用，“食物”意指向包括人在內的動物提供營養價值的任意成分、組分或 組合物。如本文中所用，按慣例，當描述蛋白質和編碼它們的基因時，用于該基因的術語一 般用斜體(例如，編碼amyL(地衣芽孢桿菌AA)的基因可以表示為amyL)。用于蛋白質的術 語一般不用斜體并且首字母通常大寫(例如，由amyL基因編碼的蛋白質可以表示為AmyL 或amyL)。除非另外說明，分別地，核酸從左至右以5’至3’方向書寫，并且氨基酸序列從左
至由以氨基至羧基方向書寫。如本文中所用術語“包含”及其關聯詞以其包含......在內的意義使用；即，等同
于術語“包括”及其對應的關聯詞。數字范圍包括定義該范圍的數字在內。本文中提供的標題不限制所公開的多個方面或實施方案。盡管可以在實施或檢驗所公開的內容中使用與本文中所述的那些方法和材料相 似或等同的任意方法和材料，然而描述了某些當前優選的方法和材料而不意圖使實施者限 于所描述的任何具體方法、方案和試劑，因而這些可以變動。通過引用的方式明確并入本文 中所參考的全部專利和出版物，包括此類專利和出版物中公開的全部序列。2.命名在本說明書和權利要求書中，使用氨基酸殘基的常規單字母或三字母代碼。出于 引用方便，α-淀粉酶變體通常地由以下命名描述原始氨基酸位置替換的氨基酸根據這種命名，例如將第242位置處用丙氨酸替換絲氨酸顯示為Ser242Ala 或 S242A將第30位置處的丙氨酸缺失顯示為Ala30*或 A30*或 ΔΑ30并且將額外氨基酸殘基如賴氨酸的插入顯示為Ala30AlaLys 或 A30AK。氨基酸殘基連續區段(如氨基酸殘基30-33)的缺失顯示為(30-33) *或Δ (Α30-Ν33)。在特定α-淀粉酶與其他α-淀粉酶相比含有“缺失”并且在該位置內產生插入 的情況下，對于在第36位置插入天冬氨酸而言，這表示為* 36Asp or * 36D對于在笫36位置插入天冬氨酸而言。 多個突變由加號隔開，即Ala30Asp+Glu34Ser 或 A30N+E34S代表在30和34位置中將丙氨酸和谷氨酸分別替換為天冬氨酸和絲氨酸的突變。當可以在給定位置插入一個或多個備選氨基酸殘基時，它表示為A30N, E 或備選地，A30N 或 A30E。另外，當本文中鑒定到適合修飾的位置而不指出任何具體的修飾時，應當理解任 意氨基酸殘基可以替換該位置內存在的氨基酸殘基。因而，例如，當提到修飾在第30位置 處的丙氨酸，但不具體說明時，應當理解該丙氨酸可以缺失或替換為任何其他氨基酸，即， 以下任一氨基酸R、N、D、A、C、Q、E、G、H、I、L、K、Μ、F、P、S、Τ、W、Y、V。另夕卜，“Α30Χ”意指以下的任一替換A30R、A30N、A30D、A30C、A30Q、A30E、A30G、 A30H、A30I、A30L、A30K、A30M、A30F、A30P、A30S、A30T、A30W、A30Y 或 A30V ；或簡寫為A30R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y、V。如果用于編號的親本酶已經在該位置處具有建議替換的所討論氨基酸殘基，則在 例如N或V之一存在于野生型中的情況下使用以下命名“X30N”或“X30N，V”。這表明其他相應的親本酶在位置30被替換成“Asn”或“Val”。3.氨基酸殘基的特征帶電荷的氨基酸Asp、Glu、Arg、Lys、His帶負電荷的氨基酸(負電荷最多的殘基排在首位)Asp、Glu帶正電荷的氨基酸(正荷最多的殘基排在首位)Arg、Lys、His中性氨基酸Gly、Ala、Val、Leu、lie、Phe> Tyr> Trp、Met、Cys> Asn、Gin、Ser> Thr> Pro疏水性氨基酸殘基(疏水性最強的殘基排在最后)Gly、Ala、Val、Pro、Met、Leu、lie、Tyr、Phe、Trp，親水性氨基酸(親水性最強的殘基排在最后)Thr> Ser> Cys> His、Glu、Gin、Asn、Asp、Lys> Arg4. α-淀粉酶和AmyS樣淀粉酶4. 1多種α _淀粉酶的氨基酸同一性由芽孢桿菌屬某些物種產生的多種α -淀粉酶在氨基酸水平是高度同源(同一) 的并且可以用作本文中的親本酶。可以在下表A中找到多種已知芽孢桿菌α-淀粉酶相互 之間的同一性百分數(基于氨基酸序列)。表A 幾種已知芽孢桿菌α -淀粉酶的氨基酸序列同一性
技術人員會理解可以從文獻或通過本文中公開的或本領域已知的任意方法確定 同一性百分數。例如，已經發現地衣芽孢桿菌α-淀粉酶(LAT) (SEQ ID NO 7)與解淀 粉芽孢桿菌α-淀粉酶(SEQ ID NO 9)約81 %同源并且與嗜熱脂肪土芽孢桿菌α-淀 粉酶(BSG) (SEQ ID Ν0:1)約65%同源。額外同源α -淀粉酶包括WO 95/26397中公 開的 SP690 禾口 SP722，及由 Tsukamoto 等人，Biochemical and Biophysical Research Communications, 151 (1988)，第25-31頁描述的從芽孢桿菌屬某些物種衍生的#707 α -淀 粉酶(SEQ ID NO 6)。KSM ΑΡ1378 α -淀粉酶在WO 97/00324中公開(來自KAO公司)。4. 2親本α -淀粉酶如上文定義的AmyS樣α _淀粉酶可以作為親本α -淀粉酶使用。在一個優選的實 施方案中，親本α -淀粉酶從嗜熱脂肪土芽孢桿菌(例如上文引用的那些嗜熱脂肪土芽孢 桿菌之一)衍生，如具有SEQ ID NO :1或2中所示氨基酸序列的嗜熱脂肪土芽孢桿菌α-淀 粉酶。4. 3親本雜合α -淀粉酶親本α -淀粉酶(即主鏈α -淀粉酶)也可以是雜合α -淀粉酶，即包含從至少 兩種α-淀粉酶衍生的部分氨基酸序列的組合的α-淀粉酶。親本雜合α-淀粉酶可以是一種這樣的α-淀粉酶，其中可以基于(如上文所定 義的)氨基酸同源性(同一性)和/或DNA雜交確定所述α -淀粉酶屬于上文描述的AmyS 樣α-淀粉酶家族。在這種情況下，雜合α-淀粉酶一般由AmyS樣α-淀粉酶的至少一個 部分和選自微生物(細菌或真菌)和/或哺乳動物來源的AmyS樣α -淀粉酶或非AmyS樣 α-淀粉酶的一種或多種其他α-淀粉酶的部分組成。因而，親本雜合α -淀粉酶可以包含從至少兩種AmyS樣α -淀粉酶或從至少一種 AmyS樣和至少一種非AmyS樣細菌α -淀粉酶或從至少一種AmyS樣和至少一種真菌α-淀 粉酶衍生的部分氨基酸序列的組合。衍生部分氨基酸序列的AmyS樣α-淀粉酶可以是本文中所引用的任意的特定AmyS樣α-淀粉酶。例如，親本α -淀粉酶可以包含從地衣芽孢桿菌菌株衍生的α _淀粉酶的羧基端 部分和從嗜熱脂肪土芽孢桿菌菌株或從嗜熱脂肪土芽孢桿菌(BSG)菌株衍生的α _淀粉酶 的氨基端部分。
5.同源性(同一性)同源性可以作為兩個序列之間的同一性程度確定，表示彼此之間的關系，例如，第 一序列從第二序列衍生或反之亦然。同源性可以通過視檢或手工計算確定，不過更便利地 借助本領域已知的計算機程序如在(上文描述的)GCG程序包中提供的一種程序GAP確定。 因而，可以使用Gap GCGvS，例如采用同一性的默認評分矩陣和以下默認參數對于核酸序 列比較而言，空位創建罰分5. 0和空位延伸罰分0. 3，并且對于蛋白質序列比較而言，空位 創建罰分 3.0 和空位延伸罰分 0. 1。GAP 使用 Needleman 和 Wunsch，(1970), J. Mol. Biol. 48 443-453的方法以產生比對結果并計算同一性。在Spezyme Xtra(SEQ ID NO 2)與例如另一種α -淀粉酶之間的結構性比對結果 可以用來鑒定其他AmyS樣α-淀粉酶中的等同/對應位置。獲得所述結構性比對結果的 一種方法將是使用來自GCG軟件包的Pile Up程序，利用空位罰分的默認值，S卩，空位創建 罰分3. 0和空位延伸罰分0. 1。其他結構性比對方法包括疏水簇分析法(Gaboriaud等人， FEBS Lett. 224 149-155，1987)和反向穿線法(reverse threading) (Huber,T ；Torda,AE, Protein Sci. 7(1) 142-149,1998) 6.雜交在表征以上AmyS樣α _淀粉酶中使用的寡核苷酸探針可以基于所討論α -淀粉 酶的全部或部分核苷酸或氨基酸序列適宜地制備。評估雜交的合適條件涉及在5Χ SSC中預浸泡并在40°C于20%甲酰胺，5Χ Denhardt溶液，50mM磷酸鈉，pH 6. 8和50mg超聲處理的變性小牛胸腺DNA的溶液中預雜 交1小時，隨后在40°C于補充有IOOmMATP的相同溶液中雜交18小時，隨后在40°C (低 嚴格性)、優選地在50°C (中等嚴格性)、更優選地在65°C (高嚴格性)、甚至更優選地在 750C (非常高嚴格性)于2X SSC，0.2% SDS中洗滌濾膜3次，30分鐘。關于雜交方法的 更多細節可以在 Sambrook 等人，Molecular Cloning :A Laboratory ManuaL，第 2 版，Cold Spring Harbor, 1989 中找到。在本上下文中，“從......衍生”不僅意圖指由所討論的生物菌株產生或可產生
的α "淀粉酶，還指由分離自該菌株的DNA序列編碼并在用所述DNA序列轉化的宿主生物 中產生的α-淀粉酶。最后，該術語意圖指由合成和/或cDNA來源的DNA序列編碼并具有 所討論α-淀粉酶的鑒別性特征的α-淀粉酶。該術語意圖表明親本α-淀粉酶可以是天 然存在α-淀粉酶的變體，即這樣的變體，它是修飾(插入、替換、缺失)天然存在α-淀粉 酶的一個或多個氨基酸殘基的結果。7.變體α -淀粉酶中的一般突變在一個實施方案中，除了上文概述的那些修飾之外，本文中所述的變體還可以包 含一個或多個修飾。因而，可能有利的是將被修飾的α-淀粉酶變體的部分中存在的一個 或多個脯氨酸殘基(Pro)替換為非脯氨酸殘基，其中所述的非脯氨酸殘基可以是可能的、 天然存在的非脯氨酸殘基中的任一氨基酸殘基，并且優選地是丙氨酸、甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、纈氨酸或亮氨酸。類似地，在一個實施方案中，可以將親本α-淀粉酶中存在的一個或多個半胱氨 酸殘基替換為非半胱氨酸殘基，如絲氨酸、丙氨酸、蘇氨酸、甘氨酸、纈氨酸或亮氨酸。
應當理解本公開包括摻入兩個或更多個上文所概述修飾的變體。另外，可能有利的是在一個或多個以下位置(使用SEQ ID NO 7用于編號)導入 突變M15、V128、A111、H133、W138、T149、M197、N188、A209、A210、H405、T412，尤其以下 的單一、二重或三重或多重突變M15X，尤其 M15T，L ；V128X，尤其 V128E ；H133X，尤其 H133Y ；N188X，尤其 N188S，T，P ；M197X,尤其 M197T，L ；A209X，尤其 A209V ；M197T/W138F ；M197T/138Y ；M15T/H133Y/N188S ；M15N128E/H133Y/N188S ；E119C/S130C ；D124C/R127C ；H133Y/T149I ；禾口 / 或G475R, H133Y/S187D ；H133Y/A209V。在親本α-淀粉酶具有SEQ ID No. 7中所示氨基酸序列的情況下，可以被缺失 或替換以改善氧化穩定性的相關氨基酸殘基包括SEQ ID NO :2中的單一半胱氨酸殘基 (C363)和位于 Μ8、Μ9、Μ96、Μ200、Μ206、Μ284、Μ307、Μ311、Μ316 和 Μ438 位置內的甲硫氨酸殘基。就提高α -淀粉酶變體相對于其親本α _淀粉酶的熱穩定性而言，似乎特別希望 在SEQ ID NO :2中所示的氨基酸序列中缺失至少一個并且優選地缺失2個或甚至3個以下 氨基酸殘基F178、R179、G180、1181、G182 和 K183。特別感興趣地，這種類型的成對缺失是R179 * +G180 * ；和1181 * +G182 * (分別是 SEQ ID NO 16或15)(或在滿足本公開上下文中親本α-淀粉酶要求的另一個α -淀粉酶 中這些成對缺失的等同物)。其他目的殘基包括SEQ ID NO 2中所示氨基酸序列的N193F和V416G。8.變體的改變特性8. 1 概述以下部分描述突變之間的關系，其中所述突變存在于本文中所述的變體中并且是 可以從其產生(相對于親本AmyS樣α-淀粉酶的那些特性而言)想要的特性改變。本文中描述了具有改變特性的AmyS樣α -淀粉酶。本文中具體構思的親本α -淀 粉酶是AmyS樣α -淀粉酶和親本雜合AmyS樣α -淀粉酶。在一個實施方案中，使用嗜熱脂肪土芽孢桿菌α-淀粉酶(SEQ ID NO 2)作為起 點，即，親本淀粉酶，但是在其他實施方案中，可以使用SP722、BLA、BAN、AA560、SP690、KSM AP1378、#707和其他芽孢桿菌屬α-淀粉酶。據此輕易地確定與SEQ ID NO :2中的位置相
對應的氨基酸位置。技術人員會了解盡管出于編號/鑒定特定變體中已修飾及待修飾的氨基酸殘基的目的，可能使用任意親本α-淀粉酶作為參考淀粉酶，然而SEQID Ν0:1是目前為此目的 優選序列，因為它是本文目前可獲得的最長嗜熱脂肪芽孢桿菌序列。在一個方面，本公開涉及了具有改變特性(例如，如上所述特性)的變體。 在其幾個方面之一，本公開提供了親本嗜熱脂肪土芽孢桿菌α-淀粉酶的變體， 該變體在選自(使用例如SEQ ID Ν0:1用于氨基酸編號的)以下位置的一個或多個位置處 包含改變P17、D19、T21、N28、S51、G72、V74、A82、Q86、Q89、A93、G95、Q97、W115、D117、P123、 S124、D125、N127、I130、G132、Q135、P145、G146、G148、S153、Y159、W166、S169、K171、W187、 P209、N224、S242、G256、D269、N271、T278、N281、G302、A304、R308、T321、Q358、P378、S382、 K383、T398、H405、T417、E418、P420、G421、P432、W437、G446、G454、S457、T459、T461、S464、 G474、R483，其中(a)所述改變獨立地是在占據該位置的氨基酸下游插入氨基酸；(ii)缺失占據該 位置的氨基酸；或(iii)用不同的氨基酸替換占據該位置的氨基酸，(b)該變體具有α -淀粉酶活性，并且(c)每個位置對應于親本淀粉酶(例如嗜熱脂肪土芽孢桿菌α -淀粉酶(例如具 有SEQ ID Ν0:2中所示的氨基酸序列))的氨基酸序列的位置，所述親本淀粉酶例如是作為 來自Genencor的SPEZYME XTRA可商業獲得的截短α -淀粉酶。本文中具體構思了S242A、S242Q、S242N 和 S242E。額外地，選擇殘基R179、G180、I181、G182、K183以探索鈣-鈉結合區中突變的作 用并且因為在α -螺旋中央的脯氨酸是不尋常的，故選擇Ρ245。可以通過如上所述的比對，例如，如與圖4中比對結果中所示的那些序列比對找 到其他親本AmyS樣α-淀粉酶中的對應位置。因而，本文中構思了在以上列舉的位置(使 用例如SEQ ID NO :1用于比較性氨基酸編號)處包含改變的親本AmyS樣α -淀粉酶的變 體。8. 