專利名稱：能提高黑色素細胞中谷胱甘肽比率的化合物在治療灰發癥中的用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及能提高毛囊黑色素細胞中谷胱甘肽(GSH)比率的化合物在治療灰發癥中的化妝用途。
毛囊是一種表皮的管狀疊套，它進入深處直到真皮的深層。其下部，即毛球本身包括一個真皮乳頭處在其中的疊套。該乳頭下部是細胞增生區，其中有構成頭發的角質化細胞前體。來自這些前體的細胞上升時在該乳頭上部逐漸地被角質化，這種角質化細胞集合將構成毛發桿。
頭發與體毛的顏色主要基于以不同量與比存在的兩組黑色素真黑素(褐色和黑色顏料)和phéomélanine(紅色和紅色顏料)。頭發和體毛著色需要在毛囊乳頭處有黑色素細胞。這些黑色素細胞處于活性態，即它們合成黑色素。這些顏料轉移到用于構成疊桿的角化細胞，這樣導致長出著色頭發或體毛。這種結構在下面稱之“著色的囊單元”。
在哺乳動物中，該黑素生成涉及至少三種酶酪氨酸酶、多巴色素互變異構酶(TRP-2，與酪氨酸酶相關的蛋白2)和DHICA氧化酶(TRP-1，與酪氨酸酶相關的蛋白1)。
該酪氨酸酶是引發生物合成黑色素的酶。它也被描述是黑素生成的限制酶。
TRP-2催化DOPA色素互變異構化成5，6-二羥基吲哚-2-羧酸(DHICA)。沒有TRP-2時，DOPA色素進行自發的脫羧作用，生成5，6-二羥基吲哚(DHI)。
DHICA和DHI是兩種顏料前體，TRP-1氧化DHICA分子，生成醌衍生物(Pawelek JM和Chakraborty AK，“黑素生成酶學”。在Nordlund JJ，Boissy RE，Hearing VJ，King RA，Ortonne J-P.“顏料系統生理學和病理生理學”。New YorkOxford university press；1998.p.391-400)。
特別出現了在黑素生成中涉及的這三種酶，酪氨酸酶、TRP-2和TRP-1。此外，曾將這三種酶的活性描述是真黑素生物合成最大活性必不可少的。
頭發和體毛經受循環。這個循環包括生長期(毛發生長初期)、變性期(毛發生長中期)和休止期(毛發生長終期)，其后將出現新的毛發生長初期。由于這個毛發循環，并且與表皮的著色單元相反，該著色的囊單元也應該循環地重新開始。
該灰發癥(頭發的自然變白)與頭發黑色素細胞特別逐漸地稀化相關，因此同時影響毛球的黑色素細胞和黑色素細胞的前體細胞(Commo等人，《Br J Dermatol》，2004；150435-443)。不影響在這些毛囊中存在的其它類細胞。另外，這種黑色素細胞稀化在表皮中沒有觀察到。直至今天還沒有確定在這種毛囊中黑色素細胞和黑色素細胞前體特別逐漸稀化的原因。
為了對抗該灰發癥，因此顯然有必要對抗人的毛囊黑色素細胞的消失，即同時影響這些乳頭活性黑色素細胞和毛囊上部的休止黑色素細胞的過程。
本申請人已經描述了通過對酶TRP-2起作用對抗頭發變白的辦法(WO 03/103568)。
申請人現在令人驚奇而又出乎意外地發現，酶TRP-2的表達是與GSH表達相關聯的，事實上，TRP-2表達誘發GSH在這些黑色素細胞中的比率增加。
因此，已證明在這些沒有表達TRP-2的黑色素細胞(例如，這些頭發黑色素細胞前體)中，GSH的比率與表達酶TRP-2黑色素細胞(例如，所有頭發的黑色素細胞)相比是低的。
于是，本申請人現在確定了治療灰發癥的新靶物，本申請人已證明，能提高GSH在黑色素細胞中的比率的這些化合物，與在文獻中所描述的脫色作用相反，將導致恢復頭發著色。
