專利名稱：基于褪黑素和免疫抑制物質的組合成分的制作方法
技術領域：
本發明涉及褪黑素和其他活性物質以及化妝品成分的協同聯合，適用于處理所有那些 導致或伴隨皮膚、頭發或其他組織衰老的表現形式。尤其是，本發明是基于褪黑素與免疫 抑制物質和抗氧化物質的聯合，顯著地增強它的抗衰老活性，顯著地減少了自由基形成， 因而改善了包括皮膚和頭發的外觀。
現有技術的狀態
人們已經知道，自由基(02—)和諸如H2(D2等其他氧(基)反應類(ROS)和/或諸如 過氧亞硝基陰離子等一氧化氮(NO)供體，通常在體內產生，也在皮膚和皮膚的附屬物上 產生。
相應地，人們沿著他們的進化也發展了一種基于抗氧化劑的防御體系，該體系適用于 保護整個有機體，也保護皮膚和皮膚附屬物，避免ROS (氧基反應類)和NOS (—氧化氮 類)。人們也已知，人類的整套免疫防御成分是怎樣的，諸如郎格罕氏細胞、淋巴細胞、 巨噬細胞，以及神經肽和神經激素表達為防御的第一戰線，避免受到化學劑、污染物質、 紫外線、臭氧和其他外源物質的攻擊，也避免例如細菌、真菌、病毒等的攻擊。
所有這些侵犯性環境因素導致了自由基(ROS和NOS)的持續形成的增加。由于這些 原因，生理的抗氧化劑系統參與的組織防御可徹底地減少，創造出整個免疫系統不平衡的 環境(例如，由于紫外線)。正如這些所指出的防衛平衡改變了，這建立起進攻的環境， 稱之為氧化應激(oxidative stress)。
由此，早衰的皮膚和皮膚附屬物，伴隨皺紋的出現，易形成色素過度的點，并減少毛 發數量和體積。而且，氧化應激會容易引起刺激性的形式和許多病理的狀態，例如，銀屑 癬、不同的天然皮膚癌和幾種類型的禿頭癥。
文獻中已經報道，抗氧化劑和免疫抑制劑分別會減少和/或消除所有會導致氧化應激的 反應，首先是脂質過氧化物的所有形式。
褪黑素褪黑素，具有抗氧化活性，是普遍用于減少睡眠/蘇醒的閾值(Brziezinski A(1997)N. EnglJ.Med 336: 186-195)。根據本發明的研究，褪黑素與維生素C和E有關聯，已經觀察 到，這種關聯使其抗氧化活性高于單獨使用褪黑素自身(Dreher F， Gabord B, Schwindt DH， Maibach HI (1998) Br. J. Dermatol 139: 332-339)。
類胡羅卜素
類胡羅卜素的抗氧化活性己在文獻中有所描述(Foote CS, Chang YE, Denny RW (1970) J. Am Chem Soc. 92: 5218-5219; Hill TJ, Land EJ, McGarvey DJ; Schalch W et al (1995) J. Am ChemSoc. 117: 8322-8326)。
而且，已經舉例說明維生素E (疏水的)能修復由在細胞膜中的氧化而產生的胡羅
卜素根除，而維生素C (親水的)存在于細胞外空間，壓制維生素E的根除，接著在細胞 膜以外氧化為脫氫抗壞血酸(Bohm F, Edge R， Land EJ et al (1997) J. Am Chem Soc. 119: 621-622)。
a-硫辛酸
a畫硫辛酸的抗氧化作用描述在以下文獻中Pelle et al. (1999) Photoderm. Photoim. 15: 115-119。
免疫抑制劑
在免疫抑制劑中，廣泛地應用上述所有的6-葡聚糖和羧甲基B-葡聚糖用于它的免疫抑 制能力，在局部的和系統的應用中已舉例說明。(Stone BA, Bohnn JA, Miller JN (1995) Carbohydrate Polymers 28:3-14; Luzio NR (1987) TIPS 344-347)