2改變的特性穩定性在本文中所述變體的上下文中，就實現改變的穩定性、尤其改善的穩定性(即更 高或更低)，在尤其高的溫度(即約70-120°C)和/或極端ρΗ(即低或高ρΗ，即分別是ρΗ 4-6或ρΗ 8-11)，尤其在低于60ppm的游離(即未結合的，因而溶液中的)鈣濃度而言，重 要的突變(包括氨基酸替換和缺失)包括在“改變的特性”部分中所列出的任意突變。可 以如下文“方法”部分中所述確定穩定性。8. 3改變的特性Ca2+穩定性改變的Ca2+穩定性意指已經相對于親本酶而改善酶在Ca2+耗竭下的穩定性，S卩，更 高或更低的穩定性。在本文中所述變體的上下文中，就實現改變的Ca2+穩定性、尤其改善的 Ca2+穩定性，S卩，更高或更低的穩定性，尤其在高ρΗ(即ρΗ 8-10.5)而言，重要的突變(包 括氨基酸替換和缺失)包括在“改變的特性”部分中所列出的任意突變。8. 4改變的特性比活性在又一方面，就獲得變體而言，重要的突變(包括氨基酸替換和缺失)包括在“改 變的特性”部分中所列出的任意突變，其中所述的變體展示改變的比活性，尤其提高或降低的比活性，尤其在約10-60°C的溫度、優選約20-50°C、尤其約0-40°C。可以如下文“方法” 部分中所述確定比活性。8. 5改變的特性氧化穩定性 與親本α-淀粉酶相比，所描述的變體可以具有改變的氧化穩定性，尤其是更高 的氧化穩定性。提高的氧化穩定性在例如洗滌劑組合物中是有利的，并且降低的氧化穩定 性可能在意圖用于淀粉液化的組合物中是有利的。可以如下文“方法”部分中所述確定氧 化穩定性。8. 6改變的特性改變的ρΗ譜就獲得變體而言，重要的位置和突變包括靠近活性中心殘基存在的氨基酸殘基的 突變，其中所述變體具有改變的PH譜，特別地在尤其高的ρΗ(即ρΗ 8-10. 5)或低的ρΗ(即 PH 4-6)時改善的活性。優選的特定突變/替換包括上文在“改變的特性”部分中對所討論位置列出的那 些突變/替換。在下文“方法”部分中描述合適的測定法。8. 7改變的特性洗滌性能就獲得變體而言，重要的位置和突變包括上文在“改變的特性”部分中對所討論位 置列出的特定突變/替換，其中所述變體在尤其高的ΡΗ(即ρΗ8. 5-11)時具有改善的洗滌 性能。可以如下文“方法”部分中所述測試洗滌性能。9.制備α-淀粉酶變體的方法如用于α -淀粉酶編碼性DNA序列的克隆方法那樣，用于導入突變至基因中的方 法是本領域已知的。將在下文討論此類方法，包括用于在α-淀粉酶編碼序列內部特定位 點處產生突變的方法。9. 1克隆編碼α -淀粉酶的DNA序列編碼親本α -淀粉酶的DNA序列可以使用本領域熟知的各種方法從產生所討論 α-淀粉酶的任意細胞或微生物分離。首先，應當使用來自產生待研究α-淀粉酶的生物的 染色體DNA或信使RNA構建基因組DNA和/或cDNA文庫。如果該α -淀粉酶的氨基酸序列 是已知的，則可以合成并使用同源的標記寡核苷酸探針以從基因組文庫鑒定編碼α-淀粉 酶的克隆，其中所述的基因組文庫從所討論生物制備。備選地。可以使用含有與已知α -淀 粉酶基因同源的序列的標記寡核苷酸探針作為探針來鑒定編碼α"淀粉酶的克隆，例如使 用低嚴格性的雜交和洗滌條件。用于鑒定編碼α _淀粉酶的克隆的另一種方法是基于將基因組DNA片段插入表達 載體如質粒，用所得基因組DNA文庫轉化α -淀粉酶陰性細菌并將轉化的細菌涂布在含有 α -淀粉酶底物的瓊脂上，因而允許輕易地鑒定表達α -淀粉酶的克隆。備選地，編碼所述酶的DNA序列可以通過已建立的標準方法合成地制備，例如 S. L. Beaucage 禾口 Μ. H. Caruthers,Tetrahedron Letters 22 1859-1869 (1981)描述的亞磷 酰胺法或Matthes等人，EMBO J. 3 :801_895 (1984)描述的方法。在亞磷酰胺方法中，將寡 核苷酸合成，例如在自動DNA合成儀中，純化、復性、連接和在適宜載體中克隆。最后，DNA序列可以是混合來源的，包含例如根據標準技術，通過連接合成的、基因 組的或cDNA來源的片段(根據需要，與整個DNA序列的多個部分相對應的片段)制備的基 因組序列和合成序列、合成序列和cDNA序列或基因組序列和cDNA序列。DNA序列也可以通過使用特異性引物的聚合酶鏈反應(PCR)，例如在美國專利號4，683，202或R. K. Saiki等人 EMBO J. 3 =801-895(1988)中所述的 PCR 制備。9. 2位點定向誘變 一旦已經分離編碼α -淀粉酶的DNA序列并鑒定了用于突變的所需位點，則可以 使用合成的寡核苷酸導入突變。這些寡核苷酸含有分布在所需突變位點側翼的核苷酸序 列；將突變核苷酸在寡核苷酸合成期間插入。在一個具體方法中，在攜帶α-淀粉酶基因 的載體中產生跨接編碼α-淀粉酶的序列的DNA單鏈缺口。隨后，攜帶所需突變的合成性 核苷酸與單鏈DNA的同源部分復性。剩余缺口隨后用DNA聚合酶I (克列諾片段)補平 并使用Τ4連接酶連接構建體。這種方法的具體例子在Morinaga等人Biotechnology 2 636-639(1984)中描述。美國專利號4，760，025公開了通過表達盒的微小改變而導入編碼 多重突變的寡核苷酸。然而，可以通過Morinaga方法在任一時間導入甚至更多種類的突 變，原因在于可以導入長度各異的許多寡核苷酸。在Nelson 和 Long, Analytical Biochem.，180 147-151，1989 中描述了將突變導 入編碼α-淀粉酶的DNA序列的另一種方法。該方法涉及含有所需突變的PCR片段的3-步 驟生成，其中所需突變通過使用化學合成的DNA鏈作為PCR反應中的引物之一導入。攜帶 突變的DNA片段可以從PCR生成的片段通過用限制性核酸內切酶切割進行分離并重新插入 表達質粒。技術人員會了解許多備選方法可用于提供或獲得本文中的變體。例如，基因改 組，例如，如 WO 95/22625 (來自 Affymax Technologies N. V.)或 WO 96/00343 (來自 Novo Nordisk A/S)中所述，或產生包含所討論突變例如替換和/或缺失的雜合酶的其他相應技 術。9.3α-淀粉酶變體的表達可以使用表達載體以酶形式表達編碼由上文所述方法或由本領域已知的任意備 選方法產生的變體的DNA序列，其中所述表達載體一般包括編碼啟動子、操縱基因、核糖體 結合位點、翻譯起始信號和任選地阻遏基因或多種激活基因的調控序列。攜帶編碼用于本文中的α -淀粉酶變體的DNA序列的重組表達載體可以任意載 體，其可以便利地經歷重組DNA過程，并且載體的選擇經常取決于待導入該載體的宿主細 胞。因而，載體可以是自主復制型載體，即作為其復制不依賴染色體復制的染色體外實體存 在的載體，例如，質粒、噬菌體、染色體外元件、微型染色體或人工染色體。備選地，載體可以 整合到宿主細胞基因組中并隨已經整合有該載體的染色體一起復制。在載體中，所述DNA序列應當有效連接于合適的啟動子序列。該啟動子可以是在 所選宿主細胞中顯示轉錄活性的任意DNA序列并可以從編碼與該宿主細胞同源或異源的 蛋白質的基因衍生。用于指導編碼用于本文中的α-淀粉酶變體的DNA序列轉錄、尤其在 細菌宿主中轉錄的合適啟動子的例子是大腸桿菌Iac操縱子的啟動子、天藍色鏈霉菌瓊脂 糖酶基因dagA的啟動子、地衣芽孢桿菌α-淀粉酶基因(amyL)的啟動子、嗜熱脂肪土芽孢 桿菌生麥芽糖淀粉酶基因(amyM)的啟動子、解淀粉芽孢桿菌α -淀粉酶(amyQ)的啟動子、 枯草芽孢桿菌xylA和xylB基因的啟動子等。對于真菌宿主中的轉錄，有用啟動子的例子 是從編碼稻曲霉(A.oryZae)TAKA淀粉酶、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白 酶、黑曲霉(A.niger)中性α-淀粉酶、黑曲霉酸穩定的α-淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米黑根毛霉脂肪酶、稻曲霉堿性蛋白酶、稻曲霉磷酸三糖異構酶或構巢曲霉(A.nidulans)乙 酰胺酶的基因衍生的那些啟動子。用于本文中的表達載體也可以包含合適的轉錄終止子和在真核生物中與編碼 α -淀粉酶變體的DNA序列有效連接的多腺苷酸化序列。終止序列和多腺苷酸化序列可以 適宜地從與啟動子相同的來源衍生。 載體可以還包含能夠使該載體在所討論的宿主細胞中復制的DNA序列。此類序列 的例子是質粒 pUC19、pACYC177、pUB110、pE194、pAMBl 和 pIJ702 的復制起點。載體也可以包含選擇標記，例如其產物彌補宿主細胞中缺陷的基因，如來自枯草 芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌的dal基因，或賦予抗生素抗性如氨芐青霉素、卡那霉素、氯霉素 或四環素抗性的基因。另外，該載體可以包含曲霉屬選擇標記如amdS、argB、niaD和sC、產 生潮霉素抗性的標記，或可以通過共轉化實現選擇，例如，如WO 91/17243中所述。盡管胞內表達可以在一些方面是有利的，例如當使用某些細菌作為宿主細胞時， 然而通常優選表達是胞外的。通常，本文中提到的芽孢桿菌屬α-淀粉酶包含允許所表達 的蛋白酶分泌到培養基中的前區域。根據需要，這種前區域可以被不同的前區域或信號序 列替換，便利地通過替換編碼各自前區域的DNA序列實現。本領域技術人員熟知用來連接分別編碼α -淀粉酶變體、啟動子、終止子和其他 元件的DNA構建體并將這些DNA構建體插入含有復制必需信息的合適載體的方法(參參 見例如 Sambrook 等人，MOLECULARCLONING :A LABORATORY MANUAL，第二版，Cold Spring Harbor,1989)。用于本文中的細胞，例如包含如上文定義的DNA構建體或表達載體的細胞，可以 在α-淀粉酶變體的重組產生中用作宿主細胞。細胞可以用編碼變體的DNA構建體轉化， 便利地通過在宿主染色體中整合(一個或多個拷貝的)DNA構建體。通常認為這種整合是 有利的，因為DNA序列更有可能穩定地維持于細胞中。可以根據常規方法例如通過同源或 異源重組將DNA構建體整合到宿主染色體中。備選地，細胞可以用與不同類型宿主細胞有 關的如上所述表達載體轉化。用于本文中的細胞可以是高等生物如哺乳動物或昆蟲的細胞，但優選地是微生物 細胞，例如細菌細胞或真菌(包括酵母)細胞。合適細菌的例子是革蘭氏陽性細菌，如枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、遲緩芽孢桿 菌、短芽孢桿菌、嗜熱脂肪土芽孢桿菌、嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、凝固芽孢桿菌、環 形芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)、蘇云金芽孢桿菌或變 鉛青鏈霉菌或鼠灰色鏈霉菌；或革蘭氏陰性細菌如大腸桿菌。細菌的轉化可以例如通過原 生質體轉化或通過使用感受態細胞以本身已知的方式實施。在被用于表達的情況下，酵母可以有利地選自酵母屬(Saccharomyces)或裂殖酵 母屬(Schizosaccharomyces)物種，例如釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。絲狀真菌 可以有利地選自曲霉屬物種，例如稻曲霉或黑曲霉。真菌細胞可以通過涉及原生質體形成 和原生質體轉化隨后細胞壁再生的方法以本身已知的方式轉化。用于轉化曲霉屬宿主細胞 的合適方法在EP238023中描述。在又一方面，本公開涉及產生α-淀粉酶變體的方法，所述方法包括在促進變體 產生的條件下培育如上文所述的宿主細胞并從細胞和/或培養基回收該變體。
用來培育細胞的培養基可以是適于生長所討論的宿主細胞并獲得α -淀粉酶變 體表達的任何常規培養基。合適的培養基是從商業供應商可獲得的或可以根據公開(例 如，如ATCC目錄中所述)的配方制備。 從宿主細胞分泌的α -淀粉酶變體可以通過已知方法從培養基回收，所述的已知 方法包括通過離心或過濾將細胞與培養基分離并借助鹽(如硫酸銨)析出培養基的蛋白質 組分，隨后使用層析方法如離子交換層析、親和層析等。9. 4用于表征和篩選變體的方法9. 4. 1濾紙篩選測定法以下測定法可以用來篩選在高或低ρΗ和/或在Ca2+耗竭條件下與親本酶和AmyS 樣α-淀粉酶相比具有改變的穩定性的AmyS樣α _淀粉酶變體。9. 4. 2高ρΗ濾紙測定法將芽孢桿菌文庫涂布在含10 μ g/mL卡那霉素的TY瓊脂平板上的乙酸纖維素 濾紙(0E 67，Schleicher&Schuell, Dassel，德國)和硝化纖維素濾紙(Protran-Ba 85， Schleicher&Schuell，Dassel，德國)的夾層上，在37°C持續至少21小時。乙酸纖維素層 位于TY瓊脂平板上面。在涂布后，但在溫育前，用針專門標記每個濾紙夾層，目的在于能夠定位濾紙上 的陽性變體，并將硝化纖維素濾紙連同結合的變體轉移至具有甘氨酸-NaOH緩沖液，ρΗ 8. 6-10. 6的容器并在室溫(可以從約10-60°C變化)溫育15分鐘。將帶有菌落的乙酸纖 維素濾紙在室溫貯存于TY-平板上，直至使用。溫育后，在ρΗ 8. 6-10. 6甘氨酸-NaOH緩沖 液中含有瓊脂糖，0.2%淀粉的平板上檢測殘余活性。將帶有硝化纖維素濾紙的測試平 板以與濾紙夾層相同的方式標記并在室溫溫育2小時。在取出濾紙后，測試平板用10%路 戈爾碘液染色。檢測到淀粉降解變體作為深藍色背景上的白點并且隨后在貯存平板上鑒定 它們。陽性變體在與第一次篩選相同的條件下重新篩選2次。9. 4. 3低鈣濾紙測定法將芽孢桿菌文庫涂布在含相關抗生素例如卡那霉素或氯霉素的TY瓊脂平板 上的乙酸纖維素濾紙(0E 67，Schleicher&Schuell, Dassel，德國)和硝化纖維素濾紙 (Protran-Ba 85，Schleicher&Schuell，Dassel，德國)的夾層上，在 37°C持續至少 21 小時。 乙酸纖維素層位于TY瓊脂平板上面。在涂布后，但在溫育前，用針專門標記每個濾紙夾層，目的在于能夠定位濾紙上的 陽性變體，并將硝化纖維素濾紙連同結合的變體轉移至具有碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖液約PH 8. 5-10并具有不同EDTA濃度(約0. OOlmM至約IOOmM)的容器。濾紙在室溫溫育1小時。 將帶有菌落的乙酸纖維素濾紙在室溫貯存于TY-平板上，直至使用。溫育后，在碳酸鹽/碳 酸氫鹽緩沖液約PH 8. 5-10中含有瓊脂糖，0.2%淀粉的平板上檢測殘余活性。將帶有 硝化纖維素濾紙的測試平板以與濾紙夾層相同的方式標記并在室溫溫育約2小時。在取 出濾紙后，測試平板用約10%路戈爾碘液染色。檢測到淀粉降解變體作為深藍色背景上的 白點并且隨后在貯存平板上鑒定它們。陽性變體在與第一次篩選相同的條件下重新篩選2 次。9. 4.4低ρΗ濾紙測定法將芽孢桿菌文庫涂布在含10 μ g/mL氯霉素的TY瓊脂平板上的乙酸纖維素濾紙(0E 67，Schleicher&Schuell, Dassel,德國)和硝化纖維素濾紙(Protran-Ba 85， Schleicher&Schuell，Dassel，德國)的夾層上，在37°C持續至少21小時。乙酸纖維素層 位于TY瓊脂平板上面。