考慮提高GSH在黑色素細胞中的比率的這些已知化合物，例如硫辛酸和氫化香豆素，(Yamamura等人，2002，Lin等人2002)被描述是限制黑色素合成的劑，因此降低皮膚著色，與GSH不利于黑色素合成的結論一致(Del Marmol等人，1993，Jara等人1988)這個事實，這種用途具有特別令人驚奇的特性。
因此，本發明的目的涉及能提高GSH在毛發黑色素細胞中的比率的化合物作為能夠防止、限制或停止灰發癥發展，和保持和/或促進頭發和/或體毛自然再著色的劑的用途。
特別地，本發明的目的涉及能提高GSH比率的化合物在防止和/或限制和/或停止灰發癥發展中的用途。
這些能提高GSH比率的化合物例如是誘發合成GSH的化合物或限制其消耗的化合物，它們可以具體地采用下述方法進行鑒定a-培養黑色素細胞，例如像在Commo等人文章《Pigment CellRes》，2004，17488-497中描述所得到皮膚或頭發黑色素細胞的初步培養。
b-往培養介質添加希望試驗提高GSH比率性能的化合物。
c-黑色素細胞培育時間足夠長，以便有可使該化合物成為活性的。
d-測量GSH比率。
e-選擇提高GSH比率的化合物。
在鑒定提高GSH比率的化合物的方法特別實施方式中，這些細胞培養在37℃與5％CO2的培養箱(étuve)中進行.。
特別地，步驟(a)可以按照下述方案進行在J0用介質M2(PromoCell，Heidelberg，D)接種這些黑色素細胞。例如可涉及如在Commo等人文章《Pigment Cell Res》，2004，17488-497中描述所得到皮膚或頭發黑色素細胞的初步培養。
處理前讓這些細胞在這種培養介質中保持12-72小時。
步驟(b)可以按照下述方案進行這些黑色素細胞在培養時使用希望試驗提高GSH比率性能的化合物進行處理，其處理時間必需達到讓它們顯示出這些性能，這個時間一般是12-72小時。
測量GSH比率的步驟(d)例如可以采用HPLC方法進行。在這種測量的特別方式中，從培養與處理細胞中提取的游離氨基酸(AA)采用氨基酸自動分析儀HITACHI L-8500進行分析。以這種方式，這些游離氨基酸使用離子交換柱與使用鋰鹽基洗脫劑進行分離，然后，在茚三酮反應后采用比色法進行定量。
采用熒光法，使用細胞內GSH的熒光探測器，例如像Monochlorobimane(Molecular Probes，USA)，也可以進行GSH定量。
或者使用商品試劑盒，例如比色法分析的Bioxytech GSH-400試劑盒(Calbiochem，USA)，也可以進行GSH定量。
本發明的目的還涉及能提高GSH比率的化合物在保持灰色頭發和/或體毛自然著色中的用途。
能提高GSH比率的化合物特別可以選自硫辛酸、奧替普拉(oltipraz)、咖啡豆醇、咖啡醇、angelicalactone、二烯丙基硫醚、bensylisothyocyanate(Scharf G等人，《Nutr Cancer》，2003，45(1)74-83；Huber WW等人，《Environ Mol Mutagen.》2004，44(4)265-276；Sbeen LY等人，《Food Chem Toxicol》，1996，34(10)971-978；Gupta E等人，《Clin Cancer Res.》，1995，1(10)1133-1138)。
優選地，能提高GSH比率的化合物不應是N-乙酰基半胱氨酸，也不應是櫟素(quercitine)。