因為由氧化應激引起的細胞凋亡的特殊機制尚未完全闡明，越來越多致力于發展化妝 用的/治療的策略，以避免由于氧化應激而產生細胞損傷。雖然每個上述化合物已經包含了 保護劑，既用于皮膚也用于皮膚附屬物，這仍需要開發新的和更有活性的化合物，或者改 良其用途，以致它們在短程和長程中都能更為效。
發明內容
本發明所進行的研究工作已經在體外細胞模型中揭示出抗氧化注射是怎樣實現細胞 保護作用以抵抗氧自由基(氧基反應類，ROS)的侵犯。該細胞保護作用尤其是在褪黑素 中發現，但也可聯合褪黑素和其他活性物質，這個聯合是在適當的濃度，能在體外模型中 保持細胞活力。然而，同樣的工作已經顯著表明，在增加褪黑素或其他抗氧化劑的濃度的情況下，細胞活力趨向降低。尤其是，在一個對于神經細胞作為實驗模型而進行的初步研 究中，已經觀察到，抗氧化劑濃度不得不小心地提高以預防任何毒性效應。
這些研究表明，在避免和治療氧化應激上增加的效應是不能僅僅通過應用高濃度的單 一抗氧化物質來獲得，而單獨通過開發新的物質組合可以獲得一種即使在低濃度也會產生 的協同效應。
因此，本發明的目的是提供一種混合物質，包括褪黑素和至少一種添加物質，該物質 選自免疫抑制物質和抗氧化物質。
尤其是，本發明的目的是提供一種混合物質，包括褪黑素、至少一種免疫抑制物質 和至少一種抗氧化物質。
本發明的第二個目的是提供上述混合物質用于制備治療皮膚組織和皮膚附屬物的自 然衰老和光老化問題的藥物的用途。
本發明的第三個目的是提供一種化妝品成分，包括作為活性成分的根據權利要求1 至4之一所述的混合物質，賦形劑，藥學上可接受的佐劑和添加劑。
本發明的進一步目的是提供一種制備本發明所述的成分的方法，以及同一混合物質的 用途。
附圖簡要說明
圖1顯示了在褪黑素與抗氧化劑和免疫抑制劑混合物刺激下纖維原細胞的生長值。
圖2顯示了對于UVA/UVB照射的ATP保護。
圖3顯示了在纖維原細胞培養物中膠原質產生的增加。
圖4顯示了對志愿者的血液用抗氧化劑和免疫抑制劑預處理后的淋巴細胞的IL-8檢
圖5顯示了在對面部皮膚的每天兩次處理的60天后，對患有皮膚干燥的人的皮膚水 合程度檢測。
圖6顯示了在面部皮膚的每天兩次處理的60天后，對患有皮膚干燥的婦女的皮膚表 面脂質檢測。
圖7顯示了在患有皮膚干燥的婦女的手臂皮膚上檢測的脂質過氧化物的濃度(3次評 估的平均值)
圖8顯示了在喂食富含抗氧化劑和免疫抑制劑的裸鼠的皮膚上檢測的脂質過氧化物的濃度，該裸鼠經受25 J/cm2 UV-AB的單獨照射。
圖9顯示了以不同的抗氧化劑和免疫抑制劑在(R16)黑素細胞生長上產生的褪色活性。
圖10報告了在以褪黑素富集抗氧化劑和免疫抑制劑進行局部治療(每天兩次治療的 60天)后重長的每cn^的毛發的平均數量。
圖11報告了在以褪黑素富集抗氧化劑和免疫抑制劑進行局部治療(每周兩次治療的 60天)后重長的每cr^的毛發重量的增加。
本發明的詳述
本發明是基于抗氧化物質的聯合的用途，該物質包括褪黑素，作為精選的抗氧化劑， 以及補充的(整合的)褪黑素的抗自由基活性，以及其他抗氧化劑和/或免疫抑制物質的活性。
己瞄準由褪黑素帶來的活性，最重要的是在羥氫氧基(OH—)的中和作用，雖然它也 能中和單個氧。需要指出的是，高親脂性分子能輕易地穿透細胞膜，到達所有細胞位點。
褪黑素活性可以通過其他抗氧化物質來調控和增強，這樣加強了它的抗老化和抗光老 化活性，顯著減少了自由基形成，因而改善了包括皮膚和毛發的外觀。
抗氧化物質可選自類胡羅卜素，諸如硫辛酸和維生素C等水溶性抗氧化劑，諸如維
生素E、維生素A或它們的混合物等脂溶性抗氧化劑。優選地，抗氧化劑混合物是P-類胡 羅卜素、葉黃素和/或硫辛酸，含有或者不含有維生素E、維生素A和維生素C以及它們 的衍生物與輔酶QIO。
類胡羅卜素是高親脂性分于，由單個氧基(02— )中和，雖然也非常容易與過氧化氫基 (OH+)反應。任意類型的類胡羅卜素都可用于木發明所述的聯合體，例如，IJ-胡羅卜素、 葉黃素、玉米黃質、番茄紅素、花青素、類黃酮和其他可從水果汁中獲得的多酚，例如蘋 果、草莓、粉紅橙、山楂等的汁。