在涂布后，但在溫育前，用針專門標記每個濾紙夾層，目的在于能夠定位濾紙上的 陽性變體，并將硝化纖維素濾紙連同結合的變體轉移至具有檸檬酸鹽緩沖液，PH4. 5的容器 并在80°C溫育20分鐘(當篩選野生型主鏈中的變體時)或在85°C溫育60分鐘(當篩選 親本a-淀粉酶的變體時)。將帶有菌落的乙酸纖維素濾紙在室溫貯存于TY-平板上，直至 使用。溫育后，在PH 6.0檸檬酸鹽中含有瓊脂糖，0.2%淀粉的測試平板上檢測殘余活 性。將帶有硝化纖維素濾紙的測試平板以與濾紙夾層相同的方式標記并在50°C溫育2小 時。在取出濾紙后，測試平板用10%路戈爾碘液染色。檢測到淀粉降解變體作為深藍色背 景上的白點并且隨后在貯存平板上鑒定它們。陽性變體在與第一次篩選相同的條件下再篩 選2次。9. 4. 5 二次篩選在重新篩選后，將陽性轉化體從貯存平板挑出并在二次平板測定法中測試。陽性 轉化體在37°C于5mL LB+氯霉素中生長22小時。在90°C于pH 4. 5檸檬酸鹽緩沖液中溫 育每個陽性轉化體和作為對照的表達相應主鏈的克隆的芽孢桿菌培養物并且在0、10、20、 30,40,60和80分鐘取得樣品。將3 y L樣品滴在測試平板上。測試平板用10%路戈爾碘 液染色。改良變體視為比主鏈具有更高殘余活性的變體(檢測為測試平板上的暈圈)。通 過核苷酸測序確定改良的變體。9. 4. 6未純化變體的穩定性測定法變體的穩定性可以如下測試將表達待分析變體的芽孢桿菌培養物在37°C在 10mL LB+氯霉素中生長21小時。將800 u L培養物與200微升檸檬酸鹽緩沖液pH 4. 5混 合。在PCR管中制得與樣品時間點編號相對應的許多70 y L等份試樣并在PCR儀中在70°C 或90°C溫育多個時間段(一般5、10、15、20、25和30分鐘)。0分鐘樣品不在高溫上溫育。 如下文“ a -淀粉酶活性測定法”中所述，通過轉移20 y L至200 y L a -淀粉酶PNP_G7底物 MPR3((Boehringer Mannheim目錄號1660730)測量樣品中的活性。結果作為活性(相對于 0時間點)百分數對時間作圖或表述為溫育某段時間后的殘余活性百分數。9.4.7a-淀粉酶變體的發酵和純化攜帶相關表達質粒的枯草芽孢桿菌菌株可以如下發酵和純化將菌株從-80°C貯 藏物劃線于含有10 U g/mL卡那霉素的LB-瓊脂平板上并在37°C過夜生長。將菌落轉移至 500mL搖瓶中補充有10 u g/mL氯霉素的100mLPS-l培養基。PS-1培養基的組成珍珠糖100g/L大豆粕40g/LNa2HP04,12H2010g/LPluronic PE 6100 0.lg/LCaC035g/L培養物在37 °C以270轉/分鐘振搖5日。通過以4500轉/分鐘離心20-25分鐘從發酵肉湯除去細胞和細胞碎片。此后，過濾上清液以獲得完全清亮的溶液。將濾液濃縮并在UF-濾器(10000截止值膜)上洗滌并且 將緩沖液換成PH 5. 5的20mM乙酸鹽緩沖液。在S-SEPHAROSE F. F.上施加UF-濾液并通過 逐步洗脫法用相同緩沖液中的0. 2M NaCl實施洗脫。洗脫液對pH 9. 0的10mM Tris透析 并施加在Q-SEPHAROSE F. F.上并且用從0_0. 3M NaCl的線型梯度經6個柱體積洗脫。匯 集含有(由PHADEBAS測定法測量的)活性的級分，將pH調節至pH 7.5，并且通過用0.5% w/v活性碳處理5分鐘除去剩余顏色。9. 4. 8比活性測定使用PHADEBAS 測定法(Magle Life Sciences)，可以測定比活性為活性/ mg酶。遵循制造商說明實施(也見下文“ a -淀粉酶活性測定法”)。9. 4. 9等電點的確定pi 由等點聚焦法(例如，使用 Pharmacia, Ampholine，pH 3. 5-9. 3)確定。9. 4. 10穩定性的確定可以使用如下方法測量淀粉酶穩定性在相關條件下溫育酶。樣品在各個時間點取得，例如在0、5、10、15和30分鐘后， 并在測試緩沖液(50mM Britton緩沖液，pH 7.3)中稀釋25倍(相同稀釋度用于全部取得 的樣品)并使用PHADEBAS測定法(MagleLife Sciences)在標準條件pH 7. 3，37°C下測量活性。使用在溫育前(0分鐘)測量的活性作為參考(100% )。將下降百分數計算為溫 育時間的函數。表顯示了在例如溫育30分鐘后的殘余活性。9. 4. 11a-淀粉酶活性測定法1. PHADEBAS 測定法a -淀粉酶活性由使用PHADEBAS 小片作為底物的方法確定。PHADEBAS小 片(PHADEBAS 淀粉酶試驗，由Magle Life Sciences供應)含有交聯的不溶性藍顏 色淀粉聚合物，該聚合物已經與牛血清白蛋白及緩沖物質混合并造片。對于每個單一測量，將一個小片懸浮在含有5mL的50mMBritton-Robinson緩沖液 (50mM乙酸，50mM磷酸，50mM硼酸，0. lmMCaCl2，用NaOH調節pH至目的值)的管中。試驗在 目的溫度的水浴中進行。在50mM Britton-Robinson緩沖液中稀釋待測試的a -淀粉酶。 將lmL這種a -淀粉酶溶液添加至5mL的50mM Britton-Robinson緩沖液。淀粉被a -淀 粉酶水解，產生可溶性藍色片段。以分光光度方式在620nm測量的所得藍色溶液的吸光度 是a-淀粉酶活性的函數。重要的是在溫育10或15分鐘(測試時間)后測量的620nm吸光度在620nm處 的0. 2至2. 0吸光度單位范圍內。在這個吸光度范圍內，活性與吸光度之間存在線性關系 (Lambert-Beer定律)。因而必須調整的酶的稀釋度以符合這個標準。在指定的條件集合 (溫度、pH、反應時間、緩沖液條件)下，lmg給定的a-淀粉酶會水解某個量的底物，并且藍 顏色會產生。在620nm測量顏色強度。測量的吸光度與給定條件集合下所討論的a -淀粉 酶的比活性(活性/mg純a -淀粉酶蛋白)直接成比例。2.備選方法a -淀粉酶活性由使用PNP_G7底物的方法確定。作為對硝基苯基- a，D_麥芽 庚糖苷縮寫的PNP-G7是可以被內切淀粉酶切割的嵌段低聚糖。切割后，該試劑盒中包含的a-葡糖苷酶消化此底物以釋放具有黃顏色并因而可以通過可見光分光光度法在入= 405nm (400-420nm)測量的游離PNP分子。含有PNP_G7底物和a -葡糖苷酶的試劑盒由 Boehringer-Mannheim 制造(目錄號 1054635)。為制備試劑溶液，如制造商推薦，將10mL底物/緩沖液添加至50mL酶/緩沖液。 通過轉移20P L樣品至96孔微量滴定平板并在25°C溫育實施該測定法。添加預平衡至 25°C的200 u L試劑溶液。將溶液混合并預溫育1分鐘并且在ELISA讀數儀中在0D 405nm 在4分鐘范圍內每隔30秒測量吸收。時間依賴性吸收曲線的斜率與給定條件集合下所討論的a -淀粉酶的活性直接 成比例。9. 4. 12LAS敏感性的確定變體在40°C與不同濃度的LAS (直鏈烷基苯磺酸鹽；Nansa 1169/P)溫育10分鐘。使用PHADEBAS 測定法或利用pnp-G7底物的備選方法確定殘余活性。在0. 1M磷酸鹽緩沖液pH 7. 5中稀釋LAS。使用以下濃度500ppm、250ppm、100ppm、50ppm、25ppm 和 lOppm 直至無 LAS。將變體在不同LAS緩沖液中稀釋成10mL總體積中的0. 01_5mg/l濃度并在溫控水 浴中溫育10分鐘。通過轉移小等份試樣至冷的測試緩沖液中停止溫育。重要的是在活性測 量期間，las濃度低于lppm，目的是不影響活性測量。使用上文提及的PHADEBAS 測 定法或備選方法一式兩份確定殘余活性。在扣除空白后測量活性。無LAS的活性是100%。10.使用淀粉酶變體的方法工業應用本文中呈現的a-淀粉酶變體具有允許在清潔過程和污漬去除中的多種工業應 用的有價值特性。本文中所述的一種或多種變體酶或組合物也可以在洗滌劑，尤其衣物洗 滌劑組合物和餐具洗滌用洗滌劑組合物、硬表面清潔組合物中使用。所述變體也可以如上 所述在用于紡織品、織物或服裝退漿的組合物、用于產生紙漿和紙張、發酵醪制備、乙醇生 產和淀粉轉化工藝的組合物使用。本文中的變體也可以用于紡織品、織物或服裝退漿(參見例如在此引入作為參考 的W0 95/21247、美國專利號4，643，736和EP 119，920)、發酵醪制備或釀造、以及用于紙漿 和紙張生產或相關工藝中。10. 1紙漿和紙張生產變體堿性a -淀粉酶也可以用在從淀粉強化廢紙和紙板產生木素纖維素材料如 紙漿、紙張和紙板中，尤其當再漿化在高于約7的pH處發生并且淀粉酶通過降解強化淀粉 而促進廢棄材料分解的情況下。a“淀粉酶變體尤其在從淀粉包層的印刷紙張產生造紙紙 漿的方法中有用。方法可以如W0 95/14807中所述進行，包括以下步驟a)使紙張分解以產生紙漿，b)在步驟a)之前、期間或之后用淀粉降解酶處理，和c)在步驟a)和b)之后，將油墨顆粒與紙漿分開。a -淀粉酶也可以在淀粉改性中非常有用，其中酶改性的淀粉連同堿性填料如碳 酸鈣、高嶺土和粘土一起用于造紙中。采用堿性a-淀粉酶變體，有可能在填料存在下將淀 粉改性，從而允許更簡單的集成工藝。10. 2紡織品、織物和服裝的退漿
a-淀粉酶變體也可以在紡織品、織物或服裝退漿中非常有用。在紡織品加工 工業中，a-淀粉酶在退漿工藝中常規地用作輔料以促進除去含淀粉的漿料，所述漿料在 織造期間在緯紗上起到保護性涂層的作用。在織造后徹底除去漿料涂層對于確保后續工 藝中的最佳結果是重要的，在所述后續工藝中將織物洗刷、漂白和染色。酶法淀粉分解 是優選的，因為它不涉及對纖維材料的任何有害影響。為降低加工成本并提高研磨通量 (millthroughput)，退漿工藝有時候與洗刷和漂白步驟合并。在這類情況下，一般使用非酶 助劑如堿或氧化劑來分解淀粉，因為常規的a “淀粉酶非常不兼容于高PH水平和漂白劑。 淀粉漿料的非酶分解由于所用的相當具侵入性的化學品而確實造成一些纖維損傷。因而， 使用a-淀粉酶變體將是受歡迎的，因為它們具有在堿性溶液中的改良性能。在含有纖維 素的織物或紡織品退漿時，a “淀粉酶可以單獨使用或與纖維素酶組合使用。退漿和漂白工藝是本領域熟知的。例如，此類工藝在在此引入作為參考的W0 95/21247、美國專利號 4，643，736 和 EP 119，920 中描述。用于退漿的市售產品包括來自Genencor的OPTISIZE FLEX。10. 3清潔過程和洗滌劑組合物本文中所述的變體a -淀粉酶可以添加至用于多種清潔或洗滌過程(包括衣物和 餐具洗滌)的洗滌劑組合物中并因而變成其組分。本文中提供的洗滌劑組合物可以例如配制為手工或機器用衣物洗滌劑組合物，包 括適于預處理染色織物的洗衣添加組合物和漂洗添加的織物軟化組合物，或配制為用于一 般家居硬表面清潔操作的洗滌劑組合物或配制用于手工或機器用餐具洗滌操作。在一個特定的方面，本文中提供了包含本文中所述變體酶的洗滌劑添加物。該洗 滌劑添加物以及洗滌劑組合物可以包含一種或多種其他酶如蛋白酶、脂肪酶、過氧化物酶、 另一種淀粉分解酶(例如另一種a “淀粉酶)、葡糖淀粉酶、生麥芽糖淀粉酶、CGTase和/ 或纖維素酶、甘露聚糖酶(如來自Genencor分公司Danisco US Inc的MANNASTAR ))、果 膠酶、果膠裂合酶、角質酶和/或漆酶。通常，所選酶的特性應當兼容于所選擇的洗滌劑(即，最適pH，與其他酶成分和非 酶成分的兼容性等)并且所述酶應當以有效量存在。蛋白酶合適的蛋白酶包括動物、植物或微生物來源的那些蛋白酶。優選微生物 來源。包括化學修飾的或蛋白質工程化的突變體。蛋白酶可以是絲氨酸蛋白酶或金屬蛋白 酶，優選地是堿性微生物蛋白酶或胰蛋白酶樣蛋白酶。堿性蛋白酶的例子是枯草蛋白酶，尤 其從芽孢桿菌屬衍生的那些枯草蛋白酶，例如枯草蛋白酶Novo、枯草蛋白酶Carlsberg、枯 草蛋白酶309、枯草蛋白酶147和枯草蛋白酶168(在W0 89/06279描述)。胰蛋白酶樣蛋 白酶的例子是(例如豬或牛來源的)胰蛋白酶和在W0 89/06270與W094/25583中描述的 鐮刀菌屬(Fusarium)蛋白酶。有用蛋白酶的其他例子可以在W098/23732、W099/20770、W0 92/19729, W0 98/20115、W098/20116 和 W0 98/34946 中找到。優選的市售蛋白酶酶包括‘ALCALASE .SAVINASE 、PRIM ASE 、 DURALASE 、ESPERASE 和 KANNASE (來自 Novozymes A/ s)、MAXATASE 、maxacal、MAXAPEM 、PROPERASE 、 PURAFECT 、PURAFECT OXP 、FN2 、FN3 、FN4 (Genencorlnternational Inc.) 0
脂肪酶合適的脂肪酶包括細菌或真菌來源的那些脂肪酶。包括化學修飾的或 蛋白質工程化的突變體。有用脂肪酶的例子包括來自腐質霉屬(Humicola)(同義詞嗜 熱真菌(Thermomyces))的脂肪酶，例如，如EP 258068和EP 305 216中所述的來自柔毛 腐質霉(H. lanuginosa) (T. lanuginosus)或如 TO 96/13580 中所述的來自 H. insolens 的 脂肪酶，假單胞菌屬(Pseudomonas)脂肪酶，例如，來自產堿假單胞菌(P. alcaligenes)或 類產堿假單胞菌(P. pseudoalcaligene) (EP 218272)、洋蔥假單胞菌(P. cepacia) (EP331 376)、斯氏假單胞菌(P. stutzer) (GB 1，372，034)、熒光假單胞菌(P. fluorescens)、假 單胞菌屬(Pseudomonas spp.)菌株 SD 705 (W0 95/06720 和 W0 96/27002)、威斯康星假 單胞菌(P.wisconsinensis) (W0 96/12012)、芽孢桿菌屬脂肪酶，例如來自枯草芽孢桿菌 (Dartois 等人(1993)，Biochemicaet Biophysica Acta，1131，253-360)、嗜熱脂肪芽孢 桿菌(JP 64/744992)或短小芽孢桿菌(B. pumilus) (W0 91/16422)。其他例子是脂肪酶 變體，如 W092/05249、W0 94/01541、EP 407225、EP 260105、W0 95/35381、W096/00292、W0 95/30744、W0 94/25578、W0 95/14783、W0 95/22615、W0 97/04079 和 W0 97/07202 中描述 的那些脂肪酶變體。優選的市售脂肪酶包括LIP0LASE 和 LIP0LASE ULTRA (Novozymes A/S)。淀粉酶也可以包括一種或多種額外的淀粉酶。合適的淀粉酶(a和/或0 )包 括細菌或真菌來源的那些淀粉酶。包括化學修飾的或蛋白質工程化的突變體。淀粉酶包括 例如從芽孢桿菌屬、例如從GB 1，296，839中更詳細描述的地衣芽孢桿菌的特定菌株獲得 的a-淀粉酶。有用a-淀粉酶的例子是在W0 94/18314、W0 96/39528、W0 94/02597、W0 94/18314、W096/23873 和 W0 97/43424 中描述的變體。