本發明的目的還是一種抗灰發癥的組合物，它含有在化妝上可接受介質中的至少一種如前面定義的能提高GSH比率的化合物，但N-乙酰基半胱氨酸和櫟素除外，與其并用的其它活性劑，該活性劑選自防頭皮脫屑狀態的劑和/或具有前-著色活性的植物提取物。優選地，能提高GSH比率的化合物選自硫辛酸、奧替普拉、咖啡豆醇、咖啡醇、angelicalactone、二烯丙基硫醚、異硫氰酸芐基酯(bensylisothyocyanate)。
本發明還涉及防灰發癥組合物，該組合物含有在化妝上可接受介質中的至少一種能提高GSH比率的化合物，該化合物選自奧替普拉、咖啡豆醇、咖啡醇、angelicalactone、異硫氰酸芐基酯(bensylisothyocyanate)，與其并用的有利于頭發再長出的劑。
本發明組合物中能提高GSH比率的化合物的量是以重量/體積計0.001％-10％，優選地以重量/體積計0.01-5％，更優選地以重量/體積計0.1-1％。
本發明組合物可以口服給藥或在皮膚(在體毛覆蓋身體的所有皮膚部位)和/或頭皮上局部涂敷。
口服時，本發明的組合物可以含有這種或這些能提高GSH比率的化合物，以在食用液體中的溶液，例如水溶液或水酒精溶液，任選地增加香味的溶液形式。還可以把它們加到口服固體賦形劑中，它們可以是例如顆粒、丸、片或糖衣丸劑型。它們還可以放在食用液體的溶液中，而該液體本身任選地包裝在口服膠囊中。
按照給藥方式，本發明的組合物可以是通常使用的任何蓋侖劑型，特別是在美容術中使用的任何蓋侖劑型。本發明的優選組合物是適合于在頭皮和/或皮膚上局部涂敷的美容組合物。
對于局部涂敷，本發明可使用的組合物特別可以呈洗劑或血清類水溶液、水酒精或油溶液或分散體劑型，或乳類液體或半液體稠度乳液劑型，這是將脂肪相分散在含水相(H/E)中或反之(E/H)得到的，或含水或無水乳油或凝膠類的柔軟稠度懸浮液或乳液劑型，或微膠囊或微粒劑型，或離子和/或非離子類泡狀分散體劑型。因此，它可以呈形式軟膏劑、酊劑、乳膏、膏、粉劑、timbre、浸透緩沖劑、溶液、乳液或泡狀分散體、洗劑、凝膠、噴灑、懸劑、洗發劑、氣溶膠或泡沫劑型。它們可以是無水的或含水的。它還可以由構成肥皂或清潔膏的固體制劑組成。這些組合物是按照通常的方法制備的。
本發明可使用的組合物可以特別地是毛發護理組合物，尤其是洗發劑、卷發洗劑、處理洗劑、發乳或發膠，任選地呈染色洗發劑形式的染色組合物(特別是氧化性染色)，頭發、面罩的再結構化洗劑。
本發明的化妝組合物優選地是乳膏、毛發洗劑、洗發劑或護發劑。
本發明可使用組合物不同組分的量是在所考慮范圍內通常使用的量。
本發明可使用的組合物是乳液時，該脂肪相的比例可以是以該組合物總重量計5-80重量％，優選地5-50重量％。在呈乳液形式的組合物中使用的油、蠟、乳化劑和助乳化劑選自在化妝領域中通常使用的這些組分。乳化劑和助乳化劑在該組合物中的比例是以該組合物總重量計0.3-30重量％，優選地0.5-20重量％。該乳液還可以含有類脂泡。
本發明可使用的組合物是溶液或含油凝膠時，該脂肪相可以是該組合物總重量的90％以上。
在本發明的具體實施方案中，該組合物應是如此的，以致該能提高GSH比率的化合物封裝在糖衣中，例如微球、毫微球、油體或毫微膠囊，該糖衣應根據能提高GSH比率的化合物的化學性質進行選擇。
作為實例，可以根據專利申請EP 0 375 520中描述的方法制備這些微球。
這些毫微球可以呈含水懸浮液形式，并且可以根據專利申請FR0015686和FR 0101438中描述的方法進行制備。
這些油體是由在水中的含油乳液組成的，該乳液是由具有分散在含水相中的層狀液晶糖衣的含油微粒形成的(參見專利申請EP 0 641557和EP 0 705 593)。