a-硫辛酸也是一種強的天然抗氧化劑，能中和和去除ROS和NOS，它也具有在脂中 和在水中的雙溶性。實際上，它的兩性分子特性使它可以在細胞內側和外側進行作為抗氧 化劑，在線粒體水平，在細胞外空間。
最后，本發明所述的混合物質的必要組分是免疫調控/免疫抑制物質，通過加強有機體 的有機防御與抗氧化劑的直接作用的相互作用，以協作效應刺激它們的活性，如實驗部分所示例。優選的免疫調控/免疫抑制物質是滲透壓調節因子ectoine、 B-葡聚糖、羧甲基JJ-葡聚糖和鋅甲基吡啶(局部用)以及其他鋅的口服衍生物，例如乳酸鹽、葡糖酸鹽、甲基 吡啶；氨基糖，例如葡糖胺，尤其是N-丁基-葡糖胺以及它的同類物；肉毒堿和它的衍生 物(Bagchi D, Bagchi M, Stohs SJ et al. (2000) Toxicology 148: 187-197; Reiter RJ (1998) Nutrition 14: 691-696.)。
優選的組合是由兩個成分組成，例如褪黑素和硫辛酸；褪黑素和fi-胡蘿卜素；褪黑 素和滲透壓調節因子ectoine;褪黑素和fi-葡聚糖；或者由三個成分組成，例如褪黑素、 B-葡聚糖和B-胡蘿卜素；褪黑素、滲透壓調節因子ectoine和硫辛酸；褪黑素、葉黃素和fi-葡聚糖。在任何組合中，任何單一成分都能被同類型的兩個或更多的物質來取代，例如， fi-葡聚糖可由羧甲基fi-葡聚糖來取代或者補充。總的來說， 一種組合可同時包含葉黃素、 硫辛酸和/或J3-胡蘿卜素，或者同時包含滲透壓調節因子ectoine、 B-葡聚糖和/或羧甲基13-葡聚糖，舉例來說，某組合包含褪黑素、葉黃素、！5-葡聚糖和滲透壓調節因子ectoine， 該組合可能有利于被采用。
而且，在所有這些組合中，硫辛酸可被維生素所取代或補充，例如維生素A、 C、 E， 生育三烯酚和輔酶QIO。
本發明所闡明的這些組合是包括適用于化妝品或者治療藥物的用途，用于局部或系統 的用藥，尤其是用于皮膚表面用藥或者經皮用藥，皮內或者皮下注射用藥。局部應用的成 分是采用以下形式溶液、洗液、乳膏、乳劑、凝膠、噴霧劑、泡沫劑、薄膜，每種形式 都可直接應用在皮膚上或者應用在皮膚附屬物上。可選地，本發明上面所述的配方的組合
可以被吸附在以下支持體上織物、面罩、膏藥、合成支持物或者用于皮膚表面應用的其 他裝置。同樣，用于口服的成分可采用以下形式溶液、乳劑或者固體劑型，例如片劑、 硬膠囊、軟膠囊、粉末或者凍干顆粒。
用于皮內或皮下的成分可以采用以下形式雙蒸水溶液、含有或不含有緩沖液的生理 鹽水溶液。
乳劑可以是O/W (油/水)、W/O (水/油)、W/O/W (水/油/水)或者O/W/O (油/水/ 油)，更好的是用微觀的納米乳劑或宏觀的納米乳劑，但也采用分散劑或膠質溶液。可應
用的微膠囊可以是凝膠、乳膏、機械氣態噴霧劑，也可以泡沫劑形式提供。這些乳劑的
制備可采用所有已知的表面活性劑，例如硅樹脂、配糖物和磷脂等。因為皮膚屏障阻礙了 任意親水性物質和親脂性物質的輸送，人們對能便于經皮穿透的裝置是非常感興趣的，包括制藥上和化妝品上，都落入本發明的范圍。例如，已經觀察到，殼質納米纖維的平均尺 寸是約240 nm時，它能容易地攜帶中小分子大小的物質穿透皮膚層，例如，抗氧化劑中 的褪黑素、葉黃素，或者免疫抑制劑中的滲透壓調節因子ectoine。因此，在一個可選的實 施例中，本發明所述的混合物質的組分可被吸收或通過離子鍵連接到殼質納米纖維，以便 形成它們皮內穿透的能力，并增加它們的生物利用度。這里所采用的殼質納米纖維在文獻 (WO-A-2006/048829)中有描述。
依據木發明，褪黑素的使用劑量范圍是從0.005 mg至10 mg每劑量單位，每os或局 部用藥的均一用量，優選地是從0.005 mg至1 mg通過局部用藥，以及1至6mg通過口 服用藥。
