專利名稱：具有抗氧化活性和抗衰老活性的中國紫荊的提取物,以及含有該提取物并用于抗氧化、皮 ...的制作方法
技術領域：
本發明涉及具有抗衰老活性的植物提取物和含有該提取物作為有效成分的化妝品組合物。更具體而言，本發明涉及具有抗氧化活性和抗衰老活性的中國紫荊(Cercis chinensis)的提取物，以及涉及含有作為有效成分的該提取物的化妝品組合物，該組合物可用于抗氧化、皮膚衰老防護和改善皺紋。
背景技術：
衰老表示隨著時間流逝而出現的身體的所有生理變化，而衰老狀況和速度因個體情況而不同，并且受到多種原因的影響。即使在一個個體中，衰老對于每個器官也表現出不同的狀況，因此面向個體的衰老研究具有局限性。更具體而言，每個器官和組織的功能都隨時間而改變，這種情況是由于細胞功能的改變引起的。例如，腦神經細胞的損傷導致認知下降，皮下脂肪細胞的損傷會導致皮膚彈性的損失，毛根黑素細胞生產黑色素能力的損失會導致白發，等等此類的情況。因此，個體細胞的衰老會導致個體的衰老。于是，最近對于衰老的研究都集中在以細胞為基礎的研究上。在很多科學家把所有精力都致力于徹底解釋衰老之后，衰老的確切機理依然沒有被揭開，這是因為衰老有多種方面并且非常復雜的緣故。通過現象研究只是提出了一些關于衰老的理論。其中，氧自由基理論和端粒理論給出了一些結果。前者認為由在通常新陳代謝過程中產生的氧自由基導致的累積氧化應激(oxidative stress)是衰老的主要原因，而后者認為反復細胞分裂之后，位于染色體末端的端粒逐漸消失，因而導致細胞分裂停止以及最終細胞死亡。其它理論也共同有助于對衰老進行完善的解釋。更精確地，對于氧自由基理論，在通常的新陳代謝過程中產生的氧自由基隨機破壞了諸如脂質、蛋白質、糖或DNA之類的細胞成分，引起細胞或組織的氧化應激，由此不僅會導致各種諸如癌癥之類的疾病、諸如腦溢血和動脈硬化之類的心血管疾病、諸如風濕病之類的慢性炎癥、自身免疫性疾病、等(Halliwell，B和Gutteridge，J.M.C，Biochem.J.，1984，219，1-14；Freeman，B.A.和Grapo，J.D.，Lab Invest，1982，47，412-426；Ames，B.N.，Science，1983，221，1256-1264；Fridovich，I.，Arch.Biochem.Biophys.，1986，247，1-11；Vishwanath，M.S.，Nutrition in Clinical Practice，1995，10，19-25)，而且由于該氧化性損傷長時間累積會衰老至死亡。1956年Harman首次提出了關于衰老的氧自由基理論(Harman，D.，Free radical theory of aging，Alan R Liss，NewYork，1986，3-49)，從那時起，很多實驗都獲得了支持該理論的結果。舉例來說，通過控制基礎代謝率(BMR)，即氧消耗、通過限制食物或通過限制運動可以延長壽命(Medvedev，Z.A.，Biol.Rev.，1990，65，375-398；Loe，J.，Northrop，J.H.，J.Biol.Chem.，1971，32，103-121；Sohal，R.S.，Insectaging，Springer-Verlag，Heidelberg，1986，23-44；Sohal，R.S.，Aging，1982，5，21-24)。
活體為了保護其免受氧化性損傷，它具有抗氧化物質和抗氧化酶，如過氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶或過氧化物酶。但是，隨著年齡增長，這些酶對于氧自由基的防御力變差(Orr，W.C.和Sohal，R.S.，Science，1994，263，1128-1130；Sohal，R.S.等，J.Biol.Chem.，1995，270，15671-15674)。例如，從老年小鼠中分離出的SOD活性比從年輕小鼠中分離出的SOD活性低。尤其是，增加抗氧化酶、SOD和過氧化氫酶的活性，可以使果蠅的壽命延長30％，這說明氧自由基是與衰老緊密相連的。因此，能夠除去氧自由基或抑制脂質過氧化作用的抗氧化劑可以有效用于治療由氧自由基引起的疾病，以及可以有效用于防止衰老。