該能提高GSH比率的化合物也能夠封裝在毫微膠囊中，該膠囊是由使用含硅酮表面活性劑得到的層狀糖衣組成(參見專利申請EP 0 780115)，還能夠制備以水分散磺酸聚酯為基的毫微膠囊(參見專利申請FR0113337)。
這種能提高GSH比率的化合物也能夠與陽離子含油微粒表面絡合，無論其尺寸如何(參見專利申請EP 1 010 413、EP 1 010 414、EP 1010 415、EP 1 010 416、EP 1 013 338、EP 1 016 453、EP 1 018 363、EP 1 020 219、EP 1 025 898、EP 1 120 101、EP 1 120 102、EP 1 129 684、EP 1 160 005和EP 1 172 077)。
最后，這種能提高GSH比率的化合物可以與具有層狀糖衣的毫微膠囊或毫微顆粒表面絡合(參見EP 0 447 318和EP 0 557489)，與在其表面含有陽離子表面活性劑的毫微膠囊或毫微顆粒表面絡合(參見前面關于陽離子表面活性劑所列舉的參考文獻)。
特別地，優選如此的組合物，裝有能提高GSH比率化合物的糖衣的直徑小于或等于10μm。該糖衣沒有形成球形囊，直徑應該理解是該囊的最大尺寸。
已知，本發明的組合物還可以含有在化妝領域中使用的常見添加劑，例如親水或親油的膠凝劑、親水或親油的添加劑、防腐劑、抗氧化劑、溶劑、香料、填料、防曬劑、氣味吸收劑和著色材料。這些不同添加劑的量是在化妝領域中通常使用的量，例如該組合物總重量的0.01-10％。這些添加劑按照其性質可以加到該脂肪相、含水相和/或類脂物小球中。
作為在本發明中可使用的油或蠟，可以列舉礦物油(凡士林油)、植物油(燭果油液體部分、向日葵油)、動物油(全氫角鯊烯)、合成油(Purcellin油)、含硅酮的油或蠟(環甲基硅酮)和氟化油(全氟聚醚)、蜜蜂蠟、巴西蠟棕石蠟。可以往這些油中添加脂肪醇和脂肪酸(硬脂酸)。
作為本發明可使用的乳化劑，可以列舉例如硬脂酸甘油酯、聚山梨酸酯60和Gattefosse公司以商品名Tefose63銷售的PEG-6/PEG-32/硬脂酸乙二醇酯混合物。
作為本發明可使用的溶劑，可以列舉低級醇，特別是乙醇和異丙醇，聚乙二醇。
作為本發明可使用的親水膠凝劑，可以列舉羧基乙烯聚合物(丙烯酸聚合物(carbomer))、丙烯酸共聚物，例如丙烯酸酯/烷基丙烯酸酯共聚物、聚丙烯酰胺；多糖，例如羥丙基纖維素；天然樹膠和粘土，作為親油膠凝劑，可以列舉改性粘土，如膨潤土；脂肪酸金屬鹽，如硬脂酸鋁，和疏水二氧化硅、乙基纖維素、聚乙烯。
這些本發明可使用的組合物可以將其它活性劑與至少一種能提高GSH比率的化合物并用。在這些其它活性劑中，作為實例可以列舉-調節皮膚細胞分化和/或增生和/或著色的劑，例如視黃醇及其酯、維生素D及其衍生物、雌激素，例如雌甾二醇、AMPc調節劑，例如POMC衍生物、腺苷，或毛喉萜及其衍生物、前列腺素及其衍生物、三碘羥碘苯基二碘酪氨酸鹽酸鹽及其衍生物；-植物提取物，例如鳶尾科或大豆提取物，即這時可以含有或不含有異黃酮的提取物；-微生物提取物；-抗自由基的劑，例如生育酚或其酯，超氧化物歧化酶或其模仿物，某些金屬螯合劑或抗壞血酸及其酯；-抗-脂溢，例如某些含硫的氨基酸、13-順視黃酸，乙酸去乙酰環丙氯地孕酮；-防頭皮脫屑狀態的其它劑，如鋅羥基吡啶硫酮、二硫化硒、克寧巴索、十一烯酸、酮康唑、羥吡酮(羥甲辛吡酮)或ciclopiroctone(環己吡酮乙醇胺)；特別地，可涉及刺激頭發再長出和/或有利于延緩頭發脫落的活性劑，更特別地可以非限制性地列舉-煙堿酸酯，其中特別是煙堿酸生育酚酯、煙堿酸芐酯和煙堿酸(C1-C6)烷基酯，如煙堿酸甲酯或己酯；-嘧啶衍生物，如在US 4 139 619和US 4 596 812專利中描述的2，4-二氨基6-哌啶子基3-氧化嘧啶或“Minoxidil”；在WO96/09048中描述的Aminexil或2，4-二氨基3氧化嘧啶；-有利于頭發再長出的脂肪氧合酶抑制劑或環氧化酶誘導物，如本申請人在歐洲專利申請EP 0 648 488中所描述的；-殺菌劑，例如大環內酯、吡喃糖苷和四環素，特別是紅霉素；
