蛋白酶的制作方法
                            
            
                            
            文檔序號：1362751閱讀：848來源：國知局
            
                            
                        
            
                        
            
                        
            
                            專利名稱：蛋白酶的制作方法
            
技術領域：
            本發明涉及具有蛋白酶活性的分離多肽和編碼該多肽的分離的核酸序列。本發明還涉及含有該核酸序列的核酸構建體、載體和宿主細胞，包括植物和動物細胞，本發明還涉及產生和使用所述多肽的方法，尤其是所述多肽在動物飼料和洗滌劑中的用途。
            
背景技術：
             得自擬諾卡氏菌屬的菌株(Nocardiopsis sp.)NRRL 18262和達松維爾擬諾卡氏菌(Nocardiopsis dassonvillei)NRRL 18133的蛋白酶公開于WO88/03947。得自擬諾卡氏菌NRRL 18262的蛋白酶的DNA和氨基酸序列在DK申請no.1996 00013中顯示。WO 01/58276中公開酸穩定的蛋白酶在動物飼料中的用途，其中所說的蛋白酶與得自擬諾卡氏菌NRRL 18262以及得自Nocardiopsis alba DSM 14010的蛋白酶相關。
            
JP 2-255081-A公開一種得自擬諾卡氏菌菌株OPC-210(FERM P-10508)的蛋白酶，然而無序列信息。該菌株不再能夠獲得，因為保藏被撤銷。
            
DD 200432|8公開了一種得自達松維爾擬諾卡氏菌菌株ZIMET 43647的蛋白水解制劑，然而無序列信息。該菌株似乎不再能夠獲得。
            
JP 2003284571-A公開了得自擬諾卡氏菌TOA-1(FERM P-18676)的蛋白酶的氨基酸序列和相應的DNA序列。該序列已經以編號ADF43564進入GENESEQP。
            
本發明的目的是提供另一種可選擇的蛋白酶，尤其是在動物飼料和/或洗滌劑中的用途。
            

            發明內容
            
克隆、純化和表征了許多蛋白酶。這些蛋白酶命名如下得自達松維爾擬諾卡氏菌達松維爾亞種(Nocardiopsis dassonvillei subsp.dassonvillei)DSM43235的蛋白酶L1a(參見SEQ ID NOs.1和2)；得自Nocardiopsis prasinaDSM 15649的蛋白酶L1b(參見SEQ ID NOs3和4)；得自Nocardiopsisprasina(以前是alba)DSM 14010的蛋白酶L1c(參見SEQ ID NOs5和6)；得自擬諾卡氏菌屬的菌種DSM 16424的蛋白酶L2a(參見SEQ ID NOs7和8)；得自嗜堿擬諾卡氏菌(Nocardiopsis alkaliphila)DSM 44657的蛋白酶L2b(參見SEQ ID NOs9和10)；和得自盧森坦類諾卡氏菌(Nocardiopsis lucentensis)DSM 44048的蛋白酶L2c(參見SEQ ID NOs11和12)。
            
第一個方面，本發明涉及一種具有蛋白酶活性的分離多肽，選自(a)具有氨基酸序列的多肽，其中所說的氨基酸序列與SEQ ID NO6的1-192位氨基酸具有至少71.5％的同一性程度；(b)由核酸序列編碼的多肽，其中所說的核酸序列在非常高嚴緊條件下與(i)SEQ ID NO5的574-1149核苷酸、(ii)(i)的至少100個核苷酸的亞序列和/或(iii)(i)或(ii)的互補鏈雜交；(c)具有SEQID NO6的1-192位氨基酸的氨基酸序列，包括取代、缺失、延伸和/或插入一個或多個氨基酸的多肽的變體；(d)(a)或(b)的等位變體；和(e)(a)、(b)或(d)的具有蛋白酶活性的片段。
            
其他五個方面，對應于本說明書結尾處給出的五組具體的實施方案，本發明還涉及一種具有蛋白酶活性的分離多肽，其選自下組(a)具有氨基酸序列的多肽，其中所說的氨基酸序列與SEQ ID NO4的1-192位氨基酸具有至少69.9％的同一性程度；(b)由核酸序列編碼的多肽，其中所說的核酸序列在低嚴緊條件下與(i)SEQ ID NO3的574-1149位核苷酸、(ii)(i)的至少100個核苷酸的亞序列和/或(iii)(i)或(ii)的互補鏈雜交；(c)具有SEQ ID NO4的1-192位氨基酸的氨基酸序列，包括取代、缺失、延伸和/或插入一個或多個氨基酸的多肽的變體；(d)(a)或(b)的等位變體；和(e)(a)、(b)或(d)的具有蛋白酶活性的片段。
            
一種具有蛋白酶活性的分離多肽，其選自下組(a)具有氨基酸序列的多肽，其中所說的氨基酸序列與SEQ ID NO2的1-192位氨基酸具有至少75.1％的同一性程度；(b)由核酸序列編碼的多肽，其中所說的核酸序列在低嚴緊條件下與(i)SEQ ID NO1的568-1143位核苷酸、(ii)(i)的至少100個核苷酸的亞序列和/或(iii)(i)或(ii)的互補鏈雜交；(c)具有SEQ ID NO2的1-192位氨基酸的氨基酸序列，包括取代、缺失、延伸和/或插入一個或多個氨基酸的多肽的變體；(d)(a)或(b)的等位變體；和(e)(a)、(b)或(d)的具有蛋白酶活性的片段。
            
一種具有蛋白酶活性的分離多肽，其選自下組(a)具有氨基酸序列的多肽，其中所說的氨基酸序列與SEQ ID NO8的1-189位氨基酸具有至少92.2％的同一性程度；(b)由核酸序列編碼的多肽，其中所說的核酸序列在低嚴緊條件下與(i)SEQ ID NO7的586-1152位核苷酸、(ii)(i)的至少100個核苷酸的亞序列和/或(iii)(i)或(ii)的互補鏈雜交；(c)具有SEQ ID NO8的1-189位氨基酸的氨基酸序列，包括取代、缺失、延伸和/或插入一個或多個氨基酸的多肽的變體；(d)(a)或(b)的等位變體；和(e)(a)、(b)或(d)的具有蛋白酶活性的片段。
            
一種具有蛋白酶活性的分離多肽，其選自下組(a)具有氨基酸序列的多肽，其中所說的氨基酸序列與SEQ ID NO10的1-189位氨基酸具有至少93.2％的同一性程度；(b)由核酸序列編碼的多肽，其中所說的核酸序列在低嚴緊條件下與(i)SEQ ID NO9的586-1149位核苷酸、(ii)(i)的至少100個核苷酸的亞序列和/或(iii)(i)或(ii)的互補鏈雜交；(c)具有SEQ ID NO10的1-189位氨基酸的氨基酸序列，包括取代、缺失、延伸和/或插入一個或多個氨基酸的多肽的變體；(d)(a)或(b)的等位變體；和(e)(a)、(b)或(d)的具有蛋白酶活性的片段。
            
一種具有蛋白酶活性的分離多肽，其選自下組(a)具有氨基酸序列的多肽，其中所說的氨基酸序列與SEQ ID NO12的1-189位氨基酸具有至少83.3％的同一性程度；(b)由核酸編碼的多肽，其中所說的核酸序列在低嚴緊條件下與(i)SEQ ID NO11的586-1152位核苷酸、(ii)(i)的至少100個核苷酸的亞序列和/或(iii)(i)或(ii)的互補鏈雜交；(c)具有SEQ ID NO12的1-189位氨基酸的氨基酸序列，包括取代、缺失、延伸和/或插入一個或多個氨基酸的多肽的變體；(d)(a)或(b)的等位變體；和(e)(a)、(b)或(d)的具有蛋白酶活性的片段。
            
本發明還涉及編碼上述多肽的分離的核酸序列并且涉及含有該核酸序列的核酸構建體、載體和宿主細胞，以及產生和使用所述多肽的方法，特別是在動物飼料和洗滌劑中。
            
發明詳述具有蛋白酶活性的多肽具有蛋白酶活性的多肽，或蛋白酶，有時也命名為肽酶、蛋白酶(proteinase)、肽水解酶或蛋白水解酶。蛋白酶可以是從肽的任何一端開始水解肽的外切型，或者是在多肽鏈內部起作用的內切型(內肽酶(endopeptidase))。內肽酶在N端和C端阻斷的肽底物上顯示活性，其中所說的肽底物與所述蛋白酶的特異性有關。
            
本文中，術語″蛋白酶″定義為水解肽鍵的酶。它包括屬于EC 3.4酶組的任何酶(包括其13個亞類中的任何一個)。EC編號參考NC-IUBMB的酶命名法(Enzyme Nomenclature)1992，Academic Press，San Diego，California，包括分別公布于Eur.J.Bio-chem.1994，223，1-5；Eur.J.Biochem.1995，232，1-6；Eur.J.Biochem.1996，237，1-5；Eur.J.Biochem.1997，250，1-6和Eur.J.Biochem.1999，264，610-650的增補1-5。該命名法定期補充并且更新；參見例如萬維網(WWW)在http://www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/enzyme/index.html。
            
按其催化機理為基礎，蛋白酶可分成以下幾個組絲氨酸蛋白酶(S)，半光氨酸蛋白酶(C)，天冬氨酸蛋白酶(A)，金屬蛋白酶(M)和未知的或仍未分類的蛋白酶(U)，參見蛋白水解酶手冊(Handbook of Proteolytic Enzymes)，A.J.Barrett，N.D.Rawlings，J.F.Woessner(編)，Academic Press(1998)，特別是其總體介紹部分。
            
在具體的實施方案中，本發明和根據本發明用途的蛋白酶選自(a)屬于EC 3.4.-.-酶組的蛋白酶；(b)屬于上述手冊中S組的絲氨酸蛋白酶；(c)肽酶家族S2A的絲氨酸蛋白酶；和/或(d)肽酶家族S1E的絲氨酸蛋白酶，描述于Biochem.J.290205-218(1993)和MEROPS蛋白酶數據庫，6.20版本，2003.3.24(www.merops.ac.uk)。該數據庫描述于Rawlings，N.D.，O′Brien，E.A.& Barrett，A.J.(2002)MEROPSthe protease database.Nucleic Acids Res.30，343-346。
            
為測定給定蛋白酶是否是絲氨酸蛋白酶，和S2A家族蛋白酶，參考上述的手冊及其中指示的原則。這種測定可針對所有類型的蛋白酶進行，無論是天然存在的還是野生型蛋白酶；或者是基因工程改造或合成的蛋白酶。
            
蛋白酶活性可以使用任何測試來測定，在測試中使用底物，該底物包括與所述蛋白酶的特異性有關的肽鍵。測試-pH和測試-溫度同樣適合于所述的蛋白酶。測試-pH-值的實例為pH2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12。測試-溫度的實例是30、35、37、40、45、50、55、60、65、70、80、90或95℃。
            
蛋白酶底物的實例是酪蛋白，如天青蛋白(Azurine)-交聯的酪蛋白(AZCL-酪蛋白)。本文的實施例4-5描述了三種蛋白酶測試，可以使用其中任何一種來測定蛋白酶的活性。本發明中，所謂的pNA測試是優選的測試方法。
            
本發明和/或根據本發明用途的蛋白酶，其來源沒有限制。由此，術語″蛋白酶″不僅包括從任何屬的微生物中獲得的天然或野生型蛋白酶，而且包括其顯示蛋白酶活性的任何突變體、變體、片段等，以及合成的蛋白酶，如改組蛋白酶和共有蛋白酶。這種基因工程蛋白酶可以按照本領域通常已知的方法制備，例如通過定點突變，通過PCR(在PCR反應中，使用含有所需突變的PCR片段作為引物之一)或者通過隨機突變。共有蛋白質的制備在例如EP897985中有所描述。基因改組在例如WO 95/22625和WO 96/00343中一般地描述。蛋白酶基因的重組可以通過Ness，J.E.等在Nature Biotechnology，Vol.20(12)，pp.1251-1255，2002中描述的合成改組獨立地由親本的特定序列制成。，設計在其DNA序列中簡并以提供在該組親本蛋白酶中存在的所有氨基酸的可能性的合成寡核苷酸并根據參考文獻組裝基因。改組可以針對全長序列進行，或者僅對部分序列，然后再與基因的其余部分合并以得到全長序列。SEQ ID NOs2、4、6、8、10和12的蛋白酶以及上面所列的現有文獻中描述的擬諾卡氏菌屬蛋白酶，是這種親本蛋白酶的具體實例，可以將它們進行如上所述的改組，以便提供本發明的其他的蛋白酶。本文中與給定來源連用的術語″得自″應指，由核酸序列編碼的多肽是通過該來源產生的或者通過其中存在來自該來源的核酸序列的細胞產生的。在一個優選的實施方案中，多肽是胞外分泌的。
            
在具體的實施方案中，蛋白酶是低變應原性(allergenic)變體，被設計成當與動物(包括人)接觸時引起免疫反應降低。術語″免疫反應″應理解為接觸該蛋白酶的動物的免疫系統所引起的任何反應。一種類型的免疫反應是過敏性反應，導致接觸動物中IgE水平增加。低變應原性變體可以使用本領域已知的技術來制備。例如，可以將蛋白酶和與免疫反應有關的蛋白酶的多聚體部分的屏蔽部位或表位綴合(conjugation)。與多聚體綴合可涉及多聚體與蛋白酶的體外化學偶聯，例如WO 96/17929、WO 98/30682、WO 98/35026和/或WO99/00489中所描述的。所述的綴合可以附加地或可選擇地包括多聚體與蛋白酶的體內偶聯。這種綴合可以通過編碼蛋白酶的核苷酸序列的基因工程改造，在蛋白酶中插入編碼附加糖基化位點的共有序列并且在能夠使蛋白酶糖基化的宿主中表達該蛋白酶來完成，例如參見WO 00/26354。另一種提供低變應原性變體的方式是編碼蛋白酶的核苷酸序列的基因工程改造，以便引起蛋白酶自寡聚化，致使蛋白酶單體可以屏蔽其他蛋白酶單體的表位并且由此降低寡聚體的抗原性。這種產物及其制備在例如WO 96/16177中有所描述。在免疫反應中涉及的表位可以通過各種方法來鑒定，諸如WO 00/26230和WO01/83559中所述的噬菌體展示方法或EP 561907中描述的隨機方法，當表位得到鑒定后，可以改變其氨基酸序列，以通過已知的基因操縱技術來產生蛋白酶的改變免疫特性，所述基因操縱技術例如定點突變(參見例如WO00/26230，WO 00/26354和/或WO 00/22103)和/或多聚體的綴合可以足夠接近表位進行以使多聚體屏蔽該表位。
            
本發明的各個方面涉及具有蛋白酶活性的分離多肽(簡稱為″蛋白酶″)，以及對應的分離的核酸序列，所說的多肽或核酸分別含有氨基酸序列或核酸序列，它們分別與氨基酸序列或核酸序列的特定片段具有一定程度的同一性，氨基酸序列或核酸序列的特定片段具有特定的SEQ ID NO。特定的片段分別對應于成熟多肽或核酸序列的成熟多肽編碼部分。
            
本發明中，兩個氨基酸序列之間的同一性程度以及兩個核苷酸序列之間的同一性程度，通過″對比″程序來測定，其是Needleman-Wunsch對比(即整體對比(global alignment))。該程序用于多肽的對比，以及核苷酸序列的對比。使用默認的計分矩陣BLOSUM50進行多肽對比，并且使用默認的同一性矩陣進行核苷酸對比。缺口(gap)的第一個殘基的罰分(penalty)對于多肽是-12，而對于核苷酸是-16。缺口其他殘基的罰分對于多肽是-2，而對于核苷酸是-4。
            
″對比″是FASTA軟件包v20u6版本中的一部分(參見W.R.Pearson和D.J.Lipman(1988)，″Improved Tools for Biological Sequence Analysis″，PNAS 852444-2448，及W.R.Pearson(1990)″Rapid and Sensitive Sequence Comparisonwith FASTP and FASTA，″Methods in Enzymology 18363-98)。FASTA蛋白對比使用Smith-Waterman算法，對缺口的大小沒有限制(參見″Smith-Watermanalgorithm″，T.F.Smith and M.S.Waterman(1981)J.Mol.Biol.147195-197)。
            
在具體的實施方案中，本發明的多肽與SEQ ID NOs2、4、6、8、10或12中任一個的成熟部分具有至少70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或至少99％的同一性程度。
            
在其他具體的實施方案中，本發明的核酸序列與SEQ ID NOs1、3、5、7、9或11中任一個的成熟肽編碼部分具有至少78％，79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或至少99％的同一性程度。
            
在另外的具體實施方案中，本發明的蛋白酶具有與SEQ ID NOs2、4、6、8、10和12中任一個的成熟部分相差(i)不超過20，19，18，17，16，15，14，13，12或不超過11個氨基酸；(ii)不超過10，9，8，7，6，5，4，3，2或不超過1個氨基酸；(iii)10或9或8或7或6或5個氨基酸；或(iv)4或3或2個氨基酸，或1個氨基酸的氨基酸序列。
            
在另外的具體實施方案中，本發明的蛋白酶包括SEQ ID NOs2、4、6、8、10或12中任一個的成熟部分的氨基酸序列；或者是其等位變體；或其具有蛋白酶活性的片段。
            
在其他優選的實施方案中，本發明的多肽由SEQ ID NO2、4、6、8、10或12中任一個的成熟肽部分；或其等位變體；或其具有蛋白酶活性的片段組成。
            
SEQ ID NOs2、4、6、8、10或12中任一個的片段是從這些氨基酸序列的氨基和/或羧基末端缺失一個或多個氨基酸的多肽。在一個實施方案中，片段含有至少75個氨基酸殘基，或者至少100個氨基酸殘基，或至少125個氨基酸殘基，或至少150個氨基酸殘基，或至少160個氨基酸殘基，或至少165個氨基酸殘基，或至少170個氨基酸殘基，或至少175個氨基酸殘基。
            
等位變體是指占據相同染色體基因座的基因的兩種或更多種可選形式的任一種。等位變異通過突變自然發生，并且可在群體中導致多態性(polymorphism)。基因突變可以是沉默的(編碼多肽中沒有變化)或者可編碼具有改變的氨基酸序列的多肽。多肽的等位變體是由基因的等位變體編碼的多肽。
            
本發明還涉及分離的多肽，其具有蛋白酶活性并且由核酸序列編碼，所述核酸序列在非常低或低或中等或中-高或高或非常高的嚴緊條件下與核酸探針雜交，其中所說的核酸探針在相同條件下與(a)SEQ ID NOs1、3、5、7、9或11中的任一個，或其成熟肽編碼部分；(b)(a)的亞序列，或(c)(a)或(b)的互補鏈雜交(J.Sambrook，E.F.Fritsch，和T.Maniatis，1989，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2nd edition，Cold Spring Harbor，New York)。在具體的實施方案中，核酸探針選自上述(a)，(b)或(c)的核酸序列。
            
(a)的亞序列可以是至少100個核苷酸，或者在另一個實施方案中，至少200個核苷酸。此外，所述亞序列可以編碼具有蛋白酶活性的多肽片段。
            
SEQ ID NOs1、3、5、7、9或11中任一種的核酸序列或其成熟肽編碼部分或其亞序列，以及SEQ ID NOs2、4、6、8、10或12中任一種的氨基酸序列或其片段，可以用來根據本領域公知的方法設計核酸探針來鑒別和克隆來自相同或不同屬或種的菌株中的編碼具有蛋白酶活性的多肽的DNA。具體說，可以依照標準的Southern印跡法，使用這種探針與目標屬或種的基因組或cDNA雜交，以便鑒別和分離其中相應的基因。這種探針可以比全序列短得多，但應當為至少15個，優選至少25個，更優選至少35個核苷酸的長度。也可以使用更長的探針。DNA和RNA探針均可使用。通常，(例如，用32p，3H，35S，生物素或抗生物素蛋白)標記探針用于檢測相應的基因。這種探針也包括在本發明的范圍內。
            
由此，可以篩選由所述其他生物制備的基因組DNA或cDNA文庫，得到與上述探針雜交并且編碼具有蛋白酶活性的多肽的DNA。可以通過瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳或其他的分離技術，從所述其他的生物中分離基因組或其他DNA。可以將來自文庫的DNA或分離的DNA轉移到并固定在硝化纖維或其他適當的載體材料上。為了鑒定與SEQ ID NOs1、3、5、7、9和11中的任一種或其亞序列同源的克隆或DNA，在Southern印跡中使用載體材料。本發明中，雜交是指在非常低至非常高的嚴緊條件下，將核酸序列與標記的核酸探針雜交，其中所說的標記的核酸探針對應于這些SEQ ID NOs中任一種所示的核酸序列，其互補鏈或其亞序列。使用X-射線膠片檢測在這些條件下核酸探針所雜交的分子。
            
在具體的實施方案中，核酸探針是編碼SEQ ID NOs2、4、6、8、10或12中任一種的成熟肽部分的核酸序列或其亞序列。在另一個實施方案中，核酸探針是SEQ ID NOs1、3、5、7、9或11中任一種的那些核苷酸，其對應于編碼區域的成熟多肽。
            
對于至少100個核苷酸長度的長探針來說，非常低至非常高的嚴緊條件定義為42℃，在5 X SSPE，0.3％SDS，200μg/ml經剪切和變性的鮭精DNA，和25％甲酰胺(對于非常低和低的嚴格度)、35％甲酰胺(對于中等和中高的嚴格度)，或50％甲酰胺(對于高和非常高的嚴格度)，按照標準的Southem印跡法進行的預雜交和雜交。
            
對于至少100個核苷酸長度的長探針而言，載體材料最后用2 X SSC，0.2％SDS，優選至少在45℃(非常低嚴格度)，更優選至少在50℃(低嚴格度)，更優選至少在55℃(中等嚴格度)，更優選至少在60℃(中-高嚴格度)，還更優選至少在65℃(高嚴格度)，并最優選至少70℃在(非常高嚴格度)洗滌三次，每次15分鐘。優選，使用0.2 X SSC、0.1 X SSC或0.02 X SSC來進行洗滌，其他洗滌條件不變(即洗滌三次，每次15分鐘；包括0.2％SDS，洗滌優選至少在45℃(非常低的嚴格度)，更優選至少在50℃(低嚴格度)，更優選至少在55℃(中等嚴格度)，更優選至少在60℃(中等-高嚴格度)，更優選至少在65℃(高嚴格度)并且首選至少在70℃(非常高嚴格度))。
            
對于約15個核苷酸至約70個核苷酸長度的短探針而言，嚴緊條件定義為于在低于計算的Tm值5℃至10℃條件下，在0.9 M NaCl、0.09 M Tris-HClpH7.6，6mM EDTA，0.5％NP-40，1X Denhardt′s溶液，1mM焦磷酸鈉，1mM磷酸二氫鈉(sodium monobasic phosphate)，0.1mM ATP及每毫升0.2mg酵母RNA中，按照標準的Southem印跡法進行預雜交、雜交和雜交后洗滌，其中所說的Tm值是使用Bolton和McCarthy的計算方法(1962，Proceedings of theNational Academy of Sciences USA 481390)所計算的。
            
對于約15個核苷酸至約70個核苷酸長度的短探針，將載體材料在低于所計算的Tm值5℃至10℃條件下，在6X SSC加0.1％SDS中洗滌一次，15分鐘，用6X SSC洗滌兩次，每次15分鐘。
            
本發明還涉及含有SEQ ID NOs2、4、6、8、10或12中任一種的成熟部分，并且含有取代、缺失和/或插入一個或多個氨基酸的多肽的變體。
            
變體多肽的氨基酸序列與SEQ ID NOs2、4、6、8、10或12中任一種的成熟部分的氨基酸序列的差別可以是插入或缺失一個或多個氨基酸殘基和/或用不同的氨基酸殘基取代一個或多個氨基酸殘基。優選，氨基酸的變化是較少天然的，也就是保守性氨基酸取代，其不明顯影響蛋白質的折疊和/或活性；小的缺失，一般是1至約30個氨基酸；小的氨基或羧基末端延伸，例如氨基末端的蛋氨酸殘基；最多約20-25個殘基的小的連接肽；或者通過改變凈電荷或其他功能有助于純化的小的延伸，如多組氨酸區(poly-histidinetract)，抗原表位或結合域。
            
保守性取代的實例是在堿性氨基酸(精氨酸、賴氨酸和組氨酸)，酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)，極性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)，疏水氨基酸(亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸)，芳族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨酸基(甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和甲硫氨酸)的組內。因此，例如，本發明涉及具有或含有SEQ ID NOs2、4、6、8、10或12中任一種所列序列或其活性片段的多肽，其中保守性氨基酸取代包括在堿性氨基酸(精氨酸、賴氨酸和組氨酸)中、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)中、極性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)中、疏水氨基酸(丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸)中、芳族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)中和小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和甲硫氨酸)中或其任意組合中的置換，一個置換另一個。通常不改變比活性(specific activity)的氨基酸取代在本領域是已知的并且由，例如，H.Neurath和R.L.Hill，1979，在，The Proteins，Academic Press，New York中有所描述。最常發生的交換是Ala/Ser，Val/Ile，Asp/Glu，Thr/Ser，Ala/Gly，Ala/Thr，Ser/Asn，Ala/Val，Ser/Gly，Tyr/Phe，Ala/Pro，Lys/Arg，Asp/Asn，Leu/Ile，Leu/Val，Ala/Glu和Asp/Gly以及反過來。
            
本發明的多肽可以是細菌或真菌多肽。真菌多肽可以來源于絲狀真菌或來源于酵母。
            
在具體的實施方案中，本發明的多肽是i)細菌蛋白酶；ii)放線菌門的蛋白酶；iii)放線菌綱的；iv)放線菌目的；v)擬諾卡氏菌科的；vi)擬諾卡氏菌屬的；和/或來源于vii)擬諾卡氏菌屬菌種的蛋白酶，所述擬諾卡氏菌屬菌種諸如Nocardiopsis alba，嗜堿擬諾卡氏菌，Nocardiopsis antarctica，Nocardiopsis prasina，Nocardiopsis composta，Nocardiopsis exhalans，嗜鹽擬諾卡氏菌(Nocardiopsis halophila)，Nocardiopsis halotolerans，Nocardiopsiskunsanensis，李氏擬諾卡氏菌(Nocardiopsis listeri)，盧森坦類諾卡氏菌，Nocardiopsis metallicus，Nocardiopsis synnemataformans，Nocardiopsistrehalosi，Nocardiopsis tropica，Nocardiopsis umidischolae，Nocardiopsisxinjiangensis或達松維爾擬諾卡氏菌，例如來源于達松維爾擬諾卡氏菌達松維爾亞種DSM 43235，Nocardiopsis prasina DSM 15649，Nocardiopsisprasina(以前是alba)DSM 14010，擬諾卡氏菌屬的菌種DSM 16424，嗜堿擬諾卡氏菌DSM 44657中的任一種，或者來源于盧森坦類諾卡氏菌DSM 44048。
            
在具體的實施方案中，蛋白酶得自于Nocardiopsis alba，嗜堿擬諾卡氏菌，達松維爾擬諾卡氏菌，盧森坦類諾卡氏菌，Nocardiopsis prasina或擬諾卡氏菌屬菌種。
            
上述的分類法是根據章節The road map to the Manual，G.M.Garrity & J.G.Holt in Bergey′s Manual of Systematic Bacterio1ogy，2001，第二版，volume l，David R.Bone，Richard W.Castenholz。
            
應當理解的是，對于前述的菌種，本發明包括完全階段和不完全階段(perfect and imperfect state)，和其他分類法的等同物，例如無性型(anamorphs)，與它們已知的菌種名稱無關。本領域技術人員將容易識別適當等同物的同一性。
            
公眾可以很容易在幾個培養物保藏中心得到這些菌種的菌株，例如美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection)(ATCC)、德意志微生物與細胞培養物保藏中心(Deutsche Sarumiung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH)(DSM)、霉菌培養物中心局(Centraalbureau VoorSchimmelcultures)(CBS)和農業研究機構專利培養物保藏中心(AgriculturalResearch Service Patent Culture Collection，Northern Regional Research Center)(NRRL)。
            
此外，這種多肽也可以使用上述的探針，從其他來源包括從自然界(例如，土壤、堆肥(composts)、水等)分離的微生物中鑒定并且獲得。從自然的生活環境分離微生物的技術是本領域公知的。然后，可以類似地通過篩選另一個微生物的基因組或cDNA文庫來得到核酸序列。一旦用探針檢測到編碼多肽的核酸序列，就可以利用本領域普通技術人員已知的技術分離或克隆該序列(參見，例如，Sambrook等，1989，如上)。
            
本文中定義的″分離的″多肽是基本上不含其他非蛋白酶多肽的多肽，例如通過SDS-PASE測定，至少約20％純度，優選至少約40％純度，更優選約60％純度，還更優選約80％純度，最優選約90％純度，甚至最優選約95％純度的多肽。
            
本發明的核酸序列編碼的多肽還包括融合多肽或可裂解的融合多肽，其中將另一個多肽融合在所述多肽或其片段的N-末端或C-末端。融合多肽通過將編碼另一個多肽的核酸序列(或其部分)與本發明的核酸序列(或其部分)融合來產生。產生融合多肽的技術是本領域已知的，并且包括將編碼多肽的編碼序列連接(ligating)，以使它們位于框中并且使融合多肽的表達處于相同啟動子和終止子的控制之下。
            
在具體的實施方案中，本發明的多肽是酸穩定的。本發明中，術語酸穩定的指在pH2.0、pH2.5或pH3.0及37℃保溫2小時后的殘留活性，與pH9.0及5℃保溫2小時后的相應樣品的殘留活性相比為至少50％。在具體實施方案中，殘余活性為至少55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％或至少90％。一種測定酸穩定性的適宜的測試方法是實施例2的pH-穩定性測試。
            
在另一個具體的實施方案中，本發明的多肽是堿穩定的。本發明中，術語堿穩定的是指在pH12.0及37℃保溫2小時后的殘留活性，與pH9.0及5℃保溫2小時后的相應樣品的殘留活性相比為至少85％。在具體的實施方案中，殘留活性為至少86％，87％，88％，89％，90％，91％，或至少92％。一種測定堿穩定性的適宜的測試方法是實施例4的pH-穩定性測試。
            