在所述組合的褪黑素和任意免疫抑制物質之間的重量比是在1:0.005至1:1的范圍，直 至1:50的范圍，對于單獨采用的單一組分或者與其他同一類型的組合中。
各種維生素可以加入的濃度范圍是從5至100 mg每劑量單位或每份，單獨加入和/或 混合加入。
總的來說，在褪黑素、免疫抑制劑和抗氧化劑之間的有效地重量比是對于1 mg褪 黑素，免疫抑制劑是從0.005 mg至50 mg，抗氧化劑是從0.005 mg至50 mg。
在所述混合物質的實施例中，褪黑素/|3-胡蘿卜素/p-葡聚糖/維生素E的組分之間的優 選重量比是用于局部應用時，為0.5mg/0.005mg/0.5mg/0.5mg;而用于口服時，為 5mg/7.5mg/1 Omg/1 Omg 。
皮下或皮內注射時，優選的重量比為0.5 (褪黑素)0.05 (免疫抑制劑)0.05 (抗氧 化劑)0.5 (水溶性維生素)，其中，(3-胡蘿卜素可以與硫辛酸同時放入，而維生素E可以 與維生素C及其衍生物和/或其他水溶性維生素同時放入。
本發明所述混合物質帶來的強抗氧化作用，能減少ROS產生，包括在體內水平(血清) 與局部皮膚水平。通過減少自由基，獲得以下效果增加皮膚水合度和彈性，調節皮膚表 面脂質層，減少皮膚粗燥度，也使所謂老年斑褪色，改善了在毛發生長周期中的生長期/ 停止期(anagen/catagen)的比率。實際上，這些混合物的應用也能調節毛發的更新階 段，解決由于病理原因而減少毛發，諸如以下多種形式禿頭癥，或者減少或中斷的毛發， 由于壓力或不同環境因素造成毛發重量和數量減少的情況。
正如表l-9所著重指出的，所有采用的抗氧化劑都是對保護細胞免受自由基引起的損 害特別有效的，因而改善了它們的增殖。尤其是，硫辛酸和類胡蘿卜素(!3-胡蘿卜素和葉黃素)還能增強褪黑素的正效應。在后面所述的試驗中，硫辛酸顯得比類胡蘿卜素更有活 性。類似地，也可能以不同機制，免疫抑制劑也能增強褪黑素的作用。在我們的實驗條件 下，免疫抑制劑JJ-葡聚糖看來是比滲透壓調節因子ectoine更有活性。
這樣，從獲得的細致檢測結果中可以表明，濃度相等的，抗氧化劑，例如硫辛酸和類 胡蘿卜素，以及免疫抑制劑，例如fi-葡聚糖、羧甲基fi-葡聚糖和滲透壓調節因子ectoine， 看來具有與作為協同劑的褪黑素的抗氧化作用類似的活性。實際上，已經觀察到，濃度相 等的，包括抗氧化劑和免疫抑制劑，分別與褪黑素以雙組分形式來應用，可產生比褪黑素 作用更強的協同效應。
最后，在這些表中所觀察到的和報道的結果表明，褪黑素、免疫抑制劑與抗氧化劑的 三重組合，更為顯著地增加了所產生的協同效應，即使單個組分在低濃度的情況下。
這樣，舉例來說，通過3mg褪黑素所實現的活性已證明會低于以下組合的類似活性 1 mg褪黑素，1 mg免疫抑制劑(滲透壓調節因于ectoine或者IJ-葡聚糖)與1 mg抗氧化 劑(li-胡蘿卜素、葉黃素、硫辛酸、維生素C、 E和A，以及輔酶QIO)。僅根據這些令人 驚喜的結果，我們進行了一項研究，以便核實根據本發明所述的混合物質在毛發生長周期 的影響。實際上，明顯影響了毛發生長階段，應對特別的不同的挑戰。
因此，可以通過示例說明，木發明所述的這些組合也能在毛發生長周期的生長階段發 揮出令人驚喜的協同效應。
最后，通過在神經細胞培養物作為實驗模型上進行的初步試驗證實了，抗氧化劑的濃 度必須小心的提高以避免毒性效應。通過木發明所進行的以下研究，已經表明，毒性會與 單一活性物質的濃度成正比例增加，而當以低濃度的雙組分所獲得相同的末端效應時，毒 性的增加非常緩慢。實踐上，單一的3-mg劑量的褪黑素單獨使用，巳證實會產生比褪黑 素、類胡蘿卜素和免疫抑制劑各l-mg劑量的聯合使用更大的毒性。
實驗部分
體外活性
在纖維原細胞上的實驗