市售的a -淀粉酶是 DURAMYLtm、L1QUEZYMEtm、TERMAMYtm、NATALASEtm、FUNGAMYL 和 BAN (Novozymes A/S)、RAPIDASE 和 PURASTAR (來自 Genencor)。纖維素酶合適的纖維素酶包括細菌或真菌來源的那些纖維素酶。包括化學修飾 的或蛋白質工程化的突變體。合適的纖維素酶包括來自芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、木霉屬 (Trichoderma)、腐質霉屬、鐮刀菌屬、草根霉屬(Thielavia)、枝頂孢霉屬(Acremonium)的 纖維素酶，例如在美國專利號4，435，307、美國專利號5，648，263、美國專利號5，691，178、 美國專利號5，776，757和W0 89/09259中公開的從Humicola insolens、嗜熱毀絲霉 (Myceliophthora thermophila)禾口尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)產生的真菌纖維 素酶。里氏木霉纖維素酶在美國專利號4，689，297、美國專利號5，814，501、美國專利號 5，324，649、W0 92/06221 和 W0 92/06165 中公開。市售的纖維素酶包括CELLUZYME 和CAREZYME (NovozymesA/ s)、 CLAZINASE 禾口 PURADAX HA (Genencor International Inc.)禾口 KAC-500 (B) (Kao Corporation)。過氧化物酶/氧化酶合適的過氧化物酶/氧化酶包括植物、細菌或真菌來源的 那些過氧化物酶/氧化酶。包括化學修飾的或蛋白質工程化的突變體。有用過氧化物酶的 例子包括來自鬼傘屬(Coprinus)，例如，來自灰蓋鬼傘(C. cinereus)的過氧化物酶和其變 體，如在W0 93/24618、W0 95/10602和W0 98/15257中描述的那些變體。市售的過氧化物酶包括GUARDZYME (Novozymes A/S)。洗滌劑酶可以通過添加含有一種或多種酶的獨立添加物或通過添加包含全部這些酶的合并添加物被包含于洗滌劑組合物中。洗滌劑添加物(例如獨立添加物或合并添加 物)可以配制為例如顆粒劑、液體劑、漿液劑等。優選的洗滌劑添加物制劑是顆粒劑，尤其 無塵顆粒劑，液體劑，尤其穩定化液體劑或漿液劑 。無塵顆粒劑可以如美國專利號4，106，991和4，661，452中所公開那樣產生并且 可以任選地由本領域已知的方法包衣。蠟質包衣材料的例子是平均摩爾重量約1000至約 20000的聚(環氧乙烷)產物(聚乙二醇，PEG)；具有16至50個環氧乙烷單位的乙氧基化 壬基苯酚；其中醇含有12至20個碳原子并且其中存在15至80個環氧乙烷單位的乙氧基 化脂肪醇；脂肪醇；脂肪酸；和脂肪酸單酰甘油和二酰甘油和三酰甘油。在GB 1483591中 給出適用于流化床技術的成膜包衣材料的例子。液體酶制品可以根據建立的方法例如通過 添加多元醇如丙二醇、糖或糖醇、乳酸或硼酸穩定化。可以根據EP 238，216中所述的方法 制備受保護的酶。洗滌劑組合物可以是任何便利的形式，例如，棒劑、片劑、粉劑、顆粒劑、糊劑或液 體劑。液體洗滌劑可以是含水的，一般含有多達約70%的水和0至約30%有機溶劑，或是 非含水的。洗滌劑組合物包含一種或多種表面活性劑，所述表面活性劑可以是非離子的、半 極性的、陰離子的、陽離子和/或兩性離子的。表面活性劑一般以約0. 至約60%重量的 水平存在。當包含于洗滌劑中時，洗滌劑通常將含有從約至約40%的陰離子表面活性劑 如直鏈烷基苯磺酸鹽、α -烯基磺酸鹽、烷基硫酸鹽(脂肪醇硫酸鹽)、乙氧基化脂肪醇醚硫 酸鹽、仲烷基磺酸鹽、α -磺基脂肪酸甲酯、烷基或鏈烯基丁二酸或皂。當包含于洗滌劑中時，洗滌劑通常將含有從約0. 2%至約40%的非離子表面活性 劑如脂肪醇乙氧基化物、壬基酚聚氧乙烯醚、烷基多糖苷、烷基二甲胺氧化物、乙氧基化脂 肪酸單乙醇酰胺、脂肪酸單乙醇酰胺、多羥基烷基脂肪酸酰胺或葡糖胺的N-酰基N-烷基衍 生物(“葡糖酰胺”)。洗滌劑可以含有0至約65%的洗滌劑增效助劑或絡合劑，如沸石、二磷酸鹽、三磷 酸鹽、膦酸鹽、碳酸鹽、檸檬酸鹽、氨三乙酸、乙二胺四乙酸、二乙三胺五乙酸、烷基或鏈烯基 丁二酸、可溶性硅酸鹽或分層硅酸鹽(例如來自Hoechst的SKS-6)。洗滌劑可以包含一種或多種聚合物。例子是羧甲基纖維素、聚(乙烯吡咯烷酮)、 聚(乙二醇)、聚乙烯醇、聚(乙烯吡啶-N-氧化物)、聚(乙烯咪唑)、聚羧酸酯如聚丙烯酸 酯、馬來酸/丙烯酸共聚物和甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物。洗滌劑可以含有漂白系統，所述漂白系統可以包含H2O2源，如可以與形成過酸的 漂白激活物如四乙酰乙二胺或壬酰氧苯磺酸鹽組合的過硼酸鹽或過碳酸鹽。備選地，該漂 白系統可以包含過氧酸，例如酰胺型、亞酰胺型或砜型過氧酸。可以使用常規穩定劑，例如，多元醇，如丙二醇或甘油、糖或糖醇、乳酸、硼酸或硼 酸衍生物，例如芳族硼酸酯或苯基硼酸衍生物如4-甲酰基苯硼酸穩定化洗滌劑組合物的 酶，并且該組合物可以如WO 92/19709和WO 92/19708中所述配制。洗滌劑也可以含有其他常規洗滌劑成分，例如織物調理劑，包括粘土，泡沫促進 齊U，抑泡劑、抗腐蝕劑、懸污劑、抗污漬再沉積劑、染料、殺菌劑、熒光增白劑、水溶助長劑、晦 暗抑制劑或香料。
目前構思的是在洗滌劑組合物中，可以添加任意酶，尤其本文中所述的一種或多 種變體酶，例如，以每升洗液約0. Olmg至IOOmg酶蛋白。在一個實施方案中，使用每升洗液 約0.055mg酶蛋白。在其他實施方案中，使用每升洗液約0. Img至約1. Omg酶蛋白。 本文中所述的一種或多種變體酶可以額外地摻入在并入本文作為參考的WO 97/07202中公開的洗滌劑制劑。10. 4餐具洗滌用洗滌劑組合物所述酶也可以用于餐具洗滌用洗滌劑組合物中，所述組合物包括1)粉末自動餐具洗滌組合物非離子表面活性劑 0.4-2.5%硅酸鈉0-20%二硅酸鈉3-20%三磷酸鈉20-40%碳酸鈉0-20%過硼酸鈉2-9%四乙酰乙二胺(TAED)1-4%硫酸鈉5-33%酶0.0001-0.1%2)粉末自動餐具洗滌組合物非離子表面活性劑1-2%(例如，脂肪醇乙氧基化物)二硅酸鈉2-30%碳酸鈉10-50%膦酸鈉0-5%二水合檸檬酸三鈉9-30%次氮基三乙酸鈉(NTA)0-20%一水合過硼酸鈉5-10%四乙酰乙二胺(TAED)1-2%聚丙烯酸酯聚合物6-25%(例如馬來酸/丙烯酸共聚物)酶0.0001-0.1%香料0. 1-0. 5%/K5-10%3)粉末自動餐具洗滌組合物非離子表面活性劑0.5-2.0%二硅酸鈉25-40%檸檬酸鈉30-55%碳酸鈉0-29%碳酸氫鈉0-20%一水合過硼酸鈉0-15%
四乙酰乙二胺(TAED)0-6%馬來酸/丙烯酸共聚物0-5%粘土1-3%
聚氨基酸0-20%聚丙烯酸鈉0-8%酶0.0001-0.1%4)粉末自動餐具洗滌組合物非離子表面活性劑1-2%沸MAP15-42%二硅酸鈉30-34%檸檬酸鈉0-12%碳酸鈉0-20%一水合過硼酸鈉7-15%四乙酰乙二胺(TAED)聚合物0-3%0-4%馬來酸/丙烯酸共聚物0-5%有機膦酸鹽0-4%粘土1-2%酶0.0001-0.1%硫酸鈉平衡5)粉末自動餐具洗滌組合物非離子表面活性劑1-7%二硅酸鈉18-30%檸檬酸三鈉10-24%碳酸鈉12-20%單過硫酸鹽15-21%(2KHS05. KHSO4. K2SO4)漂白穩定劑0.1-2%馬來酸/丙烯酸共聚物0-6%二乙烯三胺五乙酸五鈉鹽 0-2.5%酶0.0001-0.1%硫酸鈉，水平衡6)具有清潔表面活性劑系統的散劑和液體餐具洗滌組合物非離子表面活性劑0-1.5%二水合N-氧化十八烷基二甲胺0-5%二水合N-氧化十八烷基二甲胺與二水合N-氧化 0-4%十六烷基二甲胺的80 20重量C18/C16摻合物無水N-氧化十八烷基二(羥乙基)胺與無水N-氧化 0-5%十六烷基二(羥乙基)胺的70 30重量C18/C16摻
合物具有平均乙氧基化度3的C13-C15烷基乙氧基硫酸 0-10%酯具有平均乙氧基化度3的C12-C15烷基乙氧基硫酸 0-5 %酉旨
具有平均乙氧基化度12的C13-C15乙氧基化醇0-5%具有平均乙氧基化度9的C12-C15乙氧基化醇的摻 0-6. 5%合物具有平均乙氧基化度30的C13-C15乙氧基化醇的0-4%摻合物二硅酸鈉0-33%三聚磷酸鈉0-46%檸檬酸鈉0-28%檸檬酸0-29%碳酸鈉0-20%一水合過硼酸鈉0-11.5%四乙酰乙二胺(TAED)0-4%馬來酸/丙烯酸共聚物0-7. 5%硫酸鈉0-12.5%酶0.0001-0.1%7)非含水液體自動餐具洗滌組合物液體非離子表面活性劑(例如脂肪醇乙氧基化物)2. 0-10. 0%堿金屬硅酸鹽3.0-15.0%堿金屬磷酸鹽20.0-40.0%選自高級二醇、聚二元醇、多氧化物、25.0-45.0%二元醇醚的液體載體穩定劑(例如，磷酸與C16-C18鏈烷醇的偏酯)0. 5-7. 0%抑泡劑(例如硅氧烷)0-1.5%酶0.0001-0.1%8)非含水液體餐具洗滌組合物液體非離子表面活性劑(例如脂肪醇乙氧基化物)2. 0-10. 0%硅酸鈉3.0-15.0%堿金屬碳酸鹽7.0-20.0%檸檬酸鈉0.0-1.5%穩定系統(例如，精細分散的硅氧烷0.5-7.0%與低分子量二烷基聚二元醇醚的混合物)低分子量聚丙烯酸酯聚合物5.0-15.0%粘土凝膠增稠劑(例如膨潤土 )0.0-10.0%羥丙基纖維素聚合物0.0-0.6%
酶0.0001-0.1%選自高級二醇、聚二元醇、多氧化物、平衡二元醇醚的液體載體9)觸變的液體自動餐具洗滌組合物C12-C14 脂肪酸0-0.5%嵌段共聚物表面活性劑1.5-15.0% 檸檬酸鈉0-12%三聚磷酸鈉0-15%碳酸鈉0-8%三硬脂酸鋁0-0.1%枯烯磺酸鈉0-1.7%聚丙烯酸酯增稠劑1.32-2.5%聚丙烯酸鈉2.4-6.0%硼酸0-4.0%甲酸鈉0-0.45%甲酸鈣0-0.2%正癸基二苯醚二磺酸鈉0-4.0%單乙醇胺(MEA)0-1. 86%氫氧化鈉(50%)1. 9-9. 3%1，2_ 丙二醇0-9.4%酶0.0001-0.1%抑泡劑、染料、香料、水平衡10)液體自動餐具洗滌組合物脂肪醇乙氧基化物0-20%脂肪酸磺酸酯0-30%十二烷基硫酸鈉0-20%烷基多苷0-21%油酸0-10%一水合二硅酸鈉18-33%二水合檸檬酸鈉18-33%硬脂酸鈉0-2.5%一水合過硼酸鈉0-13%四乙酰乙二胺(TAED)0-8%馬來酸/丙烯酸共聚物4-8%酶0.0001-0.1%11)含有受保護的漂白劑顆粒的液體自動餐具洗滌組合物硅酸鈉5-10%焦磷酸四鉀15-25%三磷酸鈉0-2%
碳酸鉀4-8%受保護的漂白劑顆粒，例如，氯 5-10%高分子型增稠劑0.7-1.5%氫氧化鉀0-2%酶0.0001-0.1%
水平衡12)如1)、2)、3)、4)、6)中所述的自動餐具洗滌組合物，其中過硼酸鹽被過碳酸鹽替代。13)如1)_6)中所述的自動餐具洗滌組合物，其額外地含有錳催化劑。所述錳催 化劑可以例如是“用于低溫漂白作用的高效錳催化劑”(〃 Efficientmanganese catalysts for low-temperature bleaching" )，Nature 369:637-639(1994)中所述的化合物之一。
14)高級HDL液體洗滌劑配方Bio-Soft S-101 直鏈烷基苯磺酸Steol CS-330 月桂基聚氧乙烯醚硫酸鈉Bio-soft N25-7 具有7摩爾EQ的直鏈烷基乙氧基化物Stepanate SXS 二甲苯磺酸鈉15)超級液體洗滌劑配方Tionopal CBS-X 熒光增白劑Alpha-step MC-48 α-磺基甲酯鈉Makon TD-6十三烷醇乙氧基化物11.包含變體α -淀粉酶的組合物在本公開的幾個方面之一，本公開提供了組合物，其包含a)至少一種變體α-淀粉酶，其包含與親本AmyS樣α -淀粉酶的氨基酸序列至 少95%同一的氨基酸序列并在與參考α -淀粉酶第242位置相對應的氨基酸位置處具有替 換，該變體具有可檢測的α-淀粉酶活性，和b)至少一種以下物質額外的酶、洗滌劑、表面活性劑、螯合劑、氧化劑、酸化劑、 堿化劑、過氧化物源、硬度源、鹽、洗滌絡合劑、聚合物、穩定劑或織物調理劑。在優選的實施方案中，與親本AmyS樣α -淀粉酶或參考淀粉酶相比，該變體在可 能改變其對于某些應用(例如本文中所述的商業過程)的用途或性能的一種或多種特方面 改變。改變的特性可以包括任意特性，例如，凈電荷、底物特異性、底物切割、底物結合、熱穩 定性、在一個或多個PH處的活性、在一個或多個ρΗ處的穩定性、氧化條件下的穩定性、Ca2+ 需求、比活性、催化速率、催化效率、在螯合劑存在下的活性、在螯合劑存在下的熱或PH穩 定性、退漿用途或清潔過程的用途、或在蛋白質表達系統中的表達量。如技術人員會理解， 這些改變的特性優選地對淀粉酶的終端用戶或生產者有用。可以使用序列已知或輕易確定的多種淀粉酶作為參考淀粉酶。在多個實施方案 中，參考淀粉酶是SEQ ID Ν0:1或2。在一些實施方案中，親本淀粉酶和參考淀粉酶可以是 相同的淀粉酶。在某些實施方案中，該組合物是用于衣物、餐具或硬表面清潔、退漿、或者織物或 污漬處理的產品的組分。例如，該組合物可以是作為液體劑、半固體劑、固體劑等使用的餐具洗滌用洗滌劑的部分，或它可以是顆粒或液體衣物洗滌劑制劑。該組合物包含對預期應 用所需要的額外組分。本文中提供了許多此類制劑的例子并且還有其他例子將是本領域技 術人員熟悉的。在一個實施方案中，該組合物包含額外的酶，所述額外的酶是蛋白酶、脂肪酶、淀 粉酶、纖維素酶、過氧化物酶、氧化酶、果膠酶、裂合酶、角質酶、漆酶或其它有用酶。技術人 員將熟悉這些酶和連同本文中提供的變體淀粉酶一起使用的其他酶。對于給定應用，可以 經驗地確定有用的酶的量，然而，本文中提供了指南，例如，在實施例中。在多個實施方案中，該組合物包含一種或多種表面活性劑。該表面活性劑是非離 子的、陰離子的、陽離子的或兩性離子的、或它們的組合。在一個實施方案中，該淀粉酶變體優選地是S242A、S242D、S242E、S242F、S242G、 S242H、S242L、S242M、S242N、S242Q或S242T變體。對于某些用途，如在洗滌和清潔實施方 案中的用途，對氧化作用的穩定性和對螯合劑或改變的金屬離子濃度的穩定性是有用的。 因此，在多個實施方案中，該變體淀粉酶具有針對氧化作用的改變穩定性并且該變體還包 括一個或多個甲硫氨酸殘基的缺失或替換，包括位于親本淀粉酶第8、9、96、200、206、284、 307、311、316和438氨基酸位置處的殘基，其中參考淀粉酶是SEQ ID N0:1或2。變體淀粉 酶還可以在與參考淀粉酶(其優選地是SEQ ID而1或2)第97、179、180、193、319、349、 358、416、428或443氨基酸位置相對應的一個或多個氨基酸位置處包含氨基酸序列修飾。