在其他具體的實施方案中，本發明的和根據本發明用途的多肽具有i)在15℃和pH9，至少0.02、0.04、0.06、0.08、0.10或至少0.11的相對活性；ii)在25℃和pH9，至少0.05、0.10、0.15或至少0.17的相對活性；和/或iii)在37℃和pH9，至少0.05、0.10、0.15、0.20、0.25或至少0.30的相對活性。使用實施例4的溫度分布試驗進行這些測定。
            
在其他具體實施方案中，本發明的多肽具有如通過DSC測定的至少76.6℃，或至少77、78或至少78.2℃的Tm。Tm在pH7.0下測定，如實施例7中所述。
            
在一個附加的具體實施方案中，本發明的蛋白酶于pH7.5和25℃對于血紅蛋白顯示的比活性為至少38.4AU/g。比活性可以如實施例5所述測定。本發明的蛋白酶可以顯示至少39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、49.8或至少50AU/g的比活性。
            
在另外一個具體的實施方案中，本發明的蛋白酶能夠將單胃體外消化模型中的玉米/大豆粉(soybean meal)膳食(SBM∶玉米＝2∶3(w/w))的可消化蛋白的水平與空白相比提高至少13％。該模型包括胃消化步驟(1.0小時，在pH3.0和40℃)和隨后的腸消化步驟(4.5小時，在pH6.8和40℃)。該模型還包括添加胃蛋白酶(3000U/g，在胃消化步驟中)和胰酶(8mg/g，在腸消化步驟中)。蛋白酶劑量是100mg蛋白酶酶蛋白(EP)每kg膳食。實施例8中描述了合適的模型。提高的水平可以為至少14％、15％或至少16％。
            
在本發明的其他具體實施方案中，本發明不包括來自(i)達松維爾擬諾卡氏菌NRRL 18133的蛋白酶，其公開于WO 88/03947；(ii)擬諾卡氏菌屬的菌株OPC-210(FERM P-10508)的蛋白酶，其公開于JP 2-255081-A；和/或(iii)得自達松維爾擬諾卡氏菌菌種的菌株ZIMET 43647的蛋白酶，其公開于DD200432|8。
            
核酸序列本發明還涉及編碼本發明多肽的分離的核酸序列。本發明的具體的核酸序列是(i)SEQ ID NO1的1-1143、1-87、88-567和568-1143位核苷酸；(ii)SEQ ID NO3的1-1149、1-87、88-573和574-1149位核苷酸；(iii)SEQ ID NO5的1-1149、1-87、88-573和574-1149位核苷酸；(iv)SEQ ID NO7的1-1152、1-87、88-585和586-1152位核苷酸；(v) SEQ ID NO9的1-1149、1-87、88-585和586-1149位核苷酸；和(vi)SEQ ID NO11的1-1152、1-87、88-585和586-1152位核苷酸；及(vii)它們的任何組合。
            
特別優選的核苷酸是(i)SEQ ID NO1的568-1143位核苷酸；(ii)SEQ IDNO3的574-1149位核苷酸；(iii)SEQ ID NO5的574-1149位核苷酸；(iv)SEQ ID NO7的586-1152位核苷酸；(v)SEQ ID NO9的586-1149位核苷酸；和(vi)SEQ ID NO11的586-1152位核苷酸；對應于成熟多肽編碼部分或區域。
            
本發明還包括編碼具有SEQ ID NOs2、4、6、8、1 0或12中任一種的成熟部分的多肽的核酸序列，其由于遺傳密碼的簡并性分別與SEQ ID NOs1、3、5、7、9和11相應部分有所區別。本發明還涉及SEQ ID NOs1、3、5、7、9和11中任一種的亞序列，其分別編碼SEQ ID NOs2、4、6、8、10或12的片段并且具有蛋白酶活性。
            
SEQ ID NOs1、3、5、7、9和11中任一種的亞序列是包括在SEQ ID NOs1、3、5、7、9或11中的核酸序列，只是5′和/或3′端缺失一個或多個核苷酸。優選，亞序列含有至少100、125、150、175、200或至少225個核苷酸，更優選至少300個核苷酸，還更優選至少325、350、375、400、425、450、475、500、525、550或至少560個核苷酸。
            
本發明還涉及與SEQ ID NOs1、3、5、7、9或11中任一種的成熟肽編碼部分具有至少77.7％，優選至少78％，79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或至少99％的同一性程度的核苷酸序列。
            
為測定核苷酸同一性的程度，使用如上所述的″對比″程序。
            
本發明還涉及在上述(i)-(vi)所列的任一核苷酸、優選其成熟肽編碼部分中包含至少一個突變的突變核酸序列，其中突變核酸序列編碼的多肽(i)由SEQ ID NOs2、4、6、8、10或12中任一種的氨基酸序列，優選其成熟肽部分組成，或(ii)是(i)中任一序列的變體，其中變體包括取代、缺失和/或插入一個或多個氨基酸，或(iii)是(i)中任一序列的等位變體，或(iv)是(i)中任一序列的片段。
            
用于分離或克隆編碼多肽的核酸序列的技術是本領域已知的，并且包括從基因組DNA分離，從cDNA制備，或其組合。可以從這種基因組中實現本發明的核酸序列的克隆，例如通過使用公知的聚合酶鏈式反應(PCR)或表達文庫的抗體篩選來檢測具有共有結構特征的克隆的DNA片段。參見，例如Innis等，1990，PCRA Guide to Methods and Application，Academic Press，New York。可以使用其他的核酸擴增方法，例如連接酶鏈式反應(LCR)、連接活化轉錄(ligated activated transcription)(LAT)和基于核酸序列的擴增(NASBA)。可以從擬諾卡氏菌屬的菌株或另外的或相關的生物中克隆該核酸序列，并且由此可為，例如，核酸序列的多肽編碼區的等位或物種變體。
            
本文所用的術語″分離的核酸序列″是指基本上不含其他核酸序列的核酸序列，例如通過瓊脂糖凝膠電泳測定的至少約20％純度，優選至少約40％純度，更優選至少約60％純度，還更優選至少約80％純度，最優選至少約90％純度的核酸序列。例如，分離的核酸序列可以通過基因工程中使用的標準克隆方法來獲得，所說的基因工程用于將核酸序列從其天然位置重新定位于其將要被復制的不同的位置。這種克隆方法可能涉及將包含編碼多肽的核酸序列的所需核酸片段切除并分離，將此片段插入載體分子，并且將重組載體摻入宿主細胞中，核酸序列的多個拷貝或克隆在其中將得到復制。核酸序列可以是基因組，cDNA，RNA，半合成的，合成來源的，或其任何的組合。
            
編碼本發明的多肽的核酸序列的修飾，對于合成與所述多肽基本類似的多肽可為必要的。術語與所述多肽″基本類似″是指非天然存在形式的多肽。這些多肽在某些工程改造方面可能與從其天然來源分離的多肽不同，例如，在比活性、熱穩定性、最適pH、變應原性等等有所差異的變體。可以是在核酸序列的基礎上構建變體序列，其中所說的核酸序列作為SEQ ID NOs1、3、5、7、9或11中任一種的多肽編碼部分或成熟肽編碼部分存在，例如其亞序列，和/或通過引入核苷酸取代來構建，所說的核苷酸取代不產生核酸序列所編碼的多肽的其他氨基酸序列，但其對應于意欲生產蛋白酶的宿主生物的密碼子使用，或者通過引入可產生不同氨基酸序列的核苷酸取代來構建。關于核苷酸取代的總體性說明，參見，例如，Ford等，1991，Protein Expression andPurincation 295-107。例如，可以如上所述制備低變應原性多肽。
            
對本領域熟練技術人員來說是顯而易見的是，這種取代可以在對分子功能至關重要的區域之外進行，并且仍然產生具有活性的多肽。可以按照本領域已知的方法，例如定點突變或丙氨酸掃描突變(參見，例如Cunningham andWells，1989，Science 2441081-1085)來鑒定氨基酸殘基，所述氨基酸殘基對于由本發明的分離的核酸序列所編碼的多肽的活性來說是必要的，并且因此優選沒有進行取代。在后一種技術中，將突變引入分子中的每一個帶正電的殘基中，測試所得突變分子的蛋白酶活性，以鑒定對于分子活性至關重要的氨基酸殘基。也可以分析通過以諸如核磁共振分析、結晶學或光親合標記(參見，例如，de Vos等，192，Science 255306-312Smith等，1992 Journalof Molecular Biology 224899-904；Wlodaver等，1992，FEBS Letters 30959-64)的技術所測定的三維結構，來測定底物-蛋白酶反應的位點。
            
本發明還涉及編碼本發明多肽的分離的核酸序列，其在非常低的嚴緊條件，優選低嚴緊條件，更優選中等嚴緊條件，更優選中-高嚴緊條件，還更優選高嚴緊條件，最優選非常高的嚴緊條件下，與核酸探針雜交，其中所說的核酸探針在相同條件下與SEQ ID NOs1、3、5、7、9或11中任一種的核酸序列，優選其成熟肽編碼部分，或互補鏈雜交；或如本文所定義的其等位變體或其亞序列(Sambrook等，1989，如上)。
            
本發明還涉及分離的核酸序列，其通過(a)在非常低、低、中等、中-高、高、非常高的嚴緊條件下將DNA與上述(i)-(vi)所提及的任一核苷酸，優選其成熟肽編碼部分，或其亞序列或互補鏈雜交；和(b)分離該核酸序列來產生。
            
產生突變核酸序列的方法本發明還涉及產生突變核酸序列的方法，包括將至少一個突變引入SEQID NOs1、3、5、7、9或11中任一種的成熟多肽編碼部分，或其亞序列，其中突變核酸序列分別編碼由SEQ ID NOs2、4、6、8、10和12的成熟肽或其具有蛋白酶活性的片段組成的多肽。
            
向核酸序列中引入突變，以便將核苷酸交換另一個核苷酸，可以通過定點突變使用本領域已知的任一種方法來完成。特別有用的是利用具有目標插入物的超螺旋、雙鏈DNA載體和含有所需突變的兩個合成引物的方法。與載體的相反鏈各自互補的寡核苷酸引物，在溫度循環期間借助Pfu DNA聚合酶延伸。一旦摻入引物，便產生包含交錯切口(nick)的突變質粒。溫度循環之后，用對于甲基化和半甲基化DNA特異性的DpnI處理產物，以消化親本DNA模板并且選擇包含突變的合成DNA。也可以使用本領域已知的其他方法。
            
核酸構建體本發明還涉及含有與一個或多個控制序列可操作性相連的本發明核酸序列的核酸構建體，其中所說的控制序列在與控制序列相容的條件下指導編碼序列在適當的宿主細胞中表達。表達應理解為包括生產多肽時所涉及的任何步驟，其包括但不限于轉錄、轉錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾和分泌。
            
本文中的″核酸構建體″定義為單鏈或雙鏈的核酸分子，其從天然存在的基因中分離，或者是經過修飾，以包含以自然界不存在的其它方式組合和并列的核酸的區段。當核酸構建體包含表達本發明的編碼序列所需要的所有控制序列時，術語核酸構建體與術語表達盒是同義的。本文中術語″編碼序列″定義為直接說明其蛋白質產物的氨基酸序列的核酸序列。編碼序列的界限通常通過位于mRNA 5′端的開放閱讀框正上游的核糖體結合位點(原核生物)或ATG起始密碼子(真核生物)，及位于mRNA 3′端的開放閱讀框正下游的轉錄終止子序列來確定。編碼序列可以包括但不限于DNA、cDNA、以及重組核酸序列。
            
編碼本發明多肽的分離的核酸序列可以按各種各樣的方式來操縱，以提供多肽的表達。將核酸序列插入載體之前操縱核酸序列是合意的或是必要的，取決于表達載體。利用重組DNA方法對核酸序列進行修飾的技術是本領域所公知的。
            
本文中的術語″控制序列″定義為包括表達本發明多肽所必需的或有利的所有組分。每個控制序列對于編碼多肽的核酸序列來說可以是天然的或者是外源的。這種控制序列包括但不限于前導序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、啟動子、信號肽序列和轉錄終止子。控制序列最少包括啟動子及轉錄和翻譯終止信號。控制序列可與接頭一起提供，目的是為了引入特定限制性位點，有助于控制序列與編碼多肽的核酸序列的編碼區連接。本文中，術語″可操作性相連″定義為一種構型，在這種構型中，控制序列被適當地放置在與DNA序列的編碼序列相關的位置，以使控制序列指導多肽的表達。
            
控制序列可以是合適的啟動子序列，其為由宿主細胞識別用來表達所述核酸序列的核酸序列。啟動子序列含有介導多肽表達的轉錄控制序列。啟動子可以是在所選擇的宿主細胞中顯示轉錄活性的任何核酸序列，包括突變、截短和雜合的啟動子，并可以由編碼胞外或胞內多肽的基因獲得，其中所說的基因與宿主細胞同源或異源。
            
指導本發明核酸構建體轉錄、特別是在細菌宿主細胞中轉錄的適宜的啟動子的實例為獲得自下述的啟動子大腸桿菌lac操縱子、天藍色鏈霉菌(Streptomyces coelicolor)瓊脂酶基因(dagA)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)果聚糖蔗糖酶基因(sacB)，地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)α-淀粉酶基因(amyL)、嗜熱脂肪芽胞桿菌(Bacillus stearothermophilus)產麥芽糖淀粉酶基因(amyM)、解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢桿菌青霉素酶基因(penP)、枯草芽孢桿菌xylA和xylB基因以及原核生物β-內酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等，1978，Proceedings of the NationalAcademy of Sciences USA 753727-3731)的啟動子，以及tac啟動子(DeBoer等，1983，Proceedings of the National Academy of Sciences USA 8021-25)。其他啟動子在″Useful proteins from recombinant bacteria″in ScientificAmerican，1980，24274-94中；及在Sambrook等，1989，同上中描述。
            
指導本發明核酸構建體在絲狀真菌宿主細胞中轉錄的適宜的啟動子的實例為從米曲霉(Aspergillus oryzae)TAKA淀粉酶、米赫根毛霉(Rhizomucormiehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉(Aspergillus niger)中性α-淀粉酶、黑曲霉酸穩定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉(Aspergillus awamori)葡萄糖淀粉酶(glaA)、米赫根毛霉脂肪酶、米曲霉堿性蛋白酶、米曲霉磷酸丙糖異構酶、構巢曲霉(Aspergillus nidulans)乙酰胺酶和尖鐮孢(Fusarium oxysporum)胰蛋白酶樣蛋白酶的基因中獲得的啟動子(WO 96/00787)，以及NA2-tpi啟動子(來自黑曲霉中性α-淀粉酶與米曲霉磷酸丙糖異構酶的基因的啟動子的雜合體)，及其突變、截短的和雜合的啟動子。
            
在酵母宿主中，有用的啟動子從釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)烯醇化酶(ENO-1)、釀酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、釀酒酵母醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶(ADH2/GAP)及釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶的基因中獲得。其他有用的酵母宿主細胞啟動子由Romanos等，1992，Yeast 8423-488描述。
            
控制序列也可以是適宜的轉錄終止子序列，其為由宿主細胞所識別來終止轉錄的序列。終止子序列與編碼多肽的核酸序列3′末端可操作性相連。任何在所選擇的宿主細胞中發揮功能的終止子均可用于本發明。
            
用于絲狀真菌宿主細胞的優選的終止子從米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡萄糖淀粉酶、構巢曲霉鄰氨基苯甲酸合酶、黑曲霉α-葡萄糖苷酶和尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶的基因中獲得。
            
用于酵母宿主細胞的優選的終止子從釀酒酵母烯醇化酶、釀酒酵母細胞色素C(CYC1)和釀酒酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶的基因中獲得。其他用于酵母宿主細胞的有用終止子由Romanos等，1992，同上描述。
            
用于細菌宿主細胞例如芽孢桿菌的優選的終止子為來自地衣芽孢桿菌α-淀粉酶基因(amyL)、嗜熱脂肪芽胞桿菌產麥芽糖淀粉酶基因(amyM)或解淀粉芽孢桿菌α-淀粉酶基因(amyQ)的終止子。
            
控制序列還可以是適宜的前導序列，其是mRNA的非翻譯區，對宿主細胞的翻譯是重要的。前導序列與編碼多肽的核酸序列5′末端可操作性相連。任何在所選擇的宿主細胞中發揮功能的前導序列均可用于本發明。
            
用于絲狀真菌宿主細胞的優選的前導序列從米曲霉TAKA淀粉酶和構巢曲霉丙糖磷酸異構酶的基因中獲得。
            
用于酵母宿主細胞的適宜的前導序列從釀酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、釀酒酵母α-因子和釀酒酵母醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶(ADH2/GAP)的基因中獲得。
            
控制序列還可以是聚腺苷酸化序列，其為與核酸序列的3’末端可操作性相連的序列，當轉錄時，其作為向轉錄的mRNA添加多聚腺苷殘基的信號由宿主細胞所識別。任何在所選擇的宿主細胞中發揮功能的聚腺苷酸化序列均可用于本發明。
            
用于絲狀真菌宿主細胞的優選聚腺苷酸化序列從米曲霉TAKA淀粉酶，黑曲霉葡萄糖淀粉酶、構巢曲霉鄰氨基苯甲酸合酶、尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶和黑曲霉α-葡萄糖苷酶的基因中獲得。
            
用于酵母宿主細胞的有用的聚腺苷酸化序列在Guo和Sherman，1995，Molecular Cellular Biology 155983-5990中有所描述。
            
控制序列還可以是信號肽編碼區，其編碼連接于多肽氨基末端的氨基酸序列，并且指導所編碼的多肽進入細胞分泌途徑。核酸序列的編碼序列5′端可以固有地包含信號肽編碼區，該信號肽編碼區在翻譯閱讀框中天然地與編碼分泌多肽的編碼區片段相連。或者，編碼區的5′端可以包含對編碼序列來說為外源的信號肽編碼區。編碼序列不天然地包括信號肽編碼區時，就需要外源的信號肽編碼區。或者，外源信號肽編碼區可以簡單地替換天然的信號肽編碼區以增強多肽的分泌。然而，引導表達的多肽進入所選擇的宿主細胞分泌途徑的任何信號肽編碼區均可用于本發明。
            
用于細菌宿主細胞的有效的信號肽編碼區是從芽孢桿菌NCIB 11837產麥芽糖淀粉酶、嗜熱脂肪芽胞桿菌α-淀粉酶、地衣芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶、地衣芽孢桿菌α-淀粉酶、嗜熱脂肪芽胞桿菌中性蛋白酶(nprT，nprS，nprM)和枯草芽孢桿菌prsA的基因中獲得的信號肽編碼區。Simonen和Palva，1993，1993，Microbiological Reviews 57109-137中描述了更多的信號肽。
            
用于絲狀真菌宿主細胞的有效的信號肽編碼區是從米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡萄糖淀粉酶、米赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、Humicola insolens纖維素酶和Humicola lanuginosa脂肪酶的基因中獲得的信號肽編碼區。
            
用于酵母宿主細胞的有用的信號肽從釀酒酵母α-因子和釀酒酵母轉化酶的基因中獲得。其他的有用信號肽編碼區由Romanos等，1992，同上描述。
            
控制序列還可以是編碼位于多肽氨基末端的氨基酸序列的前肽編碼區。所得的多肽稱為前體酶(proenzyme)或前體多肽(propolypeptide)(有些情況中稱為酶原)。前體多肽通常是無活性的并且可以由前體多肽通過前肽催化或自體催化裂解轉變為成熟的活性多肽。前肽編碼區可以從枯草芽孢桿菌堿性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢桿菌中性蛋白酶(nprT)、釀酒酵母α-因子、米赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、嗜熱毀絲霉(Myceliophthora thermophila)漆酶(WO 95/33836)的基因中獲得。
            
在一個優選的實施方案中，信號肽編碼區是SEQ ID NOs1、3、5、7、9或11中任一種的信號肽編碼區。
            
在另一個優選的實施方案中，前肽編碼區是SEQ ID NOs1、3、5、7、9或11中任一種的前肽編碼區。
            
當信號肽和前肽區兩者都存在于多肽的氨基端時，前肽區位于多肽的氨基末端之后，而信號肽區位于前肽區的氨基末端之后。
            
添加允許相對于宿主細胞生長來調控多肽表達的調控序列也是合意的。調控系統的實例為，可引起基因的表達因響應化學或物理刺激，包括調控化合物的存在，而開啟或關閉的那些調控系統。原核系統中的調控系統包括lac、tac和trp操縱子系統。在酵母中，可以使用ADH2系統或GAL1系統。在絲狀真菌中，可使用TAKAα-淀粉酶啟動子、黑曲霉葡萄糖淀粉酶啟動子和米曲霉葡萄糖淀粉酶啟動子作為調控序列。調控序列的其他實例為允許基因擴增的那些調控序列。在真核系統中，其包括存在氨甲蝶呤(methotrexate)時擴增的二氫葉酸還原酶基因，以及以重金屬擴增的金屬硫蛋白基因。在這些情況下，編碼多肽的核酸序列將與調控序列可操作性相連。
            
表達載體本發明還涉及包含本發明核酸序列、啟動子和轉錄及翻譯終止信號的重組表達載體。上述的各種核酸和控制序列可連接在一起以產生重組表達載體，其可以包括一個或多個方便的限制性位點，以允許在這些位點上插入或取代編碼多肽的核酸序列。或者，可以通過將核酸序列或包括該序列的核酸構建體插入用于表達的合適載體來表達本發明的核酸序列。在構建表達載體時，將編碼序列置于載體中，以將編碼序列與適當的表達控制序列可操作性相連。
            
重組表達載體可以是能夠方便進行重組DNA方法并且可以導致核酸序列表達的任何載體(例如，質粒或病毒)。通常，載體的選擇取決于載體與其將要被導入的宿主細胞的相容性。該載體可以是線性的質粒或閉合的環狀質粒。
            
載體可以是自主復制的載體，即，作為染色體外的實體存在的載體，其復制不依賴于染色體的復制，例如，質粒、染色體外成分、微小染色體(minichromosome)或人工染色體。載體可以含有確保自我復制的任何方式(means)。或者，載體可以是這樣的一個載體，當其被導入宿主細胞中時，其整合到基因組中并且與其所整合的染色體(s)一起復制。另外，也可以使用同時包含將要導入宿主細胞基因組的總DNA的單一載體或質粒，或者兩個或多個載體或質粒，或者可以使用轉座子。
            
本發明的載體優選包含一個或多個可選擇標記，其允許很容易地選擇轉化的細胞。可選擇標記為基因，其產物可提供生物殺蟲劑(biocide)或病毒抗性，對重金屬的抗性、原養型變為營養缺陷型等等。細菌的可選擇標記的實例為來自枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌的dal基因，或可賦予抗生素抗性諸如氨芐青霉素、卡那霉素、氯霉素或四環素抗性的標記。用于酵母宿主細胞的適宜標記為ADE2，HIS3，LEU2，LYS2，MET3，TRP1和URA3。用于絲狀真菌宿主細胞的可選擇標記包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鳥氨酸氨基甲酰轉移酶)、bar(草銨膦乙酰轉移酶)、hygB(潮霉素磷酸轉移酶)、niaD(硝酸還原酶)、pyrG(乳清酸核苷-5′-磷酸脫羧酶)、sC(硫酸腺苷酰基轉移酶(sulfateadenyltransferase))、trpC(鄰氨基苯甲酸合酶)，及其等同物。優選用于曲霉菌細胞的為構巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG基因以及吸水鏈霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的bar基因。
            
本發明的載體優選包含允許載體穩定整合于宿主細胞基因組或者允許載體在細胞中不依賴于基因組而自主復制的一個或多個元件。
            
為了整合于宿主細胞基因組，載體可能依賴于編碼多肽的核酸序列，或者其他任何用于通過同源和不同源重組將載體穩定地整合于基因組的載體元件。或者，載體可以包含通過同源重組指導向宿主細胞基因組整合的附加的核酸序列。附加的核酸序列使載體能夠整合于宿主細胞基因組一個或多個染色體中一個或多個精確位置。為了增加在精確位置整合的可能性，整合元件應當優選包含足夠數量的核酸，例如100至1,500個堿基對，優選400至1,500個堿基對，最優選800至1,500個堿基對，這些堿基對與相應的目標序列高度同源，以增加同源重組的概率。整合元件可以是與宿主細胞基因組中的目標序列同源的任何序列。另外，整合元件可以是非編碼或編碼核酸序列。另一方面，載體可以通過非同源重組整合至宿主細胞基因組。
            
為了自主復制，載體可以進一步包含使載體能夠在所述的宿主細胞中自主復制的復制起點。細菌復制起點的實例為允許在大腸桿菌中復制的質粒pBR322，pUC19，pACYC177和pACYC184，及允許在芽孢桿菌中復制的質粒pUB110，pE194，pTA1060和pAMβ1的復制起點。用于酵母宿主細胞的復制起點的實例為2微米復制起點，ARS1，ARS4，ARS1與CEN3的組合及ARS4與CEN6的組合。復制起點可以是具有突變的復制起點，該突變使其在宿主細胞中發揮溫度敏感性功能(參見，例如，Ehrlich，1978，Proceedings ofthe National Academy of Sciences USA 751433)。
            
可以將超過一個拷貝的本發明的核酸序列插入宿主細胞中，以增加基因產物的生產。可以通過將至少一個附加拷貝的序列整合于宿主細胞基因組中，或者通過在包含擴增的可選擇標記基因拷貝的細胞中，使核酸序列包含可擴增的可選擇標記基因，并因此可以在存在適當的可選擇試劑的情況下，通過培養細胞來選擇附加拷貝的核酸序列，以得到核酸序列拷貝數的增加。
            
用于連接上述元件以構建本發明的重組表達載體的方法是本領域技術人員所熟知的(參見，例如，Sambrook等，1989，如上)。
            
還可以將蛋白酶與至少一種其他用于動物飼料的目標酶共表達，例如淀粉酶；肌醇六磷酸酶；木聚糖酶；半乳聚糖酶；α-半乳糖苷酶；蛋白酶；磷脂酶和/或β-葡聚糖酶。
            
酶可以從不同載體、從一個載體中表達或使用兩種技術的混合技術來共表達。當使用不同的載體時，載體可以具有不同的可選擇標記及不同的復制起點。當只使用一個載體時，可以從一個或多個啟動子表達基因。如果在一個啟動子(二或多順反子)的調控下克隆，所克隆的基因的順序可能影響蛋白質的表達水平。蛋白酶也可以作為融合蛋白表達，即，在讀碼框中，編碼蛋白酶的基因融合于編碼另一蛋白的基因。該蛋白可能是另一種酶或另一種酶的功能區。
            
宿主細胞本發明還涉及包含本發明核酸序列的重組宿主細胞，其有利地用于多肽的重組生產。將包含本發明核酸序列的載體導入宿主細胞，以使載體保持為染色體整合體或作為前述的自我復制的染色體外載體。術語″宿主細胞″包含因復制過程中發生突變而與親本細胞不同的親本細胞的任何后代。宿主細胞的選擇在很大程度上將取決于編碼多肽的基因及其來源。
            
宿主細胞可以是單細胞微生物，例如，原核生物，或者是非單核微生物，例如，真核生物。
            
有用的單細胞是細菌細胞，如革蘭氏陽性細菌包括但不限于芽孢桿菌屬(Bacillus)細胞，或鏈霉菌屬(Streptomyces)細胞，或乳酸細菌的細胞；或者為革蘭氏陰性細菌，例如大腸桿菌和假單胞菌屬(Pseudomonas)的菌種。乳酸細菌包括但不限于乳球菌屬(Lactococcus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、明串珠菌屬(Leuconostoc)、鏈球菌屬(Streptococcus)、片球菌屬(Pediococcus)、腸球菌屬(Enterococcus)的菌種。
            
可以通過例如原生質體轉化(參見，例如，Chang和Cohen，1979，MolecularGeneral Genetics 168111-115)，使用感受態細胞(參見，例如，Young和Spizizin，1961，Joumal of Bacteriology 81823-829，或者Dubnau和Davidoff-Abelson，1971，Joumal of Molecular Biology 56209-221)，電穿孔法(參見，例如，Shigekawa和Dower，1988，Biotechniques 6742-751)，接合法(參見，例如，Koehler和Thorne，1987，Journal ofBacteriology 1695771-5278)將載體導入細菌宿主細胞。
            
宿主細胞可以是真核細胞，例如非人動物細胞，昆蟲細胞、植物細胞或者真菌細胞。
            
在一個具體的實施方案中，宿主細胞是真菌細胞。本文所用的″真菌″包括子囊菌門(Ascomycota)、擔子菌門(Basidiomycota)、壺菌門(Chytridiomycota)和接合菌門(Zygomycota)(如Hawksworth等在Ainsworth and Bisby′sDictionary of The Fungi，8th edition，1995，CAB International，University Press，Cambridge，UK中所定義的)以及卵菌門(Oomycota)(如在Hawksworth等，1995，同上第171頁所提及的)和所有的有絲分裂孢子真菌(Hawksworth等，1995，同上)。
            
在另一個具體實施方案中，真菌宿主細胞是酵母細胞。本文中所用的″酵母″包括產子囊孢子酵母(ascosporogenous)(酵母目(Endomycetales))、產擔子孢子(basidiosporogenous)酵母和屬于不完全菌綱(Fungi Imperfecti)(酵母菌(Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分類將來可能會有所變化，因此本發明中，酵母應當按照Biology and Activities of Yeast(Skinner，F.A.，Passmore，S.M.和Davenport，R.R.，編，Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9，1980)中所描述進行定義。
            
酵母宿主細胞可以是假絲酵母(Candida)、漢遜酵母(Hansenula)，克魯維酵母(Kluyveromyces)、畢赤酵母(Pichia)、糖酵母(Saccharomyces)、裂殖酵母(Schizosaccharomyces)或者西洋蓍霉(Yarrowia)細胞。
            
真菌宿主細胞可以是絲狀真菌細胞。″絲狀真菌″包括真菌門(Eumycota)和卵菌門(Oomycota)亞門的所有絲狀形式(如Hawksworth等，1995，同上，所定義的)。絲狀真菌以由殼多糖、纖維素、葡聚糖、脫乙酰殼多糖，甘露聚糖、以及其他復合多糖組成的菌絲體壁為特征。營養生長依靠菌絲的延長并且碳的分解代謝是專性需氧的。相反，諸如釀酒酵母的酵母的營養生長是通過單細胞葉狀體(thallus)的芽殖(budding)，并且碳的分解代謝可以是發酵性的。
            