將活體持續置于由諸如空氣污染、UV、應激(stress)或疾病之類的有害環境導致的氧化應激中，會增加活體中的自由基，會破壞透明質酸、彈性蛋白、膠原蛋白和真皮的結締組織而導致皺紋，甚至會由于氧化細胞膜中的脂質而破壞了細胞，從而導致如皮炎、皮疹或皮膚癌之類的疾病。自由基與黑色素的產生有關，這種關系被認為是變色、雀斑和皺紋的原因。迄今為止，抗壞血酸、α-生育酚或SOD用于制備保護皮膚的化妝品或作為自由基消除劑的醫療用品。但是，其價格高昂，并且由于化學混合物的不穩定性，而使其效果不確定。因此，在醫療用品、食品和化妝品工業中的共同目標是開發出即安全又能滿意去除自由基效果的物質。
端粒理論是解釋衰老的另一種主要理論。人類的正常細胞在體外只經歷確定數量的細胞分裂。即，在完成預定分裂之后，細胞分裂終止，這種情況稱作復制型老化。端粒理論解釋了為什么發生復制型老化(Kim，S.H.，等，Oncogene 21503-511(2002)；Harley，C.B.，等，Nature 345458-460(1990)；Olovnikov，A.M.J.Theoret.Biol.41181-190(1973)；Harley，C.B.，Exp.Gerontol.27375-382(1992)；Allsopp，R.C.，Weissman，I.L.，Oncogene，213270-3273(2002))。端粒是真核細胞線性染色體的末端部分，具有非常獨特的結構，在該結構中′TTAGGG′序列是重復的。尤其是，鳥嘌呤(G)通過氫鍵形成了非常穩定的G-四連體結構(G-quartet structure)，因此它可穩定并保護染色體(Moyzis，R.K.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.856622-6626(1988))。然而，已知在人類體細胞中每當細胞分裂發生時，端粒就逐漸縮短(Harley，C.B.，Futcher，A.B.，Greider，C.W，Nature 345458-460(1990)；Harley，C.B.et al.，Exp.Gerontol.27375-382(1992)；Allsopp，R.C.，Weissman，I.L.，Oncogene 213270-3273(2002))。這是因為“末端復制問題”的緣故，所述“末端復制問題”表示當DNA復制時，3’-末端的引物區域是不復制的(Olovnikov，A.M.J.Theoret.Biol.41181-190(1973))。因此，每次發生細胞分裂，已復制DNA都縮短引物的該部分，在染色體中的端粒也縮短引物的該部分。當端粒繼續縮短超過臨界點時，DNA的單鏈和雙鏈被切斷，導致細胞分裂在G1階段被細胞周期蛋白依賴激酶抑制劑(cyclin dependent kinase inhibitors)阻礙(Harley，C.B.，et al.，Exp.Gerontol，27375-382(1992))。根據最近研究，端粒長度隨氧化應激而變化。也就是說，氧化應激促使端粒變短，這是因為與染色體的其它部分相比，在端粒DNA部分中的氧化性損傷較少被修復的緣故(Saretzki，G.，von Zglinicki，T.，Ann.New York Acad.Sci.95924-29(2002)；von Zglinicki，T.，Ann.NewYork Acad.Sci.90899-110(2000)；von Zglinicki，T.，TRENDS Biochem.Sci.27339-344(2002)；Lorenz，M.，等，Free Radic.Biol.Med.31824-831(2001))。