-鈣拮抗藥，如桂利嗪、尼莫地平和硝苯地平；-激素，例如雌三醇或類似物，或甲狀腺素及其鹽；-抗雄激素劑，例如oxendolone、安體舒通、二乙基己烯雌酚和氟他米特；-5-α-還原酶的類固醇或非類固醇抑制劑，例如本申請人在歐洲專利申請EP 0 964 852和EP 1 068 858中所描述的，或非納斯特胺；-依賴ATP的鉀管激動藥，例如克羅卡林和尼可地爾；-具有前-著色活性的植物提取物，例如像在FR 2768343中描述的chrysanthème提取物，在FR 2782920A1中描述的地榆提取物。
優選地，能提高GSH比率的化合物與選自防頭皮脫屑狀態的劑、有利于頭發再長出的劑、具有前著色活性的植物提取物的其它活性劑并用。
本發明的另一個目的涉及灰發癥的化妝處理方法，其特征在于在待治療部位給藥或涂敷如前面定義的含有至少一種能提高GSH比率化合物的組合物。
本發明還涉及用于保持灰色或白色頭發和/或體毛自然著色的化妝處理方法，其特征在于在待治療部位給藥或涂敷如前面定義的含有至少一種能提高GSH比率化合物的組合物。
灰發癥和灰色或白色頭發和/或體毛著色的處理方法還可在于攝食含有至少一種能提高GSH比率的化合物的組合物。
待治療部位可以毫無限制地是例如頭皮、眉毛、小胡子和/或胡須和由體毛覆蓋的任何皮膚部位。
更特別地，這些灰發癥和灰色或白色頭發和/或體毛自然著色的化妝處理方法在于涂敷含有至少一種能提高GSH比率的化合物的組合物。
防灰發癥和/或保持灰色或白色頭發和/或體毛自然著色的化妝處理方法可能在于例如在傍晚把該組合物涂敷在頭發與頭皮上，保留該組合物一整夜，任選地在早晨進行洗頭或使用這種組合物洗滌頭發，漂洗前再接觸幾分鐘。本發明的組合物以毛發洗劑形式涂敷，任選地漂洗或甚至以洗發劑形式涂敷時顯得特別有利。
附圖
圖1圖1表示如實施例1描述的在黑色素細胞WM35-wt(野型)、C2、C4、C7和C8(轉染和選擇克隆)細胞系上有抗體抗-TRP-2和抗-波形蛋白的蛋白質印跡。由這個蛋白質印跡得出只是克隆C2、C4和C8表達TRP-2。
圖2圖2是直方圖，它表示在黑色素細胞WM35-wt(野型)、C2、C4、C7和C8細胞系中GSH與選擇定量氨基酸之和的比(參見實施例1，部分C)。
圖3和4圖3和4表示氧化應激(H2O2)對表達不多或沒有表達TRP-2的野生黑色素細胞(菱形)、TRP2(+)黑色素細胞(方形)和使用并用的咖啡醇+咖啡豆醇(圖3)或使用奧替普拉(圖4)(三角形)處理的表達不多或沒有表達TRP-2的野生黑色素細胞的細胞生活力的影響。
實施例1定量測定在黑色素細胞中GSH隨著TRP-2表達而變化。
A-制備正TRP-2和負TRP-2黑色素細胞系。
A1克隆蛋白質TRP-2。
根據基因庫D17547序列，使用探針5′-GGAGATGGTGAGAAGCGCTAC-3′和5′-GCGGAAACTACAGCTAAGCAT-3′，采用RT-PCR技術，由皮膚黑色素細胞初步培養物提取的信使RNA，克隆編碼蛋白質TRP-2的整個信使RNA域。所得到的PCR產物再使用探針進行克隆，該探針含有相應于在真核細胞表達媒介物中克隆的限制位點的核苷酸序列5′-AGGGATCCATGAGCCCCCTTTGGTGGGGGTTT-3′和5′-GGAATTCAGCACCCTAGGCTTC-3′。使用的表達媒介物是pCDNA3.1(+)。然后由有能力的細菌產生含有編碼蛋白質TRP-2的域的媒介物，再進行純化，這種媒介物然后稱之pCDNA-TRP2。