絲狀真菌宿主細胞的實例是但不限于枝頂孢霉屬(Acremonium)，曲霉屬(Aspergillus)，鐮孢屬(Fusarium)，腐質霉屬(Humicola)，毛霉屬(Mucor)，毀絲霉屬(Myceliophthora)，脈孢菌屬(Neurospora)，青霉屬(Penicillium)，梭孢殼屬(Thielavia)，Tolypocladium或木霉屬(Trichoderma)菌種的細胞。
            
真菌細胞可以通過涉及原生質體形成、原生質體轉化、以及細胞壁再生的方法以本領域已知的方式轉化。EP 238 023和Yelton等，1984，Proceedingsof the National Academy of Sciences USA 811470-1474中描述了轉化曲霉屬宿主細胞的適宜方法。Malardier等，1989，Gene 78147-156和WO 96/00787中描述了轉化鐮孢屬菌種的適宜方法。可以使用Becker和Guarente，在Abelson，J.N.和Simon，M.I.，編者，Guide to Yeast Genetics and MolecularBiology，Methods in Enzymology，Volume 194，pp 182-187，Academic Press，Inc.，New York；Ito等，1983，Journal of Bacteriology 153163；和Hinnen等，1978，Proceedings of the National Academy of Sciences USA 751920中描述的方法轉化酵母。
            
生產方法本發明還涉及本發明的多肽的生產方法，包括(a)培養菌株，該菌株的野生型能夠生產多肽，以產生含有多肽的上清液；并且(b)回收多肽。在一個優選的實施方案中，菌株是放線菌門、優選放線菌綱、更優選放線菌目，還更優選是擬諾卡氏菌科，并且最優選是擬諾卡氏菌屬的菌株，例如任何擬諾卡氏菌屬的菌種，例如前面所列的具體菌株。
            
本發明還涉及本發明的多肽的生產方法，包括(a)在有利于產生多肽的條件下培養宿主細胞；并且(b)回收多肽。
            
本發明還涉及本發明的多肽的生產方法，包括(a)在有利于產生多肽的條件下培養宿主細胞，其中宿主細胞含有突變核酸序列，該突變核酸序列在SEQID NOs1、3、5、7、9或11中任一種的成熟肽編碼部分中包含至少一個突變，其中突變核酸序列編碼多肽，該多肽(i)分別由SEQ ID NOs2、4、6、8、10或12中任一種的成熟肽組成；或(ii)是(i)的任一序列的變體，其中變體包括取代、缺失和/或插入一個或多個氨基酸，或(iii)是(i)的任一序列的等位變體，或(iv)是(i)的任一序列的片段。
            
在本發明的生產方法中，將細胞在適宜用本領域已知方法生產多肽的營養培養基中培養。例如，可以在實驗室或者工業發酵罐中，在適宜的培養基中并且在允許多肽表達和/或分離的條件下，通過搖瓶培養、小規模或大規模發酵(包括連續的、分批的、補料-分批的、或者固態發酵)來培養細胞。在包含碳源和氮源以及無機鹽的適宜營養培養基中以本領域已知的方法進行培養。合適的培養基可以從供應商處獲得，或者可以根據公布的組合物(例如，美國典型培養物保藏中心目錄中的)制備。如果多肽分泌到營養培養基中，則可以直接從培養基回收多肽。如果多肽沒有分泌，則其可以從細胞裂解物中回收。
            
可以使用本領域已知的專門用于所述多肽的方法來檢測多肽。這些檢測方法可包括使用特異性抗體、形成蛋白酶產物、或者蛋白酶底物的消失。例如，可如本文所述使用蛋白酶測試來測定多肽的活性。
            
所得的多肽可以用本領域已知的方法回收。例如，可以通過傳統的方法，包括但不限于離心、過濾、提取、噴霧干燥、蒸發、或沉淀從營養培養基中回收多肽。
            
本發明的多肽可以用本領域已知的方法來純化，包括但不限于層析(例如，離子交換層析、親合層析、疏水層析、色譜聚焦層析，大小排阻層析)、電泳方法(例如，制備性等電聚焦電泳)，差別溶解度(例如，硫酸銨沉淀)、SDS-PAGE、或者提取(參見，例如，Protein Purification，J.-C.Janson和LarsRyden，編者，VCH Publishers，New York，1989)。
            
植物本發明還涉及轉基因植物、植物部分或者植物細胞，其是用編碼本發明具有蛋白酶活性的多肽的核酸序列所轉化的，以表達和產生可回收量的多肽。多肽可以從植物或植物部分中回收。或者，就此使用包含重組多肽的植物或植物部分用于改善食物或飼料的質量，例如，提高營養價值、改善適口性和流變性質，或者用于破壞抗營養因子。
            
在一個具體的實施方案中，將所述多肽定位于種子的胚乳存儲液泡中。這可以通過用適當的信號肽將其合成為前體來獲得，參見Horvath等，PNAS，Feb.15，2000，vol.97，no.4，p.1914-1919。
            
轉基因植物可以是雙子葉的(雙子葉植物)或者單子葉的(單子葉植物)或其工程改造的變體。單子葉植物的實例為禾草，例如草地早熟禾(meadow grass)(藍草(blue grass)，藍草(Poa))，飼草，如羊茅屬(Festuca)、黑麥草屬(Lolium)，寒地型牧草(temperate grass)，如剪股穎屬(Agrostis)和谷類，例如小麥、燕麥，黑麥，大麥、水稻、高粱、黑小麥(小麥(Triticum)和黑麥(Secale)的穩定化雜種)及玉米。雙子葉植物的實例是煙草，豆科植物，例如向日葵(Helianthus)，棉花(Gossypium)，羽扇豆(lupins)、馬鈴薯、糖用甜菜、豌豆、菜豆(bean)和大豆(soybean)及十字花科植物，例如花椰菜、油菜籽以及非常相關的模式生物擬南芥(Arabidopsis thaliana)。例如，美國專利5,689,054和美國專利6,111,168中描述的低肌醇六磷酸植物為工程改造的植物的實例。
            
植物部分的實例是莖、愈傷組織、葉、根、果實、種子和塊莖，以及包含這些部分的單獨的組織，例如表皮、葉肉，薄壁組織、維管組織、分生組織。特定的植物細胞區室例如葉綠體、質外體、線粒體、液泡、過氧化物酶體和細胞質也被認為是植物部分。另外，任何植物細胞，無論什么組織來源，都被認為是植物部分。同樣，植物部分例如為方便本發明利用而分離的特定組織和細胞也被認為是植物部分，例如，胚、胚乳、糊粉和種皮。
            
這些植物、植物部分和植物細胞的后代也包括在本發明的范圍之內。
            
可以按照本領域已知的方法構建表達本發明的多肽的轉基因植物或植物細胞。簡單地說，將一個或多個編碼本發明多肽的表達構建體整合至植物宿主基因組，并且將所得的修飾的植物或植物細胞繁殖為轉基因植物或植物細胞，以此來構建植物或植物細胞。
            
方便地，所述表達構建體為核酸構建體，其包含與適當的調控序列可操作性相連的編碼本發明多肽的核酸序列，其中所說的調控序列是在所選植物或植物部分中表達核酸序列所需要的。另外，表達構建體可以包含可選擇標記，該標記用于鑒定其中已整合了表達構建體的宿主細胞，和將所述構建體導入所述植物所必需的DNA序列(后者依賴于所使用的DNA導入方法)。
            
調控序列的選擇，例如啟動子和終止子序列和可選的信號或轉運序列的選擇，例如，以需要何時、何地及如何表達多肽為基礎來確定。例如，編碼本發明多肽的基因的表達可以是組成型或誘導型，或者可以是發育、階段或組織特異性的，并且基因產物可以定向至特定的細胞區室、組織或植物部分例如種子或葉子。調控序列，例如，在Tague等，1988，Plant Physiology 86506有所描述。
            
對于組成型表達，可以使用以下的啟動子35S-CaMV啟動子(Frantk等，1980，Cell 21285-294)，玉米泛素(maize ubiqutin)1(Christensen AH，SharrockRA和Quail 1992.Maize polyubiquitin genesstructure，thermal perturbation ofexpression and transcript splicing，and promoter activity following transfertoprotoplasts by electroporation)，或者稻肌動蛋白(rice actin)1啟動子(Plant Mo.Biol.18，675-689.；Zhang W，Mc Elroy D.和Wu R 1991，Analysis of rice Actl5′region activity in transgenic rice plants.Plant Cell 3，1155-1165)。器官特異性啟動子可以是，例如，來自貯藏匯集組織(storage sink tissue)如種子、馬鈴薯塊莖和果實的啟動子(Edwards & Coruzzi，1990，Ann.Rev.Genet.24275-303)，或者來自代謝匯集組織如分生組織的啟動子(Ito等，1994，Plant Mol.Biol.24863-878)，種子特異的啟動子，如來自水稻的谷蛋白、谷醇溶蛋白、球蛋白和白蛋白的啟動子(Wu等，1998，Plant and Cell Physiology 39885-889)，來自豆球蛋白B4的蠶豆(vicia faba)啟動子和來自蠶豆的未知種子蛋白基因(Conrad等，1998，Journal of Plant Physiology 152708-711)，來自種子油體蛋白的啟動子(Chen等，1998，Plant and Cell Physiology 39935-941)，來自Brassica napus的貯藏蛋白napA啟動子，或者本領域已知的任何其他種子特異性啟動子，例如WO 91/14772所描述的。另外，啟動子可以是葉特異性啟動子，例如來自水稻或番茄的rbcs啟動子(Kyozuka等，1993，Plant Physiology102991-1000)，小球藻病毒腺嘌呤甲基轉移酶基因啟動子(Mitra and Higgins，1994，Plant Molecular Biology 2685-93)，或者水稻的aldP基因啟動子(Kagaya等，1995，Molecular and General Genetics 248668-674)，或者創傷誘導的啟動子，例如馬鈴薯pin2啟動子(Xu等，1993，Plant Molecular Biology 22573-588)。同樣，啟動子可以是能夠由非生物處理如溫度、干旱、鹽度改變所誘導的，或者是能夠由激活啟動子的外源施加的物質如乙醇、雌激素、植物激素像乙烯、脫落酸、赤霉酸和/或重金屬所誘導的。
            
也可以使用啟動子增強子元件，以便在植物中獲得更高的蛋白酶表達。例如，啟動子增強子元件可以是位于啟動子和編碼本發明多肽的核苷序列之間的內含子。例如，Xu等，1993，如上公開了稻肌動蛋白1基因的第一個內含子用于增強表達的用途。
            
更進一步，可對于所述的植物物種優化密碼子選擇，以改善表達(參見，上文引用的Horvath等)。
            
可選擇標記基因和表達構建體的任何其他部分可選自本領域中可獲得的那些。
            
根據本領域已知的常規技術將核酸構建體整合至植物基因組，所述的常規技術包括土壤桿菌(Agrobacterium)介導的轉化、病毒介導的轉化、顯微注射、粒子轟擊、基因槍法轉化、和電穿孔(Gasser等，1990，Science 2441293；Potrykus，1990，Bio/Technology 8535；Shimamoto等，1989，Nature 338274)。
            
目前，根癌土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)-介導的基因轉移是用于產生轉基因雙子葉植物的優選方法(其綜述，參見Hooykas and Schilperoort，1992，Plant Molecular Biology 1915-38)，其也可以用于轉化單子葉植物，盡管其他的轉化方法對于這些植物來說是更常用的。目前，補充根癌土壤桿菌方法用于產生轉基因單子葉植物的優選方法是對胚胎愈傷組織或發育中的胚胎進行粒子轟擊(用轉化DNA包覆的微小的金或鎢粒子)(Christou，1992，Plant Journal 2275-281；Shimamoto，1994，Current Opinion Biotechnology 5158-162；Vasil等，1992，Bio/Technology 10667-674)。用于單子葉植物轉化的另一種可替代的方法基于Omirulleh等，1993，Plant Molecular Biology21415-428中所述的原生質體轉化。
            
轉化之后，根據本領域公知的方法選擇其中具有整合的表達構建體的轉化體，并且使其再生為完整的植物。通常，設計轉化方法，通過使用例如用兩個單獨的T-DNA構建體共轉化或者通過特異性重組酶進行選擇基因的位點特異性切除以在再生期間或下一代中選擇性消除選擇基因。
            
本發明還涉及生產本發明的多肽的方法，包括(a)在有利于產生多肽的條件下，培養轉基因植物或植物細胞，其中所說的轉基因植物或植物細胞含有編碼本發明的具有蛋白酶活性的多肽的核酸序列；并且(b)回收多肽。
            
動物本發明還涉及轉基因非人動物及其產品或部分，其實例是體液，如奶和血液、器官、肉、以及動物細胞。例如在哺乳動物細胞中表達蛋白質的技術是本領域已知的，參見，例如，the handbook Protein ExpressionA PracticalApproach，Higgins和Hames(編)，Oxford University Press(1999)，以及涉及基因轉錄、RNA加工、翻譯后加工的該系列中的三本其他手冊。通常來講，為制備轉基因動物，用編碼本發明的具有蛋白酶活性的多肽的核酸序列轉化所選動物的選定細胞，以表達和產生多肽。可以從動物例如雌性動物的奶中回收多肽，或者可表達多肽以對動物自身有利，例如幫助動物消化。動物的實例在下面標題為動物飼料的部分將會提到。
            
為了生產轉基因動物從而從動物的奶中回收蛋白酶，可以將編碼蛋白酶的基因插入所述動物的受精卵，例如通過使用含有適當的奶蛋白啟動子和編碼蛋白酶的基因的轉基因表達載體來實現。將轉基因表達載體顯微注射到受精卵，并優選永久整合至染色體。一旦卵開始生長分裂，就將潛在的胚胎植入代孕母親，并鑒定攜帶有轉化基因的動物。然后可以通過傳統的飼養方法繁殖所得的動物。可以從動物的奶中純化多肽，參見，例如Meade，H.M.等(1999)Expression of recombinant proteins in the milk of transgenic animals，Gene expression systemsUsing nature for the art of expression，J，M.Fernandez和J.P.Hoeffler(編)，Academic Press。
            
在可選方案中，為產生在其體細胞和/或生殖細胞的基因組中攜帶包括異源轉基因構建體的核酸序列的轉基因非人動物，其中所說的轉基因構建體包括編碼蛋白酶的轉基因，可以如WO 2000064247所公開的，將該轉基因與用于蛋白酶唾液腺特異性表達的第一個調控序列可操作性相連。
            
組合物在又一個方面，本發明涉及含有本發明的多肽的組合物。
            
多肽組合物可以按照本領域已知的方法來制備，而且多肽組合物可以是液體或干燥組合物的形式。例如，多肽組合物可以是顆粒或微顆粒的形式。可以按照本領域已知的方法使將要包含在該組合物中的多肽穩定化。
            
下面將給出本發明的多肽或多肽組合物的優選用途的實例。
            
動物飼料本發明還涉及在動物飼料中使用具有蛋白酶活性的多肽的方法，以及含有本發明多肽的飼料組合物和飼料添加劑。
            
術語動物包括所有的動物，包括人在內。動物的實例為非反芻動物和反芻動物。反芻動物包括例如綿羊、山羊、馬、和牛，例如肉牛、母牛和小牛。在一個具體實施方案中，動物是非反芻動物。非反芻動物包括單胃動物，例如豬(pigs)或豬(swine)(包括但不限于豬仔、生長豬、和母豬)；家禽，例如火雞、鴨、雞(包括但不限于童子雞、蛋雞)；小牛；和魚(包括但不限于鮭魚、鱒魚、羅非魚、鯰魚、鯉魚)；及甲殼動物(包括但不限于蝦、對蝦)。
            
術語飼料或飼料組合物意指適于或者希望動物攝入的任何化合物、制劑、混合物或組合物。
            
在本發明的用途中，可將蛋白酶在給動物飲食之前、之后或者與飲食同時飼喂動物。后者是優選的。
            
在一個具體的實施方案中，蛋白酶，以添加到飼料中的形式或當包含在飼料添加劑中時，是明確的。″明確的″是指如通過大小排阻層析所測定的(參見WO 01/58275的實施例12)，蛋白酶制劑的純度為至少50％。在其他具體的實施方案中，通過此方法測定的蛋白酶制劑為至少60、70、80、85、88、90、92、94或至少95％純度的。
            
明確的蛋白酶制劑是有利的。例如，比較容易向飼料中添加正確劑量的蛋白酶而基本不受其他蛋白酶的干擾或污染。術語正確劑量具體是指獲得一致或恒定結果的目的，和基于所需的效果而優化劑量的能力。
            
然而，用于動物飼料用途時，蛋白酶無需具有那樣的純度；例如它可以包括其他的酶，這種情況下其可以稱為蛋白酶制劑。
            
蛋白酶制劑可以(a)直接添加到飼料中(或直接在蛋白質的處理過程中使用)，或者(b)可以用于生產一種或多種中間組合物，如飼料添加劑或者預混料，隨后將其添加到飼料中(或在處理過程中使用)。上述的純度指原始蛋白酶制劑的純度，無論其是用于上述的(a)或是(b)中。
            
特別地，具有這種純度數量級的蛋白酶制劑是可使用重組生產的方法獲得的，而使用傳統的發酵方法生產蛋白酶時，它們是不能夠如此容易地獲得的，并且有較高的批次與批次(barch-to-batch)的差異。
            
當然，可以將這種蛋白酶制劑可以與其他的酶混合。
            
在一個具體的實施方案中，用于本發明用途的蛋白酶能夠按照本文實施例8的體外模型增溶蛋白質。
            
蛋白質可以是動物蛋白，例如肉和骨粉和/或魚粉；或者可以是植物蛋白。
            
本文所用的術語植物蛋白是指包括得自或來源于植物的至少一種蛋白質的任何化合物、組合物、制劑或混合物，包括修飾的蛋白和蛋白質衍生物。在具體的實施方案中，植物蛋白的蛋白質含量為至少10，20，30，40，50或60％(w/w)。
            
植物蛋白可以得自植物蛋白源，例如豆類和谷類，例如來自豆科(Fabaceae)(豆科(Leguminosae))、十字花科(Cruciferaceae)、藜科(Chenopodiaceae)和禾本科(Poaceae)植物的原料，例如大豆粉、羽扇豆粉和油菜籽粉。
            
在一個具體的實施方案中，植物蛋白源是一種或多種豆科植物的原料，例如大豆、羽扇豆、豌豆或大豆。
            
在其他具體的實施方案中，植物蛋白源是一種或多種藜科植物的原料，例如甜菜、糖用甜菜、菠菜或奎奴亞藜(quinoa)。
            
植物蛋白源的其他實例是油菜籽、向日葵籽、棉花籽和甘藍。
            
大豆是優選的植物蛋白源。
            
植物蛋白源的其他實例是谷類，例如大麥、小麥、黑麥、燕麥、玉米(corn)、水稻、黑小麥和高梁。
            
根據本發明，用至少一種本發明的蛋白酶處理蛋白質，與空白相比可以使蛋白質的溶解增加。參考實施例8的體外模型，使用本發明的蛋白酶，可以獲得至少101％，或102％、103％、104％、105％、106％或至少107％的增溶蛋白。術語蛋白質的增溶基本上是指使一種或多種蛋白質進入溶液。這種增溶可以歸因于蛋白質從常見復合天然組合物如飼料的其他成分中釋放，這種釋放是由蛋白酶介導的。增溶可以作為可溶性蛋白對照沒有蛋白酶處理的樣品的增加量來測定(參見實施例8)。
            
根據本發明，用至少一種本發明的蛋白酶處理蛋白質，與空白相比可以增加蛋白質的可消化性。參考實施例8的體外模型，使用本發明的蛋白酶，可以獲得至少101％，或102％、103％、104％、105％、106％、107％、108％、109％、110％、111％、112％、113％、114％、115％或至少116％的可消化蛋白。
            
在處理方法的一個具體實施方案中，所述一種或多種蛋白酶影響(或作用于、或發揮增溶作用影響于)蛋白質例如植物蛋白或蛋白源。為達到此，通常將蛋白質或蛋白源懸浮于溶劑中，例如含水溶劑如水，并且針對所述酶的特征，調整pH和溫度值。例如，處理可以在實際蛋白酶的活性為至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％，70％，80％或至少90％的pH值下進行。同樣地，例如，處理可以在實際蛋白酶的活性為至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％，70％，80％或至少90％的溫度下進行。上述的百分數活性指標是相對于最大活性而言的。使酶反應持續至得到所需結果為止，此后可以通過將酶滅活，如通過熱處理步驟來終止酶反應，也可不終止。
            
在本發明處理方法的另一個具體實施方案中，蛋白酶作用是持續的(sustained)，意指，例如，將蛋白酶添加至蛋白質中，但其增溶作用可以說沒有開啟，直至以后需要時，一旦建立了適宜的增溶條件，或者一旦任何酶抑制劑被失活，或者任何其他可能用于延遲酶作用的任何方式被取消。
            
在一個實施方案中，所述的處理是對動物飼料或動物飼料中使用的蛋白質的預處理，即在攝取前將蛋白質增溶。
            
術語改善動物飼料的營養價值意指改善蛋白質的可利用性，由此使蛋白質的提取增加，蛋白質的產量增高，和/或改善蛋白質的利用。因此，飼料的營養價值得到提高，動物的生長率和/或增重和/或飼料轉化率(即，攝取的飼料重量與增重的對比)就會得到改善。
            
可以將蛋白酶以任何形式加入飼料中，其可以是相對純的蛋白酶，或者是與欲加入動物飼料的其他成分一起的摻混物，例如，以飼料添加劑的形式，例如，所謂的動物飼料預混料。
            
另一方面，本發明涉及在動物飼料中使用的組合物，例如動物飼料和動物飼料添加劑，例如預混料。
            
除本發明的蛋白酶外，本發明的動物飼料添加劑還含有至少一種脂溶性維生素和/或至少一種水溶性維生素和/或至少一種痕量礦物質和/或至少一種常量(macro)礦物質。
            
此外，可選地，飼料添加劑成分是著色劑，例如，類胡蘿卜素，如β-胡蘿卜素、蝦青素、葉黃素；芳香化合物；穩定劑；抗微生物肽；多不飽和脂肪酸；活性氧生成物質和/或至少一種其他的酶，其中所說的酶選自肌醇六磷酸酶(EC 3.1.3.8或3.1.3.26)；木聚糖酶(EC 3.2.1.8)；半乳聚糖酶(EC3.2.1.89)；α-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.22)；蛋白酶(EC 3.4.-.-)；磷脂酶Al(EC3.1.1.32)；磷脂酶A2(EC 3.1.1.4)；溶血磷脂酶(EC 3.1.1.5)；磷脂酶C(3.1.4.3)；磷脂酶D(EC 3.1.4.4)；淀粉酶，例如，α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)；和/或β-葡聚糖酶(EC 3.2.1.4或EC 3.2.1.6)。
            
在一個具體的實施方案中，這些其他酶是明確的(如上述針對蛋白酶制劑所定義的)。
            
抗微生物肽(AMP’s)的實例為CAP18、Leucocin A、Tritrpticin、Protegrin-1、死亡肽(Thanstin)、防衛素(Defensin)、乳鐵蛋白(Lactoferrin)、乳鐵蛋白肽(Lactoferricin)和Ovispirin，諸如Novispirin(Robert Lehrer，2000)、Plectasins和抑制素類(Statins)，包括WO 03/044049和WO 03/048148中公開的化合物和多肽，以及保留抗微生物活性的上述肽的變體或片段。
            
抗真菌多肽(AFP’s)的實例為WO 94/01459和WO 02/090384中所公開的巨大曲霉(Aspergillus giganteus)和黑曲霉肽，以及其保留抗真菌活性的變體和片段。
            
多不飽和脂肪酸的實例為C18、C20和C22多不飽和脂肪酸，例如花生四烯酸、二十二碳六烯酸、二十碳五烯酸和γ-亞麻酸(gamma-linoleic acid)。
            
活性氧生成物質的實例是化學物質，例如過硼酸鹽、過硫酸鹽或者過碳酸鹽；和酶，例如氧化酶、加氧酶或者合成酶(syntethase)。
            
常見脂溶性和水溶性維生素以及痕量礦物質形成欲往飼料中添加的所謂預混料的一部分，而常量礦物質通常單獨添加到飼料中。這些組合物類型的任一種，當富含本發明的蛋白酶時，是本發明的動物飼料添加劑。
            
在一個具體的實施方案中，欲包含(或規定必需包含)在動物膳食或飼料中的本發明的動物飼料添加劑的水平為0.01至10.0％，更特別地在0.05至5.0％；或0.2至1.0％(％指g添加劑每100g飼料)。在預混料中尤其如此。
            
下面為這些成分的實例的非排他性列表脂溶性維生素的實例為維生素A、維生素D3、維生素E和維生素K，例如維生素K3。
            
水溶性維生素的實例為維生素B12、生物素和膽堿、維生素B1、維生素B2、維生素B6、煙酸、葉酸和泛酸鹽(panthothenate)例如Ca-D-泛酸鹽。
            
痕量礦物質的實例為錳、鋅、鐵、銅、碘、硒和鈷。
            
常量礦物質的實例為鈣、磷和鈉。
            
這些成分的營養要求(以禽類和小豬/豬為例)列于WO 01/58275的表A中。營養要求是指這些成分應該以所指出的濃度在膳食中提供。
            
在一個選擇方案中，本發明的動物飼料添加劑含有至少一種WO01/58275的表A中所具體列出的單一成分。至少一種是指一種、或兩種、或三種、或四種等等，直至所有13種，或者直至所有l5種單一成分中的任一種、一種或多種。更具體說，這種至少一種單一成分在本發明添加劑中的含量應當能夠提供表A第四欄或第五欄或第六欄所示范圍之內的飼料中濃度。
            
在又一個實施方案中，本發明的動物飼料添加劑含有至少一種下列維生素，優選提供下面表1具體所示范圍之內的飼料中濃度(分別對于小豬膳食和小雞膳食)。
            
表1典型維生素推薦  
            
     
            
本發明還涉及動物飼料組合物。動物飼料組合物或膳食具有相對高的蛋白質含量。家禽和豬的膳食可以如WO 01/58275表B第2-3欄所示來表征。魚的膳食可以如表B第4欄所示來表征。此外，這種魚的膳食通常具有200-310g/kg的粗脂肪含量。
            
WO 01/58275，對應于US 09/779334，其并入本文作為參考。
            
本發明的動物飼料組合物中具有50-800g/kg的粗蛋白含量，并且還包括至少一種本發明所要求的蛋白酶。
            
此外，或者可選地(對于上述指定的粗蛋白含量)，本發明的動物飼料組合物具有10-30MJ/kg的可代謝能量的含量；和/或0.1-200g/kg的鈣含量；和/或0.1-200g/kg的可利用磷含量；和/或0.1-100g/kg的甲硫氨酸含量；和/或0.1-150g/kg的甲硫氨酸加半胱氨酸含量；和/或0.5-50g/kg的賴氨酸含量。
            
在具體的實施方案中，可代謝能量、粗蛋白、鈣、磷、甲硫氨酸、甲硫氨酸加半胱氨酸和/或賴氨酸的含量在WO 01/58275表B(R.2-5)中2、3、4或5中的任意一個范圍之內。
            
粗蛋白計算為氮(N)乘以因數6.25，即，粗蛋白(g/kg)＝N(g/kg)×6.25。氮含量通過Kjeldahl法(A.O.A.C.，1984，Official Methods of Analysis第14版，Association of Official Analytical Chemists，Washington DC)測定。
            
可代謝能量可以根據NRC publication Nutrient requirements in swine，第9修訂版1988，subcommittee on swine nutrition，committee on animal nutrition，board of agriculture，national research council.National Academy Press，Washington，D.C.，pp.2-6，和European Table of Energy Values for PoultryFeed-stuffs.Spelderholt centre for poultry research and extension，7361 DABeekbergen，The Netherlands.Grafisch bedrijf Ponsen & looijen bv，Wageningen.ISBN 90-71463-12-5進行計算。
            
完全動物膳食中的鈣、可利用磷和氨基酸的膳食含量可以根據飼料表，如Veevoedertabel 1997，gegevens over chemische samenstelling，verteerbaarheiden voederwaarde van voedermiddelen；Central Veevoederbureau，Runderweg 6，8219 pk Lelystad.ISBN 90-72839-13-7進行計算。
            
在一個具體的實施方案中，本發明的動物飼料組合物中含有至少一種上述定義的植物蛋白。其也可以含有動物蛋白，例如肉和骨粉，和/或魚粉，一般來說，其量為0-25％。
            
在其他具體的實施方案中，本發明的動物飼料組合物含有0-80％的玉米；和/或0-80％的高梁；和/或0-70％的小麥；和/或0-70％的大麥；和/或0-30％的燕麥；和/或0-40％的大豆粉；和/或0-25％的魚粉；和/或0-25％的肉和骨粉；和/或0-20％的乳清。
            
動物膳食可以制成例如糊狀飼料(非粒狀)或粒狀飼料。一般，將磨碎的飼料-食料混和，并且按照對所述物質的說明，加入足夠量的必需維生素和礦物質。酶可以作為固體或液體酶制劑加入。例如，固體酶制劑一般可以在混和步驟之前或混和過程中加入；而液體酶制劑一般是在制粒步驟之后加入。也可以將酶摻入飼料添加劑或者預混料中。
            
膳食中的最終酶濃度在0.01-200mg酶蛋白每kg膳食的范圍內，例如在0.5-25mg酶蛋白每kg動物膳食的范圍內。
            
當然，蛋白酶應當以有效量施用，即，足夠改善飼料增溶性、可消化性和/或提高其營養價值的量。本發明包括以一個或多個下述的用量(劑量范圍)施用酶0.01-200；0.01-100；0.5-100；1-50；5-100；10-100；0.05-50；或者0.10至10，所有這些范圍均以mg蛋白酶蛋白每kg飼料(ppm)計。
            
為測定mg酶蛋白每kg飼料，將蛋白酶從飼料組合物中純化，使用相關的測試(參見下面的蛋白酶活性，底物和測試)來測定純化的蛋白酶的比活性。飼料組合物的蛋白酶活性也使用相同的測試方法如此測定，并且以這兩個測定為基礎，計算以mg酶蛋白每kg飼料計的劑量。
            