正如已知的，真皮是指皮膚的基礎和支持部分。真皮的乳突部分包含大量的膠原質纖 維和彈性纖維，使賦予皮膚堅固和彈性所需的部分。在乳突狀真皮中包含大量的纖維原細 胞，該細胞是指派用于這些纖維的持續產生。皮膚老化導致真皮變薄，以及纖維原細胞的 質量和數量的減少，從而不能有效地產生這些纖維。這樣，通過檢測單獨采用褪黑素在纖維原細胞生長上的影響，以及檢測聯合采用褪黑素、抗氧化劑和免疫抑制劑在纖維原細胞 生長上的影響，來揭示有關效應。 方法
采用纖維原細胞的NB1RGB細胞株(2xl05cell/ml)，放入10個陪替氏培養皿，在添 加a-MEM的培養基(包含10%小牛血清(FBS)、 100單位/ml青霉素和lOOpg/ml鏈霉素) 中培養。
分別加入以下不同的培養物
(1)褪黑素；
(2)褪黑素、硫辛酸；
(3)褪黑素、p-胡蘿卜素；
(4)褪黑素、滲透壓調節因子ectoine;
(5)褪黑素、fi-葡聚糖；
(6)褪黑素、(3-胡蘿卜素、B-葡聚糖；
(7)褪黑素、硫辛酸、滲透壓調節因于ectoine;
(8)褪黑素、葉黃素、！3-葡聚糖；
而另2個培養皿留作對照。所有產品的添加濃度為1 ^g/ml。
所獲得的實驗結果報道在表l (圖l)中，顯示對應于控制值得細胞增殖百分比。 再生活性
皮膚再生過程在年青人和在健康皮膚中是非常有效的，但隨著年老而逐漸降低。外部 的影響諸如壓力，失眠、空調、正常細胞流轉的減少。
這個現象也會對皮膚的總體老化起作用，它可通過不同方法檢測到，例如，通過評估 不同新陳代謝過程所需的能量，該能量以ATP的形式儲存。
ATPasic活性的控制
所有生化過程都需要能量，該能量是以ATP (三磷酸腺苷)形式積聚的。因此，在角 化細胞的培養物上照射4J/cm2 UVA+ 04 J/cm2 UVB，再檢測其ATP，與未照射的角化細胞， 以及加入待研究產品的角化細胞進行比較。當然，輻射導致ATP的猛降。
在采用的9個含有培養物的陪替氏培養皿之中，8個添加了 1 )ig/ml的1%不同待測物 質，另一個培養皿作為對照。
實驗結果報道在表2中，顯示每個培養皿中ATP存量的殘留。對膠原質合成的刺激
對于ECM (細胞外矩陣，extracellular matrix)結構，連續的和規則的膠原合成是至關 重要的，因而用于增強皮膚彈性和致密性，減少皺紋。膠原1的存在是采用特定抗體在所 有IO個細胞培養物上證實的，其中8個為富含l%)Lig/ml的不同物質，這些物質直接加入 培養基中，另一個作為對照。
實驗結果報道在表3中，顯示膠原相對于對照值的增加的百分數。
體內活性
IL-8對照
外部侵犯引起免疫反應，通常伴隨炎癥反應。當這些反應是異常時，會出現異常級和 炎癥前介質的相關產物。
白介素8 (IL-8)是對于炎癥狀態的持久最負有責任的介質(Zheng M, Sun G Mrowietz U. (1996) Exp dermatol 5(6) 334-340)。
實驗方案
選擇10個患有遺傳性過敏癥的皮膚丁燥的志愿者，年齡在15至20歲。
采集血樣，之前補充和不補充研究中的組分(1 ^g/ml)，分別加入IO個陪替氏培養皿， 其中8個還補充10lag/ml腫瘤壞死因于a (TNF-a)，另一個留作對照。TNF-a的添加導致 IL-8產生的明顯增加，而木發明所述的物質或組合可減少該增加。IL-8量是通過特定的抗 體由分光光度計來測定的。
所獲得的實驗結果報道在表4，顯示了自由IL-8相對于對照值的相對量。
過氧化氫物對照
皮膚表面脂質對于環境中的有氧攻擊是敏感的，和/或由內生過程導致，引起脂質過氧 化物的形成。
這些化合物可被中和，或避免它們的形成，用于化妝品和/或食品添加劑，完成抗氧化 活性。
在皮膚特性上的標準以下的研究的影響 實驗方案