在多個實施方案中，該變體包含或還包含一個或多個在如下位置處的替換在第 349氨基酸位置處的半胱氨酸、在第428氨基酸位置處的半胱氨酸、在第97氨基酸位置處的 谷氨酸、在第97氨基酸位置處的精氨酸、在第319氨基酸位置處的谷氨酸、在第319氨基酸 位置處的精氨酸、在第358氨基酸位置處的谷氨酸、在第358氨基酸位置處的精氨酸、在第 443氨基酸位置處的谷氨酸或在第443氨基酸位置處的精氨酸。另外，在一個實施方案中，該變體包含附93或V416或這二者的替換，例如，作為 N193F或V416G或這二者的替換。其他實施方案包括進一步的修飾，如在位置F178、R179、 G180、1181、G182和K183處的一個或多個氨基酸缺失。如本文中其他地方所描述，當以成 對方式或更多方式提供時，此類缺失可以是甚至更有用的。優選地，在此類實施方案中，該 變體在不存在添加的鈣或在螯合劑存在下或在不存在添加的鈣和在螯合劑存在下的組合 情況下具有改變的金屬離子依賴性或改變的穩定性或活性。此類變體也可以在清潔和洗滌 過程中具有極好的應用。在一個實施方案中，該變體淀粉酶與SEQ ID NO 2具有至少95%同源性并且相對 于包含氨基酸序列SEQ ID NO :1的參考淀粉酶中的編號而言包含第242位氨基酸替換。如 同本文中所述的其他實施方案那樣，該變體優選地具有可檢測的α-淀粉酶活性，尤其在 使用條件下。在某些目前優選的實施方案中，親本α-淀粉酶是SEQ ID NO 1、2、6、7、8、9、10、 11、12、15或16，并且參考淀粉酶是SEQ ID Ν0:1或2。在多個實施方案中，該變體淀粉酶在非常低和非常高的ρΗ的洗滌過程中具有改 善的性能。在一個實施方案中，洗滌性能在PH >約8相對于親本淀粉酶被改善。更優選的 是在約PH 8.5至約？!1 11以上具有改良洗滌性能的那些變體。在一個實施方案中，相對于參考淀粉酶(例如SEQ ID NO :1或2淀粉酶序列)，該變體包含 a)Q97E、Q319E、Q358E、Q443E ；b)Q97E、Q319R、Q358E、Q443R ；c)Q97E、Q319R、 Q358E ；d)Q97E、Q319R、Q443E ；e)Q97E、Q319R、Q443R ；f)Q97E、Q358R ；g)Q97E、Q443E ；h) Q319R、Q358E、Q443E ；或 i) Q319R、Q358R、Q443E 的成組替換。在本公開的另一方面，提供了包含至少一種變體淀粉酶的洗滌劑或清潔制劑，所 述的變體淀粉酶包含與親本AmyS樣α -淀粉酶的氨基酸序列至少95%同一的氨基酸序列。 所述淀粉酶變體在與參考α -淀粉酶第242位置相對應的氨基酸位置處具有替換并具有可 檢測的α-淀粉酶活性。優選地，參考淀粉酶是SEQ ID Ν0:1或2。該洗滌劑或清潔制劑優選地包含淀粉酶變體，所述淀粉酶變體是至少包含S242A、 S242D、S242E、S242F、S242G、S242H、S242L、S242M、S242N、S242Q 或 S242T 替換的 S242 變 體。如同上文所提供的組合物那樣，該變體可以包含任一本文中所公開的變體特征和改變 或者包含它們的組合。在本公開幾個方面的另一個方面，本公開提供了試劑盒。該試劑盒的一個實施方 案包含
a) 一種或多種變體α -淀粉酶，所述變體α -淀粉酶包含與親本AmyS樣α -淀粉 酶的氨基酸序列至少95%同一的氨基酸序列并在與參考α -淀粉酶第242位置相對應的氨 基酸位置處具有替換，該變體具有可檢測的α -淀粉酶活性，和b)至少一種以下物質額外的酶、洗滌劑、表面活性劑、螯合劑、氧化劑、酸化劑、 堿化劑、過氧化物源、硬度源、鹽、洗滌絡合劑、聚合物、穩定劑或織物調理劑。在一個實施方案中，該試劑盒還包含在用于織造材料退漿或洗滌或清潔用含淀粉 物質弄臟的一種或多種物品的方法中使用該試劑盒的說明書。技術人員還會理解也提供了用于制備所述α -淀粉酶的試劑盒。所述試劑盒提供 了用作親本α-淀粉酶和參考淀粉酶的代表性序列例如氨基酸序列和/或從其衍生的核酸。12.在退漿和洗滌/清潔過程中使用淀粉酶變體在另一方面，本公開提供了在織物或其他織造材料的退漿和在洗滌或清潔過程中 使用變體α-淀粉酶的方法。在一方面，本公開提供了織造工藝后退漿織造材料的方法。所述方法通常地包含 將織造材料與變體α“淀粉酶在有效用于至少部分地從織造材料去除漿料的條件和時間 下接觸。該變體包含與親本AmyS樣α -淀粉酶的氨基酸序列至少95%同一的氨基酸序列 并在與參考α-淀粉酶第242位置相對應的氨基酸位置處具有替換。該變體具有可檢測的 α-淀粉酶活性。與親本AmyS樣α -淀粉酶或參考淀粉酶相比，該變體優選地在一個或多個物理或 酶學特性上改變。在多個實施方案中，該淀粉酶在以下一個或多個特征方面改變凈電荷、 底物特異性、底物切割、底物結合、熱穩定性、在一個或多個PH處的活性、在一個或多個ρΗ 處的穩定性、氧化條件下的穩定性、Ca2+需求、比活性、催化速率、催化效率、在螯合劑存在下 的活性、在螯合劑存在下的熱或PH穩定性、退漿效能或在蛋白質表達系統中的表達量。上文討論了參考淀粉酶，并且在該方法的一個實施方案中，參考淀粉酶是SEQ ID NO :1 或 2。在一個實施方案中，親本α-淀粉酶是SEQ ID NO 1、2、6、7、8、9、10、11、12、15或16，并且參考淀粉酶是SEQ ID N0:1或2。在某些實施方案中，所述變體是S242A、S242D、 S242E、S242F、S242G、S242H、S242L、S242M、S242N、S242Q 或 S242T 變體。該淀粉酶變體可以還包含一個或多個在如下位置處的替換在第349位置處的半 胱氨酸、在第428位置處的半胱氨酸、在第97位置處的谷氨酸、在第97位置處的精氨酸、在 第319位置處的谷氨酸、在第319位置處的精氨酸、在第358位置處的谷氨酸、在第358位置 處的精氨酸、在第443位置處的谷氨酸或在第443位置處的精氨酸，其中參考淀粉酶是SEQ ID NO 1 或 2。在另一方面，本文中提供了洗滌或清潔的方法。盡管洗滌和清潔操作經常可以得 益于包含一種或多種酶活性，然而洗滌或清潔過程可以使酶(包括淀粉酶)經歷極端條件 并對酶活性的極限提出挑戰。因此，所提供的方法包括將待洗滌或清潔的一個或多種物品 與包含變體α “淀粉酶的組合物接觸，其中所述變體α “淀粉酶包含與親本AmyS樣α -淀 粉酶的氨基酸序列至少95%同一的氨基酸序列并在與參考α -淀粉酶第242位置相對應的 氨基酸位置處具有替換。該變體優選地具有可檢測的α-淀粉酶活性，并且接觸步驟在有 效用于至少部分地洗滌或清潔所述一種或多種物品的條件和時間下進行。優選地，一種或 多種物品中的至少一種物品用至少一種含淀粉材料弄臟，所述含淀粉材料的去除受變體淀 粉酶輔助。
在一個實施方案中，該組合物還包含洗滌劑組合物或清潔制劑的至少一種組分。 例如，該組合物包含一種或多種以下物質額外的酶、洗滌劑、表面活性劑、螯合劑、氧化劑、 酸化劑、堿化劑、過氧化物源、硬度源、鹽、洗滌絡合劑、聚合物、穩定劑或織物調理劑。在一個實施方案中，親本α-淀粉酶可以是任一 SEQ ID NO 1、2、6、7、8、9、10、11、 12、15或16，并且參考淀粉酶是SEQ ID Ν0:1或2。在某些實施方案中，親本α -淀粉酶便 利地是SEQ ID NO :1、2、15或16，而在其他實施方案中，親本α-淀粉酶是SEQ ID NO :6、7、 8、9、10、11 或 12。在目前優選的實施方案中，該變體是S242A、S242D、S242E、S242F、S242G、S242H、 S242L、S242M、S242N、S242Q或S242T變體。在某些實施方案中，該參考淀粉酶是SEQ ID NO :1 或 2，并且該變體是 S242A、S242D、S242E、S242F、S242G、S242H、S242L、S242M、S242N、 S242Q 或 S242T 變體。在多個實施方案中，例如，當該變體是S242A、S242D、S242E、S242F、S242G、S242H、 S242L、S242M、S242N、S242Q或S242T變體的情況下，該變體還在與參考淀粉酶第97、179、 180、193、319、349、358、416、428或443氨基酸位置相對應的一個或多個氨基酸位置處包含 序列修飾。更特別地，在多個實施方案中，該變體包含一個或多個在如下位置處的替換在 第349位置處的半胱氨酸、在第428位置處的半胱氨酸、在第97位置處的谷氨酸、在第97 位置處的精氨酸、在第319位置處的谷氨酸、在第319位置處的精氨酸、在第358位置處的 谷氨酸、在第358位置處的精氨酸、在第443位置處的谷氨酸或在第443位置處的精氨酸。 Ν193或V416或這二者的替換，如N193F或V416G或這兩者的替換也用于某些變體中。在其他實施方案中，該變體包含在任一特定位置F178、R179、G180、1181、G182和 Κ183處的一個或多個氨基酸的缺失。在此類實施方案中，變體優選地在不存在添加的鈣或 在螯合劑存在下具有改變的金屬離子依賴性或改變的穩定性或活性。如同其他修飾那樣， 前述氨基酸缺失也可以單獨地或與任意的前述改變組合地使用。
該變體一般相對于親本淀粉酶在洗滌過程中例如在如pH >約8的條件下具有改 善的性能。在一個目前優選的實施方案中，所述方法包括使用變體，其中所述變體包含a) Q97E、Q319E、Q358E、Q443E ；b)Q97E、Q319R、Q358E、Q443R ；c)Q97E、Q319R、Q358E ；d)Q97E、 Q319R、Q443E ；e)Q97E、Q319R、Q443R ；f)Q97E、Q358R ；g)Q97E、Q443E ；h)Q319R、Q358E、 Q443E ；或 i)Q319R、Q358R、Q443E 的成組替換。本公開在后續實施例中包括進一步細節，所述實施例不意圖以任何方式限制所要 求的范圍。附圖是所提供說明書和描述的必要部分。所引用的全部參考文獻通過引用方式 在本文中對其中所述的全部那些內容特別地并入。因而提供了以下實施例以說明，但不用 于限制所要求保護的內容。
實施例實施例1-變體的構建 使用位點定向誘變法構建在AmyS的成熟序列第S242位置處的變異。用于 誘變的模板是來自New England Biolabs (馬薩諸塞州)的使用dam甲基化酶的甲基 化 pHPLT-AmyS (見圖 2)。在 Operon (Huntsville，AL)合成簡并引物(S242F(正向)和 S242R(反向)，下文分別給出)并稀釋至10 μ M，互補性正向和反向序列均含有用于反應 中連接的5’磷酸酯基團。親本α-淀粉酶的序列(SEQ ID NO 2)附于本申請中。使用在 靶位置處以NN(G/C)隨機化的寡核苷酸引物，以Stratagene Quik-Change 多位點試劑盒 (Stratagene，La Jolla CA)創建文庫。所選擇的氨基酸(即S242)隨機地用全部19種可 能備選物替換。用于誘變的S242引物S242 F 5，[PhosjGTCAAGCATATTAAGTTCNNSTTTTTTCCTGATTGGTTG 3，SEQ ID NO 17S242 R 5，[Phos]CAACCAATCAGGAAAAAASNNGAACTTAATATGCTTGAC 3，SEQ ID NO 18反應如下進行QUIK-CHANGE 反應該反應由18μ L無菌蒸餾水、2. 5μ L來自該試劑盒的IOx緩沖液、1 μ L來自該 試劑盒的dNTP、1.25yL正向引物(10 μ M母液)、1· 25 μ L反向引物(10 μ M母液)、lyL pHPLT-AmyS質粒DNA作為模板(約70ng)和1 μ L來自該試劑盒的酶摻合物組成，總計 26. 5 μ L0循環條件循環條件是95°C 1分鐘，進行一次，隨后95°C 1分鐘、55°C 1分鐘、65°C 10分鐘， 25個循環。將1 微升 Dpn I (lOU/μ L)添加至 Multi-Site Quik-Change 反應混合物并在 37°C溫育18小時，并隨后添加另一份0. 5 μ L Dpn I溫育額外3小時。使用1微升DpnI消化的反應物作為采用TEMPLIPHI擴增試劑盒(Amersham Biosciences, Piscataway，NJ)的滾環復制的模板并且根據Amersham方案進行反應。將1微升滾環DNA轉化至100 μ L枯草芽孢桿菌感受態細胞(2種蛋白酶缺失的枯草芽孢桿菌菌 株(AaprE, AnprE, amyE: xylRPxylAcomK-phIeo))并在 37°C振搖 1 小時。隨后將全部 轉化物涂布在LA+10ppm新霉素+1%不溶性淀粉平板(一個平板上涂布25 μ L，另一個平 板上涂布75 μ L)并在37°C溫育過夜。用96針復制工具將過夜平板印在一個大LA+10ppm Neo+1%不溶性淀粉平板上并提交至Quintara Biosciences (Berkeley, CA)用于菌落PCR 和測序。在確定變體序列后，將變體挑入含有125 μ L LB+10ppm Neo的96孔微量滴定平 板，將所述變體排列成帶對照的四重樣式(quad format)。排列的微量滴定平板在37°C 和250轉/分鐘培育6小時。利用復制器(荷蘭萊頓Enzyscreen)，使用微量滴定培養 平板來來接種含有150 μ 1用于蛋白質表達的MBD培養基(G. Vogtentanz等人，產生大 豆Bowman-Birk蛋白酶抑制劑的枯草芽孢桿菌融合蛋白系統(“A Bacillus subtilis fusion proteinsystem to produce soybean Bowman-Birk protease inhibitor"),Prot. Expr.&Purif. ,55 =40-52,2007)并補充有用于蛋白質表達的5mM CaCl2的一個新微量滴定 平板(微量滴定平板和平板蓋來自荷蘭萊頓Enzy screen)。將表達平板在37 °C、250轉/分 鐘和70%濕度培育64小時。隨后，表達培養物經微濾板(0. 22 μ m，Mi 11 ipore,Billerica, ΜΑ)過濾并篩選改善的熱穩定性(見實施例3)。實施例2-變體的表達、純化和表征 將菌落從實施例1的微量滴定平板劃線到具有IOppm新霉素的淀粉平板。平板 在37°C溫育過夜并挑取單菌落并用來接種含有培養基(見下文)和20ppm新霉素的搖 瓶(250mL，具有25mL培養基)。培養物在37°C，275轉/分鐘培育約8小時(直至達到 0D(600nm)2.0)。將培養物肉湯與50%甘油以2 1比率混合，置入分別標記的培養小瓶并 冷凍于-80°C。隨后從這些甘油貯藏物產生所選擇的α-淀粉酶。α -淀粉酶發酵在500mL搖瓶內37°C培育含有1 % (w/v)大豆胨的極限MOPS培養 基(Neidhardt 等人，J. Bacteriol. 119(3) :736_747，1974)60 小時實施。使用如下疏水性 相互作用層析從發酵肉湯純化酶將肉湯濃縮10倍，隨后用含有IM硫酸銨的50mM MES, 2mM CaCl2, pH 6. 8稀釋復原至其原始體積，隨后使用玻璃纖維濾器無菌過濾。樣品隨后上載到 用同一種緩沖液預平衡的苯基SEPHAR0SE FF高密度柱(20x95mm ；Amersham, GE Healthcare Bio-Sciences, Sweden)上。用10個柱體積的無硫酸銨的相同緩沖液，隨后用5個柱體積的 水除去非淀粉酶蛋白質。用含有40%丙二醇的50mM MES,2mM CaCl2, pH 6. 8洗脫目的酶。用標準定量SDS PAGE凝膠光密度測定法；或者使用來自Megazyme (Wicklow， Ireland)的標準淀粉酶測定試劑盒，利用活性測定法確定蛋白質濃度。利用純化淀粉酶 (芽孢桿菌屬707淀粉酶；SEQ ID NO 6)生成的標準曲線用于比較所測定數據。實施例3-確定改變的特性熱應激本實施例顯示本文中所述的變體可以相對于親本α -淀粉酶具有改變的特性。實 施嗜熱脂肪土芽孢桿菌α-淀粉酶(AmyS)變體的高通量熱穩定性篩選。在初步研究后，如下選擇熱應激條件，使得野生型酶在熱應激后大致顯示40%初 始(應激前)活性(即，(熱應激后活性)/(熱應激前活性)大致是0. 4)。一式四份篩選 突變體文庫并且將潛在勝出者鑒定為熱應激后顯示比野生型酶的平均殘余活性高至少2 個標準差的殘余活性的那些突變體。