A2制備正TRP-2黑色素細胞系。
用質粒pCDNA-TRP2轉染黑色素瘤WM35類的細胞(Pak BJ等人，《Melanoma Res.》，2000，10499)，它們在活體外以構建方式表達不多的蛋白質TRP-2(野生細胞系)。然后，通過用généticine(G418)處理選種穩定轉染的細胞。這些得到的克隆再進行分離與擴增。
B采用蛋白質印跡方法(參見Commo等人，《Pigment Cell Res》，2004，17488-497)檢測在這些不同的選種克隆中TRP-2的不同表達。
每種克隆培養物用適合于蛋白質提取與蛋白質印跡分析的同樣細胞溶解緩沖液進行細胞溶解。采用蛋白質印跡方法，使用8μg蛋白質提取物測定在不同提取物中的TRP-2比率。該蛋白質印跡(參見Maniatis等人的方案)是用下述抗體進行的αPEP8h、Dr VJ Hearing提供的多克隆抗體(NIH，Bethesda，USA)和α波形蛋白、Vim3B4單克隆抗體(Cymbus，UK)。
圖1表明與克隆7和野生細胞系(wt)相比，克隆C2、C4和C8表達更多蛋白質TRP-2。
C定量測定在正TRP-2和負TRP-2克隆中的GSH對于每個所研究的克隆，按照2×104個細胞/cm2接種這些細胞。然后，這些細胞培養物使用pH 2細胞溶解緩沖液進行細胞溶解。
提取的游離氨基酸(AA)采用HITACHI L-8500氨基酸自動分析儀進行分析。這樣采用離子交換柱，使用鋰鹽基洗脫劑分離游離的AA，然后在與茚三酮反應后采用比色法進行定量測定。在每個提取物中，測量的GSH比率是以AA總量計的(proline(P)，甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、纈氨酸(V)、半胱氨酸(C)、蛋氨酸(M)、異亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、酪氨酸(Y)、苯基丙氨酸(F)、賴氨酸(K)、組氨酸(H)、精氨酸(R))，以便使該試樣標準化。
圖2表明C2、C4和C8克隆的GSH比率比C7克隆和野生細胞的高。
實施例2-提高GSH比率或限制其降低的化合物對TRP-2M黑色素細胞生活力的影響實施例。
這個試驗的原理如下a-培養兩個表達TRP-2和沒有表達TRP-2的細胞型，它們已根據與實施例1A采用的類似方法發育，分別為Cell-TRP2(+)和Cell-TRP2(-)，可涉及所有的細胞型，優選地黑色素細胞型。
b-往Cell-TRP2(-)細胞培養介質中添加能有利于GSH積累的化合物。
c-培育培養物的時間之長足以有可提高這些細胞中的GSH比率。
d-在誘發自然死亡或衰老的條件下照射細胞。
e-測量自然死亡或衰老。
f-選擇有利于GSH積累與能夠保護TRP2(-)細胞的化合物。
在該方法的特別實施方式中，在37℃與5％CO2培養箱中進行這些細胞培養。
特別地，步驟(a)可以按照下述方案進行在J0用介質M2(PromoCell，Heidelberg，D)接種這些細胞，密度為5×104細胞/cm2。處理前，這些細胞在這種培養介質中保持12-72小時。
步驟(b)可以按照下述方案進行這些細胞在培養時用待試驗化合物處理達到為顯示這種性質所必要的時間，這個時間一般是12-72小時。