應用同樣的方法測定飼料添加劑中的mg蛋白酶蛋白。當然，如果可以獲得用于制備飼料添加劑或者飼料的蛋白酶樣品，就由該樣品測定比活性(無需從飼料組合物或添加劑中純化蛋白酶)。
            
洗滌劑組合物本發明的蛋白酶可以添加到洗滌劑組合物中，由此成為洗滌劑組合物的組分。
            
本發明的洗滌劑組合物可以配制成例如手洗或機洗的洗滌劑組合物，其包含適于預處理污染織物的洗衣添加劑組合物和漂洗加入的織物軟化劑組合物，或者可以配制成用于常規家用物品硬表面清洗操作的洗滌劑組合物，或者可以配制成用于手洗或機洗洗碗操作的洗滌劑組合物。
            
在一個具體的方面，本發明提供一種含有本發明蛋白酶的洗滌劑添加劑。洗滌劑添加劑以及洗滌劑組合物中可以包含一種或多種其他的酶，例如另一種蛋白酶，諸如源于芽孢桿菌的堿性蛋白酶、脂肪酶、角質酶、淀粉酶、糖酶、纖維素酶、果膠酶、甘露聚糖酶、阿拉伯聚糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶，例如漆酶和/或過氧化物酶。
            
通常，所選一種或多種酶的性質應當與選擇的洗滌劑相容(即，最適pH，與其他酶學和非酶學組分的相容性等)，并且所述一種或多種酶應當以有效量存在。
            
適宜的脂肪酶包括細菌或真菌來源的脂肪酶。包括化學修飾的或蛋白質工程突變體。有用的脂肪酶的例子包括來自腐質霉屬(同義詞Thermomyces)的脂肪酶，例如EP 258068和EP 305216所述來自H.lanuginosa(T.lanuginosus)或者如WO 96/13580所述來自H.insolens，假單胞菌屬(Pseudomonas)脂肪酶，例如來自產堿假單胞菌(P.alcaiigenes)或者類產堿假單胞菌(P.pseudoalcaligenes)(EP 218272)、洋蔥假單胞菌(P.cepacia)(EP 331376)、施氏假單胞菌(P.stutzeri)(GB 1,372,034)、熒光假單胞菌(P.fluorescens)、假單胞菌菌株SD 705(WO 95/06720和WO 96/27002)、P.wisconsinensis (WO 96/12012)的脂肪酶，芽孢桿菌屬脂肪酶，例如來自枯草芽孢桿菌(Dartois等，(1993)，Biochemica et Biophysica Acta，1131，253-360)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(JP64/744992)或者短小芽孢桿菌(B.pumilus)(WO 91/16422)的脂肪酶。其他的實例是例如WO 92/05249，WO 94/01541，EP 407225，EP 260105，WO 95/35381，WO 96/00292，WO 95/30744，WO 94/25578，WO 95/14783，WO 95/22615，WO 97/04079和WO97/07202中描述的脂肪酶變體。優選的商業上可獲得的脂肪酶包括LipolaseTM和Lipolase UltraTM(Novozymes A/S)。適宜的淀粉酶(α-和/或β-)包括細菌或真菌來源的淀粉酶。包括化學修飾的或者蛋白質工程突變體。淀粉酶包括，例如，由芽孢桿菌，例如地衣芽孢桿菌的特定菌株獲得的α-淀粉酶，GB 1,296,839中有其更為詳細的描述。有用的淀粉酶的實例為WO94/02597，WO 94/18314，WO 95/26397，WO 96/23873，WO 97/43424，WO00/60060和WO 01/66712中描述的變體，特別是在下述一個或多個位置具有取代的變體15，23，105，106，124，128，133，154，156，181，188，190，197，202，208，209，243，264，304，305，391，408和444。商業上可獲得的淀粉酶為NatalaseTM，SupramylTM，StainzymeTM，DuramylTM，TermamylTM，FungamylTM和BANTM(Novozymes A/S)，RapidaseTM和PurastarTM(來自Genencor Intemational Inc.)。
            
適宜的纖維素酶包括細菌或真菌來源的纖維素酶。包括化學修飾的或者蛋白質工程突變體。合適的纖維素酶包括來自芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、腐質霉屬、鐮孢屬、梭孢殼屬、枝頂孢霉屬的纖維素酶，例如US 4,435,307，US 5,648,263，US 5,691,178，US 5,776,757和WO 89/09259中公開的從Humicola insolens、嗜熱毀絲霉和尖鐮孢生產的真菌纖維素酶。特別適宜的纖維素酶是具有顏色護理益處的堿性或中性纖維素酶。這種纖維素酶的實例是EP 0 495257，EP 531372，WO 96/11262，WO 96/29397，WO 98/08940中描述的纖維素酶。其他的實例為纖維素酶變體，例如WO 94/07998，EP 0 531 315，US 5,457,046，US 5,686,593，US 5,763,254，WO 95/24471，WO 98/12307和WO 99/01544中所描述的。商業上可獲得的纖維素酶包括CelluzymeTM和CarezymerTM(Novozymes A/S)，ClazinaseTM和Puradax HATM(GenencorIntemationalInc.)及KAC-500(B)TM(Kao Corporation)。
            
適宜的過氧化物酶/氧化酶包括植物、細菌或真菌來源的過氧化物酶/氧化酶。包括化學修飾的或者蛋白質工程突變體。有用的過氧化物酶的實例包括WO 93/24618、WO 95/10602和WO 98/15257中所描述的來自鬼傘屬(Coprinus)，例如灰蓋鬼傘(C.cinereus)的過氧化物酶及其變體。商業上可獲得的過氧化物酶包括GuardzymeTM(Novozyroes)。
            
可以通過添加包含一種或多種酶的單獨的添加劑或者通過添加包含所有這些酶的組合的添加劑，將一種或多種洗滌劑酶加入洗滌劑組合物中。本發明的洗滌劑添加劑，即單獨的或組合的添加劑，可以配制成例如顆粒、液體、漿液等，優選的洗滌劑添加劑劑型為顆粒，特別是無粉塵顆粒；液體，特別是穩定化液體；或者漿液。
            
無粉塵顆粒可以例如US 4,106,991和4,661,452中所公開的進行生產，并且可任選地使用本領域已知的方法涂覆。蠟狀涂覆材料的實例為具有1000至20000平均摩爾重量的聚環氧乙烷產品(聚乙二醇，PEG)；具有16至50個環氧乙烷單位的乙氧基化壬基酚；乙氧基化脂肪醇，其中醇包含12至20個碳原子，且其具有15至80個環氧乙烷單位；脂肪醇；脂肪酸；和脂肪酸的單酸甘油酯、二酸甘油酯及三酸甘油酯。GB 1483591中給出了適于通過流化床技術施用的膜形成涂覆材料。可以根據已建立的方法，通過例如加入多元醇(polyol)如丙二醇，糖或糖醇，乳酸或者硼酸將液態酶制劑穩定化。可以根據EP 238216中公開的方法制備被保護的酶。
            
本發明的洗滌劑組合物可以是任何方便的形式，例如，條、片劑、粉劑、顆粒、糊劑或液體。液體洗滌劑可以是含水的，一般含有多至70％的水分和0-30％的有機溶劑，或者是不含水的。
            
洗滌劑組合物中含有一種或多種的表面活性劑，其可以是非離子型的，包括半極性和/或陰離子和/或陽離子和/或兩性離子型的。表面活性劑一般以0.1wt％至60wt％的水平存在。
            
當其中含有陰離子表面活性劑時，洗滌劑通常含有約1％至約40％的陰離子表面活性劑，例如線性烷基苯磺酸鹽、α-烯烴磺酸鹽、烷基硫酸鹽(脂肪醇硫酸鹽)、醇乙氧基硫酸鹽、仲烷基磺酸鹽、α-磺基脂肪酸甲酯、烷基或烯基琥珀酸或者肥皂。
            
當其中含有非離子表面活性劑時，洗滌劑通常含有約0.2％至約40％的非離子表面活性劑，例如醇乙氧基化物、壬基酚乙氧基化物、烷基多葡糖苷、烷基二甲基胺氧化物、乙氧基化脂肪酸單乙醇酰胺、脂肪酸單乙醇酰胺、多羥基烷基脂肪酸酰胺或者葡糖胺的N-酰基N-烷基衍生物(“glucamides”)。
            
洗滌劑可以含有0-65％的洗滌劑助劑或者絡合劑(complexing agent)，如沸石、二磷酸鹽、三磷酸鹽、膦酸鹽、碳酸鹽、檸檬酸鹽、次氮基三乙酸(nitrilotriacetic acid)、乙二胺四乙酸、二乙烯三胺五乙酸、烷基或烯基琥珀酸、可溶性硅酸鹽或層狀硅酸鹽(例如，來自Hoechst的SKS-6)。
            
洗滌劑可以含有一種或多種聚合物。實例為羧甲基纖維素、聚(乙烯吡咯烷酮)、聚(乙二醇)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯基吡啶-N-氧化物)、聚(乙烯基咪唑)、聚羧酸酯，如聚丙烯酸酯、馬來酸/丙烯酸共聚物和甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物。
            
洗滌劑可以含有漂白系統，其可以包含H2O2源，例如過硼酸鹽或者過碳酸鹽，其可以與形成過酸的漂白激活劑組合，其中所述形成過酸的漂白激活劑例如四乙酰乙二胺或壬酰氧苯磺酸鹽。或者，漂白系統可以含有例如酰胺、酰亞胺、砜類型的過氧酸。
            
可以使用常規的穩定化試劑，來使本發明洗滌劑組合物的一種或多種酶穩定化，所述穩定化試劑例如多元醇，如丙二醇或丙三醇，糖或糖醇，乳酸，硼酸或硼酸衍生物，例如芳族硼酸酯，或苯基硼酸衍生物如4-甲酰基苯基硼酸，并且可以按照例如WO 92/19709和WO92/19708中所述來配制組合物。
            
洗滌劑中還可以含有其他常規的洗滌劑成分，例如織物調理劑，包括粘土，發泡促進劑，抑泡劑，防腐劑，污垢懸浮劑，防污垢再沉積劑，染料，殺菌劑，熒光增亮劑，助水溶物，失澤抑制劑或香料。
            
可預期在本發明的洗滌劑組合物中可以以相當于0.01-100mg酶蛋白每升洗滌液，優選0.05-5mg酶蛋白每升洗滌液，特別是0.1-1mg酶蛋白每升洗滌液的量添加任何酶，特別是本發明的酶。
            
可以將本發明的酶附加地摻入WO 97/07202所公開的洗滌劑配方中。
            
具體實施方案本發明還涉及以下具體實施方案，按編號1-21和42-121排列1、一種具有蛋白酶活性的分離多肽，選自(a)具有氨基酸序列的多肽，其中所說的氨基酸序列與SEQ ID NO4的1-192位氨基酸具有至少69.9％的同一性程度；(b)由核酸序列編碼的多肽，其中所說的核酸序列在低嚴緊條件下與(i)SEQ ID NO3的574-1149位核苷酸，(ii)(i)的至少100個核苷酸的亞序列和/或(iii)(i)或(ii)的互補鏈雜交；(c)具有SEQ ID NO4的1-192位氨基酸的氨基酸序列，包括取代、缺失、延伸和/或插入一個或多個氨基酸的多肽的變體；(d)(a)或(b)的等位變體；和(e)(a)、(b)或(d)的具有蛋白酶活性的片段。
            
2、實施方案1的多肽，其含有以下蛋白酶中的任何一種(a)SEQ ID NO6的1-192位氨基酸；(b)SEQ ID NO10的1-189位氨基酸；(c)SEQ ID NO2的1-192位氨基酸；或(d)SEQ ID NO4的1-192位氨基酸。
            
3、一種分離的核酸序列，其含有編碼具有蛋白酶活性的多肽的核酸序列，并且該核酸序列(a)編碼實施方案1-2中任一項的多肽；(b)在低嚴緊條件下與(i)SEQ ID NO3的574-1149位核苷酸，(ii)(i)的至少100個核苷酸的亞序列；和/或(iii)(i)或(ii)的互補鏈雜交；和/或(c)與SEQ ID NO3的574-1149位核苷酸具有至少77.7％的同一性程度。
            
4、實施方案3的核酸序列，其含有以下蛋白酶-編碼核酸序列中的任何一種(a)SEQ ID NO3的574-1149位核苷酸；(b)SEQ ID NO5的574-1149位核苷酸；(c)SEQ ID NO7的586-1152位核苷酸；或(d)SEQ ID NO1的568-1143位核苷酸。
            
5、一種分離的核酸序列，其通過(a)將DNA在低嚴緊條件下與(i)SEQ IDNO3的574-1149位核苷酸；(ii)(i)的至少100個核苷酸的亞序列；或(iii)(i)或(ii)的互補鏈雜交；并且(b)分離核酸序列來生產。
            
6、一種核酸構建體，含有與一個或多個控制序列可操作性相連的實施方案3-5中任一項的核酸序列，其中所說的控制序列指導多肽在適宜表達宿主中產生。
            
7、一種含有實施方案6的核酸構建體的重組表達載體。
            
8、一種含有實施方案6的核酸構建體或實施方案7的載體的重組宿主細胞。
            
9、一種轉基因植物或植物部分，能夠表達實施方案1-2中任一項的多肽。
            
10、一種轉基因非人動物或其產品或元件，能夠表達實施方案1-2中任一項的多肽。
            
11、一種實施方案1-2中任一項的多肽的生產方法，該方法包括(a)培養實施方案8的重組宿主細胞以產生含有多肽的上清液；并且(b)回收多肽。
            
12、一種實施方案1-2中任一項的多肽的生產方法，該方法包括(a)培養以下菌株中的任何一種(i)達松維爾擬諾卡氏菌達松維爾亞種DSM 43235，(ii)Nocardiopsis prasina DSM 15649，(iii)Nocardiopsis prasina DSM 14010，或(iv)嗜堿擬諾卡氏菌DSM 44657；并且(b)回收多肽。
            
13、實施方案1-2中任一項的至少一種蛋白酶的用途，用于(i)動物飼料；(ii)動物飼料添加劑；(iii)制備動物飼料中使用的組合物；(iv)改善動物飼料的營養價值；(v)增加動物飼料中可消化的和/或可溶性蛋白；(vi)增加動物飼料中蛋白水解程度；和/或(vii)處理蛋白質。
            
14、一種改善動物飼料營養價值的方法，其中將實施方案1-2中任一項的至少一種蛋白酶添加至飼料中。
            
15、一種動物飼料添加劑，含有(a)實施方案1-2中任一項的至少一種蛋白酶；和(b)至少一種脂溶性維生素，和/或(c)至少一種水溶性維生素，和/或(d)至少一種痕量礦物質。
            
16、實施方案15的動物飼料添加劑，還含有淀粉酶；肌醇六磷酸酶；木聚糖酶；半乳聚糖酶；α-半乳糖苷酶；蛋白酶，磷脂酶；和/或β-葡聚糖酶。
            
17、一種動物飼料，具有50-800g/kg的粗蛋白含量并且含有實施方案1-2中任一項的至少一種蛋白酶。
            
18、一種處理蛋白質的方法，包括將實施方案1-2中任一項的至少一種蛋白酶添加至至少一種蛋白質或蛋白源的步驟。
            
19、實施方案18的方法，其中至少一種蛋白源中包括大豆。
            
20、實施方案1-2中任一項的至少一種蛋白酶在洗滌劑中的用途。
            
21、擬諾卡氏菌屬的菌種DSM 16424。
            
42、一種具有蛋白酶活性的分離的多肽，選自下組(a)具有氨基酸序列的多肽，其中所說的氨基酸序列與SEQ ID NO2的1-192位氨基酸具有至少75.1％的同一性程度；(b)由核酸序列編碼的多肽，其中所說的核酸序列在低嚴緊條件下與(i)SEQ ID NO1的568-1143位核苷酸，(ii)(i)的至少100個核苷酸的亞序列，和/或(iii)(i)或(ii)的互補鏈雜交；(c)具有SEQ ID NO2的1-192位氨基酸的氨基酸序列，包括取代、缺失、延伸和/或插入一個或多個氨基酸的多肽的變體；(d)(a)或(b)的等位變體；和(e)(a)、(b)或(d)的具有蛋白酶活性的片段。
            
43、實施方案42的多肽，其含有以下蛋白酶中的任何一種(a)SEQ IDNO6的1-192位氨基酸；(b)SEQ ID NO2的1-192位氨基酸；或(c)SEQ IDNO4的1-192位氨基酸。
            
44、一種分離的核酸序列，含有編碼具有蛋白酶活性的多肽的核酸序列，并且該核酸序列(a)編碼實施方案42-43中任一項的多肽；(b)在低嚴緊條件下與(i)SEQ ID NO1的568-1143位核苷酸，(ii)(i)的至少100個核苷酸的亞序列，和/或(iii)(i)或(ii)的互補鏈雜交；和/或(c)與SEQ ID NO1的568-1143位核苷酸具有至少81.2％的同一性程度。
            
45、實施方案3或44的核酸序列，其含有以下編碼蛋白酶的核酸序列中的任何一種(a)SEQ ID NO3的574-1149位核苷酸；(b)SEQ ID NO5的574-1149核苷酸；或(c)SEQ ID NO1的568-1143位核苷酸。
            
46、一種分離的核酸序列，通過下述產生(a)將DNA在低嚴緊條件下與(i)SEQ ID NO1的568-1143位核苷酸；(ii)(i)的至少100個核苷酸的亞序列，或(iii)(i)或(ii)的互補鏈雜交；和(b)分離核酸序列。
            
47、一種核酸構建體，含有與一個或多個控制序列可操作性相連的實施方案44-46中任一項的核酸序列，其中所說的控制序列指導多肽在適宜表達宿主中產生。
            
48、一種含有實施方案47的核酸構建體的重組表達載體。
            
49、一種含有實施方案47的核酸構建體或實施方案48的載體的重組宿主細胞。
            
50、一種轉基因植物或植物部分，其能夠表達實施方案42-43中任一項的多肽。
            
51、一種轉基因非人動物或其產品或元件，其能夠表達實施方案42-43中任一項的多肽。
            
52、一種生產實施方案42-43中任一項的多肽的方法，該方法包括(a)培養實施方案49的重組宿主細胞，產生含有多肽的上清液；并且(b)回收多肽。
            
53、一種生產實施方案42-43中任一項的多肽的方法，該方法包括(a)培養以下菌株中的任何一種(i)達松維爾擬諾卡氏菌達松維爾亞種DSM 43235，(ii)Nocardiopsis prasina DSM 15649，或(iii)Nocardiopsis prasina DSM 14010；并且(b)回收多肽。
            
54、實施方案42-43中任一項的至少一種蛋白酶的用途，用于(i)動物飼料；(ii)動物飼料添加劑；(iii)制備動物飼料中使用的組合物；(iv)提高動物飼料的營養價值；(v)增加動物飼料中可消化和/或可溶性蛋白；(vi)增加動物飲食中蛋白水解程度；和/或(vii)處理蛋白質。
            
55、一種提高動物飼料營養價值的方法，其中將實施方案42-43中任一項的至少一種蛋白酶添加至飼料中。
            
56、一種動物飼料添加劑，含有(a)實施方案42-43中任一項的至少一種蛋白酶；和(b)至少一種脂溶性維生素，和/或(c)至少一種水溶性維生素，和/或(d)至少一種痕量礦物質。
            
57、實施方案56的動物飼料添加劑，還含有淀粉酶；肌醇六磷酸酶；木聚糖酶；半乳聚糖酶；α-半乳糖苷酶；蛋白酶，磷脂酶；和/或β-葡聚糖酶。
            
58、一種動物飼料，具有50-800g/kg的粗蛋白含量并且含有實施方案42-43中任一項的至少一種蛋白酶。
            
59、一種處理蛋白質的方法，包括將實施方案42-43中任一項的至少一種蛋白酶添加至至少一種蛋白質或蛋白源的步驟。
            
60、實施方案59的方法，其中至少一種蛋白源中包括大豆。
            
61、實施方案42-43中任一項的至少一種蛋白酶在洗滌劑中的用途。
            
62、一種具有蛋白酶活性的分離的多肽，其選自下組(a)具有氨基酸序列的多肽，其中所說的氨基酸序列與SEQ ID NO8的1-189位氨基酸具有至少92.2％的同一性程度；(b)由核酸序列編碼的多肽，其中所說的核酸序列在低嚴緊條件下與(i)SEQ ID NO7的586-1152位核苷酸，(ii)(i)的至少100個核苷酸的亞序列，和/或(iii)(i)或(ii)的互補鏈雜交；(c)具有SEQ ID NO8的1-189位氨基酸的氨基酸序列，包括取代、缺失、延伸和/或插入一個或多個氨基酸的多肽的變體；(d)(a)或(b)的等位變體；和(e)(a)、(b)或(d)的具有蛋白酶活性的片段。
            
63、實施方案1或62的多肽，其含有SEQ ID NO8的1-189位氨基酸。
            
64、一種分離的核酸序列，其含有編碼具有蛋白酶活性的多肽的核酸序列，并且該核酸序列(a)編碼實施方案62-63中任一項的多肽；(b)在低嚴緊條件下與(i)SEQ ID NO7的586-1152位核苷酸，(ii)(i)的至少100個核苷酸的亞序列，和/或(iii)(i)或(ii)的互補鏈雜交；和/或(c)與SEQ ID NO7的586-1152位核苷酸具有至少93.6％的同一性程度。
            
65、實施方案64的核酸序列，其含有SEQ ID NO7的586-1152位核苷酸。
            
66、一種分離的核酸序列，其通過如下產生(a)將DNA在低嚴緊條件下與(i)SEQ ID NO7的586-1152位核苷酸；(ii)(i)的至少100個核苷酸的亞序列，或(iii)(i)或(ii)的互補鏈雜交；和(b)分離核酸序列。
            
67、一種核酸構建體，其含有與一個或多個控制序列可操作性相連的實施方案64-66中任一項的核酸序列，其中所說的控制序列指導多肽在適宜表達宿主中產生。
            
68、一種含有實施方案67的核酸構建體的重組表達載體。
            
69、一種含有實施方案67的核酸構建體或實施方案68的載體的重組宿主細胞。
            
70、一種轉基因植物或植物部分，其能夠表達實施方案62-63中任一項的多肽。
            
71、一種轉基因非人動物或其產品或元件，其能夠表達實施方案62-63中任一項的多肽。
            
72、一種產生實施方案62-63中任一項的多肽的方法，該方法包括(a)培養實施方案69的重組宿主細胞，以產生含有所述多肽的上清液；并且(b)回收所述多肽。
            
73、一種產生實施方案62-63中任一項的多肽的方法，該方法包括(a)培養(i)擬諾卡氏菌屬的菌種DSM 16424；并且(b)回收所述多肽。
            
74、實施方案62-63中任一項的至少一種蛋白酶的用途，用于(i)動物飼料；(ii)動物飼料添加劑；(iii)制備動物飼料中使用的組合物；(iv)提高動物飼料營養價值；(v)增加動物飼料中可消化和/或可溶性蛋白；(vi)增加動物飲食中蛋白水解程度；和/或(vii)處理蛋白質。
            
75、一種提高動物飼料營養價值的方法，其中將實施方案62-63中任一項的至少一種蛋白酶添加至飼料中。
            
76、一種動物飼料添加劑，其含有(a)實施方案62-63中任一項的至少一種蛋白酶；和(b)至少一種脂溶性維生素，和/或(c)至少一種水溶性維生素，和/或(d)至少一種痕量礦物質。
            
77、實施方案76的動物飼料添加劑，還含有淀粉酶；肌醇六磷酸酶；木聚糖酶；半乳聚糖酶；α-半乳糖苷酶；蛋白酶，磷脂酶；和/或β-葡聚糖酶。
            
78、一種動物飼料，具有50-800g/kg的粗蛋白含量并且含有實施方案62-63中任一項的至少一種蛋白酶。
            
79、一種處理蛋白質的方法，包括將實施方案62-63中任一項的至少一種蛋白酶添加至至少一種蛋白質或蛋白源的步驟。
            
80、實施方案79的方法，其中至少一種蛋白源中包括大豆。
            
81、實施方案62-63中任一項的至少一種蛋白酶在洗滌劑中的用途。
            
82、一種具有蛋白酶活性的分離的多肽，其選自下組(a)具有氨基酸序列的多肽，其中所說的氨基酸序列與SEQ ID NO10的1-189位氨基酸具有至少93.2％的同一性程度；(b)由核酸序列編碼的多肽，其中所說的核酸序列在低嚴緊條件下與(i)SEQ ID NO9的586-1149位核苷酸，(ii)(i)的至少100個核苷酸的亞序列，和/或(iii)(i)或(ii)的互補鏈雜交；(c)具有SEQ ID NO10的1-189位氨基酸的氨基酸序列，包括取代、缺失、延伸和/或插入一個或多個氨基酸的多肽的變體；(d)(a)或(b)的等位變體；和(e)(a)、(b)或(d)的具有蛋白酶活性的片段。
            
83、實施方案1或82的多肽，其含有SEQ ID NO10的1-189位氨基酸。
            
84、一種分離的核酸序列，其含有編碼具有蛋白酶活性的多肽的核酸序列，并且該核酸序列(a)編碼實施方案82-83中任一項的多肽；(b)在低嚴緊條件下與(i)SEQ ID NO9的586-1149位核苷酸，(ii)(i)的至少100個核苷酸的亞序列，和/或(iii)(i)或(ii)的互補鏈雜交；和/或(c)與SEQ ID NO9的586-1149位核苷酸具有至少90.3％的同一性程度。
            
85、實施方案3或84的核酸序列，其含有SEQ ID NO9的586-1149位核苷酸。
            
86、一種分離的核酸序列，其通過下述產生(a)將DNA在低嚴緊條件下與(i)SEQ ID NO9的586-1149位核苷酸；(ii)(i)的至少100個核苷酸的亞序列，或(iii)(i)或(ii)的互補鏈雜交；并且(b)分離所述核酸序列。
            
87、一種核酸構建體，含有與一個或多個控制序列可操作性相連的實施方案84-86中任一項的核酸序列，其中所說的控制序列指導多肽在適宜的表達宿主中產生。
            
88、一種含有實施方案87的核酸構建體的重組表達載體。
            
89、一種含有實施方案87的核酸構建體或實施方案88的載體的重組宿主細胞。
            
90、一種轉基因植物或植物部分，其能夠表達實施方案82-83中任一項的多肽。
            
91、一種轉基因非人動物或其產品或元件，能夠表達實施方案82-83中任一項的多肽。
            
92、一種產生實施方案82-83中任一項的多肽的方法，該方法包括(a)培養實施方案89的重組宿主細胞，以產生含有所述多肽的上清液；并且(b)回收該多肽。
            
93、一種產生實施方案82-83中任一項的多肽的方法，該方法包括培養嗜堿擬諾卡氏菌DSM 44657；并且回收所述多肽。
            
94、實施方案82-83中任一項的至少一種蛋白酶的用途，用于(i)動物飼料；(ii)動物飼料添加劑；(iii)制備動物飼料中使用的組合物；(iv)提高動物飼料營養價值；(v)增加動物飼料中可消化和/或可溶性蛋白；(vi)增加動物飲食中蛋白水解程度；和/或(vii)處理蛋白質。
            
95、一種提高動物飼料營養價值的方法，其中將實施方案82-83中任一項的至少一種蛋白酶添加至飼料中。
            
96、一種動物飼料添加劑，含有(a)實施方案82-83中任一項的至少一種蛋白酶；和(b)至少一種脂溶性維生素，和/或(c)至少一種水溶性維生素，和/或(d)至少一種痕量礦物質。
            
97、實施方案96的動物飼料添加劑，還含有淀粉酶；肌醇六磷酸酶；木聚糖酶；半乳聚糖酶；α-半乳糖苷酶；蛋白酶，磷脂酶；和/或β-葡聚糖酶。
            
98、一種動物飼料，具有50-800g/kg的粗蛋白含量并且含有實施方案82-83中任一項的至少一種蛋白酶。
            
99、一種處理蛋白質的方法，包括將實施方案82-83中任一項的至少一種蛋白酶添加至至少一種蛋白質或蛋白源的步驟。
            
100、實施方案99的方法，其中至少一種蛋白源中包括大豆。
            
101、實施方案82-83中任一項的至少一種蛋白酶在洗滌劑中的用途。
            
102、一種具有蛋白酶活性的分離的多肽，選自(a)具有氨基酸序列的多肽，其中所說的氨基酸序列與SEQ ID NO12的1-189位氨基酸具有至少83.3％的同一性程度；(b)由核酸序列編碼的多肽，其中所說的核酸序列在低嚴緊條件下與(i)SEQ ID NO11的586-1152位核苷酸，(ii)(i)的至少100個核苷酸的亞序列，和/或(iii)(i)或(ii)的互補鏈雜交；(c)具有SEQ ID NO12的1-189位氨基酸的氨基酸序列，包括取代、缺失、延伸和/或插入一個或多個氨基酸的多肽的變體；(d)(a)或(b)的等位變體；和(e)(a)、(b)或(d)的具有蛋白酶活性的片段。
            
103、實施方案1或102的多肽，其含有SEQ ID NO12的1-189位氨基酸。
            
104、一種分離的核酸序列，其含有編碼具有蛋白酶活性的多肽的核酸序列，并且該核酸序列(a)編碼實施方案102-103中任一項的多肽；(b)在低嚴緊條件下與(i)SEQ ID NO11的586-1152位核苷酸，(ii)(i)的至少100個核苷酸的亞序列，和/或(iii)(i)或(ii)的互補鏈雜交；和/或(c)具有與SEQ ID NO11的586-1152位核苷酸至少83.9％的同一性程度。
            
105、實施方案104的核酸序列，其含有SEQ ID NO11的586-1152位核苷酸。
            
106、一種分離的核酸序列，其通過下述產生(a)將DNA在低嚴緊條件下與(i)SEQ ID NO11的586-1152位核苷酸；(ii)(i)的至少100個核苷酸的亞序列，或(iii)(i)或(ii)的互補鏈雜交；并且(b)分離所述核酸序列。
            