淀粉酶表達在表達平板的培養上清液中是大約lOOppm。在37°C于加濕搖床(250 轉/分鐘和70%r相對濕度)中生長60-65小時后，使用濾板澄清培養上清液以除去細胞物 質。將澄清的上清液 10 倍稀釋到含有 50mMNa0Ac/2. 6mM CaCl2/0. 002% Tween_20，pH 5. 8 的緩沖液中，至終濃度大約lOppm。將每種上清液的一個等份試樣進一步稀釋成0. 02ppm， 以使用熒光標記的谷物淀粉底物如下文所述確定酶變體的活性。每種上清液的第二等 份試樣在熱循環儀中經歷95°C熱應激30分鐘，隨后在50mMNa0Ac/2. 6mM CaCl2/0. 002% Tween-20,pH 5. 8中稀釋成0. 02ppm，并使用下文所述熒光底物和測定法測定殘余活性。使 用淀粉酶ENZCHECKULTRA AMYLASE測定試劑盒基本上如制造商(Invitrogen，San DiegoCA) 所述確定淀粉酶活性。該測定法中淀粉酶的終濃度是大約0.02ppm。測試緩沖液是50mM Na0Ac/2. 6mM CaCl2/0. 002% Tween-20, pH 5.8。底物是 BODIPY 熒光染料綴合的來自谷 物的 100yg/mL DQ 淀粉(Invitrogen, Eugene, OR)。使用 SpectraMAX M2 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA)測量表示淀粉酶活性的增加的熒光。用記錄動態模式的儀器在室 溫監測反應5分鐘。激發波長是485nm ；用515nm的截止濾光片在520nm監測發射。野生 型AmyS(Xtra)在經歷95°C熱應激30分鐘后顯示33-43%殘余活性。AmyS變體S242A和 S242Q在相同熱應激條件后仍分別保留55-65%和70-80%殘余活性。見圖3和表3_1。這 些殘余活性量值表明這兩種變體比野生型α-淀粉酶更熱穩定。表3-1 每種變體的殘余活性百分數。野生型(SPEZYME XTRA)。如所示，每塊平板 包括 SPEZYME ETHYL 和 SPEZYME XTRA 作為對照。
實施例4-確定改變的特性DSC使用疏水性相互作用層析法從搖瓶發酵肉湯(見實施例2)純化Spezyme Xtra, S242A、S242E 和 S242Q。使用含有 40%丙二醇和 2mMCaCl2 的 50mM MES, pH 6. 8 從該柱以 純化的形式洗脫蛋白質。使用超敏感掃描高通量微量量熱器VP-CAP DSC (MicroCal, Inc. , Northampton, ΜΑ)測量過量熱容量曲線。已經公開了 DSC測量的標準方法和該技術的理論(E. Freire，“差 示掃描量熱法(Differential ScanningCalorimetry)，”Methods. Mol. Biol. 41，191-218， 1995)。在30-120°C溫度范圍掃描大約500 μ L的0. 5mg/mL野生型嗜熱脂肪芽孢桿菌α -淀 粉酶或變體S242A、S242E和S242Q (均在2mM氯化鈣不存在和存在時)。隨后再掃描相同 樣品以檢查該過程的可逆性。對于α-淀粉酶，熱解折疊過程是不可逆的。使用的緩沖液 是IOmM乙酸鈉，pH 5. 5。使用200°C /小時掃描率來使本來可能因聚集引起的任何人造物 最小化。使用DSC曲線的熱中點(Tm)作為所測試蛋白質的熱穩定性的指示。表4-1顯示 所測試淀粉酶蛋白質的熱熔點。圖5中顯示野生型和變體淀粉酶的熱熔融曲線和熔點。與野生型的熔點相比時，淀粉酶變體S242A、S242E和S242Q在2mM氯化鈣不存在 和存在下的熱解折疊過程顯示變體的熔點明顯提高。在不存在添加的氯化鈣的情況下，野 生型淀粉酶具有100. 8°C熱熔點，而S242A、S242E和S242Q的Tm分別是106. 5°C >107. 8°C和110. 1°C。因而，S242替換為A引起Tm提高5.7°C;S242替換為E引起Tm提高7°C;并且 S242替換為Q引起Tm提高9. 3°C。在2mM氯化鈣存在下，野生型淀粉酶顯示106. 8°C的熱熔點，而S242A、S242E和 S242Q的Tm分別是111. 8°C、112. 2°C和113. 8°C。因而，相對于鈣不存在下的量值，在2mM 氯化鈣存在下，全部4種蛋白質具有提高的Tm值。野生型和S242A變體在鈣存在下的Tm提 高分別是6°C和5.3°C。S242E變體的Tm提高是4.4°C。S242Q變體的Tm提高是3. 7°C。這 提示S242Q變體更少地被鈣穩定化，或就穩定性而言，該變體更少依賴于鈣。在氯化鈣存在 下S242A、S242E和S242Q相對于野生型的Tm提高分別是5°C、5. 4°C和3°C。這提示所述變 體的熱動力學特性不同于野生型或Spezyme Xtra的那些熱動力學特性。這個觀察結果與 應用研究中其增強的性能相一致(見實施例5)。表4-1由DSC確定的多種淀粉酶的Tm(°C ) 實施例5-活性特征該實施例顯示所測試變體不僅相對于親本α -淀粉酶，還相對于工業標準酶具有 改變的活性特征。在純化樣品或平板樣品上進行蛋白質確定。基于相等蛋白質濃度分別測 試變體和標準α-淀粉酶。使用ρΗ 5. 6蘋果緩沖液，將平板變體或純化變體稀釋成大約20ppm。底物由相同 50mM蘋果酸緩沖液，ρΗ 5. 6中的15%谷物淀粉組成。將400微升淀粉混懸液平衡至70°C 持續2. 5分鐘。將七(7) μ L稀釋的酶以約0. 36ppm蛋白質終濃度迅速添加至平衡的淀粉。 反應混合物隨后置入預熱至85°C的振搖加熱器并以300轉/分鐘混合。反應用50μ L的 125mM NaOH在預定時間間隔猝滅。將反應管離心并將上清液按10倍稀釋到IOmMNaOH中， 以通過HPAEC-PAD分析DP譜。在4、10和20分鐘建立反應。4分鐘反應提供產物至底物的酶初始轉化過程的指 示；10分鐘反應提供酶熱活性的指示并且20分鐘反應提供酶熱穩定性的指示。將從DP2至HPLC運行結束的總面積集成并除以總蛋白質和反應時間。結果在圖 6和7中提供。實施例6-額外的方法在實施例中使用以下測定法。在實施例中通常顯示了對下文所提供方案的偏離。在這些實驗中，使用分光光度計來測量反應期間所形成產物的吸光度。A.蛋白質含量確定BCA(雙喹啉-4-羧酸 Mcinchoninic acid))測定法使用BCA(Pierce)測定法在微量滴定平板(MTP)規格上確定樣品中的蛋白質濃 度。使用的化學品和試劑溶液是BCA蛋白質測定試劑和Pierce稀釋緩沖液(50mM MES, pH 6. 5,2mM CaCl2,0. 005 %TWEEN - 80) 設備包括 SpectraMAX (340 型；Molecular Devices)MTP 讀數儀。MTP 從 Costar 獲得(9Ol7 型)。將二百(200) μ 1 BCA試劑移入各孔，隨后移入20 μ 1稀釋的蛋白質。徹底混合 后，MTP在37°C溫育30分鐘。除去氣泡，此后在562nm處讀取孔中溶液的光密度(OD)。為 確定蛋白質濃度，從樣品讀數中扣除背景讀數。對蛋白質標準物(純化的酶)標出OD562以 產生標準曲線。從該標準曲線內推樣品的蛋白質濃度。Bradford測定法使用Bradford染料試劑(Quick Start)測定法在MTP規格上 確定樣品中的蛋白質濃度。使用的化學品和試劑溶液是快速啟動Bradford染料試劑 (BIO-RAD 目錄號 500-0205)、稀釋緩沖液(IOmM NaCl,0. ImM CaCI2,0. 005%TWEEN -80)。使用的設備是 Bionmek FXRobot (Beckman)和 SpectraMAX(340 型)MTP 讀數儀。MTP 來自 Costar (9017 型)。將二百(200) μ 1 Bradford染料試劑移入各孔，隨后移入15 μ 1稀釋緩沖液。添 加10 μ 1濾過的培養肉湯至諸孔。徹底混合后，MTP在室溫溫育至少10分鐘。吹去氣泡并 且在595nm處讀取每孔的0D。為測定蛋白質濃度，從樣品讀數中扣除背景讀數(即來自非 溫育孔的讀數)。所獲得的OD595值提供了樣品中蛋白質含量的相對量值。B.用于測試酶性能的微量樣品測定法在本測定法中使用的洗滌劑不含酶或已經通過如本文件中其他地方所述的熱滅 活法摧毀商業洗滌劑中存在的酶。使用的設備包括Eppendorf熱混合儀和SpectraMAX (340 型)MTP讀數儀。MTP從Costar獲得(9017型)。洗滌劑制備(AATCC HDL ；美國條件)將Milli-Q水調節至6gpg水硬度(Ca/Mg = 3/1)，并添加無增白劑的1.5g/l AATCC 2003標準參考液體洗滌劑。劇烈地攪拌洗滌劑溶 液至少15分鐘。然后，添加5mM HEPES (無酸)并調節pH至8. 0。用于測試淀粉酶性能的稻淀粉微量樣品測定法如本文件中其他地方所述制備試 驗洗滌劑。使用的設備包括New Brunswick Innova 4230搖床/恒溫箱和SpectraMAX (340 型)MTP讀數儀。MTP從Corning獲得(3641型)。具有橙色色素樣品的老化稻淀粉(CS-28) 從(荷蘭弗拉爾丁恩)試驗材料中心(Center for Test Materials)獲得。在切成0. 25 英寸圓形微量樣品前，該織物用水洗滌。將兩份微量樣品置于96孔微量滴定平板的每個孔 中。在20°C (北美)或40°C (西歐)平衡試驗洗滌劑。將190 μ L洗滌劑溶液添加至MTP 的含有微量樣品的每個孔。向該混合物添加10 μ L稀釋的酶溶液。MTP用粘性箔密封并置 于恒溫箱中1小時，同時在所需的試驗溫度(通常20°C或40°C )以750轉/分鐘混合。溫 育后，從每個孔轉移150 μ L溶液至一個新鮮MTP中并在488nm處使用SpectraMAX MTP讀 數儀讀數以量化清潔作用。還包括空白對照以及含有微量樣品和洗滌劑但不含酶的對照。酶性能的計算所獲得的吸光度值對空白值校正(即在無酶時溫育微量樣品后獲得的吸光度值)。所得吸光度是水解活性的量值。
C.通過抗體滴定確定淀粉酶濃度在一些情況下，通過用抑制性多克隆抗體滴定確定α-淀粉酶的濃度和比活性。 發現針對嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶(AmyS)產生的多克隆抗體強烈地抑制AmyS和來自 芽孢桿菌物種TS-23的α -淀粉酶(例如，結合牢固足以產生活性喪失的線性滴定)。因 而，這種抗體可以用來測量酶濃度，后者轉而用來計算比活性。簡而言之，測量了由抗體的幾個已知濃度引起的酶抑制作用的量。從這個信息外 推出完全抑制作用所需的抗體濃度，該抗體濃度等價于樣品中的酶濃度。使用產生熒光的 BODIPY-淀粉測定法測量α -淀粉酶活性和抑制作用。緩沖液是含有0. 005% Tween-80的 pH 7. 0 的 50mM MOPS。針對純化AmyS的多克隆抗體在兔中產生并由標準方法純化。通過測量對比活性 已知的AmyS樣品的抑制作用，確定了抗體貯存液的經驗性“表觀濃度”值。抗體樣品用來 確定AmyS和TS23t變體的濃度和比活性。使用這些值來產生歸一化96孔酶貯存平板，其 中將全部變體稀釋至常見濃度。D.天然蛋白凝膠電泳使用PHASTGEL系統(GE Healthcare)在7. 5%或12. 5%濃度的預制天然聚丙烯 酰胺凝膠(PHASTGEL Homogeneous)上測量變體蛋白質樣品的電泳遷移率。使用緩沖帶 (PHASTGEL Native)并且它由0. 88M L-丙氨酸，0. 25M Tris緩沖液中的pH 8. 8組成。一 般運行條件由400V持續12. 75分鐘，陽極至陰極距離3. 7cm組成。備選地，通過選擇合適緩沖系統，在多個pH值(即5. 8、8. 0和10. 0)的Imm厚度 0. 5-1. 5%瓊脂糖凝膠上測量變體蛋白質樣品的電泳遷移率。電泳在非變性條件下實施。陰 極-陽極長度是13. 9cm。1-2 yg蛋白質樣品與5%甘油+0. 05%溴酚藍混合并加到每個泳 道上。凝膠一般在100V運行1小時。凝膠用溶解在10%乙酸中的Louiseville藍染料染色并用10%甲醇和10%%酸 性酸水溶液脫色。根據使用的天然凝膠系統，同時加載12種至20種蛋白質變體。結果，相 對于在相同凝膠上加載的電荷標準物梯，可以立即評估蛋白質變體的電泳遷移率。E.洗滌劑熱失活商業洗滌劑配方的熱失活起到摧毀任意蛋白質組分的酶活性而保留非酶組分特 性的作用。因而，這種方法適于制備商業購買的洗滌劑或用于測試酶變體。對于北美(NA) 和西歐(WE)重垢液體衣物(HDL)洗滌劑，通過將(玻璃瓶子中)預稱重的液體洗滌劑置于 95°C水浴中2小時進行熱失活。用于熱失活北美(NA)和日本(JPN)重垢顆粒衣物(HDG) 洗滌劑的溫育時間是8小時而西歐(WE)HDG洗滌劑的該溫育時間是5小時。用于熱失活NA 和WE自動餐具(ADW)洗滌劑的溫育時間是8小時。所述洗滌劑從本地超市商店購買。在 溶解洗滌劑至精確測定失活百分數的5分鐘范圍內測試未加熱過和加熱過的洗滌劑。酶活 性由suc-AAPF-pNA測定法測試。為在熱失活的洗滌劑中測試酶活性，從熱失活的母液制備洗滌劑的工作溶液。添加適宜量的水硬度(6gpg或12gpg)和緩沖液至該洗滌劑溶液以匹配想要的條件(表6-1)。 通過旋轉或顛倒瓶子而混合溶液。 縮寫Procter&Gamble(P&G)禾口 Reckitt Benckiser (RB)。F.用于清潔性能確定的TERG-0-T0METER測定法使用了用于評估蛋白質和糖污漬清潔作用的標準方案，其中在標準條件下清潔之 前和之后測量織物樣品上的污漬水平。織物樣品由以玉米淀粉、稻淀粉或血液、乳和炭黑 混合物弄臟的織造棉質織物組成。樣品從Testfabrics，Inc. (West Pittiston，PA)購買。 玉米淀粉(EMPA 161)和血液、乳及炭黑(EMPA 116)技術性污漬由EMPA試驗材料AG (St. Galle，瑞士)產生。稻淀粉(CFT CS-28)污漬由試驗材料中心BV (荷蘭弗拉爾丁恩)產生。 使用設置成D65 (6500° K)標準照明的Minolta光反射儀CR-410，通過光反射率在處理之 前和之后測量每種污漬。將L、a、b值的差異轉化成總色差(dE)，如CIE-LAB顏色空間所定 義。通過取得洗滌之前和之后的顏色差異之間的比率并比較該比率與未洗滌過的污漬(洗 滌之前)對未弄臟織物的差異，將污漬的清潔作用表述為百分污漬去除指數(％ SRI)。清潔實驗在配備6 個 2L 不銹鋼罐的 TERG-0-T0METER(UnitedStates Testing Co.