選擇一組30名婦女志愿者，年齡在25至35歲，患有皮膚干燥，都分別進行雙盲條 件下的兩種不同類型的乳劑的用藥，在左臂與在右臂輕按摩，早晚各一次，以及在面部的 兩個半區輕按摩。這兩種乳劑，包含在不同顏色的管內，用于60天的療程。其他10名婦女給予對照品 (攜帶者獨自)，該對照品標注為數字l (褪黑素)。 在檢測時，進行+60天，治療組又分為以下組 組l (30名婦女)
10名婦女用產品2 (褪黑素和硫辛酸)和產品3 (褪黑素和J3-胡蘿卜素)治療； 10名婦女用產品4 (褪黑素和滲透壓調節因子ectoine)和產品5 (褪黑素和fi-葡聚糖) 治療；
10名婦女用產品6 (褪黑素、J3-胡蘿卜素和！5-葡聚糖)和產品7 (褪黑素、硫辛酸和
滲透壓調節因子ectoine )治療；
組2 (IO名婦女)作為對照，用產品l (褪黑素)來治療。 在檢測過程中，皮膚表面脂質和水合程度是通過3C系統來證實的。 所獲得的結果報告在表5和表6中，顯示了相對于理論參考值，皮膚水合程度的增加
百分數，以及皮膚脂質的增加百分數。 脂質過氧化物
月旨質過氧化物是以Pugliesi方法(Pugliesi P. (1990) Assessment of Antiaging Products. In: W.C. Wagguner Clinical Safety and Efficacy Testing in Cosmetics, Marcel Dekker Inc., NY, PP 306-309)來檢測的，通過采用丙二酰醛(MDA)來確定這些衍生物的存在。
所獲得的結果報告在表7中，顯示了在皮膚上發現的脂質過氧化物的值的減小。
在裸鼠上的脂質過氧化物
100只裸鼠(HRS/J)受到所述治療，分為10組，每組10只，喂標準的鼠食，預先添 加0.8 mg/Kg的不同混合物，有抗氧化劑和免疫抑制劑組成，編為號碼1至9，除了對照 以外。這個實驗的目的是評估在口服時這些化合物的保護活性。
規則喂食60天的小鼠，在麻醉狀態下進行福射， 一次25 J/cm2 (約10MED)。 在輻射后，立即從被輻射的側部區域與未經輻射的中間區域移除皮膚。隨后提取并檢 測，恢復到T狀態的剩余物再次溶解在甲醇/乙醇(1:1)中。經HPLC分離的脂質過氧化 物是由化學發光法測量的。(Jamamoto Y， Brodsky MH, Baker JC and Ames BN (1987) Anal. Bioch. 160.7-13)
所獲得的結果報告在表8中，顯示脂質過氧化物的在輻射后的濃度。由本發明所述的 物質的組合所產生的保護效應是明顯的。體外褪色活性(老年斑)
本發明所述的混合物質產品的任何褪色活性是通過在B16黑素瘤細胞(5x10 cell/ml) 上證實的，該細胞懸浮培養在MEM培養基(10% FBS， 1000 I.U./ml青霉素和100 pg/mg 鏈霉素)中，該培養基包含2 mM teophylline。該懸浮液分為7個500 |al的部分。對于每 個部分，適當隔開放置，加入50pg/ml的不同活性組分的混合物。對每種混合物，制備了 6個樣品。
培養后，加入300 )al PBS，然后將所有樣品以超聲波破碎。高或低的黑色素是通過 415-nm分光光度計來檢測的。本發明所述的組合導致黑色素形成的降低。 所獲得的平均結果報告在表9中，顯示相對于對照值的百分數值。 在毛發生長周期的生長階段的作用
毛發纖維是在生長期(anagenphase)產生的，以約1 cm/月或0.35 mm/天的速度延長， 在停滯期(telogen phase)脫落。該生長期通常持續2到6年，而停滯期每次3個月，中間 的停止期(catagen)每次3周。該周期總體上類似地發生在所有頭皮區域。由于諸如實際 病理問題或者環境誘因，或者經受太多經常性壓力的生活方式，該生長周期都會發生改變， 伴有掉發，因而減少了毛發數量和厚度。