107、一種核酸構建體，含有與一個或多個控制序列可操作性相連的實施方案104-106中任一項的核酸序列，其中所說的控制序列指導多肽在適宜的表達宿主中產生。
            
108、一種含有實施方案107的核酸構建體的重組表達載體。
            
109、一種含有實施方案107的核酸構建體或實施方案108的載體的重組宿主細胞。
            
110、一種轉基因植物或植物部分，其能夠表達實施方案102-103中任一項的多肽。
            
111、一種轉基因非人動物或其產品或元件，其能夠表達實施方案102-103中任一項的多肽。
            
112、一種產生實施方案102-103中任一項的多肽的方法，該方法包括(a)培養實施方案109的重組宿主細胞，以產生含有所述多肽的上清液；并且(b)回收該多肽。
            
113、一種產生實施方案102-103中任一項的多肽的方法，該方法包括培養盧森坦類諾卡氏菌DSM 44048；并且回收所述多肽。
            
114、實施方案102-103中任一項的至少一種蛋白酶的用途，用于(i)動物飼料；(ii)動物飼料添加劑；(iii)制備動物飼料中使用的組合物；(iv)提高動物飼料營養價值；(v)增加動物飼料中可消化和/或可溶性蛋白；(vi)增加動物飲食中蛋白水解的程度；和/或(vii)處理蛋白質。
            
115、一種提高動物飼料營養價值的方法，其中將實施方案102-103中任一項的至少一種蛋白酶添加至飼料中。
            
116、一種動物飼料添加劑，其含有(a)實施方案102-103中任一項的至少一種蛋白酶；和(b)至少一種脂溶性維生素，和/或(c)至少一種水溶性維生素，和/或(d)至少一種痕量礦物質。
            
117、實施方案116的動物飼料添加劑，還含有淀粉酶；肌醇六磷酸酶；木聚糖酶；半乳聚糖酶；α-半乳糖苷酶；蛋白酶，磷脂酶；和/或β-葡聚糖酶。
            
118、一種動物飼料，具有50-800g/kg的粗蛋白含量并且含有實施方案102-103中任一項的至少一種蛋白酶。
            
119、一種處理蛋白質的方法，包括將實施方案102-103中任一項的至少一種蛋白酶添加至至少一種蛋白質或蛋白源的步驟。
            
120、實施方案119的方法，其中至少一種蛋白源中包括大豆。
            
121、實施方案102-103中任一項的至少一種蛋白酶在洗滌劑中的用途。
            
生物材料的保藏以下生物材料已經按照布達佩斯條約的條款保藏于DSMZ (德國微生物和細胞培養物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH)，Mascheroder Weg 1 b，D-38124 Braunschweig，Germany)，并且給出以下保藏號保藏  保藏號   保藏日期擬諾卡氏菌屬菌株  DSM 164242004.5.24Nocardiopsis prasina  DSM 156492003.5.30Nocardiopsis prasina(以前是alba)  DSM 140102001.1.20這些菌株在確保在本專利申請未結案期間，由專利與商標委員依據37C.F.R.§1.14和35 U.S.C.§122所授權的人能夠得到該菌株的條件下保藏。這種保藏表示所保藏的菌株基本上是純的培養物。這種保藏可以在提交了這些申請的副本或其后續文本的國家，依據該外國專利法的要求獲得。然而，應當理解，保藏物的獲得并不構成對實施本發明的許可，實施本發明將侵犯由政府行為所授予的專利權。
            
菌株DSM 15649是在2001年從丹麥的土壤樣品中分離的。
            
以下菌株是公眾可以從DSMZ中獲得的達松維爾擬諾卡氏菌達松維爾亞種   DSM 43235嗜堿擬諾卡氏菌   DSM 44657盧森坦類諾卡氏菌 DSM 44048達松維爾擬諾卡氏菌達松維爾亞種菌株DSM 43235也在如下的其它保藏機構中進行了保藏ATCC 23219，IMRU 1250，NCTC 10489。
            
本文所描述及所要求保護的本發明不受本文所公開的具體實施方案的范圍所限制，因為這些實施方案旨在作為本發明幾個方面的舉例說明。任何等效的實施方案都將被認為在本發明的范圍之內。事實上，按照前面的描述，在本文所示和所述的基礎上對本發明作出各種修改，對于本領域技術人員來說是顯而易見的。這些修改也都落在所附的權利要求的范圍內。對于有沖突的情況，將以包括定義的本公開為準。
            
本文所提到的各參考文獻，其公開的內容整體并入本文作為參考。
            
實施例實施例1三種蛋白酶(L1a、L1b和L1c)的克隆和表達試劑和培養基LB瓊脂 描述于Ausubel，F.M.等(編)″Current protocols in MolecularBiology″John Wiley and Sons，1995；LB-PG瓊脂  LB瓊脂，補充0.5％葡萄糖和0.05 M磷酸鉀，pH7.0PS-1   10％蔗糖，4％大豆粉，1％Na3PO4-12H2O，0.5％CaCO3，和0.01％普魯蘭酸(pluronic acid)TE 10mM Tris-HCl，pH7.41mM EDTA，pH 8.0TEL50mg/ml溶菌酶(Lysozym)于TE-緩沖液中硫氰酸鹽   5M硫氰酸胍100mM EDTA  
            
0.6％w/v N-月桂基肌氨酸，鈉鹽，將60g硫氰酸鹽，20ml 0.5M EDTA，pH8.0，20ml H2O在65℃下溶解。冷卻至室溫(RT)并且添加0.6g N-月桂基肌氨酸。加H2O至100ml并且通過0.2μ無菌濾器過濾NH4Ac7.5M CH3COONH4TER  1μg/ml RNAse A于TE-緩沖液中CIA  氯仿/異戊醇24∶1擬諾卡氏菌屬菌株的發酵將達松維爾擬諾卡氏菌達松維爾亞種DSM 43235，Nocardiopsis prasinaDSM 15649和Nocardiopsis prasina(以前是alba)DSM 14010各菌株在以下培養基中在30℃培養3天，然后收獲胰酶解酪蛋白(trypticase)20g酵母提取物  5g氯化亞鐵6mg硫酸鎂  15mg蒸餾水至1000ml添加碳酸鈉將pH調節至9制備基因組DNA按照如下步驟分離基因組DNA1.收獲1.5ml培養物并且重懸于100μl TEL中。37℃下保溫30min。
            
2、加入500μl硫氰酸鹽緩沖液，并且在室溫放置10min。
            
3、加入250μl NH4Ac，并且置于冰上10min。
            
4、加入500μl CIA，并且混合。
            
5、轉移至微型離心機并且全速旋轉10min。
            
6、將上清轉移至新的Eppendorf管，并且加入0.54體積的冷異丙醇，徹底混和。
            
7、旋轉并且用70％EtOH洗滌DNA小丸。
            
8、將基因組DNA重懸于100μl TER中。
            
枯草芽孢桿菌表達菌株Sav-L1a、Sav-L1b和Sav-L1c的構建用以下引物1424和1485在從達松維爾擬諾卡氏菌達松維爾亞種DSM43235中分離的基因組DNA上擴增前-成熟(pro-mature)蛋白酶L1a的編碼區(SEQ ID NO1的88-1143位核苷酸)引物1485(SEQ ID NO14)5′-gcttttagttcatcgatcgcatcggctgcgaccgtaccggccgagccag-3′引物1424(SEQ ID NO15)5′-ggagcggattgaacatgcgattactaaccggtcaccagggacagcc-3′用以下引物1751和1753在從Nocardiopsis prasina DSM15649中分離的基因DNA上擴增前-成熟蛋白酶L1b的編碼區(SEQ ID NO3的88-1149位核苷酸)1751(SEQ ID NO16)5′-gttcatcgatcgcatcggctgtcaccgcacccaccgagcc-3′1753(SEQ ID NO17)5′-ggagcggattgaacatgcgattagctggtgacgaggctgaggttc-3′用以下引物1755和1756在從Nocardiopsis prasina DSM14010中分離的基因組DNA上擴增前-成熟蛋白酶L1c的編碼區(SEQ ID NO5的88-1149位核苷酸)1755(SEQ ID NO18)5′-gttcatcgatcgcatcggctgtgaccgcccccgccgag-3′1756(SEQ ID NO19)5′-ggagcggattgaacatgcgattagctcgtgacgaggctgaggttc-3′將這些L1a、L1b和L1c多核苷酸，通過PCR，各自在框內融合成編碼Sav信號肽(SEQ ID NO13)的異源DNA片段。
            
通過在枯草芽孢桿菌MB1053宿主細胞基因組(WO 03/95658)上進行同源重組來摻入這些基因(包括信號肽編碼部分)以構建枯草芽孢桿菌菌株，分別命名為Sav-L1a，Sav-L1b和Sav-L1c。在三啟動子系統(如WO 99/43835中所述)的控制下表達基因，其中所說的三啟動子系統由來自地衣芽孢桿菌α-淀粉酶基因(amyL)、解淀粉芽孢桿菌α-淀粉酶基因(amyQ)的啟動子和包括穩定化序列的蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)crylllA啟動子組成。使用編碼氯霉素乙酰轉移酶的基因作為標記(例如在Diderichsen，B.；Poulsen，G.B.；Joergensen，S.T.；A useful cloning vector for Bacillus subtilis.Plasmid 30312(1993)中描述)。
            
檢查氯霉素抗性轉化體在1％脫脂奶LB-PG瓊脂平板(補充6μg/ml氯霉素)上的蛋白酶活性。通過對插入片段進行DNA測序來進一步分析一些蛋白酶陽性菌落，以證實正確的DNA序列，并對于每個構建體選擇一個菌株。
            
芽孢桿菌屬宿主菌株的發酵將每個轉化的枯草芽孢桿菌宿主菌株在旋轉搖床(250r.p.m.)上，于500ml帶擋板的錐形瓶中發酵，其中所說的錐形瓶中含有補充6μg/ml氯霉素的100ml PS-1培養基，在37℃發酵16小時，并且在26℃發酵額外4天。
            
實施例2蛋白酶L2a的克隆和表達通過實施例1所述的步驟從擬諾卡氏菌屬的菌種DSM 16424中分離蛋白酶編碼基因(SEQ ID NO7的88-1152位核苷酸)的前體形式(pro-form)，不同之處是使用以下引物1718(SEQ ID NO20)5′-gttcatcgatcgcatcggctgcgcccggccccgtcccccag-3′1720(SEQ ID NO21)5′-ggagcggattgaacatgcgatcagctggtgcggatgcgaac-3′。
            
相應的蛋白酶(SEQ ID NO8)命名為L2a。
            
也如實施例1一般地描述，構建了枯草芽孢桿菌宿主菌株，命名為Sav-L2a，選擇氯霉素抗性的、蛋白酶陽性菌落并通過對插入物的DNA測序進行分析。
            
實施例3兩種另外的蛋白酶的克隆通過實施例1描述的方法，分別從嗜堿擬諾卡氏菌DSM 44657和盧森坦類諾卡氏菌DSM 44048中分離兩種另外的蛋白酶編碼基因(分別是核苷酸SEQ ID NO9的88-1149位核苷酸和SEQ ID NO11的88-1152位核苷酸)的前體形式，不同之處是分別使用引物1728和1763；及1747和17491728(SEQ ID NO22)5′-gttcatcgatcgcatcggctgcccccgccccccagtc-3′；1763(SEQ ID NO23)5′-ggagcggattgaacatgcgattaggtgcgcagacgcaggcccca-3′；1747(SEQ ID NO24)5′-gttcatcgatcgcatcggctggaaccgtacccaccccccagg-3′；1749(SEQ ID NO25)5′-ggagcggattgaacatgcgattagctggtgcgcagtcgcac-3′相應的蛋白酶(分別是SEQ ID NO10和12)分別命名為L2b和L2c。
            
也如實施例1一般地描述，構建枯草芽孢桿菌宿主菌株，分別命名為Sav-L2b和Sav-L2c，并且選擇氯霉素抗性的、蛋白酶陽性菌落并通過對插入物的DNA測序進行分析。
            
實施例4  L1a蛋白酶的純化和表征蛋白酶測試1)pNA測試pNA底物Suc-AAPF-pNA(Bachem L-1400)溫度   室溫(25℃)測試緩沖液 100mM琥珀酸，100mM HEPES，100mM CHES，100mMCABS，1mM CaCl2，150mM KCl，0.01％Triton X-100，用HCl或NaOH調節至pH值2.0，2.5，3.0，3.5，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0，11.0和12.0。
            
將20μl蛋白酶(用0.01％Triton X-100稀釋)與100μl測試緩沖液混和。通過添加100μl pNA底物(50mg溶于1.0ml DMSO中并進一步用0.01％TritonX-100稀釋45x)開始測試。監測OD405的增加，作為蛋白酶活性的量度。
            
2)Protazyme AK測試底物  Protazyme AK片(交聯并染色的酪蛋白；來自Megazyme)溫度  受控(測試溫度)測試緩沖液100mM琥珀酸，100mM HEPES，100mM CHES，100mMCABS，1mM CaCl2，150mM KCl，0.01％Triton X-100，用HCl或NaOH調節至pH值2.0，2.5，3.0，3.5，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0和11.0。
            
通過輕輕攪動將Protazyme AK片懸浮于2.0ml 0.01％Triton X-100中。將500μl此懸浮液和500μl測試緩沖液在Eppendorf管中混和并且放在冰上。加入20μl蛋白酶樣品(在0.01％Triton X-100中稀釋)。通過將Eppendorf管轉移至設置為測試溫度的Eppendorf熱混合器中來開始測試。將管在Eppendorf熱混合器中以其最高的搖動速率(1400rpm)保溫15分鐘。通過將管轉移至冰浴中來停止保溫。然后將管在冰冷的離心機中離心幾分鐘并且將200μl上清液轉移至微量滴定板中。讀取OD650值作為蛋白酶活性的量度。測試中包括緩沖液空白(buffer blind)(代替酶)。
            
純化也如實施例1所述，將實施例1所述的表達L1a蛋白酶的轉化的芽孢桿菌屬宿主發酵，但在26℃下發酵6天。將培養液離心(20000xg，20min)并且將上清液仔細地從沉淀中傾析出來。將合并的上清液通過Seitz EKS板過濾，以便除去剩余的芽孢桿菌屬宿主細胞。將EKS濾液轉移至G25 sephadex柱上的50mM H3BO3、5mM琥珀酸、1mM CaCl2，pH7中。向來自G25 sephadex柱的酶溶液添加固體硫酸銨，得到1.6M最終(NH4)2SO4濃度的酶溶液。在添加(NH4)2SO4期間將此酶溶液用磁力攪拌器輕輕混和并且在添加之后繼續攪拌30分鐘以使系統達到平衡。然后將酶溶液上樣于Butyl Toyopearl柱，該柱在100mM H3BO3、10mM琥珀酸、2mM CaCl2、1.6M(NH4)2SO4，pH7中平衡。用平衡緩沖液大量沖洗該柱之后，用線性(NH4)2SO4梯度(1.6至0M)在相同緩沖液中洗脫蛋白酶。收集合有蛋白酶的級分并且轉移至G25 sephadex柱上的20mM HEPES，pH8中并且上樣于Q sepharose FF柱，該柱在相同緩沖液中平衡。將柱用平衡緩沖液大量沖洗之后，用線性NaCl梯度(0至0.5M)在相同緩沖液中洗脫蛋白酶。分析柱級分的蛋白酶活性(在pH9使用Suc-AAPF-pNA測試)并且通過SDS-PAGE進一步分析活性級分。收集只有一個條帶的級分(如通過考馬斯染色的SDS-PAGE凝膠來判斷)，以便提供用于進一步表征的純化的制備物。
            
如下表征L1a蛋白酶，與得自達松維爾擬諾卡氏菌達松維爾亞種DSM43235的其他蛋白酶進行比較，其按WO 2004/111220中所述來制備(在下文中簡單命名為″L2蛋白酶″)。
            
pH-活性、pH-穩定性和溫度-活性使用pNA測試來獲得pH-活性分布以及pH-穩定性分布。對pH-穩定性分布，將蛋白酶在測試緩沖液中稀釋10x并且在37℃保溫2小時。保溫之后，進行殘余活性測試之前，通過在pH9測試緩沖液中稀釋，將蛋白酶樣品轉變至相同的pH(pH9)。使用Protazyme AK測試，獲得pH 9的溫度-活性分布。結果示于下表1-3。
            
表1pH-活性分布  
            
     
            
     
            
表2pH-穩定性分布  
            
     
            
表3溫度-活性分布  
            
     
            
     
            
其他特征L1a蛋白酶是一種α-分解蛋白酶樣的酶(肽酶家族S1E，舊稱S2A)，據發現其可通過苯甲基磺酰氟(PMSF)和鏈霉菌枯草桿菌蛋白酶抑制劑(Streptomyces Subtilisin Inhibitor)(SSI)來抑制。其相對分子量通過SDS-PAGE測定為Mr＝22kDa，并且N-末端序列ADIVGGEAY(SEQ ID NO26)。
            
實施例5L1a蛋白酶的比活性使用實施例4所述的純化的蛋白酶制劑測定比活性。當通過SDS-PAGE分析(如WO 01/58275中的實施例2A所述測定)時，制品的純度為95％以上。將此蛋白酶樣品一分為二。一部分通過氨基酸分析來分析蛋白含量(mg/ml)，另一部分分析蛋白酶活性。
            
氨基酸分析(AAA)/(mg/ml)將蛋白酶樣品的肽鍵進行酸水解，然后在Biochrom 20 Plus氨基酸分析儀(可從Bie & Bemtsen A/S，Sandbaekvej 5-7，DK-2610 Roedovre，Denmark商購獲得)上根據制造商的說明分離并且定量釋放的氨基酸。為進行酸水解，將蛋白質樣品在真空離心機中干燥，溶解于18.5％(體積/體積)HCl+0.1％(體積/體積)苯酚中，110℃下保溫16小時。保溫之后，將樣品在真空離心機中再次干燥，溶解于上樣緩沖液(0.2M檸檬酸鈉，pH2.2)，上樣到Biochrom 20Plus氨基酸分析儀。
            
為了定量，將水解的樣品加樣到陽離子交換樹脂UltroPac no.8，鈉形式(Sodium-form)，其可從Bie & Bemtsen A/S商購獲得，目錄號80-2104-15。根據制造商的說明，將pH(pH1至pH8)和離子強度變化的緩沖液泵送通過柱子，以便分離不同的氨基酸。同樣根據制造商的說明，精確控制柱溫(從53℃至92℃，并回到53℃)，以確保所需要的分離。將柱洗脫液與茚三酮試劑(Bie& Berntsen，目錄號80-2038-07)混合，并使混合物穿過氨基酸分析儀的高溫反應盤管(reaction coil)。在反應盤管中，茚三酮與氨基酸反應形成有色化合物，有色化合物的量與所存在的氨基酸的量成正比。
            
蛋白酶活性測試(AU/ml)將變性血紅蛋白(0.65％(w/w)，于6.7mM KH2PO4/NaOH緩沖液中，pH7.50)在25℃用蛋白酶降解10分鐘，用三氯乙酸(TCA)沉淀未消化的血紅蛋白，并通過過濾除去。用Folin & Ciocalteu的苯酚試劑測定濾液中的TCA可溶性的血紅蛋白降解產物，所述的試劑使幾種氨基酸顯示藍色。參照ALCALASETM標準測量并且確定活性單位(AU)，測試的詳細描述以及ALCALASETM標準的樣品可根據要求從Novozymes A/S，Krogshoejvej 36，DK-2880 Bagsvaerd，Denmark獲得(測試號EB-SM-0349.02/01)。
            
比活性計算為比活性(AU/g)＝(活性(AU/ml)/AAA(mg/ml))×1000(mg/g)。
            
L1a蛋白酶的比活性為49.8AU/g，與之對比來源于擬諾卡氏菌屬的菌種NRRL 18262的蛋白酶的比活性為38.3AU/g。
            
實施例6L2a蛋白酶的純化和表征將實施例2所述的表達L2a蛋白酶的轉化的芽孢桿菌屬宿主如實施例1所述進行發酵，但在30℃下發酵5天。將培養液離心(20000xg，20min)并且將上清液仔細地從沉淀中傾析出來。將組合的上清液通過Seitz EKS板過濾，以便除去剩余的芽孢桿菌屬宿主細胞。將EKS濾液轉移至G25 sephadex柱上的50mM H3BO3、5mM琥珀酸、1mM CaCl2，pH7中，并且上樣于在相同緩沖液中平衡的桿菌肽二氧化硅柱(silica column)。用平衡緩沖液大量沖洗桿菌肽柱之后，用100mM H3BO3、10mM琥珀酸、2mM CaCl2，1M NaCl、25％異丙醇，pH7分步洗脫(step-eluted)。將桿菌肽洗脫液轉移至G25 sephadex柱上的50mM H3BO3、10mM CH3COOH、1mM CaCl2，pH4.5中并且上樣于在相同緩沖液中平衡的S sepharose HP柱。用平衡緩沖液大量洗滌該柱之后，用相同緩沖液中的線性NaCl梯度(0至0.5M)洗脫蛋白酶。分析來自柱的級分的蛋白酶活性(使用Protazyme AK測試，在37℃和pH9)并且通過SDS-PAGE進一步分析活性級分。收集只有一個條帶的級分(如通過考馬斯染色的SDS-PAGE凝膠所判斷的)，以提供用于進一步表征的純化的制備物。
            
如上面實施例4所述表征L2a蛋白酶，與得自擬諾卡氏菌屬的菌種NRRL18262的已知蛋白酶(簡稱為″蛋白酶10″)進行比較。結果示于下表4-6。
            
表4DH-活性分布  
            
     
            
表5pH-穩定性分布  
            
     
            
表6溫度活性分布  
            
     
            
     
            
其他特征L2a蛋白酶是一種α-分解蛋白酶樣的酶(肽酶家族S1E，舊稱S2A)，據發現其受苯基甲基磺酰氟(PMSF)抑制。其相對分子量通過SDS-PAGE測定為Mr＝20kDa，并且N-末端序列ANIIGGLAYT(SEQ ID NO27)。
            
實施例7L2a蛋白酶的解鏈溫度(melting temprature)差式掃描量熱法(DSC)使用DSC，測定源自擬諾卡氏菌屬的菌種DSM 16424的L2a蛋白酶在pH7.0下的溫度穩定性。將蛋白酶如實施例6所述純化并對10mM磷酸鈉、50mM氯化鈉，pH7.0在4℃透析過夜，并且在VP-DSC儀器(Micro Cal)上，從20℃至100℃以1.5℃/min的恒定掃描速率進行操作。使用MicroCal Origin軟件進行數據處理。
            
所得的變性或解鏈溫度(Tm或Td)為78.2℃；蛋白酶10的Tm為76.5℃。
            
實施例8L2a蛋白酶在單胃體外消化模型中的性能在模擬單胃動物中的消化的體外模型中測試實施例6描述的純化的L2a蛋白酶的性能，與源自擬諾卡氏菌的菌種NRRL 18262的已知的蛋白酶(″蛋白酶10″)比較。具體地說，檢測蛋白酶改善溶解和消化玉米/-SBM(玉米/-大豆粉)蛋白的能力。該體外系統由18個燒瓶組成，其中將玉米/-SBM底物起初與HCl/胃蛋白酶一起保溫-模擬胃的消化，隨后與胰酶一起保溫-模擬腸的消化。在胃階段開始時，用蛋白酶配制8個燒瓶，而剩余的10個燒瓶作為空白。在腸保溫階段結束時，移出體外消化的樣品并且分析增溶和消化的蛋白質。
            
體外消化過程概況  
            
     
            
     
            
條件底物4g SBM，6g玉米(預混的)pH  3.0胃步驟/6.8-7.0腸步驟HCl 0.105M，1.5小時(即30min HCl-底物預混和)胃蛋白酶3000U/g飲食，1小時胰酶8mg/g飲食，4小時溫度40℃重復次數n溶液0.39M NaOH0.105M HCl0.105M HCl，含6000U胃蛋白酶每5ml1M NaHCO3，含16mg胰酶每ml125mM NaAc-緩沖液，pH6.0酶蛋白測定在A280值和氨基酸序列(氨基酸組成)的基礎上，使用S.C.Gill & P.H.vonHippel，Ahalytical Biochemistry 182，319-326，(1989)中概述的原理，計算蛋白酶酶蛋白(EP)的量。
            
體外模型的實驗過程根據上述概況進行實驗過程。在第1、2.5和5.5小時測定pH。6小時后終止保溫并且移出30ml樣品，放在冰上，然后離心(10000xg，10min，4℃)。移出上清液并且在-20℃儲存。
            
分析使用凝膠過濾分析所有樣品的增溶和消化的蛋白的含量。
            
增溶和消化的蛋白的估測使用凝膠過濾HPLC通過定量粗蛋白(CP)，來估測來自體外消化樣品的上清液中增溶蛋白的含量。將上清液融化，通過0.45μm聚碳酸酯過濾器過濾并且用H2O稀釋(1∶50，v/v)。使用Superdex Peptide PE(7.5×300mm)凝膠過濾柱(Global)將稀釋的樣品通過HPLC進行層析。用于等度洗脫(isocraticelution)的洗脫劑為含有150mM NaCl的50mM磷酸鈉緩沖液(pH7.0)。每次操作洗脫劑的總體積為26ml且流速為0.4ml/min。在214nm記錄洗脫圖(elution profile)，并且通過積分確定所述圖線下的總面積。為了從積分面積估測蛋白含量，由具有已知總蛋白含量的體外消化的對照玉米/-SBM樣品的稀釋系列中，獲得校正曲線(R2＝0.9993)。在對照樣品中，使用Kjeldahl方法(測定％氮；A.O.A.C.(1984)Official Methods of Analysis第14版，Washington DC)進行蛋白測定。
            
通過將對應于具有1500 Dalton或更低的分子量的肽和氨基酸的色譜圖面積進行積分，來估測消化蛋白的含量(Savoie，L.；Gauthier，S.F.Dialysis CellFor The In-vitro Measurement Of Protein Digestibility.J.Food Sci.1986，51，494-498；Babinszky，L.；Van，D.M.J.M.；Boer，H.；Den，H.L.A.An In-vitroMethod for Prediction of The Digestible Crude Protein Content in Pig Feeds.J.Sci.Food A gr.1990，50，173-178；Boisen，S.；Eggum，B.O.Critical Evaluationof In-vitro Methods for Estimating Digestibility in Simple-Stomach Animals.Nutrition Research Reviews 1991，4，141-162)。為測定1500 Dalton分界線，使用細胞色素C(Boehringer，Germany)、抑肽酶、胃泌素I和物質P(SigmaAldrich，USA)作為分子量標準進行校準。
            
結果下表7中所示的結果說明，L2a蛋白酶，如同蛋白酶10，使可溶性和可消化蛋白的水平相對于空白顯著增加。此外，L2a蛋白酶至少在數字上看起來使可消化蛋白的水平與已知的蛋白酶10相比得到提高。
            
表7增溶和消化的粗蛋白  
            
     
            
同一欄中的不同字母表示顯著差異(1-way ANOVA，Tukey-Kramer試驗，P＜0.05)。SD＝標準偏差。％CV＝方差系數＝(SD/平均值)×100％實施例9動物飼料和動物飼料添加劑含有本發明蛋白酶L2a的動物飼料添加劑，為維生素和礦物質預混物的形式，由下表8所示組分組成。維生素和類胡蘿卜素可從DSM NutritionalProducts商購獲得。所有量按g/kg計。
            
表8預混組合物  
            
     
            
表8的預混物與下表9中所示的組合物包含在產卵雞(layers)的飲食中。各成分的量以％(w/w)表示。L2a蛋白酶在飲食中的濃度為100mg蛋白酶酶蛋白每kg飲食。
            
表9產卵雞飲食  
            
     
            
序列表<110>諾維信公司(Novozymes A/S)<120>蛋白酶<130>10644.204-WO<160>27<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>1146<212>DNA<213>達松維爾擬諾卡氏菌達松維爾亞種DSM 43235<220>  
            
<221>CDS<222>(1)..(1143)<220>  
            
<221>sig_肽<222>(1)..(87)<220>  
            
<221>mat_肽<222>(568)..(1143)<400>1atg cga ccc tcc ccc  gct atc tcc gct atc  ggc acc ggc gca ctc 45Met Arg Pro Ser Pro  Ala Ile Ser Ala Ile  Gly Thr Gly Ala Leu-185 -180 -175gcg ttc ggt ctg gcg  ttc tcc gtg acg ccg  ggc gcc agt gcg gcg 90Ala Phe Gly Leu Ala  Phe Ser Val Thr Pro  Gly Ala Ser Ala Ala-170 -165 -160acc gta ccg gcc gag  cca gcg agc gag gcc  cag acg atg atg gaa 135Thr Val Pro Ala Glu  Pro Ala Ser Glu Ala  Gln Thr Met Met Glu-155 -150 -145gcg ctg cag aga gac  ctc ggc ctc acc ccg  ctc ggg gcc gag gag 180Ala Leu Gln Arg Asp  Leu Gly Leu Thr Pro  Leu Gly Ala Glu Glu-140 -135 -130ctg ctc tcg gcg cag  gaa gag gcg atc gag  acc gac gcc gag gcc 225Leu Leu Ser Ala Gln  Glu Glu Ala Ile Glu  Thr Asp Ala Glu Ala-125 -120 -115acc gag gcc gcg gga  gcg tcc tac ggc ggc  tcc ctg ttc gac acc 270Thr Glu Ala Ala Gly  Ala Ser Tyr Gly Gly  Ser Leu Phe Asp Thr-110 -105 -100gag acc ctc cag ctc acc gtg ctg gtg acc gac gcc tcg gcc gtc gag   318Glu Thr Leu Gln Leu Thr Val Leu Val Thr Asp Ala Ser Ala Val Glu-95 -90 -85gcg gtg gag gcc acc ggc gcc gag gcc acc gtg gtc tca cac ggc gca   366Ala Val Glu Ala Thr Gly Ala Glu Ala Thr Val Val Ser His Gly Ala-80 -75 -70gag ggc ctg gcc gag gtg gtc gac gcg ctc gac gag acc ggc ggc cgg   414Glu Gly Leu Ala Glu Val Val Asp Ala Leu Asp Glu Thr Gly Gly Arg-65 -60 -55gaa ggg gtc gtc ggc tgg tac ccg gac gtg gag agc gac acc gtc gtg   462Glu Gly Val Val Gly Trp Tyr Pro Asp Val Glu Ser Asp Thr Val Val  
            