本發明人以那些關于衰老的理論為基礎，致力于從植物中找出抑制皮膚衰老的新物質。植物具有建立完善的自我防御體系，這種自我防御體系保護它們自身避免遭受由包括過氧化物自由基(光合作用的殘留產物)的許多氧自由基引起的氧化應激。因此，植物自身是抗氧化劑的重要來源。因此，本發明人對于350種植物研究了清除自由基的活性和抑制脂質過氧化作用的活性，并且選擇了幾種具有抗氧化活性的候選物。從易于確保來源以及其成分和活性沒有被公開考慮，本發明人選擇了中國紫荊作為用于抗氧化劑的最終候選物。
中國紫荊，一種落葉灌木，它屬于豆科族并在中國生長。中國紫荊高3～5m，其末梢沒有絨毛，但有很多皮孔。它具有簡單的互生葉(alternateleaves)，葉子形成直徑為6-11cm的圓形心，沒有絨毛、無花紋，邊緣光滑。葉子上端為墨綠色并有光澤，但葉子背部為淡綠色。托葉為四邊形并且早期脫落。花為1-2cm長，葉腋具有多個花。花沒有花軸但有花梗。花萼為傘膜狀，其上面邊緣具有5個鈍鋸齒。花冠為蝶形和絳紅色，它具有5個不規則的花瓣。它具有10個全部分離的雄蕊。雄蕊底部附著在花萼上，雄蕊的花絲薄并且很長。它具有單個雌蕊。子房平滑且沒有絨毛。子房也具有囊(bag)。上部形狀彎曲，花的柱頭小、短且無花紋。開花時間約為4月，開花后長出葉子。作為豆科植物，果實具有扁平帶狀，其末端部分收縮形成短喙(short bill)。豆莢長7～12cm，在八月或九月成熟。種子為圓形、扁平并接近黑色(Lee，Y.N.，Flora of Korea，Kyo-Hak Publishing Co.，Ltd.，Seoul，1996，362-363)。中國紫荊的莖皮、根皮和莖用于改善血液循環、痛經、水腫、碰傷以及各種傷害(Bae，K.H.，The medicinal plants of Korea，Kyo-Hak Publishing，Seoul，Korea，2000)。
本發明人證實中國紫荊的提取物與其它合成的抗氧化劑不同，它對人類沒有傷害，它對氧化應激具有優異的保護細胞活性，它甚至可以通過降低端粒縮短速度而延長細胞壽命，因此該提取物可以有效用作用于抗衰老、保護皮膚彈性和皺紋護理的化妝品組合物，因而本發明人完成了本發明。
發明概述本發明目的是提供中國紫荊的提取物，它具有抗氧化、抗皮膚衰老、保護皮膚彈性和防止皺紋的活性，并且該提取物是使用水或醇作為提取劑進行提取的。
本發明的另一目的是提供化妝品組合物，它用于抗氧化、改善皮膚彈性或皺紋護理，它含有作為有效成分的從由上述提取物或從其中分離的成分組成的組中選取的化合物，該化合物由化學式1～20表示。
本發明的再一個目的是提供藥物組合物，它含有作為有效成分的上述提取物。
本發明的還一個目的是提供本發明上述提取物的制備方法。
優選實施方案的詳細描述為了實現本發明的上述目的，本發明提供了中國紫荊的提取物，它具有抗氧化、抗皮膚衰老、保護皮膚彈性和防止皺紋的活性，并且該提取物是使用水或醇作為提取劑進行提取的。
本發明也提供了化妝品組合物，它用于抗氧化、改善皮膚彈性或皺紋護理，它含有作為有效成分的從由上述提取物或從其中分離的成分組成的組中選取的化合物，該化合物由化學式1～20表示。
本發明還提供了藥物組合物，它含有作為有效成分的上述提取物。
本發明也提供了本發明上述提取物的制備方法。
下面，詳細描述本發明。
本發明提供了中國紫荊的提取物，它具有抗氧化、抗皮膚衰老、保護皮膚彈性和防止皺紋的活性，并且該提取物是使用水或醇作為提取劑進行提取的。
基于氧自由基理論，本發明人收集了超過140種草本藥和210種植物以研究抗氧化活性，然后選擇了有用的候選物。其中，因為中國紫荊易于確保來源并且還沒有被充分研究，所以它被選作最終的候選物。而且中國紫荊最終被發明人確認為具有抗氧化活性。在本發明中使用的中國紫荊是由Daeduk Science Town(Daejeon，Korea)和Chungnam National University(Daejeon，Korea)在2001年9月收集的，并且由KiHwan Bae教授(College ofPharmacy，Chungnam National University)確定的。憑證標本(HK 1122)陳列于Hansaeng化妝品公司的Jakwang研究所中(Jakwang Research Instituteof the Hansaeng Cosmetics Co.，Ltd.)。