參照我們以前的經驗(Morganti P， Fabrizi G James B and Bruno C. (1998) J. Applied Cosmetol. 16: 57-64)，我們希望檢測由活性成分的溶液(毛細管洗液)完成的活性實驗， 已經部分地采用，通過采用研究中的抗氧化劑和免疫抑制劑，活性能被增強或改善。
上述洗液是來自鋸葉棕櫚的活性成分，非常適用于雄性禿頭癥的形式。這種新洗液看 來更適用于所有那些脫發的形式，由外傷或化學原因引起的禿頭癥。另一方面，通過考慮 的抗氧化劑和免疫抑制劑，可提供特殊活性，該溶液被證實有助于增強頭皮，因而改善了 毛發的光澤，發體抗拉性，外傷的治療例如褪色，褽平或燙發。
實驗方案
30個志愿者(15名女人和15名男人)，患有以下頭發問題輕微變薄、變薄、頭發 的持續脫落，以及禿頭癥的偶然形成，限制在頭皮區域，都送去治療。
通過皮膚學者的專家檢測，禿頭癥的形式幾乎肯定是由于以下形式受檢對象的心理 -生理壓力，在月內小心選擇，進行前面所述的測試。
在雙盲條件下，給出的所有對象，早、晚各以輕按摩方式施用所述洗液，在不同區域
上澆上5/6滴，確信足夠用于整個頭皮的治療。所用的3種洗液，分別用字母A (基礎攜帶者)、字母B (添加褪黑素的攜帶者)、字 母C (添加褪黑素、P-葡聚糖、滲透壓調節因子ectoine和葉黃素)來標注。 本研究持續了60天。
在第O天，在頭皮的頂前區中，有約lcm2的區域被劃出，在該區域的頭發被小心地 移除。移除的頭發經稱量以便證實質量是加重的，毛囊的數量也可通過合適的網格來計算。 在第60天，重新長出的頭發的數量和重量都進行再評估，再次檢測毛囊的數量。 所獲得的平均結果報道在表10和表11中。
正如通過表10和表11的比較獲得更清楚的證據，褪黑素是己知的(Fischert, Wigger-Alberm W， Eisner P (1999) Hautarzt 50 (1):5-11 )可導致頭發的生長期增加，因而加 強了它的再生長，不會在頭發重量上發揮效用，因而在它的體積上發揮效用。
與之相反，添加到溶液中的抗氧化劑和免疫抑制劑不僅可導致在頭發再生上的更大增 強效果，而且影響了頭發的體積，因而發體也改善了。
實際上，所有用洗液C治療的對象注意到這個現象，并聲稱他們非常滿意該實驗的治療。
褪黑素、葉黃素、ECTOINE的組合在納米結構的殼質的皮膚異常的評估
為實現木評估的目的，采用殼質的納米纖維的等比(1:1)雙重混合物，含有褪黑素和 葉黃素或滲透壓調節因于ectoine。
已知量(lmg)的晶體葉黃素被溶解在50ml有機溶液(氯仿)中，同樣量(lmg) 的殼質納米纖維被加入到溶液中。所產生的懸浮液經機械攪拌，經超聲波降解約2小時。 接著，以Buchner過濾器經真空而過濾。
在過濾器上殘留的黃-紅-著色的濾出物，構造在由葉黃素結合的殼質納米纖維上，在 掃描電鏡(SEM)下檢測。該溶液的剩余物經真空干燥，產生另外的紅色結晶物質，證實 為葉黃素、納米纖維和葉黃素結合的納米纖維的混合物。通過重量差異測量，可觀察到， 葉黃素的20至30%保留結合在納米纖維上。
重復該步驟，通過混合產生的混合物中包含2%褪黑素或滲透壓調節因于ectoine，都 是水溶性的，帶有2%殼質納米纖維懸浮物，獲得終濃度為1%的兩種活性劑。該懸浮物也 可經機械離心，經超聲波降解2小時。經真空過濾后，對這些樣品進行理化性質的檢測。
重復該實驗，所用溶液包含三種成分(褪黑素、葉黃素和滲透壓調節因子ectoine)， 分別在不同濃度，從0.1至0.9%，通常達到納米纖維與活性成分之間的穩定結合。這樣，所產生的這些混合物接著被制成乳劑(純水溶液+溶性的)，并涂敷在脫毛小鼠 上，證實它們的穿透吸收性。 這樣，可以發現
a) 殼質-活性成分復合物能穿透皮膚；
b) 殼質納米纖維不會損害細胞，細胞保持正常的生理狀態；