，Hoboken, NJ)中實施，其中所述不銹鋼罐配有懸臂式攪拌器。每個處理在由6格令/ 每加侖3 1(鈣鎂)水硬度或12格令/每加侖水硬度組成的IL總體積中實施。洗滌 實驗中使用的洗滌劑是具有PH 8的5mM HEPES緩沖液的1. 5g/L AATCC HDL WOB 2003液體洗滌劑、0. 7g/L AATCC HDD WOB 1993顆粒洗滌劑、具有過硼酸鹽和TAED漂白劑的8g/L IEC A* 60456顆粒洗滌劑，或5g/L Persil Power凝膠液體洗滌劑。將酶直接添加至洗滌 溶液并隨后通過添加40g/L或200g/L的臟污織物和陪洗織物(ballast fabric)啟動反應。 洗滌反應以100轉/分鐘在201、251、301、401或501攪拌10、15或40分鐘。清潔后， 樣品在自來水中漂洗3分鐘，在滾筒洗衣機中以1000轉/分鐘甩干以除去多余水并在干燥 器中以低熱在恒壓循環上干燥大約45分鐘。污漬去除程度的比較結果由反射測量術評估 并表述為％污漬去除指數(％ SRI)。對照條件不含有酶并且陽性對照由多種劑量的基準商 業酶組成。G.用于確定淀粉酶活性的Bodipy-淀粉測定法使用EnzChek 超級淀粉酶測定試劑盒(E33651，Invitrogen)實施B0DIPY-淀 粉測定法。通過將含有凍干底物的小瓶的內容物溶解于PH 4. OWlOOyL 50mM乙酸鈉緩 沖液中制備DQ淀粉底物的lmg/mL母液。將小瓶渦旋混合約20秒并置于室溫黑暗中，偶爾 混合直至溶解。添加900 μ L測試緩沖液(50mM乙酸鈉，含2. 6mM CaCl2,pH 5. 8)并且將小 瓶通過渦旋混合約20秒。該底物溶液貯存在室溫于黑暗中直至待用或貯存在4°C。對于該 測定法，從測試緩沖液中的lmg/mL底物溶液制備100 μ g/mL DQ底物工作溶液。將190 μ L 100 μ g/mL底物溶液添加至平底96孔微量滴定平板中的各孔。添加IOyL的每種酶樣品至 各孔，使用熱混合儀以800轉/分鐘混合30秒。在測定法中包括僅含有緩沖液和底物的空 白樣品(無酶空白)。在25°C于熒光微量滴定平板讀數儀中測量熒光強度變化率(激發 485nm，發射520nm)5 分鐘。H.測量對大分子底物的酶結合作用實施結合測定法以確定淀粉酶(AmyS)電荷階梯變體(電荷改變=相對于野生型 AmyS的-12至+12)與谷物秸稈和甘蔗渣的底物結合作用。使用的底物包括甘蔗渣(來自 巴西的甘蔗渣，由國家再生能源實驗室(NationalRenewable Energy Laboratory)稀酸預 處理、洗滌并緩沖于PH 5)、AFEX(氨纖維膨脹谷物秸稈)和PCS (稀硫酸預處理的谷物秸 稈，洗滌并調節至PH 5)。使全部底物在利用前達到想要的固體百分數。淀粉酶結合作用將淀粉酶電荷階梯變體純化并稀釋至200ppm用于測試。在硼酸 鹽緩沖液(40mM，pH 8. 5,0. 016% Tween80)中制備纖維素甘蔗渣溶液。將150 μ L甘蔗 渣溶液添加至微量滴定過濾平板中的各孔。將150 μ L硼酸鹽緩沖液添加到充當對照的一 組獨立的孔中。將10 μ L淀粉酶電荷階梯變體添加至過濾板，每種條件一式兩份。該平板 在室溫溫育2小時。收集濾液并通過BODIPY-淀粉測定法測量上清液中的淀粉酶活性。測量對微量樣品的酶結合作用；α-淀粉酶變體在標準洗滌條件下與或不與 CS-28稻淀粉微量樣品溫育30分鐘。游離酶的量由BODIPY-淀粉測定法測量。與微量樣 品結合的酶的部分計算如下結合的部分=(樣品不存在時的酶活性-樣品存在時的酶活 性)/(樣品不存在時的酶活性)。實施例7-在枯草芽孢桿菌中的淀粉酶產生在本實施例中，描述了在枯草芽孢桿菌中產生突變截短形式的嗜熱脂肪芽孢桿菌α淀粉酶(具有S242Q突變和從羧基端的29個氨基酸缺失，本文中也稱作S242Q)及其變 體。轉化如本領域已知那樣(見，例如W002/14490)進行。簡而言之，將編碼親本淀粉酶的 基因克隆到PHPLT表達載體中，其中所述pHPLT表達載體含有LAT啟動子(PLAT)、編碼LAT信號肽的序列(preLAT)，后接PstI和HpaI限制性位點用于克隆。下文顯示LAT信號肽的編碼區atgaaacaac aaaaacggct ttacgcccga ttgctgacgc tgttatttgc gctcatcttcttgctgcctc attctgcagc ttcagca(SEQ ID NO 19).下文顯示LAT信號肽的氨基酸序列MKQQKRLYAR LLTLLFALIF LLPHSAASA(SEQ ID NO 20)使用帶有以斜體顯示的替換氨基酸的成熟截短S242Q淀粉酶的氨基酸序列作為 制備本文中所述變體文庫的基礎AAPFNGTMMQ YFEffYLPDDG TLffTKVANEA NNLSSLGITA LffLPPAYKGTSRSDVGYGVY DLYDLGEFNQ KGTVRTKYGT KAQYLQAIQA AHAAGMQVYADVVFDHKGGA DGTEffVDAVE VNPSDRNQEI SGTYQIQAffT KFDFPGRGNTYSSFKffRffYH FDGVDffDESR KLSRIYKFRG IGKAffDffEVD TENGNYDYLMYADLDMDHPE VVTELKNWGK WYVNTTNIDG FRLDAVKHIK FQFFPDffLSYVRSQTGKPLF TVGEYffSYDI NKLHNYITKT NGTMSLFDAP LHNKFYTASKSGGAFDMRTL MTNTLMKDQP TLAVTFVDNH DTEPGQALQS WVDPffFKPLAYAFILTRQEG YPCVFYGDYY GIPQYNIPSL KSKIDPLLIA RRDYAYGTQHDYLDHSDIIG WTREGVTEKP GSGLAALITD GPGGSKWMYV GKQHAGKVFYDLTGNRSDTV TINSDGffGEF KVNGGSVSVff VPRKTT(SEQ ID NO :21)。使用來自Qiagen的QIAQUIK柱純化PCR產物并將該產物重懸于50 μ L去離子水 中。用HpaI (Roche)和PstI (Roche)消化50 μ L純化的DNA并將所得DNA重懸于30 μ L去離 子水中。利用PstI和HpaI克隆位點，將10-20ng/ μ L所述DNA克隆到質粒pHPLT中。連接混 合物直接轉化至感受態枯草芽孢桿菌細胞(基因型Avpr，AwprA, Ampr-ybfJ, AnprB)。 該枯草芽孢桿菌細胞具有置于木糖誘導型啟動子下的能力基因(competencygene) (comK), 從而使用木糖來誘導對DNA結合和攝取的能力(見Hahn等人，Mol. Microbiol. ,21 763-775，1996)。質粒pHPLT-AmyS的元件包括pUB110 =來自質粒pUBllO的DNA片段 (McKenzie 等人，Plasmid 15 :93_103，1986)。質粒特征包括ori_pUB110 =來自 pUBllO 的 復制起點；neo =來自pUBllO的新霉素抗性基因；Plat =來自地衣芽孢桿菌淀粉酶的轉錄 啟動子；Pre LAT =來自地衣芽孢桿菌淀粉酶的信號肽；SAMY 425ss =截短AmyE基因序列 的編碼區(由本研究中所表達的每種截短AmyE變體的編碼區替代)；和終止子=來自地衣 芽孢桿菌淀粉酶的轉錄終止子。實施例8-酶變體的表達本實施例描述了用來表達前述實施例的經轉化枯草芽孢桿菌的多種重組酶的方法。α -淀粉酶表達-2mL規模含有S242Q (或其變體)表達載體的枯草芽孢桿菌克隆用鋼制96孔復制器從甘油貯藏物復制到含有150 μ 1 LB培養基+10 μ g/mL新霉素的96孔 培養平板(BD，353075)中，于加濕箱中在37°C，220轉/分鐘培育過夜。來自過夜培養物的 100 μ L等份樣用來接種5mL塑料培養管中的2000 μ L確定成分培養基+10 μ g/mL新霉素。 該培養基是基于MOPS緩沖液的半定義豐富培養基，以脲作為主要氮源，葡萄糖作為主要碳 源并且補充有大豆胨和5mM鈣，用于穩健細胞生長。培養管在37°C以250轉/分鐘溫育72小時。溫育后，培養肉湯以3000xg離心10分鐘。將上清液傾析至15mL聚丙烯錐形 管；每個樣品80 μ L分配至96孔平板用于蛋白質定量。實施例9-酶變體的產生本實施例描述酶電荷階梯和組合電荷文庫的產生酶電荷階梯涵蓋目的物理特性范圍的多種蛋白質變體選自現存文庫或通過如本 領域已知的位點定向誘變技術(見例如授予Genencorlnternational的美國專利申請系列 號10/576，331、11/581，102和11/583, 334)生成。隨后在目的試驗中測試這種定義的探針
蛋白質集合。示例性淀粉酶電荷階梯變體在下表中顯示并如本文中所述測試。在這些表格中， 電荷改變是相對于親本酶而言的。
酶組合電荷文庫(CCL)嗜熱脂肪芽孢桿菌AmyS-S242Q CCL的產生。AmyS_S242Q質粒DNA從轉化的枯草芽孢桿菌菌株(基因型AaprE，AnprE, amyE: xylRPxylAcomK-phleo)分離并發送至 DNA2. 0 Inc.作為模板用于 CCL 構建。要求 DNA2. OInc. (Mountain View, CA)在 9_2 表中 所示AmyS-S242Q(S242Q)淀粉酶中4個位點的每個位點處生成位置文庫。變體作為96孔 平板中的甘油貯藏物提供。
通過鑒定以下4 個殘基 Gln97、Gln 319、Gln 358 和 Gln 443 設計出 AmyS S242Q 組合電荷文庫。通過在每個位點處產生三種可能性野生型、精氨酸或天冬氨酸的全部組 合，產生一個4位點、81個成員的CCL。
實施例10-酶洗滌性能本實施例描述在微量樣品測定法中于可變離子強度下的AATCCHDL洗滌劑或5mM HEPES緩沖液中測試1. 0 u g/mL S242Q變體。使用在實施例6中提供的方法(見，“用于測 試淀粉酶性能的稻淀粉微量樣品測定法”和“谷物粉水解”)。對于AATCC HDL洗滌劑中酶的清潔性能，存在最佳凈電荷改變。測量性能為稻淀 粉微量樣品活性測定法中觀察到的相對清潔性能。約1的值顯示在本測定法中的頂級清潔 性能。這是優化蛋白質物理屬性(例如凈電荷)以改善給定結果或益處(例如在液體衣物洗滌劑中的清潔性能)的例子。用這種有限的探針蛋白集合鑒定的最佳電荷與測量整個電 荷組合文庫時所觀察到的最佳電荷相一致。探針蛋白質的使用因而預測整個文庫的特性。根據Debye-Hiickel 理論(Israelachivili, Intermolecular and SurfaceForces， 第 2 片反With Applications to Colloidal and Biological Systems,Academic Press第 2版[1992])，靜電相互作用主要由恒定電勢或恒定電荷上的相互作用種類(酶、底、織物和 洗滌劑)之間的雙層力量強度、這些物質的尺寸和周圍介質的介電常數決定。為了表征復 雜介質如洗滌劑制劑中粒子的靜電特性，這些粒子在擁有相同Debye篩選長度的還原性環 境中的相互作用是充分的。這通過選擇在洗滌條件下使PH和導電性與洗滌劑的pH和導電 性匹配的緩沖液實現。對于這種測試適宜的緩沖液是具有可變量的不同電解質如NaCl的 PH 8.0的5福HEPES緩沖液。添加2. 5mMNaCl至這種緩沖液匹配了常見北美洗滌條件的 PH和導電性。添加更高濃度的NaCl代表日本和歐洲洗滌條件，所述日本和歐洲洗滌條件一 般在離子強度上因水硬度和洗滌劑濃度提高而更高。圖10顯示正電荷S242Q電荷變體對于北美洗衣條件下清潔稻淀粉微量樣品是優 異的。同樣，負電荷TS23t變體對于西歐洗衣條件下清潔稻淀粉微量樣品是優異的(圖11)。圖12說明正電荷S242Q變體展示出顆粒谷物淀粉底物水解的更高比活性。實施例11-熱穩定性本實施例描述了確定蛋白質電荷與熱穩定性之間的關系。α -淀粉酶測定法基于 加熱培養上清液之前和之后的BODIPY淀粉水解作用。使用的相同化學品和試劑溶液如實 施例6中描述。α -淀粉酶的熱穩定性測定法過濾的培養上清液在具有0. 002% Tween的50mM乙 酸鈉+2mM CaCl2pH 5. 8中連續稀釋。測試10 μ L每種稀釋的培養上清液以通過BODIPY淀 粉測定法確定初始淀粉酶活性。50 μ L每種稀釋的培養上清液置于VWR低特性的PCR 96孔 平板中。將30 μ L礦物油作為密封劑添加至各孔。平板在BioRad DNA引擎Peltier熱循 環儀器中在95°C根據親本酶的穩定性溫育30分鐘或60分鐘。溫育后，將平板冷卻至4°C 持續5分鐘并隨后保持在室溫。添加10 μ L每份樣品至一塊新平板并測試，以通過如實施 例1中所述的BODIPY淀粉測定法確定最終淀粉酶活性。熱穩定性的計算。樣品的殘余活性表述為最終吸光度與初始吸光度之比，其中兩 種吸光度均用空白校正。更高的比數指示熱穩定更大的變體。這是優化蛋白質物理屬性 (在這種情況下，凈電荷)以改善液體衣物應用中酶熱穩定性的例子。表11-1 :S242Q CCL-熱穩定性勝出者 實施例12-酶性能本實施例說明酶性能可以受電荷影響。使用如上文實施例6中描述的熱失活洗滌劑評估酶性能。勝出者定義為具有大于 1的性能指數(PI)的那些變體。PI是突變體殘余活性對親本(即S242Q)殘余活性的比率。 結果在圖12-1和12-2中顯示。表12-1 :S242Q CCL_CS_28稻淀粉微量樣品勝出者，2倍Tide (如實施例6中描述 的北美條件)。表12-2 :S242Q CCL_CS_28稻淀粉微量樣品勝出者，Persil (西歐條件)也使用如本文中提供的BODIPY淀粉水解測定法測量了活性。結果在表12_3中顯
示。對這種淀粉底物(谷物淀粉)的大于1的相對比活性表明該變體比S242Q親本具有更