-50 -45 -40gtc cag gtc gcc gag ggc gcc agc gcc gac ggc ctc atc gag gcc gcg  510Val Gln Val Ala Glu Gly Ala Ser Ala Asp Gly Leu Ile Glu Ala Ala-35 -30 -25 -20ggc gtg gac ccc tcc gcc gtc cgg gtg gag gag acc agt gag act ccg  558Gly Val Asp Pro Ser Ala Val Arg Val Glu Glu Thr Ser Glu Thr Pro-15 -10 -5cgc ctg tac gcc gac atc gtc ggc ggc gag gcg tac tac atg ggc ggc  606Arg Leu Tyr Ala Asp Ile Val Gly Gly Glu Ala Tyr Tyr Met Gly Gly-1  1   5   10gga cgc tgc tcg gtc ggg ttc gcc gtg acc gac ggc tcc ggc gcg ggc  654Gly Arg Cys Ser Val Gly Phe Ala Val Thr Asp Gly Ser Gly Ala Gly15  20  25ggc ttc gtg acg gcg ggc cac tgc ggc acc gtc ggc acc ggc gcc gag  702Gly Phe Val Thr Ala Gly His Cys Gly Thr Val Gly Thr Gly Ala Glu30  35  40  45agc tcc gac ggc agc ggc tcc gga acc ttc cag gag tcc gtc ttc ccg  750Ser Ser Asp Gly Ser Gly Ser Gly Thr Phe Gln Glu Ser Val Phe Pro50  55  60ggc agc gac ggc gcc ttc gtc gcg gcc acc tcc aac tgg aac gtg acc  798Gly Ser Asp Gly Ala Phe Val Ala Ala Thr Ser Asn Trp Asn Val Thr65  70  75aac ctg gtc agc cgg tac gac tcc ggc agc ccc cag gcg gtg tcg ggt  846Asn Leu Val Ser Arg Tyr Asp Ser Gly Ser Pro Gln Ala Val Ser Gly80  85  90tcc agc cag gcc ccg gag ggc tcg gcg gtg tgc cgc tcc ggc tcc acc  894Ser Ser Gln Ala Pro Glu Gly Ser Ala Val Cys Arg Ser Gly Ser Thr95  100 105acc ggc tgg cac tgc ggg acc atc gag gcc cgc ggc cag acg gtg aac  942Thr Gly Trp His Cys Gly Thr Ile Glu Ala Arg Gly Gln Thr Val Asn110 115 120 125tac ccg cag ggc acg gtc cag gac ctg acc cgg acg gac gtg tgc gcc  990Tyr Pro Gln Gly Thr Val Gln Asp Leu Thr Arg Thr Asp Val Cys Ala130 135 140gag ccc ggt gac tcc ggc ggc tcg ttc atc gcc ggt tcg cag gcc cag  1038Glu Pro Gly Asp Ser Gly Gly Ser Phe Ile Ala Gly Ser Gln Ala Gln145 150 155ggc gtc acc tcc ggc ggc tcg ggc aac tgc acc tcc ggc ggc acg acc  1086Gly Val Thr Ser Gly Gly Ser Gly Asn Cys Thr Ser Gly Gly Thr Thr160 165 170tac tac cag gag gtc act ccc ctg ctg agc agc tgg ggg ctg tcc ctg  1134Tyr Tyr Gln Glu Val Thr Pro Leu Leu Ser Ser Trp Gly Leu Ser Leu175 180 185gtg acc ggt tag  1146Val Thr Gly190<210>2<211>381<212>PRT<213>達松維爾擬諾卡氏菌達松維爾亞種DSM 43235<400>2  
            
Met Arg Pro Ser Pro  Ala Ile Ser Ala Ile  Gly Thr Gly Ala Leu-185 -180 -175Ala Phe Gly Leu Ala  Phe Ser Val Thr Pro  Gly Ala Ser Ala Ala-170 -165 -160Thr Val Pro Ala Glu  Pro Ala Ser Glu Ala  Gln Thr Met Met Glu-155 -150 -145Ala Leu Gln Arg Asp  Leu Gly Leu Thr Pro  Leu Gly Ala Glu Glu-140 -135 -130Leu Leu Ser Ala Gln  Glu Glu Ala Ile Glu  Thr Asp Ala Glu Ala-125 -120 -115Thr Glu Ala Ala Gly  Ala Ser Tyr Gly Gly  Ser Leu Phe Asp Thr-110 -105 -100Glu Thr Leu Gln Leu Thr Val Leu Val Thr Asp Ala Ser Ala Val Glu95  -90 -85Ala Val Glu Ala Thr Gly Ala Glu Ala Thr Val Val Ser His Gly Ala-80 -75 -70Glu Gly Leu Ala Glu Val Val Asp Ala Leu Asp Glu Thr Gly Gly Arg-65 -60 -55Glu Gly Val Val Gly Trp Tyr Pro Asp Val Glu Ser Asp Thr Val Val-50 -45 40Val Gln Val Ala Glu Gly Ala Ser Ala Asp Gly Leu Ile Glu Ala Ala-35 30  -25 -20Gly Val Asp Pro Ser Ala Val Arg Val Glu Glu Thr Ser Glu Thr Pro-15 10  -5Arg Leu Tyr Ala Asp Ile Val Gly Gly Glu Ala Tyr Tyr Met Gly Gly-1  1   5   10Gly Arg Cys Ser Val Gly Phe Ala Val Thr Asp Gly Ser Gly Ala Gly15  20  25Gly Phe Val Thr Ala Gly His Cys Gly Thr Val Gly Thr Gly Ala Glu30  35  40  45Ser Ser Asp Gly Ser Gly Ser Gly Thr Phe Gln Glu Ser Val Phe Pro50  55  60Gly Ser Asp Gly Ala Phe Val Ala Ala Thr Ser Asn Trp Asn Val Thr65 70  75Asn Leu Val Ser Arg Tyr Asp Ser Gly Sar Pro Gln Ala Val Ser Gly80  85  90Ser Ser Gln Ala Pro Glu Gly Ser Ala Val Cys Arg Ser Gly Ser Thr95  100 105Thr Gly Trp His Cys Gly Thr Ile Glu Ala Arg Gly Gln Thr Val Asn110 115 120 125Tyr Pro Gln Gly Thr Val Gln Asp Leu Thr Arg Thr Asp Val Cys Ala130 135 140Glu Pro Gly Asp Ser Gly Gly Ser Phe Ile Ala Gly Ser Gln Ala Gln145 150 155Gly Val Thr Ser Gly Gly Ser Gly Asn Cys Thr Ser Gly Gly Thr Thr160 165 170  
            
Tyr Tyr Gln Glu Val Thr Pro Leu Leu Ser Ser Trp Gly Leu Ser Leu175 180 185Val Thr Gly190<210>3<211>1152<212>DNA<213>Nocardiopsis prasina DSM 15649<220>  
            
<221>CDS<222>(1)..(1149)<220>  
            
<221>sig_肽<222>(1)..(87)<220>  
            
<221>mat_肽<222>(574)..(1149)<400>3atg cga  ccc tcc ccc gtc atc  tcc gcg atc ggc acg  gga gca ctg45Met Arg  Pro Ser Pro Val Ile  Ser Ala Ile Gly Thr  Gly Ala Leu-190 -185 -180gcc ttc  ggg ctc gcg ctc tcg  gtc gcg ccc ggc gcc  tcc gcc gtc90Ala Phe  Gly Leu Ala Leu Ser  Val Ala Pro Gly Ala  Ser Ala Val-175 -170 -165acc gca  ccc acc gag ccc gcg  ccc cag ggc gag gcg  gcc acc atg135Thr Ala  Pro Thr Glu Pro Ala  Pro Gln Gly Glu Ala  Ala Thr Met-160 -155 -150cag gaa  gcg ctt gag agg gac  ttc ggc ctc acc ccg  ttc gag gcc180Gln Glu  Ala Leu Glu Arg Asp  Phe Gly Leu Thr Pro  Phe Glu Ala-145 -140 -135gaa gac  ctg ctc gaa gcc cag  aat gac gct ctc ggg  atc gac acg225Glu Asp  Leu Leu Glu Ala Gln  Asn Asp Ala Leu Gly  Ile Asp Thr-130 -125 -120gcg gcg  gcc aag gcc gcc ggt  gac gcc tac gcg ggc  tcc gtg ttc270Ala Ala  Ala Lys Ala Ala Gly  Asp Ala Tyr Ala Gly  Ser Val Phe115  -110 -105gac acc  gac acc ctg gaa ctg acc gtc ctg ctc acg gac gcc gga gcc  318Asp Thr  Asp Thr Leu Glu Leu Thr Val Leu Leu Thr Asp Ala Gly Ala-100 -95 -90gtg tcg gac gtc gag gcc acc ggc gcc ggg acc gaa ctg gtc tcg tac   366Val Ser Asp Val Glu Ala Thr Gly Ala Gly Thr Glu Leu Val Ser Tyr-85 -80 -75 -70ggc acc gag ggc ctg gcg gag atc atg gac gag ctc gac gca gcc ggc   414Gly Thr Glu Gly Leu Ala Glu Ile Met Asp Glu Leu Asp Ala Ala Gly-65 -60 -55gcc cag ccg ggt gtc gtc ggc tgg tac ccg gac ctc gcc ggc gac acc   462Ala Gln Pro Gly Val Val Gly Trp Tyr Pro Asp Leu Ala Gly Asp Thr-50 -45 -40gtc gtc atc gag gcc acc gac acc tcc gag gcc cag agc ttc gtc gag   510Val Val Ile Glu Ala Thr Asp Thr Ser Glu Ala Gln Ser Phe Val Glu  
            
-35 -30 -25gcc gcg ggc gtg gac tcc tcc gcc gtc cag gtg gag cag acc gac gag  558Ala Ala Gly Val Asp Ser Ser Ala Val Gln Val Glu Gln Thr Asp Glu-20 -15 -10gcg ccg cag ctg tac gcc gac atc gtc ggc ggt gac gcc tac tac atg  606Ala Pro Gln Leu Tyr Ala Asp Ile Val Gly Gly Asp Ala Tyr Tyr Met-5  -1  1   5   10ggc ggc ggg cgc tgc tcg gtc gga ttc gcg gtc acc gac agt tcc ggc  654Gly Gly Gly Arg Cys Ser Val Gly Phe Ala Val Thr Asp Ser Ser Gly15  20  25aac gac gga ttc gtg acg gcc ggc cac tgc ggc acg gtc ggc acc tcc  702Asn Asp Gly Phe Val Thr Ala Gly His Cys Gly Thr Val Gly Thr Ser30  35  40gcc gac agc gag gac ggc agc ggc tcc ggt gtg ttc gag gag tcc arc  750Ala Asp Ser Glu Asp Gly Ser Gly Ser Gly Val Phe Glu Glu Ser Ile45  50  55ttc ccg ggc aac gac gcg gcc ttc gtc agt tcg acg tcc aac tgg acc  798Phe Pro Gly Asn Asp Ala Ala Phe Val Ser Ser Thr Ser Asn Trp Thr60  65  70  75gtc acc aac ctg gtc aac atg tac agc tcg ggt ggc acc cag tcc gtc  846Val Thr Asn Leu Val Asn Met Tyr Ser Ser Gly Gly Thr Gln Ser Val80  85  90ggc ggc tcc agc cag gcc ccg gtc ggc gcg gcc gtc tgc cgt tcc ggc  894Gly Gly Ser Ser Gln Ala Pro Val Gly Ala Ala Val Cys Arg Ser Gly95  100 105tcc acc acg ggc tgg cac tgc ggg tcc atc gag gcc cgc ggg cag tcg  942Ser Thr Thr Gly Trp His Cys Gly Ser Ile Glu Ala Arg Gly Gln Ser110 115 120gtg agc tac ccg gag ggc acc gtc acc gac atg acc cgt acc gac gtg  990Val Ser Tyr Pro Glu Gly Thr Val Thr Asp Met Thr Arg Thr Asp Val125 130 135tgc gcc gag ccc ggc gac tcc ggc ggt tcg ttc atc gcc gac gac cag  1038Cys Ala Glu Pro Gly Asp Ser Gly Gly Ser Phe Ile Ala Asp Asp Gln140 145 150 155gcc cag ggc atg acc tcg ggc ggc tcc ggc aac tgc tcc tcc ggt ggt  1086Ala Gln Gly Met Thr Ser Gly Gly Ser Gly Asn Cys Ser Ser Gly Gly160 165 170acc acg tac tac cag gag gtc ggc ccg gcg ctg agc acc tgg aac ctc  1134Thr Thr Tyr Tyr Gln Glu Val Gly Pro Ala Leu Ser Thr Trp Asn Leu175 180 185agc ctc gtc acc agc tag  1152Ser Leu Val Thr Ser190<210>4<211>383<212>PRT<213>Nocardiopsis prasina DSM 15649<400>4Met Arg  Pro Ser Pro Val Ile  Ser Ala Ile Gly Thr  Gly Ala Leu-190 -185 -180  
            
Ala Phe  Gly Leu Ala Leu Ser  Val Ala Pro Gly Ala  Ser Ala Val-175 -170 -165Thr Ala  Pro Thr Glu Pro Ala  Pro Gln Gly Glu Ala  Ala Thr Met-160 -155 -150Gln Glu  Ala Leu Glu Arg Asp  Phe Gly Leu Thr Pro  Phe Glu Ala-145 -140 -135Glu Asp  Leu Leu Glu Ala Gln  Asn Asp Ala Leu Gly  Ile Asp Thr-130 -125 -120Ala Ala  Ala Lys Ala Ala Gly  Asp Ala Tyr Ala Gly  Ser Val Phe-115 -110 -105Asp Thr  Asp Thr Leu Glu Leu Thr Val Leu Leu Thr Asp Ala Gly Ala-100 -95 -90Val Ser Asp Val Glu Ala Thr Gly Ala Gly Thr Glu Leu Val Ser Tyr-85 -80 -75 -70Gly Thr Glu Gly Leu Ala Glu Ile Met Asp Glu Leu Asp Ala Ala Gly-65 -60 -55Ala Gln Pro Gly Val Val Gly Trp Tyr Pro Asp Leu Ala Gly Asp Thr-50 -45 -40Val Val Ile Glu Ala Thr Asp Thr Ser Glu Ala Gln Ser Phe Val Glu-35 -30 -25Ala Ala Gly Val Asp Ser Ser Ala Val Gln Val Glu Gln Thr Asp Glu-20  -15  -10Ala Pro Gln Leu Tyr Ala Asp lle Val Gly Gly Asp Ala Tyr Tyr Met-5  -1  1   5   10Gly Gly Gly Arg Cys Ser Val Gly Phe Ala Val Thr Asp Ser Ser Gly15  20  25Asn Asp Gly Phe Val Thr Ala Gly His Cys Gly Thr Val Gly Thr Ser30  35  40Ala Asp Ser Glu Asp Gly Ser Gly Ser Gly Val Phe Glu Glu Ser Ile45  50  55Phe Pro Gly Asn Asp Ala Ala Phe Val Ser Ser Thr Ser Asn Trp Thr60  65  70  75Val Thr Asn Leu Val Asn Met Tyr Ser Ser Gly Gly Thr Gln Ser Val80  85  90Gly Gly Ser Ser Gln Ala Pro Val Gly Ala Ala Val Cys Arg Ser Gly95  100 105Ser Thr Thr Gly Trp His Cys Gly Ser Ile Glu Ala Arg Gly Gln Ser110 115 120Val Ser Tyr Pro Glu Gly Thr Val Thr Asp Met Thr Arg Thr Asp Val125 130 135Cys Ala Glu Pro Gly Asp Ser Gly Gly Ser Phe Ile Ala Asp Asp Gln140 145 150 155Ala Gln Gly Met Thr Ser Gly Gly Ser Gly Asn Cys Ser Ser Gly Gly160 165 170Thr Thr Tyr Tyr Gln Glu Val Gly Pro Ala Leu Ser Thr Trp Asn Leu175 180 185  
            
Ser Leu Val Thr Ser190<210>5<211>1152<212>DNA<213>Nocardiopsis prasina DSM 14010<220>  
            
<221>CDS<222>(1)..(1149)<220>  
            
<221>sig_肽<222>(1)..(87)<220>  
            
<22l>mat_肽<222>(574)..(1149)<400>5atg cga  ccc tcc ccc gtc atc  tcc gcg atc ggc acg  gga gcg ctg45Met Arg  Pro Ser Pro Val Ile  Ser Ala Ile Gly Thr  Gly Ala Leu-190 -185 -180gcc ttc  ggg ctc gcg ctc tcg  gtc gct ccc ggc gcc  tcc gcc gtg90Ala Phe  Gly Leu Ala Leu Ser  Val Ala Pro Gly Ala  Ser Ala Val-175 -170 -165acc gcc  ccc gcc gag ccc tcg  ccc cag ggc gag gcg  acc acc atg135Thr Ala  Pro Ala Glu Pro Ser  Pro Gln Gly Glu Ala  Thr Thr Met-160 -155 -150cag gaa  gcg ctt gag agg gac  ttc ggc ctc acc ccg  ttc gag gcc180Gln Glu  Ala Leu Glu Arg Asp  Phe Gly Leu Thr Pro  Phe Glu Ala-145 -140 -135gac gac  ctg ctc gaa gcc cag  aag gag gcc ctc ggg  atc gac acg225Asp Asp  Leu Leu Glu Ala Gln  Lys Glu Ala Leu Gly  Ile Asp Thr-130 -125 -120gcg gcg  gcc gag gcc gcc ggc  gac gcc tac gcg ggc  tcc gtg ttc270Ala Ala  Ala Glu Ala Ala Gly  Asp Ala Tyr Ala Gly  Ser Val Phe-115 -110 -105gac acc  gac acc ctg gaa ctg acc gtc ctg ctc acg gac ggc ggc ccg  318Asp Thr  Asp Thr Leu Glu Leu Thr Val Leu Leu Thr Asp Gly Gly Pro-100 -95 -90gcg tcg gac gtc gag gcc gcc ggc gcc gag acc tcg gtg gtc tcc cac   366Ala Ser Asp Val Glu Ala Ala Gly Ala Glu Thr Ser Val Val Ser His-85 -80 -75 -70ggc acc gac ggc ctg gcg gcg atc atg gac gag ctc gac gcg gtc ggc   414Gly Thr Asp Gly Leu Ala Ala Ile Net Asp Glu Leu Asp Ala Val Gly-65 -60 -55gcc cag ccg ggt gtc gtc ggc tgg tac ccc gac ctc gcc agc gac acg   462Ala Gln Pro Gly Val Val Gly Trp Tyr Pro Asp Leu Ala Ser Asp Thr-50 -45 -40gtg gtc gtc gag gcc acc gac gcg tcc gac gcc cag ggc ttc atc gag   510Val Val Val Glu Ala Thr Asp Ala Ser Asp Ala Gln Gly Phe Ile Glu-35 -30 -25gcc gcc ggc gtg gac tcc tcc gcc gtc cag gtg gag gag acc gac gag   558Ala Ala Glv Val Asp Ser Ser Ala Val Gln Val Glu Glu Thr Asp Glu-20 -15 -10tcg ccc gag ctg tac gcc gac atc gtc ggc ggc gac gcc tac tac atg   606Ser Pro Glu Leu Tyr Ala Asp Ile Val Gly Gly Asp Ala Tyr Tyr Met-5  -1  1   5   10  
            
ggc ggc gga cgc tgc tcg gtg ggc ttc gcg gcc acc gac agc gcg ggc   654Gly Gly Gly Arg Cys Ser Val Gly Phe Ala Ala Thr Asp Ser Ala Gly15  20  25aac gac gga ttc gtg acg gcc ggc cac tgc ggc acc gtc ggc acc tcc   702Asn Asp Gly Phe Val Thr Ala Gly His Cys Gly Thr Val Gly Thr Ser30  35  40gcc gac agc gag gac ggc agc ggc tcc ggt gtg itc gag gag tcg atc   750Ala Asp Ser Glu Asp Gly Ser Gly Ser Gly Val Phe Glu Glu Ser Ile45  50  55ttc ccg ggc aac gac gcc gcc ttc gtc cgg tcc acg tcc aac tgg acc   798Phe Pro Gly Asn Asp Ala Ala Phe Val Arg Ser Thr Ser Asn Trp Thr60  65  70  75gtc acc aac ctg gtc aac atg tac agc tcc ggc ggc acc cag tcc gtc   846ValThr Asn Leu Val Asn Met Tyr Ser Ser Gly Gly Thr Gln Ser Val80  85  90ggc ggc tcc acc cag gcc ccg gtc ggc gcg gcc gtg tgc cgc tcc ggt   894Gly Gly Ser Thr Gln Ala Pro Val Gly Ala Ala Val Cys Arg Ser Gly95  100 105tcc acc acg ggc tgg cac tgc ggc acc atc gag gcc cga ggc cag tcg   942Ser Thr Thr Gly Trp His Cys Gly Thr Ile Glu Ala Arg Gly Gln Ser110 115 120gtg agc tac ccg gag ggc acc gtc aac gac atg acc cgg acc aac gtg   990Val Ser Tyr Pro Glu Gly Thr Val Asn Asp Met Thr Arg Thr Asn Val125 130 135tgc gcc gag ccc ggc gac tcc ggc ggt tcg ttc atc tcc gac gac cag   1038Cys Ala Glu Pro Gly Asp Ser Gly Gly Ser Phe Ile Ser Asp Asp Gln140 145 150 155gcc cag ggc atg acc tcg ggc ggc tcc ggc aac tgc acc tcc ggt ggt   1086Ala Gln Gly Met Thr Ser Gly Gly Ser Gly Asn Cys Thr Ser Gly Gly160 165 170acg acg tac tac cag gag gtc ggc ccg gcg ctg agc acc tgg aac ctc   1134Thr Thr Tyr Tyr Gln Glu Val Gly Pro Ala Leu Ser Thr Trp Asn Leu175 180 185agc ctc gtc acg agc tag   1152Ser Leu Val Thr Ser190<210>6<211>383<212>PRT<213>Nocardiopsis prasina DSM 14010<400>6Met Arg  Pro Ser Pro Val Ile  Ser Ala Ile Gly Thr  Gly Ala Leu-190 -185 -180Ala Phe  Gly Leu Ala Leu Ser  Val Ala Pro Gly Ala  Ser Ala Val-175 -170 -165Thr Ala  Pro Ala Glu Pro Ser  Pro Gln Gly Glu Ala  Thr Thr Met-160 -155 -150Gln Glu  Ala Leu Glu Arg Asp  Phe Gly Leu Thr Pro  Phe Glu Ala-145 -140 -135  
            
Asp Asp  Leu Leu Glu Ala Gln  Lys Glu Ala Leu Gly  Ile Asp Thr-130 -125 -120Ala Ala  Ala Glu Ala Ala Gly  Asp Ala Tyr Ala Gly  Ser Val Phe-115 -110 -105Asp Thr  Asp Thr Leu Glu Leu Thr Val Leu Leu Thr Asp Gly Gly Pro-100 -95 -90Ala Ser Asp Val Glu Ala Ala Gly Ala Glu Thr Ser Val Val Ser His-85 -80 -75 -70Gly Thr Asp Gly Leu Ala Ala Ile Met Asp Glu Leu Asp Ala Val Gly-65 -60 -55Ala Gln Pro Gly Val Val Gly Trp Tyr Pro Asp Leu Ala Ser Asp Thr-50 -45 -40Val Val Val Glu Ala Thr Asp Ala Ser Asp Ala Gln Gly Phe Ile Glu-35 -30 -25Ala Ala Gly Val Asp Ser Ser Ala Val Gln Val Glu Glu Thr Asp Glu-20 -15 -10Ser Pro Glu Leu Tyr Ala Asp Ile Val Gly Gly Asp Ala Tyr Tyr Met-5  -1  1   5   10Gly Gly Gly Arg Cys Ser ValGly Phe Ala Ala Thr Asp Ser Ala Gly15 20  25Asn Asp Gly Phe ValThr Ala Gly His Cys Gly Thr Val Gly Thr Ser30 35  40Ala Asp Ser Glu Asp Gly Ser Gly Ser Gly Val Phe Glu Glu Ser Ile45  50  55Phe Pro Gly Asn Asp Ala Ala Phe Val Arg Ser Thr Ser Asn Trp Thr60  65  70  75Val Thr Asn Leu Val Asn Mer Tyr Ser Ser Gly Gly Thr Gln Ser Val80  85  90Gly Gly Ser Thr Gln Ala Pro Val Gly Ala Ala Val Cys Arg Ser Gly95  100 105Ser Thr Thr Gly Trp His Cys Gly Thr Ile Glu Ala Arg Gly Gln Ser110 115 120Val Ser Tyr Pro Glu Gly Thr Val Asn Asp Met Thr Arg Thr Asn Val125 130 135Cys Ala Glu Pro Gly Asp Ser Gly Gly Ser Phe Ile Ser Asp Asp Gln140 145 150 155Ala Gln Gly Met Thr Ser Gly Gly Ser Gly Asn Cys Thr Ser Gly Gly160 165 170Thr Thr Tyr Tyr Gln Glu Val Gly Pro Ala Leu Ser Thr Trp Asn Leu175 180 185Ser Leu Val Thr Ser190<210>7<211>1155<212>DNA<213>擬諾卡氏菌DSM 16424  
            
<220>  
            
<221>CDS<222>(1)..(1152)<220>  
            
<221>sig_肽<222>(1)..(87)<220>  
            
<221>mat_肽<222>(586)..(1152)<400>7atg  aga ccc tcc acc atc  gcc tcc gcc gtc ggc  aca gga gca ctg45Met  Arg Pro Ser Thr Ile  Ala Ser Ala Val Gly  Thr Gly Ala Leu-195 -190 -185gcc  ttc ggt ctg gca ctg  tcc atg gcc ccc gga  gcc ctc gcg gcg90Ala  Phe Gly Leu Ala Leu  Ser Met Ala Pro Gly  Ala Leu Ala Ala-180 -175 -170ccc  ggc ccc gtc ccc cag  acc ccc gtc gcc gac  gac agc gcc gcc135Pro  Gly Pro Val Pro Gln  Thr Pro Val Ala Asp  Asp Ser Ala Ala-165 -160 -155agc  atg acc gaa gcg ctc  aag cgt gac ctc aac  ctc tcc tcg gcc180Ser  Met Thr Glu Ala Leu  Lys Arg Asp Leu Asn  Leu Ser Ser Ala-150 -145 140gag  gcc gag gag ctg ctc  tcg gcg cag gaa gcc  gcg atc gag acc225Glu  Ala Glu Glu Leu Leu  Ser Ala Gln Glu Ala  Ala Ile Glu Thr-135 -130 -125gac  gcc gag gcc gcc gag  gcc gcg gga gag gcc  tac ggc ggc tcc270Asp  Ala Glu Ala Ala Glu  Ala Ala Gly Glu Ala  Tyr Gly Gly Ser-120 -115 -110ctg  ttc gac acc gaa acc  ctc gaa ctc acc gtg ctg gtg acc gac acc 318Leu  Phe Asp Thr Glu Thr  Leu Glu Leu Thr Val Leu Val Thr Asp Thr-105 -100 -95 -90acg gcc gtc gac gcg gtc gag gcc acc gga gcc gag gcc acc gtg gtc   366Thr Ala Val Asp Ala Val Glu Ala Thr Gly Ala Glu Ala Thr Val Val-85 -80 -75acc cac ggc acc gac ggc ctg gcc gag gtc gtg gag gac ctc aac agc   414Thr His Gly Thr Asp Gly Leu Ala Glu Val Val Glu Asp Leu Asn Ser-70 -65 -60gcc gac gcc ccg gcg ggc gtc ctc ggc tgg tac ccc gac atg gag agc   462Ala Asp Ala Pro Ala Gly Val Leu Gly Trp Tyr Pro Asp Met Glu Ser-55 -50 -45gac acc gtg gtg gtc gag gtg ctg gag ggc tcc gac gcc gac gtc gcc   510Asp Thr Val Val Val Glu Val Leu Glu Gly Ser Asp Ala Asp Val Ala-40 -35 -30gcc ctg ctc gcc gac gcc ggc gtg gac gcc tcc gcc gtc cgg gtg gag   558Ala Leu Leu Ala Asp Ala Gly Val Asp Ala Ser Ala Val Arg Val Glu-25 20  -15 -10gag gcg gag gag gtc ccg cag gtc tac gcc aac atc atc ggc ggc ctg   606Glu Ala Glu Glu Val Pro Gln Val Tyr Ala Asn Ile Ile Gly Gly Leu-5  -1  1   5gcc tac acc atg ggc gga cgc tgc tcc gtc ggc ttc gcg gcg acc aac   654Ala Tyr Thr Met Gly Gly Arg Cys Ser Val Gly Phe Ala Ala Thr Asn10  15  20  
            
agc gcc gga cag ccc ggt ttc gtg acg gcg ggc cac tgc ggc acc gtc  702Ser Ala Gly Gln Pro Gly Phe Val Thr Ala Gly His Cys Gly Thr Val25  30  35ggc acc gcc gtg acc atc ggc gac ggc cgc ggc gtc ttc gag cgc tcg  750Gly Thr Ala Val Thr Ile Gly Asp Gly Arg Gly Val Phe Glu Arg Ser40  45  50  55gtc ttc ccc ggc aac gac gcc gcc ttc gtc cgc ggc acc tcc aac ttc  798Val Phe Pro Gly Asn Asp Ala Ala Phe Val Arg Gly Thr Ser Asn Phe60  65  70acc ctg acc aac ctg gtc tcc cgc tac aac tcc ggc ggc cac cag gcg  846Thr Leu Thr Asn Leu Val Ser Arg Tyr Asn Ser Gly Gly His Gln Ala75  80  85gtg acc ggc acc agc cag gcc ccg gcc ggc tcg gcc gtc tgc cgc tcc  894Val Thr Gly Thr Ser Gln Ala Pro Ala Gly Ser Ala Val Cys Arg Ser90  95  100ggc tcc acc acc ggc tgg cac tgc ggc acc atc cag gcc cgc aac cag  942Gly Ser Thr Thr Gly Trp His Cys Gly Thr Ile Gln Ala Arg Asn Gln105 110 115acc gtg cgc tac ccg cag ggc acc gtc aac gcg ctc acc cgc acc aac  990Thr Val Arg Tyr Pro Gln Gly Thr Val Asn Ala Leu Thr Arg Thr Asn120 125 130 135gtg tgc gcc gag ccc ggt gac tcc ggc ggc tcg ttc atc tcc ggc tcg  1038Val Cys Ala Glu Pro Gly Asp Ser Gly Gly Ser Phe Ile Ser Gly Ser140 145 150cag gcc cag ggc gtc acc tcc ggc ggc tcc ggc aac tgc tcc ttc ggc  1086Gln Ala Gln Gly Val Thr Ser Gly Gly Ser Gly Asn Cys Ser Phe Gly155 160 165ggc acg acc tac tac cag gag gtc gcc ccg atg atc aac tcc tgg ggc  1134Gly Thr Thr Tyr Tyr Gln Glu Val Ala Pro Met Ile Asn Ser Trp Gly170 175 180gtt cgc atc cgc acc agc tga  1155Val Arg Ile Arg Thr Ser185<210>8<211>384<212>PRT<213>擬諾卡氏菌DSM 16424<400>8Met  Arg Pro Ser Thr Ile  Ala Ser Ala Val Gly  Thr Gly Ala Leu-195 -190 -185Ala  Phe Gly Leu Ala Leu  Ser Met Ala Pro Gly  Ala Leu Ala Ala-180 -175 -170Pro  Gly Pro Val Pro Gln  Thr Pro Val Ala Asp  Asp Ser Ala Ala-165 -160 -155Ser  Met Thr Glu Ala Leu  Lys Arg Asp Leu Asn  Leu Ser Ser Ala-150 -145 -140Glu  Ala Glu Glu Leu Leu  Ser Ala Gln Glu Ala  Ala Ile Glu Thr-135 -130 -125Asp  Ala Glu Ala Ala Glu  Ala Ala Gly Glu Ala  Tyr Gly Gly Ser  
            