c) 這種類型的結構便于各種分子的轉送穿透，包括脂溶性分子和水溶性分子，也可作 為用于根囊泡(發干)細胞的刺激。
后面的意想不到的結果表明，當本發明所述混合物質以納米結構的殼質的復合物形式 注射時，這些混合物質加強了對毛發生長周期的刺激作用。 結論
從所有在體外和體內進行的實驗可清楚地證明，抗氧化劑，例如類胡蘿卜素(fi-胡蘿 卜素和葉黃素)和硫辛酸，以及免疫抑制劑，例如滲透壓調節因子ectoine和B-葡聚糖， 顯著增強了褪黑素的生物保護活性。抗氧化劑和免疫抑制劑的混合物產生了調控褪黑素的 效應，具有高的協同作用，使褪黑素更有效。因此，上述的混合物在皮膚上實現了令人感 興趣的抗衰老和抗光衰老的作用，加強了它對于外因的和內因的侵犯的防御機制，也使得 常見的毛發問題得到有效地解決，這也是令人感興趣的。
權利要求
1、一種混合物質，包括褪黑素和至少一種添加物質，該物質選自免疫抑制物質和抗氧化物質。
2、 根據權利要求1所述的混合物質，包括褪黑素、至少一種免疫抑制物質和至少 一種抗氧化物質。
3、 根據權利要求1或2所述的混合物質，其特征在于，所述的免疫抑制物質是選自.-滲透壓調節因子ectoine、 fi-葡聚糖、羧甲基J3-葡聚糖、葡糖酸鹽、乳酸鹽和鋅甲基 吡啶，而所述抗氧化物質是選自類胡羅卜素、多酚、硫辛酸、維生素A、維生素C、 維生素E、生育三烯酚和輔酶QIO。
4、 根據權利要求3所述的混合物質，其特征在于，所述的類胡羅卜素是選自13-胡羅卜素、葉黃素、玉米黃質、番茄紅素、花青素、類黃酮和多酚。
5、 根據權利要求1至4之一所述的混合物質用于制備治療皮膚組織和皮膚附屬物 的自然衰老和光老化的藥物的用途。
6、 根據權利要求5所述的混合物質，所述的治療包括再生，水合和增加皮膚組 織的彈性，使皮膚衰老斑點即老年斑褪色，推進毛發生長周期。
7、 一種化妝品成分，包括作為活性成分的根據權利要求1至4之一所述的混合 物質，賦形劑，藥學上可接受的佐劑和添加劑。
8、 根據權利要求7所述的成分用于局部用藥，或者口服、皮下用或者皮下注射。
9、 根據權利要求7所述的成分，該成分是在以下形式溶液、膠質溶液、洗液、乳劑、宏觀的納米乳劑或微觀的納米乳劑、分散劑、凝膠、噴霧劑、泡沫劑、薄膜、面 罩、片劑、硬膠囊、軟膠囊、粉末、顆粒劑、凍千劑。
10、 根據權利要求7至9之一所述的成分，其特征在于所述混合物質的至少一個 組成物質是吸收或凝固在殼質納米纖維上的。
11、 根據權利要求7至10之一所述的成分，其特征在于褪黑素的用藥或注射的 單一劑量是在1 mg至10mg的范圍。
12、 根據權利要求11所述的成分，其特征在于在褪黑素和免疫抑制物質之間的 重量比是在1:0.005 mg至1:50 mg的范圍，而在褪黑素和抗氧化物質之間的重量比是在 1:0.005 mg至1:50 mg的范圍。
13、 一種制備根據權利要求7至12之一所述的成分的方法，包括以下步驟將褪 黑素與每種組分物質以1:0.005 mg至1:50 mg的重量比混合，并混合適當的化妝品上可 接受的賦形劑。
14、 根據權利要求1至6之一所述的混合物質的以下用途改善皮膚水合性和彈性， 調節皮膚表面脂質薄膜，減少皮膚粗糙程度，使老年斑褪色，以及改善在毛發生長周期 中的生長期/停止期的比率。
全文摘要
本發明涉及褪黑素和其他活性物質和化妝品成分的協作聯合，適用于治療所有那些導致或伴隨皮膚、毛發和其他組織老化的表現形式。尤其是，本發明是基于褪黑素與免疫抑制的和抗氧化的物質的聯合，明顯增強了它的抗衰老活性，顯著降低了自由基形成，因而改善了包括皮膚和毛發的外觀。
文檔編號A61Q19/00GK101431997SQ200780015524
公開日2009年5月13日 申請日期2007年3月2日 優先權日2006年3月3日
發明者皮爾佛朗西斯科·摩爾甘蒂 申請人:馬威蘇德公司