對于步驟(d)的實施，在培養時，在誘發自然死亡或衰老的條件下照射Cell-TRP2(+)和Cell-TRP2(-)細胞群，例如可能涉及使用順-鉑(Pak BJ.等人，2000，《Melanoma Res.》，10，499-505)或奧沙利鉑，使用毒性劑或毒性分子前體化合物，例如阿霉素、二羥基苯基丙氨酸、對草快、撲熱息痛、4-羥基雌二醇或4-羥基苯甲醚，紫外輻射照射、氧化應激(H2O2，馬來酸二乙酯)(參見Vaux D.L.& StrasserA.，1996，《Proc.Natl.Acad.Sci.》，932239-2244)處理。
對于步驟(e)的實施，可以采用下述自然死亡或衰老的顯示方法-可以采用任何能夠顯示細胞自然死亡的方法，例如鑒定DNA在瓊脂糖凝膠電泳后的碎裂情況，采用“TUNEL”方法(Gavrieli Y等人，《J Cell Biol》，1992，119493-501)標記DNA片段，anexine V的顯色(ApoAlert Annexin V Apoptosis Kit(1996)CLONTECHniques XI(3)9-11(BD Biosciences，Belgium))，定量測定胞質溶膠核小體(Kit CellDeath Detection ElisaPlus(1-774-425，Roche，Allemagne)；測量細胞生活力確定自然死亡反應。
-可以采用任何能夠顯示細胞衰老的方法，例如測定端粒縮短，測量端粒酶活性(TRAPeze kit，Intergen)，測定環化素E比率降低，測定磷酸化蛋白質Rb比率降低(Bandyopadhyay D等人，《ExperimentalGerontology》，2001，361265-1275)，測量β-半乳糖苷酶活性(DimriGP等人PNAS 1995；929363-9367)確定衰老反應。
在現在這種情況下，已測定一方面咖啡醇/咖啡豆醇混合物，另一方面奧替普拉補償野生WM35細胞系中TRP-2低表達的能力，同時這些細胞受到H2O2應激反應時保護這些細胞系。
使用在該研究中稱之“野生”細胞系的WM35人黑色素細胞系進行了這種研究，該細胞系非常低地表達TRP-2(Pak BJ等人，《(Melanoma Res.》，2000，10499)，還使用通過轉染得到的在該研究中稱之“克隆-2”的WM35細胞系的衍生細胞系進行了這種研究，該WM35細胞系強表達TRP-2(參見實施例1的點A和B)。
為了進行這種試驗，這些細胞按照密度2.5×104個細胞/孔接種，然后使用待評價化合物進行處理a-4μg/ml咖啡醇和咖啡豆醇1∶1混合物；b-50μM奧替普拉。
24h后，讓這些細胞受到由H2O2誘發的應激反應。
在這種應激后24h，使用2′，7′-二氯二氫熒光素二乙酸酯(H2DCFDA；D399，分子探針)測量了細胞生存力。
得到的結果(表1和2，圖3和4)表明，一方面用咖啡醇/咖啡豆醇混合物，另一方面用奧替普拉處理這種野生細胞系制約了這些細胞對H2O2誘發的應激反應的敏感性。這些結果因此表明在這種處理后，這種野生細胞系的敏感性接近于克隆-2細胞系的敏感性。
表1咖啡醇+咖啡豆醇處理(這些結果是生存力隨H2O2處理而變化的％表示的)
表2奧替普拉處理(這些結果是生存力隨H2O2處理而變化的％表示的)
因此，我們可以得出結論，一方面用咖啡醇/咖啡豆醇混合物，另一方面用奧替普拉處理表達不多或沒有表達TRP-2的黑色素細胞，補償了低表達TRP-2有關H2O2誘發應激反應的敏感性，因此為TRP-2低或無表達水平的黑色素細胞提供了好處.