-120 -115 -110Leu  Phe Asp Thr Glu Thr  Leu Glu Leu Thr Val Leu Val Thr Asp Thr-105 -100 -95 -90Thr Ala Val Asp Ala Val Glu Ala Thr Gly Ala Glu Ala Thr Val Val-85 -80 -75Thr His Gly Thr Asp Gly Leu Ala Glu Val Val Glu Asp Leu Asn Ser-70 -65 -60Ala Asp Ala Pro Ala Gly Val Leu Gly Trp Tyr Pro Asp Met Glu Ser-55 -50 -45Asp Thr Val Val Val Glu Val Leu Glu Gly Ser Asp Ala Asp Val Ala-40 -35 -30Ala Leu Leu Ala Asp Ala Gly Val Asp Ala Ser Ala Val Arg Val Glu25  -20 -15 -10Glu Ala Glu Glu Val Pro Gln Val Tyr Ala Asn Ile Ile Gly Gly Leu-5  -11 5Ala Tyr Thr Met Gly Gly Arg Cys Ser Val Gly Phe Ala Ala Thr Asn10  15  20Ser Ala Gly Gln Pro Gly Phe Val Thr Ala Gly His Cys Gly Thr Val25  30  35Gly Thr Ala Val Thr Ile Gly Asp Gly Arg Gly Val Phe Glu Arg Ser40  45  50  55Val Phe Pro Gly Asn Asp Ala Ala Phe Val Arg Gly Thr Ser Asn Phe60  65  70Thr Leu Thr Asn Leu Val Ser Arg Tyr Asn Ser Gly Gly His Gln Ala75  80  85Val Thr Gly Thr Ser Gln Ala Pro Ala Gly Ser Ala Val Cys Arg Ser90  95  100Gly Ser Thr Thr Gly Trp His Cys Gly Thr Ile Gln Ala Arg Asn Gln105 110 115Thr Val Arg Tyr Pro Gln Gly Thr Val Asn Ala Leu Thr Arg Thr Asn120 125 130 135Val Cys Ala Glu Pro Gly Asp Ser Gly Gly Ser Phe Ile Ser Gly Ser140 145 150Gln Ala Gln Gly Val Thr Ser Gly Gly Ser Gly Asn Cys Ser Phe Gly155 160 165Gly Thr Thr Tyr Tyr Gln Glu Val Ala Pro Met Ile Asn Ser Trp Gly170 175 180Val Arg Ile Arg Thr Ser185<2l0>9<211>1152<212>DNA<213>嗜堿擬諾卡氏菌DSM 44657<220>  
            
<221>CDS<222>(1)..(1149)  
            
<220>  
            
<221>sig_肽<222>(1)..(87)<220>  
            
<221>mat_肽<222>(586)..(1149)<400>9atg  cga ccc tcc ccc gtt  gtc tcc gcc ata ggt  aca gga gcc ttg45Met  Arg Pro Ser Pro Val  Val Ser Ala Ile Gly  Thr Gly Ala Leu-195 190  -185gcc  ttc ggc ctg gct ctg  ggc act tcc ccc gcg  gcc atc gcc gcc90Ala  Phe Gly Leu Ala Leu  Gly Thr Ser Pro Ala  Ala Ile Ala Ala-180 -175 -170ccc  gcc ccc cag tcc ccc  gac acc gaa acg cag  gcc gag gcc gtc135Pro  Ala Pro Gln Ser Pro  Asp Thr Glu Thr Gln  Ala Glu Ala Val-165 -160 -155acc  atg gcc gaa gcc ctc  caa cgc gat ctc ggt  ctg tcc tcc tcc180Thr  Met Ala Glu Ala Leu  Gln Arg Asp Leu Gly  Leu Ser Ser Ser150  -145 -140gag  gcc acc gaa ctc ctc  gcc gca cag gcc gag  gcg ttc gag gtc225Glu  Ala Thr Glu Leu Leu  Ala Ala Gln Ala Glu  Ala Phe Glu Val-135 -130 -125gac  gag gcc gcc acc gag  gcc gcc gcc gac gcc  tac ggc ggc tcc270Asp  Glu Ala Ala Thr Glu  Ala Ala Ala Asp Ala  Tyr Gly Gly Ser-120 -115 -110ctc  ttc gac acc gac agc  ctc gaa ctg acc gtg ctg gtc acc gac agc 318Leu  Phe Asp Thr Asp Ser  Leu Glu Leu Thr Val Leu Val Thr Asp Ser-105 -100 -95 -90gcc gcc gtc gac gcg gtc gag gcc acc ggc gcc aag gcc gag gtc gtc   366Ala Ala Val Asp Ala Val Glu Ala Thr Gly Ala Lys Ala Glu Val Val-85 -80 -75gac cac ggt atc gag ggc ctc gag gag atc gtc gac gaa ctc aac gag   414Asp His Gly Ile Glu Gly Leu Glu Glu lle Val Asp Glu Leu Asn Glu-70 -65 -60tcc aac gcc aag tcg ggc gtc gtc ggt tgg tac ccc gac gtg gcc ggt   462Ser Asn Ala Lys Ser Gly Val Val Gly Trp Tyr Pro Asp Val Ala Gly-55 -50 -45gac acg gtc gtc ctg gag gtc atg gaa ggc tcc gag gcc gac gtg gac   510Asp Thr Val Val Leu Glu Val Met Glu Gly Ser Glu Ala Asp Val Asp-40 -35 -30gcc ctg ctc gcc gag acc ggg gtc gac gcc gcc gac gtc acg gtg gag   558Ala Leu Leu Ala Glu Thr Gly Val Asp Ala Ala Asp Val Thr Val Glu-25  -20 -15 -10acc acc acc gag cag ccc gag ctc tac gcc gac atc atc ggt ggc ctg   606Thr Thr Thr Glu Gln Pro Glu Leu Tyr Ala Asp Ile Ile Gly Gly Leu-5  -1  1   5gcc tac acc atg ggc gga cgt tgc tcg gtc ggc ttc gcc gcc acc aac   654Ala Tyr Thr Met Gly Gly Arg Cys Ser Val Gly Phe Ala Ala Thr Asn10  15  20tcc tcc ggc cag ccc gga ttc gtc acc gcc ggc cac tgc ggc agt gtc   702Ser Ser Gly Gln Pro Gly Phe Val Thr Ala Gly His Cys Gly Ser Val25  30  35  
            
ggc acc ggc gtc acc atc ggt aac ggc cgg ggc gtc ttc gag cgt tcc  750Gly Thr Gly Val Thr Ile Gly Asn Gly Arg Gly Val Phe Glu Arg Ser40  45  50  55atc ttc ccg ggc aac gac gcc gcc ttc gtc cgt ggc acg tcc aac ttc  798Ile Phe Pro Gly Asn Asp Ala Ala Phe Val Arg Gly Thr Ser Asn Phe60  65  70acc ctg acc aac ctg gtc agc cgc tac aac tcc ggc ggc tac gcc acg  846Thr Leu Thr Asn Leu Val Ser Arg Tyr Asn Ser Gly Gly Tyr Ala Thr75  80  85gtg tcc ggg tcc tcc gcg gcc ccg atc ggc tcc cag gtg tgc cgc tcc  894Val Ser Gly Ser Ser Ala Ala Pro Ile Gly Ser Gln Val Cys Arg Ser90  95  100ggc tcc acc acc ggc tgg cac tgc ggc acc atc cag gcc cgc aac cag  942Gly Ser Thr Thr Gly Trp His Cys Gly Thr Ile Gln Ala Arg Asn Gln105 110 115acg gtg cgc tac ccg cag ggc acc gtc cag gcc ctg acc cgc acc agc  990Thr Val Arg Tyr Pro Gln Gly Thr Val Gln Ala Leu Thr Arg Thr Ser120 125 130 135gtg tgc gcc gag ccc ggt gac tcc ggt ggt tcc ttc atc tcc ggc agc  1038Val Cys Ala Glu Pro Gly Asp Ser Gly Gly Ser Phe Ile Ser Gly Ser140 145 150cag gcc cag ggc gtc acc tcc ggt ggc tcg ggc aac tgc cgc acc ggt  1086Gln Ala Gln Gly Val Thr Ser Gly Gly Ser Gly Asn Cys Arg Thr Gly155 160 165ggc acg acc tac tac cag gag gtc aac ccc atg ctc aac agc tgg ggc  1134Gly Thr Thr Tyr Tyr Gln Glu Val Asn Pro Met Leu Asn Ser Trp Gly170 175 180ctg cgt ctg cgc acc tga  1152Leu Arg Leu Arg Thr185<210>10<211>383<212>PRT<213>嗜堿擬諾卡氏菌DSM 44657<400>10Met  Arg Pro Ser Pro Val  Val Ser Ala Ile Gly  Thr Gly Ala Leu-195 190  -185Ala  Phe Gly Leu Ala Leu  Gly Thr Ser Pro Ala  Ala Ile Ala Ala-180 -175 170Pro  Ala Pro Gln Ser Pro  Asp Thr Glu Thr Gln  Ala Glu Ala Val-165 -160 -155Thr  Met Ala Glu Ala Leu  Gln Arg Asp Leu Gly  Leu Ser Ser Ser-150 -145 -140Glu  Ala Thr Glu Leu Leu  Ala Ala Gln Ala Glu  Ala Phe Glu Val-135 -130 -125Asp  Glu Ala Ala Thr Glu  Ala Ala Ala Asp Ala  Tyr Gly Gly Ser-120 -115 -110Leu  Phe Asp Thr Asp Ser  Leu Glu Leu Thr Val Leu Val Thr Asp Ser  
            
-105-100-95  -90Ala Ala Val Asp Ala Val Glu Ala Thr Gly Ala Lys Ala Glu Val Val-85 -80 -75Asp His Gly Ile Glu Gly Leu Glu Glu Ile Val Asp Glu Leu Asn Glu-70 -65 -60Ser Asn Ala Lys Ser Gly Val Val Gly Trp Tyr Pro Asp Val Ala Gly-55 -50 -45Asp Thr Val Val Leu Glu Val Met Glu Gly Ser Glu Ala Asp Val Asp-40 -35 -30Ala Leu Leu Ala Glu Thr Gly Val Asp Ala Ala Asp Val Thr Val Glu-25 -20 -15 -10Thr Thr Thr Glu Gln Pro Glu Leu Tyr Ala Asp Ile Ile Gly Gly Leu-5  -1  1   5Ala Tyr Thr Met Gly Gly Arg Cys Ser Val Gly Phe Ala Ala Thr Asn10  15  20Ser Ser Gly Gln Pro Gly Phe Val Thr Ala Gly His Cys Gly Ser Val25  30  35Gly Thr Gly Val Thr Ile Gly Asn Gly Arg Gly ValPhe Glu Arg Ser40  45  50 55Ile Phe Pro Gly Asn Asp Ala Ala Phe Val Arg Gly Thr Ser Asn Phe60  65  70Thr Leu Thr Asn Leu Val Ser Arg Tyr Asn Ser Gly Gly Tyr Ala Thr75  80  85Val Ser Gly Ser Ser Ala Ala Pro Ile Gly Ser Gln Val Cys Arg Ser90  95  100Gly Ser Thr Thr Gly Trp His Cys Gly Thr Ile Gln Ala Arg Asn Gln105 110 115Thr Val Arg Tyr Pro Gln Gly Thr Val Gln Ala Leu Thr Arg Thr Ser120 125 130 135Val Cys Ala Glu Pro Gly Asp Ser Gly Gly Ser Phe Ile Ser Gly Ser140 145 150Gln Ala Gln Gly Val Thr Ser Gly Gly Ser Gly Asn Cys Arg Thr Gly155 160 165Gly Thr Thr Tyr Tyr Gln Glu Val Asn Pro Met Leu Asn Ser Trp Gly170 175 180Leu Arg Leu Arg Thr185<210>11<211>1155<212>DNA<213>盧森坦類諾卡氏菌DSM 44048<220>  
            
<221>CDS<222>(1)..(1152)<220>  
            
<221>sig_肽<222>(1)..(87)  
            
<220>  
            
<221>mat_肽<222>(586)..(1152)<400>11atg  cga ccc tcc ccc gtt  atc tcc gcc cta gga  acc ggc gcc ctc   45Met  Arg Pro Ser Pro Val  Ile Ser Ala Leu Gly  Thr Gly Ala Leu-195 -190 -185gcc  ttc gga ctg gtc atc  acc atg gcc ccg ggc  gtg aac gcc gga   90Ala  Phe Gly Leu Val Ile  Thr Met Ala Pro Gly  Val Asn Ala Gly-180 -175 -170acc  gta ccc acc ccc cag  gcc ccc gtc ccc gac  gac gag gcc acc   135Thr  Val Pro Thr Pro Gln  Ala Pro Val Pro Asp  Asp Glu Ala Thr-165 -160 -155acc  atg ctc gaa gcc atg  gag agg gat ctc gac  ctc acc ccg ttc   180Thr  Met Leu Glu Ala Met  Glu Arg Asp Leu Asp  Leu Thr Pro Phe-150 -145 -140gag  gcc gag gaa ctc ttc  gag gca cag gaa gag  gcc atc gac ctc   225Glu  Ala Glu Glu Leu Phe  Glu Ala Gln Glu Glu  Ala Ile Asp Leu-135 -130 -125gac  gag gag gcc acc gaa  gcg gcc ggt gcg gcc  tac ggc ggt tcg   270Asp  Glu Glu Ala Thr Glu  Ala Ala Gly Ala Ala  Tyr Gly Gly Ser120  -115 -110ctc  ttc gac acc gaa acc  cac gaa ctc acc gtc ctg gtg acc gac gtc318Leu  Phe Asp Thr Glu Thr  His Glu Leu Thr Val Leu Val Thr Asp Val-105 -100 -95 -90gac gcg gtc gag gcc gtg gag gcc acc gga gcc gcc gcc gag gtc gtc  366Asp Ala Val Glu Ala Val Glu Ala Thr Gly Ala Ala Ala Glu Val Val-85 -80 -75tcc cac ggc tcc gac ggt ctg gcc gac atc gtc gag gac ctc aac gcc  414Ser His Gly Ser Asp Gly Leu Ala Asp Ile Val Glu Asp Leu Asn Ala-70 -65 -60acc gac gcc ggc agc gag gtc gtg ggc tgg tac ccc gac gtc acc agc  462Thr Asp Ala Gly Ser Glu Val Val Gly Trp Tyr Pro Asp Val Thr Ser-55 50  -45gac agc gtg gtc gtc gag gtg gtc gag ggc tcc gac gtc gac gtc gac  510Asp Ser Val Val Val Glu Val Val Glu Gly Ser Asp Val Asp Val Asp-40 -35 -30tcc atc gtc gag ggc acg ggc gtc gac ccg gcg gtc atc gag gtc cag  558Ser Ile Val Glu Gly Thr Gly Val Asp Pro Ala Val Ile Glu Val Gln-25 -20 -15 -10gag gtc tcc gaa cag cct cag acc tac gcc aac atc atc ggc ggc ctg  606Glu Val Ser Glu Gln Pro Gln Thr Tyr Ala Asn Ile Ile Gly Gly Leu-5  -1  1   5gcc tac tac atg agc tcg ggc ggc cgc tgc tcg gtc ggc ttc ccc gcc  654Ala Tyr Tyr Met Ser Ser Gly Gly Arg Cys Ser Val Gly Phe Pro Ala10  15  20acc aac agc tcc ggc cag ccg ggc ttc gtc acg gcg ggc cac tgc ggc  702Thr Asn Ser Ser Gly Gln Pro Gly Phe Val Thr Ala Gly His Cys Gly25  30  35acc gtc ggc acc ggc gtc acc atc ggc aac ggc cgc ggc acc ttc gag  750Thr Val Gly Thr Gly Val Thr Ile Gly Asn Gly Arg Gly Thr Phe Glu40  45  50  55  
            
cgc tcc gtg ttc ccc ggc aac gac gcc gcc ttc gtc cga ggc acg tcc  798Arg Ser Val Phe Pro Gly Asn Asp Ala Ala Phe Val Arg Gly Thr Ser60  65  70aac ttc acg ctg tac aac ctc gtc tac cgc tac agc ggc tac cag acc  846Asn Phe Thr Leu Tyr Asn Leu Val Tyr Arg Tyr Ser Gly Tyr Gln Thr75  80  85gtg acg ggc agc aac gcc gcc ccg atc ggc tcg tcc atc tgc cgt tcc  894Val Thr Gly Ser Asn Ala Ala Pro Ile Gly Ser Ser Ile Cys Arg Ser90  95  100ggt tcc acc acc ggc tgg cac tgc ggc acc atc cag gcc cgc aac cag  942Gly Ser Thr Thr Gly Trp His Cys Gly Thr Ile Gln Ala Arg Asn Gln105 110 115acc gtc cgg tac ccg cag ggc acc gtc tac tac ctg acc cgt acc aac  990Thr Val Arg Tyr Pro Gln Gly Thr Val Tyr Tyr Leu Thr Arg Thr Asn120 125 130 135gtg tgc gcc gag ccc ggc gac tcc gga ggc tcc ttc atc tcc gga acg  1038Val Cvs Ala Glu Pro Gly Asp Ser Gly Gly Ser Phe Ile Ser Gly Thr140 145 150cag gcc cag ggc atg acc tcc ggc ggc tcc ggc aac tgc agc agc ggt  1086Gln Ala Gln Gly Met Thr Ser Gly Gly Ser Gly Asn Cys Ser Ser Gly155 160 165ggc acc acc ttc tac cag gag gtg gac ccg gtg gag agc gcc tgg ggc  1134Gly Thr Thr Phe Tyr Gln Glu Val Asp Pro Val Glu Ser Ala Trp Gly170 175 180gtg cga ctg cgc acc agc tag  1155Val Arg Leu Arg Thr Ser185<210>12<211>384<212>PRT<213>盧森坦類諾卡氏菌DSM 44048<400>12Met  Arg Pro Ser Pro Val  Ile Ser Ala Leu Gly  Thr Gly Ala Leu-195 -190 -185Ala  Phe Gly Leu Val Ile  Thr Met Ala Pro Gly  Val Asn Ala Gly-180 -175 -170Thr  Val Pro Thr Pro Gln  Ala Pro Val Pro Asp  Asp Glu Ala Thr-165 -160 -155Thr  Met Leu Glu Ala Met  Glu Arg Asp Leu Asp  Leu Thr Pro Phe-150 -145 -140Glu  Ala Glu Glu Leu Phe  Glu Ala Gln Glu Glu  Ala Ile Asp Leu-135 -130 -125Asp  Glu Glu Ala Thr Glu  Ala Ala Gly Ala Ala  Tyr Gly Gly Ser-120 -115 -110Leu  Phe Asp Thr Glu Thr  His Glu Leu Thr Val Leu Val Thr Asp Val-105 -100 -95 -90Asp Ala Val Glu Ala Val Glu Ala Thr Gly Ala Ala Ala Glu Val Val-85 -80 -75  
            
Ser His Gly Ser Asp Gly Leu Ala Asp Ile Val Glu Asp Leu Asn Ala-70 -65 -60Thr Asp Ala Gly Ser Glu Val Val Gly Trp Tyr Pro Asp Val Thr Ser-55 -50 -45Asp Ser Val Val Val Glu Val Val Glu Gly Ser Asp Val Asp Val Asp-40 -35 -30Ser Ile Val Glu Gly Thr Gly Val Asp Pro Ala Val Ile Glu Val Gln-25 -20 -15 -10Glu Val Ser Glu Gln Pro Gln Thr Tyr Ala Asn Ile Ile Gly Gly Leu-5  -1  1   5Ala Tyr Tyr Met Ser Ser Gly Gly Arg Cys Ser Val Gly Phe Pro Ala10  15  20Thr Asn Ser Ser Gly Gln Pro Gly Phe Val Thr Ala Gly His Cys Gly25  30  35Thr Val Gly Thr Gly Val Thr Ile Gly Asn Gly Arg Gly Thr Phe Glu40  45  50  55Arg Ser Val Phe Pro Gly Asn Asp Ala Ala Phe Val Arg Gly Thr Ser60  65  70Asn Phe Thr Leu Tyr Asn Leu Val Tyr Arg Tyr Ser Gly Tyr Gln Thr75  80  85Val Thr Gly Ser Asn Ala Ala Pro Ile Gly Ser Ser Ile Cys Arg Ser90  95  100Gly Ser Thr Thr Gly Trp His Cys Gly Thr Ile Gln Ala Arg Asn Gln105 110 1l5Thr Val Arg Tyr Pro Gln Gly Thr Val Tyr Tyr Leu Thr Arg Thr Asn120 125 130 135Val Cys Ala Glu Pro Gly Asp Ser Gly Gly Ser Phe Ile Ser Gly Thr140 145 150Gln Ala Gln Gly Met Thr Ser Gly Gly Ser Gly Asn Cys Ser Ser Gly155 160 165Gly Thr Thr Phe Tyr Gln Glu Val Asp Pro Val Glu Ser Ala Trp Gly170 175 180Val Arg Leu Arg Thr Ser185<210>13<211>81<212>DNA<213>Bacillus clausii<220>  
            
<221>sig_肽<222>(1)..(81)<400>13atgaagaaac cgttggggaa aattgtcgca agcaccgcac tactcatttc tgttgctttt60agttcatcga tcgcatcggc t  81<210>14<211>49<212>DNA  
            
<213>合成的<220>  
            
<221>misc_feature<223>引物<400>14gcttttagtt catcgatcgc atcggctgcg accgtaccgg ccgagccag 49<210>15<211>46<212>DNA<213>合成的<220>  
            
<221>misc_feature<223>引物<400>15ggagcggatt gaacatgcga ttactaaccg gtcaccaggg acagcc 46<210>16<211>40<212>DNA<213>合成的<220>  
            
<221>misc_feature<223>引物<400>16gttcatcgat cgcatcggct gtcaccgcac ccaccgagcc 40<210>17<211>45<212>DNA<213>合成的<220>  
            
<221>misc_feature<223>引物<400>17ggagcggatt gaacatgcga ttagctggtg acgaggctga ggttc 45<210>18<211>38<212>DNA<213>合成的<220>  
            
<221>misc_feature<223>引物<400>18gttcatcgat cgcatcggct gtgaccgccc ccgccgag38<210>19<211>45<212>DNA<213>合成的<220>  
            
<221>misc_feature  
            
<223>引物<400>19ggagcggatt gaacatgcga ttagctcgtg acgaggctga ggttc 45<210>20<211>41<212>DNA<213>合成的<220>  
            
<221>misc_feature<223>引物<400>20gttcatcgat cgcatcggct gcgcccggcc ccgtccccca g 41<210>21<211>41<212>DNA<213>合成的<220>  
            
<221>misc_feature<223>引物<400>21ggagcggatt gaacatgcga tcagctggtg cggatgcgaa c 41<210>22<211>37<212>DNA<213>合成的<220>  
            
<221>misc_feature<223>引物<400>22gttcatcgat cgcatcggct gcccccgccc cccagtc  37<210>23<211>44<212>DNA<213>合成的<220>  
            
<221>misc_feature<223>引物<400>23ggagcggatt gaacatgcga ttaggtgcgc agacgcaggc ccca  44<210>24<211>42<212>DNA<213>合成的<220>  
            
<221>misc_feature<223>引物<400>24gttcatcgat cgcatcggct ggaaccgtac ccacccccca gg42  
            
<210>25<211>41<212>DNA<213>合成的<220>  
            
<221>misc_feature<223>引物<400>25ggagcggatt gaacatgcga ttagctggtg cgcagtcgca c 41<210>26<211>9<212>PRT<213>達松維爾擬諾卡氏菌達松維爾亞種DSM 43235<220>  
            
<221>MISC_FEATURE<223>N-末端<400>26Ala Asp Ile Val Gly Gly Glu Ala Tyr1   5<210>27<211>10<212>PRT<213>擬諾卡氏菌DSM 16424<220>  
            
<221>MISC_FEATURE<223>N-末端<400>27Ala Asn Ile Ile Gly Gly Leu Ala Tyr Thr1   5   10
            
權利要求
            
1.一種具有蛋白酶活性的分離多肽，其選自(a)具有氨基酸序列的多肽，其中所述的氨基酸序列與SEQ ID NO6的1-192位氨基酸具有至少71.5％的同一性程度；(b)由核酸序列編碼的多肽，其中所述的核酸序列在非常高嚴緊條件下與(i)SEQ ID NO5的574-1149位核苷酸，(ii)(i)的至少100個核苷酸的亞序列，和/或(iii)(i)或(ii)的互補鏈雜交；(c)具有SEQ ID NO6的1-192位氨基酸的氨基酸序列，包括取代、缺失、延伸和/或插入一個或多個氨基酸的多肽的變體；(d)(a)或(b)的等位變體；和(e)(a)、(b)或(d)的具有蛋白酶活性的片段。
            
2.權利要求1的多肽，其包括以下蛋白酶中的任何一種(a)SEQ ID NO6的1-192位氨基酸；(b)SEQ ID NO2的1-192位氨基酸；(c)SEQ ID NO4的1-192位氨基酸；或(d)SEQ ID NO8的1-189位氨基酸。
            
3.一種分離的核酸序列，其含有編碼具有蛋白酶活性的多肽的核酸序列，并且該核酸序列(a)編碼權利要求22-23任一項的多肽；(b)在非常高的嚴緊條件下，與(i)SEQ ID NO5的574-1149位核苷酸，(ii)(i)的至少100個核苷酸的亞序列；和/或(iii)(i)或(ii)的互補鏈雜交；和/或(c)與SEQ ID NO5的574-1149位核苷酸具有至少79.3％的同一性程度。
            
4.權利要求3的核酸序列，其含有以下編碼蛋白酶的核酸序列中的任何一種(a)SEQ ID NO3的574-1149位核苷酸；(b)SEQ ID NO5的574-1149位核苷酸；(c)SEQ ID NO7的586-1152位核苷酸；或(d)SEQ ID NO1的568-1143位核苷酸。
            
5.一種分離的核酸序列，其通過下述產生(a)將DNA在非常高的嚴緊條件下與(i)SEQ ID NO5的574-1149位核苷酸；(ii)(i)的至少100個核苷酸的亞序列；或(iii)(i)或(ii)的互補鏈雜交；并且(b)分離所述核酸序列。
            
6.一種核酸構建體，其含有與一個或多個控制序列可操作性相連的權利要求3-5中任一項的核酸序列，其中所述的控制序列引導多肽在適宜表達宿主中產生。
            
7.一種含有權利要求6的核酸構建體的重組表達載體。
            
8.一種含有權利要求6的核酸構建體或權利要求7的載體的重組宿主細胞。
            
9.一種轉基因植物或植物部分，其能夠表達權利要求1-2中任一項的多肽。
            
10.一種轉基因非人動物或其產品或組成部分，其能夠表達權利要求1-2中任一項的多肽。
            
11.一種產生權利要求1-2中任一項的多肽的方法，該方法包括(a)培養權利要求8的重組宿主細胞，以產生含有多肽的上清液；并且(b)回收多肽。
            
12.一種產生權利要求1-2中任一項的多肽的方法，該方法包括(a)培養以下菌株中的任何一種(i)達松維爾擬諾卡氏菌達松維爾亞種DSM 43235，(ii)Nocardiopsis prasina DSM 15649，(iii)Nocardiopsis prasina DSM 14010，或(iv)擬諾卡氏菌屬的菌種DSM 16424；并且(b)回收所述多肽。
            
13.權利要求1-2中任一項的至少一種蛋白酶用于如下方面的用途(i)動物飼料；(ii)動物飼料添加劑；(iii)制備動物飼料中使用的組合物；(iv)改善動物飼料的營養價值；(v)增加動物飼料中可消化的和/或可溶性蛋白；(vi)增加動物飲食中蛋白質水解的程度；和/或(vii)處理蛋白質。
            
14.一種改善動物飼料營養價值的方法，其中將權利要求1-2中任一項的至少一種蛋白酶添加至飼料中。
            
15.一種動物飼料添加劑，其含有(a)權利要求1-2中任一項的至少一種蛋白酶；和(b)至少一種脂溶性維生素，和/或(c)至少一種水溶性維生素，和/或(d)至少一種痕量礦物質。
            