高的比活性。相對ppm是表現滴度(expressiontiter)，大于1表示比S242Q親本更高的滴 度(在振搖管中)。表12-3 :S242Q CCL-滴度和/或B0DIPY-淀粉勝出者 實施例13-平衡對淀粉酶活性和表達的突變影響本實施例說明可以通過導入多個氨基酸替換同時優化兩種獨立的酶特性，甚至其 中所述特性是負相關的，例如負相關的原因在于對立地關聯于蛋白質的電荷特征。在實驗期間確定AmyS_242Q的中位數表達隨增加的正電荷而減少。然而，特異性 BODIPY淀粉水解作用隨增加的正電荷而提高。增強的重組淀粉酶表達和淀粉水解作用在例 如適用于燃料乙醇工業中淀粉液化或洗滌劑應用中清潔的AmyS-242Q的工程化變體中是 受歡迎的。然而，這些特性明顯是沖突的特征。使用本發明中提供的方法，有可能通過選擇 性組合單一突變來產生更高度表達的淀粉酶變體，同時并不嚴重損害淀粉水解作用。本文 中所述的策略成功地用來產生和選擇多重替換的AmyS-242Q變體，其中所述AmyS_242Q變 體具有第一特性(例如作為主要特性的表達)上的改良，同時改善了或并未犧牲第二特性 (例如作為次要特性的淀粉水解作用)。此外，與AmyS_242Q變體的中位值表達相反，谷物淀粉微量樣品清潔作用隨增加 的正電荷而提高。增強的重組淀粉酶表達和清潔性能是在AmyS-242Q的工程化變體中受歡 迎的。然而，這些特性明顯也是沖突的特性。使用本發明中公開的方法，有可能通過選擇性 組合單一突變來產生更高度表達的淀粉酶變體，同時并不嚴重損害清潔性能。本文中所述 的策略成功地用來產生和選擇多重替換的AmyS-242Q變體，所述AmyS_242Q變體具有第一 特性(例如作為主要特性的表達)上的改良，同時改善了或并未犧牲第二特性(例如作為 次要特性的稻淀粉微量樣品清潔作用)。特別地，測試了含80種成員的一個AmyS_S242Q電荷組合文庫(CCL)的振搖管表 達、BODIPY-淀粉水解作用和稻淀粉清潔活性，其中所述AmyS-S242Q電荷組合文庫包含具 有1至4個帶電荷殘基替換組合的變體。在表13-1和13-2中顯示AmyS-S242Q勝出者。 重要地，與親本酶相比，表13-1的多重替換變體具有相等同或改善的表達和相等或改良的B0DIPY-淀粉水解作用。類似地，與親本酶相比，表13-2的多重替換變體具有相等或改善的 表達和相等或改良的稻淀粉清潔活性。表13-1. AmyS-S242Q表達和B0DIPY-淀粉水解勝出者 表13-1. AmyS-S242Q表達和B0DIPY-淀粉水解勝出者 表13-2. AmyS-S242Q表達和稻淀粉水解勝出者 總之，因為酶活性和酶產生具有不同的電荷依賴性(見圖13Α、13Β、14Α和14Β)，故 它們是負相關的(見圖12Α和12Β)。然而，存在表達和活性方面均改善的眾多變體，并且以 這種方式對所述文庫的分析允許鑒定到這些變體。盡管以淀粉酶進行了說明，然而本方法可應用于其他酶類，如蛋白酶、脂肪酶、纖 維素酶、轉移酶和果膠酶。另外，可以同時分析兩種或多種特性的任何組合，如表達、活性、 結合作用、熱穩定性、在一種或多種洗滌劑存在下的穩定性和螯合劑穩定性。實施例14-淀粉酶的退漿性能在本實施例中，在85°C和97°C在幾種鈣濃度存在下將變體S242Q的退漿性能與 Ethyl 禾口 Xtra 比較。通過添加不同量的CaCl2母液至pH約6. 5的Milli Q水，每個試驗的CaCl2濃度 從0-20ppm變化。在每個試驗以O.Olppm有效蛋白質使用Ethyl、Xtra和變體S242Q。使用 50 1的浴比在LAUNDER-0-METER中進行該測定法。在稻淀粉染色的織物樣品上實施性能 測試，所述織物樣品具有與淀粉結合的指示染料(TestFabrics目錄號CS-28 ；TestFabrics Inc.)。使用3份CS-28樣品(6cmx8cm)和4份本色印花布樣品(Testfabrics，型號400R ；3英寸x4英寸)作為每個試驗的底物。將具有Milli Q水/Ca的LAUNDER-0-METER的溫度 預調節至85°C或97°C，此后添加酶和樣品。反應實施30分鐘，此后將樣品在水中漂洗并干 燥，隨后讀數。通過使用CIE顏色空間的反射測量術進行測量。每種可察覺的顏色可以 由該顏色空間中的坐標代表。“L*”代表純黑至純白0至100級別的亮度或灰階 值。“a*代表深紅色至綠色的遷移，其中大的正值代表非常深紅色調而大的負值代表非常綠 色調。“b*代表黃至藍的遷移，其中大的正值代表非常黃色調而大的負值代表非常藍色調。 當a *和b *值均是0時，缺少顏色，留下純灰色，其亮度由L *值定義。具有D 65光源的CIE Lab顏色空間中的Minolta色度儀CR200用于測量退漿性 能。為量化退漿性能，淀粉酶處理后，從每個CS-28樣品取得四個CIE L*讀數(即，2讀數 分別來自樣品的正面和反面)。較高的CIE L*值表明較好的退漿性能。如圖15和圖16中所示，與Ethyl和Xtra相比，S242Q變體在測試的條件下明顯 地顯示退漿性能的較低鈣依賴性。在以上說明書中提到的全部出版物和專利在此引入作為參考。雖然公開的方法和 酶已經在一些情況下與具體或優選的實施方案聯系加以描述，然而應當理解由所附權利要 求書所覆蓋的內容將不限于此類具體或優選的實施方案。實際上，所公開方法和酶的多種 修改和變化對于本領域技術人員是顯而易見的并且用于實施已公開內容的所述方法的多 種修改和變化被包含于后續權利要求書的范圍內。
權利要求
組合物，包含a)至少一種變體α-淀粉酶，其包含與親本AmyS樣α-淀粉酶的氨基酸序列至少95％同一的氨基酸序列并在與參考α-淀粉酶第242位置相對應的氨基酸位置處具有替換，所述變體α-淀粉酶具有可檢測的α-淀粉酶活性，和b)至少一種以下物質額外的酶、洗滌劑、表面活性劑、螯合劑、氧化劑、酸化劑、堿化劑、過氧化物源、硬度源、鹽、洗滌絡合劑、聚合物、穩定劑或織物調理劑。
2.權利要求1的組合物，其中變體a-淀粉酶與親本AmyS樣a -淀粉酶或參考a -淀 粉酶相比較在以下一個或多個特征上被改變(a)凈電荷、(b)底物特異性、(c)底物切割、 (d)底物結合、(e)熱穩定性、(f)在一個或多個pH處的活性、(g)在一個或多個pH處的穩 定性、(h)氧化條件下的穩定性、(i)Ca2+需求、(j)比活性、(k)催化速率、(1)催化效率、 (m)在螯合劑存在下的活性、(n)在螯合劑存在下的熱或pH穩定性、(o)退漿用途或清潔過 程的用途、或(P)在蛋白質表達系統中的表達量。
3.權利要求1的組合物，其中參考a-淀粉酶是SEQ ID NO :1或2。
4.權利要求1的組合物，其是用于衣物、餐具或硬表面清潔、退漿、或者織物或污漬處 理的產品的組分。
5.權利要求1至4任一項所述的組合物，其中額外的酶是蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、纖維 素酶、過氧化物酶、氧化酶、果膠酶、裂合酶、角質酶、漆酶、或它們的組合。
6.權利要求1至5任一項所述的組合物，其中表面活性劑是非離子的、陰離子的、陽離 子的或兩性離子的。
7.權利要求1至6任一項所述的組合物，其中變體a-淀粉酶是S242A、S242D、S242E、 S242F、S242G、S242H、S242L、S242M、S242N、S242Q 或 S242T 變體。
8.權利要求7的組合物，其中變體a-淀粉酶具有針對氧化作用的改變穩定性并且 該變體a “淀粉酶還包括一個或多個甲硫氨酸殘基的缺失或替換，包括位于親本AmyS樣 a -淀粉酶第8、9、96、200、206、284、307、311、316和438氨基酸位置處的殘基，其中參考 a -淀粉酶是SEQ ID NO :2。
9.權利要求7的組合物，其中變體a-淀粉酶還在與參考0-淀粉酶第97、179、180、 193、319、349、358、416、428或443氨基酸位置相對應的一個或多個氨基酸位置處包含序列 修飾。
10.權利要求9的組合物，其中變體a-淀粉酶包含一個或多個在如下位置處的替換 在第349氨基酸位置處的半胱氨酸、在第428氨基酸位置處的半胱氨酸、在第97氨基酸位 置處的谷氨酸、在第97氨基酸位置處的精氨酸、在第319氨基酸位置處的谷氨酸、在第319 氨基酸位置處的精氨酸、在第358氨基酸位置處的谷氨酸、在第358氨基酸位置處的精氨 酸、在第443氨基酸位置處的谷氨酸或在第443氨基酸位置處的精氨酸。
11.權利要求7-10任一項所述的組合物，其中變體a-淀粉酶包含附93或V416或這 二者的替換。
12.權利要求11的組合物，包含N193F或V416G或這二者的替換。
13.權利要求7至12任一項所述的組合物，還包含一個或多個在位置F178、R179、 G180、1181、G182和K183處的氨基酸缺失。
14.權利要求13的組合物，其中變體a-淀粉酶在不存在添加的鈣或在螯合劑存在下具有改變的金屬離子依賴性或者改變的穩定性或活性。
15.權利要求1的組合物，其中變體a-淀粉酶與SEQID NO :2具有至少95%同源性 并且相對于包含SEQ ID N0:1的參考a-淀粉酶中的編號而言包含第242位氨基酸替換， 并且其中該變體a-淀粉酶具有a-淀粉酶活性。
16.權利要求1的組合物，其中親本AmyS樣a-淀粉酶是SEQ ID NO :1、2、6、7、8、9、10、11、12、15或16，并且參考a-淀粉酶是SEQIDN0:1或2。
17.權利要求1的組合物，其中變體a-淀粉酶相對于親本AmyS樣a-淀粉酶在pH > 約8的洗滌過程中具有改善的性能。
18.權利要求10的組合物，其中變體a-淀粉酶包含a)Q97E、Q319E、Q358E、Q443E ；b) Q97E、Q319R、Q358E、Q443R ；c)Q97E、Q319R、Q358E ；d)Q97E、Q319R、Q443E ；e)Q97E、Q319R、 Q443R ；f)Q97E、Q358R ；g) Q97E、Q443E ；h) Q319R、Q358E、Q443E ；或 i) Q319R、Q358R、Q443E 的 成組替換。
19.洗滌劑或清潔制劑，包含權利要求1-18任一項所述的組合物或至少一種變體 a-淀粉酶，所述變體a-淀粉酶包含與親本AmyS樣a -淀粉酶的氨基酸序列至少95%同 一的氨基酸序列并在與參考a “淀粉酶第242位置相對應的氨基酸位置處具有替換，所述 的變體a “淀粉酶具有可檢測的a “淀粉酶活性；其中參考淀粉酶是SEQ ID NO :1或2。
20.權利要求19的洗滌劑或清潔制劑，其中變體a-淀粉酶是至少包含S242A、S242D、 S242E、S242F、S242G、S242H、S242L、S242M、S242N、S242Q 或 S242T 替換的 S242 變體 a -淀 粉酶。
21.織造工藝后退漿織造材料的方法，包括將織造材料與權利要求1至18任一項所述 的組合物或變體a“淀粉酶在有效用于至少部分地從織造材料去除漿料的條件和時間下 接觸，所述變體a-淀粉酶包含與親本AmyS樣a-淀粉酶的氨基酸序列至少95%同一的氨 基酸序列并在與參考a “淀粉酶第242位置相對應的氨基酸位置處具有替換，所述的變體 a-淀粉酶具有可檢測的a-淀粉酶活性。
22.權利要求21的方法，其中變體a-淀粉酶與親本AmyS樣a-淀粉酶或參考a-淀 粉酶相比較在以下一個或多個特性上被改變(a)凈電荷、(b)底物特異性、(c)底物切割、 (d)底物結合、(e)熱穩定性、(f)在一個或多個pH處的活性、(g)在一個或多個pH處的穩 定性、(h)氧化條件下的穩定性、(i)Ca2+需求、(j)比活性、(k)催化速率、(1)催化效率、(m) 在螯合劑存在下的活性、(n)在螯合劑存在下的熱或pH穩定性、(0)退漿效能、或(p)在蛋 白質表達系統中的表達量。
23.權利要求21的方法，其中親本AmyS樣a-淀粉酶是SEQ ID NO :1、2、6、7、8、9、10、11、12、15或16，并且參考a-淀粉酶是SEQIDN0:1或2。
24.權利要求21的方法，其中變體a-淀粉酶是S242A、S242D、S242E、S242F、S242G、 S242H、S242L、S242M、S242N、S242Q 或 S242T 變體。
25.權利要求24的方法，其中變體a-淀粉酶還包含一個或多個在如下位置處的替換 在第349位置處的半胱氨酸、在第428位置處的半胱氨酸、在第97位置處的谷氨酸、在第97 位置處的精氨酸、在第319位置處的谷氨酸、在第319位置處的精氨酸、在第358位置處的 谷氨酸、在第358位置處的精氨酸、在第443位置處的谷氨酸或在第443位置處的精氨酸， 其中參考a -淀粉酶是SEQ ID NO 1或2。
26.洗滌或清潔的方法，包括將待洗滌或清潔的一個或多種物品與權利要求19的洗滌 劑或包含變體a“淀粉酶的組合物在有效用于至少部分地洗滌或清潔所述一種或多種物 品的條件和時間下接觸，所述變體a-淀粉酶包含與親本AmyS樣a-淀粉酶的氨基酸序列 至少95%同一的氨基酸序列并在與參考a -淀粉酶第242位置相對應的氨基酸位置處具有 替換，所述的變體a-淀粉酶具有可檢測的a-淀粉酶活性。
27.權利要求26的方法，其中至少一種物品用至少一種含淀粉材料弄臟，所述淀粉污 漬的去除受變體a-淀粉酶輔助。
28.權利要求26的方法，其中組合物還包含一種或多種以下物質額外的酶、洗滌劑、 表面活性劑、螯合劑、氧化劑、酸化劑、堿化劑、過氧化物源、硬度源、鹽、洗滌絡合劑、聚合 物、穩定劑或織物調理劑。
29.權利要求26的方法，其中親本AmyS樣a-淀粉酶是SEQ ID NO :1、2、6、7、8、9、10、 11、12、15或16，并且參考a-淀粉酶是SEQ IDN0:1或2。
30.權利要求29的方法，其中變體a-淀粉酶是S242A、S242D、S242E、S242F、S242G、 S242H、S242L、S242M、S242N、S242Q 或 S242T 變體。
31.權利要求30的方法，其中變體a-淀粉酶相對于親本AmyS樣a-淀粉酶在pH > 約8的洗滌過程中具有改善的性能。
32.權利要求30的方法，其中變體a-淀粉酶包含一個或多個在如下位置處的替換 在第349氨基酸位置處的半胱氨酸、在第428氨基酸位置處的半胱氨酸、在第97氨基酸位 置處的谷氨酸、在第97氨基酸位置處的精氨酸、在第319氨基酸位置處的谷氨酸、在第319 氨基酸位置處的精氨酸、在第358氨基酸位置處的谷氨酸、在第358氨基酸位置處的精氨 酸、在第443氨基酸位置處的谷氨酸或在第443氨基酸位置處的精氨酸。
33.權利要求32的方法，其中變體a-淀粉酶包含a)Q97E、Q319E、Q358E、Q443E ；b) Q97E、Q319R、Q358E、Q443R ；c)Q97E、Q319R、Q358E ；d)Q97E、Q319R、Q443E ；e)Q97E、Q319R、 Q443R ；f)Q97E、Q358R ；g) Q97E、Q443E ；h) Q319R、Q358E、Q443E ；或 i) Q319R、Q358R、Q443E 的 成組替換。
34.權利要求30的方法，其中變體a-淀粉酶包含一個或多個在位置F178、R179、 G180、1181、G182或K183處的氨基酸缺失。
35.權利要求34的方法，其中變體a-淀粉酶在不存在添加的鈣或在螯合劑存在下具 有改變的金屬離子依賴性或改變的穩定性或活性。
36.試劑盒，包含a)一種或多種變體a -淀粉酶或權利要求1至18任一項所述的組合物，其中所述變 體a-淀粉酶包含與親本AmyS樣a -淀粉酶的氨基酸序列至少95%同一的氨基酸序列并 在與參考a-淀粉酶第242位置相對應的氨基酸位置處具有替換，所述的變體a-淀粉酶 具有可檢測的a-淀粉酶活性，和b)至少一種以下物質額外的酶、洗滌劑、表面活性劑、螯合劑、氧化劑、酸化劑、堿化 劑、過氧化物源、硬度源、鹽、洗滌絡合劑、聚合物、穩定劑或織物調理劑。
37.權利要求36的試劑盒，還包含在用于織造材料退漿或者洗滌或清潔用含淀粉物質 弄臟的一種或多種物品的方法中使用該試劑盒的說明書。
全文摘要
公開了包含α-淀粉酶變體的組合物，所述α-淀粉酶變體具有α-淀粉酶活性并且相對于衍生這些變體的親本AmyS樣α-淀粉酶而言展示改變的特性。所述組合物通常包含至少一種以下物質額外的酶、洗滌劑、表面活性劑、螯合劑、氧化劑、酸化劑、堿化劑、過氧化物源、硬度源、鹽、洗滌絡合劑、聚合物、穩定劑或織物調理劑。還公開了包含所述變體的洗滌劑制劑。公開了使用組合物用于織造材料退漿和洗滌或清潔物品如餐具或衣物的方法。還提供了與之相關的試劑盒。
文檔編號C11D3/386GK101848986SQ200880114762
公開日2010年9月29日 申請日期2008年11月3日 優先權日2007年11月5日
發明者M-Y·潤 申請人:丹尼斯科美國公司