實施例3-組合物-毛發洗液能對多巴色素互變異構酶代謝途徑起作用的化合物 0.5g聚乙二醇 20g乙醇95° 30g水 適量至100g每天把這種洗液涂敷在待治療部位上，優選地涂敷在整個頭皮上至少10天，優選地1-2月。這時觀察到白色或灰色出現減少，并且灰色頭發再著色。
-治療洗發液能對多巴色素互變異構酶代謝途徑起作用的化合物 1.5g聚甘油基3-羥基芳基醚 26gHercules公司以商品名Klucell G銷售的羥丙基纖維素 2g防腐劑 適量乙醇95° 50g水 適量至100g每次洗滌使用這種洗發劑，停留時間約1分鐘.持續使用約兩個月得到灰色頭發逐漸再著色。
這種洗發劑還可以用于預防，以延緩頭發變白。
-治療凝胺能對多巴色素互變異構酶代謝途徑起作用的化合物 0.75g桉樹精油 1gEconozole 0.2g月桂基聚甘油基6棕櫚糖醚(cetearyl glycoether) 1.9g防腐劑適量BF Goodrich Corporation公司銷售的Carbopol 934P0.3g中和劑 適量 pH7水 適量至 100g采用定期按摩方法每天兩次(早上和晚上)把這種凝膠涂敷在待治療部位。涂敷三個月后，觀察到待治療部位的體毛或頭發再著色。
權利要求
1.除櫟素外的能提高GSH比率的化合物在防止和/或限制或停止灰發癥發展中的化妝用途。
2.根據權利要求1所述的用途，用于保持和/或恢復灰色頭發和/或體毛自然著色。
3.根據權利要求1或2所述的用途，其特征在于能提高GSH比率的化合物選自硫辛酸、奧替普拉、咖啡豆醇、咖啡醇、angelicalactone、二烯丙基硫醚、異硫氰酸芐基酯。
4.根據權利要求1-3中任一項權利要求所述的用途，其特征在于通過局部或口服途徑給藥使用能提高GSH比率的化合物。
5.防灰發癥的化妝組合物，它含有在化妝上可接受介質中除櫟素外的至少一種能提高GSH比率的化合物與并用的其它活性劑，該活性劑選自防頭皮脫屑狀態的劑和/或具有前著色活性的植物提取物。
6.根據權利要求5所述的組合物，其特征在于所述的化合物選自硫辛酸、奧替普拉、咖啡豆醇、咖啡醇、angelicalactone、二烯丙基硫醚、異硫氰酸芐基酯。
7.化妝組合物，它含有在化妝上可接受介質中的至少一種能提高GSH比率的化合物，它選自奧替普拉、咖啡豆醇、咖啡醇、angelicalactone、異硫氰酸芐基酯，與其并用的有利于頭發再長出的劑。
8.根據權利要求5-7中任一項權利要求所述的組合物，其特征在于能提高GSH比率的化合物封裝在糖衣中，例如微球、毫微球、油體或毫微膠囊中。
9.根據權利要求5-8中任一項權利要求所述的組合物，其特征在于它適合于局部涂敷在頭皮上和/或體毛覆蓋的皮膚部位上。
10.灰發癥的化妝治療方法，其特征在于口服給藥或將含有能提高GSH比率的化合物的組合物局部涂敷在待治療部位上。
全文摘要
本發明涉及能提高毛囊黑色素細胞中谷胱甘肽(GSH)比率的化合物在治療灰發癥中的用途。
文檔編號A61Q7/00GK101087584SQ200580044414
公開日2007年12月12日 申請日期2005年12月20日 優先權日2004年12月22日
發明者S·康莫 申請人:萊雅公司