16.權利要求15的動物飼料添加劑，其還含有淀粉酶；肌醇六磷酸酶；木聚糖酶；半乳聚糖酶；α-半乳糖苷酶；蛋白酶，磷脂酶；和/或β-葡聚糖酶。
            
17.一種動物飼料，其具有50-800g/kg的粗蛋白含量并且含有權利要求1-2中任一項的至少一種蛋白酶。
            
18.一種處理蛋白質的方法，包括將權利要求1-2中任一項的至少一種蛋白酶添加至至少一種蛋白質或蛋白質源的步驟。
            
19.權利要求18的方法，其中至少一種蛋白質源中包括大豆。
            
20.權利要求1-2中任一項的至少一種蛋白酶在洗滌劑中的用途。
            
全文摘要
            
本發明涉及得自達松維爾擬諾卡氏菌達松維爾亞種DSM 43235、Nocardiopsis prasina DSM 15649、Nocardiopsis prasina(以前是alba)DSM14010、擬諾卡氏菌屬的菌種DSM 16424、嗜堿擬諾卡氏菌DSM 44657和盧森坦類諾卡氏菌DSM 44048的蛋白酶，以及同源蛋白酶；它們在各種宿主，包括轉基因植物和非人動物中的重組生產，和它們在動物飼料和洗滌劑中的用途。該蛋白酶是酸穩定的、堿穩定的和/或熱穩定的。
            
文檔編號C11D3/386GK101014704SQ200580027786 
            
公開日2007年8月8日 申請日期2005年6月17日 優先權日2004年6月21日
            
發明者索倫·F·拉森, 卡斯滕·肖霍姆, 彼得·R·奧斯特加德, 莫滕·費希爾 申請人:諾維信公司
            


                        
            
                        
            
                        
            
                            
                        
            

                        
                            
                    
            
                    
                    


                     
                        
                        
                    

                
            

                
                
            
                    
            
                        網友詢問留言
                        已有0條留言
                    
            
                    
            
                        
            
                            
                            
              

                                								

						

            • 還沒有人留言評論。精彩留言會獲得點贊！
              • 


                            
            
                        
            
                        
            
                         1 
                    
            
                        
                        
            
                            
            
                              
                            
            
                            
                        
            
                    
            
                
            
            
            
            
          
            
      
            
    
            
      

        

  
婷婷六月激情在线综合激情,亚洲国产大片,久久中文字幕综合婷婷,精品久久久久久中文字幕,亚洲一区二区三区高清不卡,99国产精品热久久久久久夜夜嗨
,欧美日韩亚洲综合在线一区二区,99国产精品电影,伊人精品线视天天综合,精品伊人久久久大香线蕉欧美

            

亚洲精品1区
国产成人一级
91精品国产欧美一区二区
亚洲精品乱码久久久久久下载
国产精品久久久久久久伊一
九色国产
国产精品九九视频
伊人久久成人爱综合网
欧美日韩亚洲区久久综合
欧美日本一道免费一区三区
夜夜爽一区二区三区精品
欧美日韩高清一区二区三区
国产成人av在线
国产精品对白交换绿帽视频
国产视频亚洲
国产在线欧美精品
国产精品综合网
国产日韩精品欧美一区色
国产日韩精品欧美一区喷
欧美日韩在线观看区一二
国产区精品
欧美视频日韩视频
中文字幕天天躁日日躁狠狠躁97
视频一二三区
欧美高清在线精品一区二区不卡
国产精品揄拍一区二区久久
99久久综合狠狠综合久久aⅴ
亚洲乱码视频在线观看
日韩在线第二页
亚洲精品无码专区在线播放
成人亚洲网站www在线观看
欧美三级一区二区
99久久精品免费看国产高清
91麻豆国产在线观看
最新日韩欧美不卡一二三区
成人在线观看不卡
日韩国产在线
在线亚洲精品
亚洲午夜久久久久中文字幕
国产精品成人久久久久久久
精品国产一区二区在线观看
欧美精品国产一区二区三区
中文在线播放
亚洲第一页在线视频
国产午夜精品福利久久
九色国产
精品国产九九
国产永久视频
久久精品人人做人人综合试看
国产一区二区三区免费观看
亚洲精品国产电影
9999热视频
国产精品资源在线
麻豆久久婷婷国产综合五月
国产精品免费一级在线观看
亚洲国产一区二区三区青草影视
中文在线播放
国产成人综合在线
国产在线观看色
国产亚洲三级
国产片一区二区三区
久久99精品久久久久久牛牛影视
亚洲欧美日韩国产
四虎永久免费网站
国产一毛片
国产精品视频在
九九热在线精品
99精品福利视频
色婷婷色99国产综合精品
97成人精品视频在线播放
精品久久久久久中文字幕
亚洲欧美一区二区三区孕妇
亚洲欧美成人网
日韩高清在线二区
国产尤物在线观看
在线不卡一区二区
91网站在线看
韩国精品福利一区二区
欧美日韩国产成人精品
99热精品久久
国产精品免费视频一区
高清视频一区
精品九九久久
欧美日韩在线观看免费
91欧美激情一区二区三区成人
99福利视频
亚洲国产精品91
久热国产在线
精品久久久久久中文字幕女
国产精品久久久久久久久99热
成人自拍视频网
国产精品视频久久久久久
久久影院国产
国产玖玖在线观看
99精品在线免费
亚洲欧美一区二区三区导航
久久久久久久综合
国产欧美日韩精品高清二区综合区
国产精品视频自拍
亚洲一级片免费
久久久久久九九
国产欧美自拍视频
视频一区二区在线观看
欧美日韩一区二区三区久久
中文在线亚洲
伊人热人久久中文字幕
日韩欧美亚洲国产一区二区三区
欧美亚洲国产成人高清在线
欧美日韩国产码高清综合人成
国产性大片免费播放网站
亚洲午夜综合网
91精品久久一区二区三区
国产无套在线播放
国产精品视频网站
国产成人亚洲精品老王
91在线网站
国产视频97
欧美黑人欧美精品刺激
国产一区二区三区免费在线视频
久久久国产精品免费看
99re6久精品国产首页
久久精品91
国产成人一级
国产成人精品曰本亚洲
日本福利在线观看
伊人成综合网
久久综合一本
国产综合久久久久久
久久精品成人免费看
久久福利
91精品国产91久久久久久麻豆
亚洲精品成人在线
亚洲伊人久久精品
欧美日本二区
国产永久视频
国产一区二
一区二区福利
国产一毛片
亚洲精品1区
毛片一区二区三区
伊人久久大香线蕉综合影
国产欧美在线观看一区
亚洲国产欧洲综合997久久
国产一区二区免费视频
国产91精品对白露脸全集观看
久久亚洲国产伦理
欧美成人伊人久久综合网
亚洲性久久久影院
久久99国产精一区二区三区!
91精品国产欧美一区二区
欧美日韩亚洲区久久综合
日韩精品一二三区
久久久夜色精品国产噜噜
国产在线精品福利91香蕉
久久久久久久亚洲精品
97se色综合一区二区二区
91国语精品自产拍在线观看性色
91久久国产综合精品女同我
日韩中文字幕a
国产成人亚洲日本精品
久久国产精品-国产精品
久久国产经典视频
久久国产精品伦理
亚洲第一页在线视频
国产精品久久久久三级
日韩毛片网
久久免费高清视频
麻豆国产在线观看一区二区
91麻豆国产福利在线观看
国产成人精品男人的天堂538
一区二区三区中文字幕
免费在线视频一区
欧美日韩国产成人精品
国产综合网站
国产资源免费观看
亚洲精品亚洲人成在线播放
精品久久久久久中文字幕专区
亚洲人成人毛片无遮挡
国产一起色一起爱
国产香蕉精品视频在
九九热免费观看
日韩亚洲欧美一区
九九热精品在线观看
精品久久久久久中文字幕专区
亚洲欧美自拍偷拍
国产精品每日更新
久久久久国产一级毛片高清板
久久天天躁狠狠躁夜夜中文字幕
久久精品片
日韩在线毛片
国产成人精品本亚洲
国产成人精品一区二区三区
九九热在线观看
国产r级在线观看
国产欧美日韩精品高清二区综合区
韩国电影一区二区
国产精品毛片va一区二区三区
五月婷婷伊人网
久久一区二区三区免费
一本色道久久综合狠狠躁篇
亚洲综合色站
国产尤物在线观看
亚洲一区亚洲二区
免费在线视频一区
欧洲精品视频在线观看
日韩中文字幕a
中文字幕日本在线mv视频精品
91精品在线免费视频
精品国产免费人成在线观看
精品a级片
中文字幕日本在线mv视频精品
日韩在线精品视频
婷婷丁香色
91精品国产高清久久久久
国产成人精品日本亚洲直接
五月综合视频
欧美日韩在线亚洲国产人
精液呈暗黄色
亚洲乱码一区
久久精品中文字幕不卡一二区
亚洲天堂精品在线
激情婷婷综合
国产免费久久精品久久久
国产精品亚洲二区在线
久久免费播放视频
五月婷婷丁香综合
在线亚洲欧美日韩
久久免费精品高清麻豆
精品久久久久久中文字幕
亚洲一区网站
国产精品福利社
日韩中文字幕免费
亚洲综合丝袜
91精品在线播放
国产精品18
亚洲日日夜夜
伊人久久大香线蕉综合影
亚洲精品中文字幕乱码影院
亚洲一区二区黄色
亚洲第一页在线视频
一区二区在线观看视频
国产成人福利精品视频
亚洲高清二区
国内成人免费视频
精品亚洲性xxx久久久
国产精品合集一区二区三区
97av免费视频
国产一起色一起爱
国产区久久
国产资源免费观看
99精品视频免费
国产成人一级
国产精品九九免费视频
欧美91精品久久久久网免费
99热国产免费
久久精品色
98精品国产综合久久
久久精品播放
中文字幕视频免费
国产欧美日韩一区二区三区在线
精品久久蜜桃
国产小视频精品
一本色道久久综合狠狠躁篇
91在线免费观看
亚洲精品区
伊人成综合网
伊人热人久久中文字幕
伊人黄色片
99国产精品热久久久久久夜夜嗨
久久免费精品视频
亚洲一区二区三区高清不卡
久久久久国产一级毛片高清板
国产片一区二区三区
久久狠狠干
99久久婷婷国产综合精品电影
国产99区
国产精品成人久久久久
久久狠狠干
青青国产在线观看
亚洲高清国产拍精品影院
国产精品一区二区av
九九热在线免费视频
伊人久久国产
国产精品久久久久久久久久一区
在线观看免费视频一区
国产精品自在在线午夜区app
国产精品综合色区在线观看
国产毛片久久久久久国产毛片
97国产免费全部免费观看
国产精品每日更新
国产尤物视频在线
九九视频这里只有精品99
一本一道久久a久久精品综合
久久综合给会久久狠狠狠
国产成人精品男人的天堂538
欧美一区二区高清
毛片一区二区三区
国产欧美日韩在线观看一区二区三区
在线国产二区
欧美不卡网
91在线精品中文字幕
在线国产福利
国内精品91久久久久
91亚洲福利
日韩欧美国产中文字幕
91久久精品国产性色也91久久
亚洲性久久久影院
欧美精品1区
国产热re99久久6国产精品
九九热免费观看
国产精品欧美日韩
久久久久国产一级毛片高清板
久久国产经典视频
日韩欧美亚洲国产一区二区三区
欧美亚洲综合另类在线观看
国产精品自在在线午夜区app
97中文字幕在线观看
视频一二三区
精品国产一区在线观看
国产欧美日韩在线一区二区不卡
欧美一区二三区
伊人成人在线观看
国内精品91久久久久
97在线亚洲
国产在线不卡一区
久久久全免费全集一级全黄片
国产精品v欧美精品∨日韩
亚洲毛片网站
在线不卡一区二区
99re热在线视频
久久激情网
国产毛片一区二区三区精品
久久亚洲综合色
中文字幕视频免费
国产视频亚洲
婷婷伊人久久
国产一区二区免费播放
久久99国产精品成人欧美
99国产在线视频
国产成人免费视频精品一区二区
国产不卡一区二区三区免费视
国产码欧美日韩高清综合一区
久久精品国产主播一区二区
国产一区电影
久久精品国产夜色
国产精品国产三级国产
日韩一区二区三区在线
久久97久久97精品免视看
久久国产免费一区二区三区
伊人久久大香线蕉综合电影网
99re6久精品国产首页
久久激情网
亚洲成人高清在线
国产精品网址
国产成人精品男人的天堂538
香蕉国产综合久久猫咪
国产专区中文字幕
91麻豆精品国产高清在线
久久国产经典视频
国产精品成人va在线观看
国产精品爱啪在线线免费观看
日本精品久久久久久久久免费
亚洲综合一区二区三区
久久五月网
精品国产网红福利在线观看
久久综合亚洲伊人色
亚洲国产精品久久久久久网站
在线日韩国产
99国产精品热久久久久久夜夜嗨
国产综合精品在线
国产区福利
精品亚洲综合久久中文字幕
国产制服丝袜在线
毛片在线播放网站
在线观看免费视频一区
国产精品久久久精品三级
亚洲国产电影在线观看
最新日韩欧美不卡一二三区
狠狠综合久久综合鬼色
日本精品1在线区
国产日韩一区二区三区在线播放
欧美日韩精品在线播放
亚洲欧美日韩国产一区二区三区精品
久久综合久久网
婷婷六月激情在线综合激情
亚洲乱码一区
国产专区91
97av视频在线观看
精品久久久久久中文字幕
久久五月视频
国产成人福利精品视频
国产精品网址
中文字幕视频在线
精品一区二区三区免费视频
伊人手机在线视频
亚洲精品中文字幕乱码
国产在线视频www色
色噜噜国产精品视频一区二区
精品亚洲成a人在线观看
国产香蕉尹人综合在线
成人免费一区二区三区在线观看
国产不卡一区二区三区免费视
欧美精品久久天天躁
国产专区中文字幕
久久精品国产免费中文
久久精品国产免费一区
久久无码精品一区二区三区
国产欧美另类久久久精品免费
欧美精品久久天天躁
亚洲精品在线视频
国产视频91在线
91精品福利一区二区三区野战
日韩中文字幕免费
国产精品99一区二区三区
欧美成人高清性色生活
国产精品系列在线观看
亚洲国产福利精品一区二区
国产成人在线小视频
国产精品久久久久免费
99re热在线视频
久久久久久久综合
一区二区国产在线播放
成人国产在线视频
亚洲精品乱码久久久久
欧美日韩一区二区综合
精品久久久久免费极品大片
中文字幕视频二区
激情粉嫩精品国产尤物
国产成人精品一区二区视频
久久精品中文字幕首页
亚洲高清在线
国产精品亚洲一区二区三区
伊人久久艹
中文在线亚洲
国产精品一区二区在线播放
国产精品九九免费视频
亚洲二区在线播放
亚洲狠狠婷婷综合久久久久网站
亚洲欧美日韩网站
日韩成人精品
亚洲国产一区二区三区青草影视
91精品国产福利在线观看
国产精品久久久久久久久99热
国产一区二区精品尤物
久碰香蕉精品视频在线观看
亚洲日日夜夜
在线不卡一区二区
国产午夜亚洲精品
九九热在线视频观看这里只有精品
伊人手机在线视频
91免费国产精品
日韩欧美中字
91精品国产91久久久久
国产全黄三级播放
视频一区二区三区免费观看
国产开裆丝袜高跟在线观看
国产成人欧美
激情综合丝袜美女一区二区
国产成人亚洲综合无
欧美精品一区二区三区免费观看
欧美亚洲国产日韩
日韩亚州
国产欧美日韩精品高清二区综合区
亚洲午夜国产片在线观看
精品久久久久久中文字幕
欧美精品1区
久久伊人久久亚洲综合
亚洲欧美日韩精品
国产成人精品久久亚洲高清不卡
久久福利影视
国产精品99精品久久免费
久久久久免费精品视频
国产日产亚洲精品
亚洲国产午夜电影在线入口
精品无码一区在线观看
午夜国产精品视频
亚洲一级片免费
伊人久久大香线蕉综合影
国产精品久久影院
久碰香蕉精品视频在线观看
www.欧美精品
在线小视频国产
亚洲国产天堂久久综合图区
欧美一区二区三区不卡
日韩美女福利视频
九九精品免视频国产成人
不卡国产00高中生在线视频
亚洲第一页在线视频
欧美日韩在线播放成人
99re视频这里只有精品
国产精品91在线
精品乱码一区二区三区在线
国产区久久
91麻豆精品国产自产在线观看一区
日韩精品成人在线
九九热在线观看
国产精品久久不卡日韩美女
欧美一区二区三区综合色视频
欧美精品免费一区欧美久久优播
国产精品网址
国产专区中文字幕
国产精品欧美亚洲韩国日本久久
日韩美香港a一级毛片
久久精品123
欧美一区二区三区免费看
99r在线视频
亚洲精品国产字幕久久vr
国产综合激情在线亚洲第一页
91免费国产精品
日韩免费小视频
亚洲国产精品综合一区在线
国产亚洲第一伦理第一区
在线亚洲精品
国产精品一区二区制服丝袜
国产在线成人精品
九九精品免视频国产成人
亚洲国产网
欧美日韩亚洲一区二区三区在线观看
在线亚洲精品
欧美一区二区三区高清视频
国产成人精品男人的天堂538
欧美日韩在线观看区一二
亚洲欧美一区二区久久
久久精品中文字幕首页
日本高清www午夜视频
久久精品国产免费
久久999精品
亚洲国产精品欧美综合
88国产精品视频一区二区三区
91久久偷偷做嫩草影院免费看
国产精品夜色视频一区二区
欧美日韩导航
国产成人啪精品午夜在线播放
一区二区视频在线免费观看
99久久精品国产自免费
精液呈暗黄色
久久99国产精品
日本精品久久久久久久久免费
精品国产97在线观看
99re视频这里只有精品
国产视频91在线
999av视频
亚洲美女视频一区二区三区
久久97久久97精品免视看
亚洲国产成人久久三区
99久久亚洲国产高清观看
日韩毛片在线视频
综合激情在线
91福利一区二区在线观看
一区二区视频在线免费观看
激情粉嫩精品国产尤物
国产成人精品曰本亚洲78
国产成人精品本亚洲
国产精品成人免费视频
国产成人啪精品视频免费软件
久久精品国产亚洲妲己影院
国产精品成人久久久久久久
久久大香线蕉综合爱
欧美一区二区三区高清视频
99热国产免费
在线观看欧美国产
91精品视频在线播放
国产精品福利社
欧美精品一区二区三区免费观看
国产一区二区免费视频
国产午夜精品一区二区
精品视频在线观看97
91精品福利久久久
国产一区福利
国产综合激情在线亚洲第一页
国产精品久久久久久久久久久不卡
九色国产
在线日韩国产
黄网在线观看
亚洲一区小说区中文字幕
中文字幕丝袜
日本二区在线观看
日本国产一区在线观看
欧美日韩一区二区三区久久
欧美精品亚洲精品日韩专
国产日产亚洲精品
久久综合九色综合欧美播
亚洲国产欧美无圣光一区
欧美视频区
亚洲乱码视频在线观看
久久无码精品一区二区三区
九九热精品免费视频
久久99精品久久久久久牛牛影视
国产精品成久久久久三级
国产一区福利
午夜国产精品视频
日本二区在线观看
99久久网站
国产亚洲天堂
精品国产一区二区三区不卡
亚洲国产日韩在线一区
国产成人综合在线观看网站
久久免费高清视频
欧美在线导航
午夜精品久久久久久99热7777
欧美久久综合网
国产小视频精品
国产尤物在线观看
亚洲国产精品综合一区在线
欧美一区二区三区不卡视频
欧美黑人欧美精品刺激
日本福利在线观看
久久国产偷
国产手机精品一区二区
国产热re99久久6国产精品
国产高清啪啪
欧美亚洲国产成人高清在线
国产在线第三页
亚洲综合一区二区三区
99r在线视频
99精品久久久久久久婷婷
国产精品乱码免费一区二区
国产在线精品福利91香蕉
国产尤物视频在线
五月婷婷亚洲
中文字幕久久综合伊人
亚洲精品一级毛片
99国产精品电影
在线视频第一页
久久99国产精品成人欧美
国产白白视频在线观看2
成人精品一区二区www
亚洲成人网在线观看
麻豆91在线视频
色综合合久久天天综合绕视看
久久精品国产免费高清
国产不卡一区二区三区免费视
欧美国产中文
99精品欧美
九九在线精品
国产中文字幕在线免费观看
国产一区中文字幕在线观看
国产成人一级
国产精品一区二区制服丝袜
国产一起色一起爱
亚洲精品成人在线
亚洲欧美精品在线
国产欧美自拍视频
99精品久久久久久久婷婷
久99视频
国产热re99久久6国产精品
视频一区亚洲
国产精品视频分类
国产精品成在线观看
99re6久精品国产首页
亚洲在成人网在线看
亚洲国产日韩在线一区
久久国产三级
日韩国产欧美
欧美在线一区二区三区
国产精品美女一级在线观看
成人午夜免费福利视频
亚洲天堂精品在线
91精品国产手机
欧美日韩视频在线播放
狠狠综合久久综合鬼色
九一色视频
青青视频国产
亚洲欧美自拍一区
中文字幕天天躁日日躁狠狠躁97
日韩免费大片
996热视频
伊人成综合网
亚洲天堂欧美
日韩精品亚洲人成在线观看
久久综合给会久久狠狠狠
日韩精品亚洲人成在线观看
日韩国产欧美
亚洲成aⅴ人片在线影院八
亚洲精品1区
99久久精品免费
国产精品高清在线观看
国产精品久久久免费视频
在线亚洲欧美日韩
91在线看视频
国产精品96久久久久久久
欧美日韩国产成人精品
91在线亚洲
热久久亚洲
国产精品美女免费视频观看
日韩在线毛片
亚洲永久免费视频
九九免费在线视频
亚洲一区网站
日本高清二区视频久二区
精品国产美女福利在线
伊人久久艹
国产精品久久久久三级
欧美成人精品第一区二区三区
99久久精品国产自免费
在线观看日韩一区
国产中文字幕一区
成人免费午夜视频
欧美日韩另类在线
久久99国产精品成人欧美
色婷婷中文网
久久天天躁夜夜躁狠狠躁2020
欧美成人伊人久久综合网
国产精品福利资源在线
国产伦精品一区二区三区高清
国产精品亚洲综合色区韩国
亚洲一区欧美日韩
色综合视频
国语自产精品视频在线区
国产高清a
成人国内精品久久久久影
国产在线精品香蕉综合网一区
国产不卡在线看
国产成人精品精品欧美
国产欧美日韩综合精品一区二区三区
韩国电影一区二区
国产在线视频www色
91中文字幕在线一区
国产人成午夜免视频网站
亚洲综合一区二区三区
色综合视频一区二区观看
久久五月网
九九热精品在线观看
国产一区二区三区国产精品
99久热re在线精品996热视频
亚洲国产网
在线视频亚洲一区
日韩字幕一中文在线综合
国产高清一级毛片在线不卡
精品国产色在线
国产高清视频一区二区
精品日本久久久久久久久久
亚洲国产午夜精品乱码
成人免费国产gav视频在线
日韩欧美一区二区在线观看
欧美曰批人成在线观看
韩国电影一区二区
99re这里只有精品6
日韩精品一区二区三区视频
99re6久精品国产首页
亚洲欧美一区二区三区导航
欧美色图一区二区三区
午夜精品视频在线观看
欧美激情在线观看一区二区三区
亚洲热在线
成人国产精品一区二区网站
亚洲一级毛片在线播放
亚洲一区小说区中文字幕
亚洲午夜久久久久影院
国产自产v一区二区三区c
国产精品视频免费
久久调教视频
国产成人91激情在线播放
国产精品欧美亚洲韩国日本久久
久久亚洲日本不卡一区二区
91中文字幕网
成人国产在线视频
国产视频91在线
欧美成人精品第一区二区三区
国产精品福利在线
久久综合九色综合精品
欧美一区二区三区精品
久久国产综合尤物免费观看
久久99青青久久99久久
日韩精品免费
久久国产精品999
91亚洲视频在线观看
国产精品igao视频
色综合区
在线亚洲欧国产精品专区
国产一区二区三区在线观看视频
亚洲精品成人在线
一区二区国产在线播放
中文在线亚洲
亚洲精品第一国产综合野
国产一区二区精品久久
一区二区三区四区精品视频
99热精品久久
中文字幕视频二区
国产成人精品男人的天堂538
99精品影视
美女福利视频一区二区
久久午夜夜伦伦鲁鲁片
综合久久久久久久综合网
国产精品国产欧美综合一区
国产99视频在线观看
国产亚洲女在线精品
婷婷影院在线综合免费视频
国产亚洲3p一区二区三区
91成人爽a毛片一区二区
亚洲一区二区高清
国产欧美亚洲精品第二区首页
欧美日韩导航
亚洲高清二区
欧美激情观看一区二区久久
日韩毛片在线播放
亚洲欧美日韩高清中文在线
亚洲日本在线播放
国产精品一区二区制服丝袜
精品国产一区二区三区不卡
国产不卡在线看
国产欧美网站
四虎永久在线观看视频精品
国产黄色片在线观看
夜夜综合
一本色道久久综合狠狠躁篇
欧美亚洲综合另类在线观看
国产91在线看
伊人久久国产
欧美一区二区在线观看免费网站
国产精品久久久久三级
久久福利
日韩中文字幕a
亚洲午夜久久久久影院
91在线高清视频
国产亚洲一区二区三区啪
久久人精品
国产精品亚洲午夜一区二区三区
综合久久久久久
久久伊人一区二区三区四区
国产综合久久久久久
日韩一区精品视频在线看
国产精品日韩欧美制服
日本精品1在线区
99re视频
无码av免费一区二区三区试看
国产视频1区
日韩欧美中文字幕一区
日本高清中文字幕一区二区三区a
亚洲国产欧美无圣光一区
国产在线视频一区二区三区
欧美国产第一页
在线亚洲欧美日韩
日韩中文字幕第一页
在线不卡一区二区
伊人久久青青
国产精品一区二区在线播放
www.五月婷婷
麻豆久久婷婷国产综合五月
亚洲精品区
久久国产欧美另类久久久
99在线视频免费
伊人久久中文字幕久久cm
久久精品成人免费看
久久这里只有精品首页
88国产精品视频一区二区三区
中文字幕日本在线mv视频精品
国产在线精品成人一区二区三区
伊人精品线视天天综合
亚洲一区二区黄色
国产尤物视频在线
亚洲精品99久久久久中文字幕
国产一区二区三区免费观看
伊人久久大香线蕉综合电影网
国产成人精品区在线观看
日本精品一区二区三区视频
日韩高清在线二区
久久免费播放视频
一区二区成人国产精品
国产精品免费精品自在线观看
亚洲精品视频二区
麻豆国产精品有码在线观看
精品日本一区二区
亚洲欧洲久久
久久中文字幕综合婷婷
中文字幕视频在线
国产成人精品综合在线观看
91精品国产91久久久久福利
精液呈暗黄色
香蕉国产综合久久猫咪
国产专区精品
亚洲精品无码不卡
国产永久视频
亚洲成a人片在线播放观看国产
一区二区国产在线播放
亚洲一区二区黄色
欧美日韩在线观看视频
亚洲精品另类
久久国产综合尤物免费观看
国产一区二区三区国产精品
高清视频一区
国产精品igao视频
国产精品资源在线
久久综合精品国产一区二区三区
www.五月婷婷
精品色综合
99热国产免费
麻豆福利影院
亚洲伊人久久大香线蕉苏妲己
久久电影院久久国产
久久精品伊人
在线日韩理论午夜中文电影
亚洲国产欧洲综合997久久
伊人国产精品
久草国产精品
欧美一区精品二区三区
亚洲成人高清在线
91免费国产精品
日韩精品福利在线
国产一线在线观看
国产不卡在线看
久久99青青久久99久久
亚洲精品亚洲人成在线播放
99久久免费看国产精品
国产日本在线观看
青草国产在线视频
麻豆久久婷婷国产综合五月
国产中文字幕一区
91久久精品国产性色也91久久
国产一区a
国产欧美日韩成人
国产亚洲女在线精品
一区二区美女
中文字幕在线2021一区
在线小视频国产
久久这里只有精品首页
国产在线第三页
欧美日韩中文字幕
在线亚洲+欧美+日本专区
精品国产一区二区三区不卡
久久这里精品
欧美在线va在线播放
精液呈暗黄色
91精品国产手机
91在线免费播放
欧美视频亚洲色图
欧美国产日韩精品
日韩高清不卡在线
精品视频免费观看
欧美日韩一区二区三区四区
国产欧美亚洲精品第二区首页
亚洲韩精品欧美一区二区三区
国产精品视频免费
在线精品小视频
久久午夜夜伦伦鲁鲁片
国产无套在线播放
久热这里只精品99re8久
欧美久久久久
久久香蕉国产线看观看精品蕉
国产成人精品男人的天堂538
亚洲人成网站色7799在线观看
日韩在线第二页
一本色道久久综合狠狠躁篇
国产一区二区三区不卡在线观看
亚洲乱码在线
在线观看欧美国产
久久福利青草精品资源站免费
国产玖玖在线观看
在线亚洲精品
亚洲成aⅴ人在线观看
精品91在线
欧美一区二三区
日韩中文字幕视频在线
日本成人一区二区
日韩免费专区
国内精品在线观看视频
久久国产综合尤物免费观看
国产精品系列在线观看
一本一道久久a久久精品综合
亚洲免费播放
久久精品国产免费
久久人精品
亚洲毛片网站
亚洲成a人一区二区三区
韩国福利一区二区三区高清视频
亚洲精品天堂在线
一区二区三区中文字幕
亚洲国产色婷婷精品综合在线观看
亚洲国产成人久久笫一页
999国产视频
国产精品香港三级在线电影
欧美日韩一区二区三区四区
日韩国产欧美
国产精品99一区二区三区
午夜国产精品理论片久久影院
亚洲精品中文字幕麻豆
亚洲国产高清视频
久久免费手机视频
日韩a在线观看
五月婷婷亚洲
亚洲精品中文字幕麻豆
中文字幕丝袜
www国产精品
亚洲天堂精品在线
亚洲乱码一区
国产日韩欧美三级
久久999精品
伊人热人久久中文字幕
久热国产在线视频
国产欧美日韩在线观看一区二区三区
国产一二三区在线
日韩国产欧美
91精品国产91久久久久
亚洲一区小说区中文字幕
精品一区二区免费视频
国产精品视频免费
国产精品亚洲综合色区韩国
亚洲国产精品成人午夜在线观看
欧美国产日韩精品
中文字幕精品一区二区精品