為了制備本發明的中國紫荊提取物，使用醇的水溶液作為溶劑，該醇的水溶液優選從由甲醇水溶液、乙醇水溶液、丙醇水溶液和丁醇水溶液組成的組中選擇。其中，更優選乙醇水溶液，尤其是優選50～80％的乙醇水溶液，更優選60％的乙醇水溶液。
在本發明中，中國紫荊的提取物通過如下步驟制備通過使用乙酸乙酯(EtOAc)和丁醇(BuOH)提取中國紫荊的醇粗提物，更優選地乙醇(EtOH)粗提物；從以上獲得各種級分；分離具有抗氧化活性的乙酸乙酯級分和丁醇級分；以及進行色譜分析。最終，從乙酸乙酯級分和丁醇級分中獲得包括化學式1～20表示的化合物的提取物(參見圖4和圖5)。而且在本發明中獲得的化學式15表示的化合物(丁香亭-3-O(2″-O-沒食子酰基)-蕓香糖苷)被證實是一種新的化合物。
<化學式1>
2’，4’，4’-三羥基查耳酮(異甘草素)
<化學式2>
2’，4’-二羥基-4-甲氧基查耳酮<化學式3>
甘草素(liquiritigenin)<化學式4>
白藜蘆醇
<化學式5>
云杉鞣酸醇(Piceatannol)<化學式6>
沒食子酸<化學式7>
沒食子酸甲酯
<化學式8>
沒食子酸乙酯<化學式9>
楊梅黃酮<化學式10>
阿福豆堿(afzelin)<化學式11>
櫟精-3-O-α-L-鼠李吡喃糖苷(櫟素)<化學式12>
楊梅黃酮-3-O-α-L-鼠李吡喃糖苷<化學式13>
楊梅黃酮-3-O-(2′-O-沒食子酰基)-α-L-鼠李吡喃糖苷
<化學式14>
丁香亭-3-O-蕓香糖苷<化學式15>
丁香亭-3-O-(2″-O-沒食子酰基)-蕓香糖苷<化學式16>
(+)-兒茶素
<化學式17>
(-)-表兒茶素(Epicatechin)-3-O-沒食子酸酯<化學式18>
(-)-表倍兒茶素(Epigallocatechin)-3-O-沒食子酸酯<化學式19>
(-)-lyoniresinol 3α-O-β-D-吡喃木糖苷
<化學式20>
(+)-lyoniresinol-3α-O-β-D-吡喃葡糖苷在化學式1至20表示的化合物中，對于本發明的中國紫荊提取物，以提取物的總重量計，優選包括0.01～1.00重量％的化學式6表示的化合物、0.01～1.00重量％的化學式12表示的化合物和0.01～0.5重量％的化學式5表示的化合物。
化學式1至20表示的本發明化合物具有抗氧化活性，如清除1，1-二苯基-2-Pycryl-偕腙肼(Hydrazyl)自由基的活性(見表3)、脂質過氧化作用抑制活性(見表4)、清除羥基自由基活性、清除一氧化氮的活性(見表6)以及清除過氧化物自由基的活性(見表5)。
在好氧生物中氧對于能量代謝是必需的，但是一旦給予物理、化學和生物應激，氧就變成有害的活性氧種類如超氧化物陰離子自由基、H2O2和羥自由基等，由此導致嚴重的生理障礙。該活性氧種類攻擊不飽和脂肪酸，導致過氧化作用，而不飽和脂肪酸是細胞膜的成分之一。而累積的脂質過氧化物可以是包括衰老在內的各種疾病的原因。在本發明中，中國紫荊提取物的抗氧化活性是通過研究提取物的清除活性氧種類活性以及脂質過氧化作用抑制活性進行測定的。結果，中國紫荊提取物的抗氧化活性與維生素E、常規的抗氧化劑、或BHA(叔丁基-4-羥基苯甲醚)、合成抗氧化劑的抗氧化活性相當或比它們更好。因此，本發明的中國紫荊提取物被證實具有優異的抗氧化活性。
化學式1～20表示的本發明化合物也具有如下的作用保護細胞免于被叔丁基氫過氧化物(叔-BuOOH)引起的氧化性損傷(見表7)、保護細胞抵抗UV輻射(見圖6a和6b)，保護裸鼠抵抗UV輻射(見圖7)、抑制由UV輻射引起的脂質過氧化作用的活性(見表8)、延長細胞壽命(見圖8)以及延長端粒長度(見圖9和
圖10)。因此，證實了本發明的中國紫荊提取物以及由此分離的活性成分不僅具有優異的抗氧化活性，而且具有令人滿意的細胞衰老抑制作用。
本發明也提供了化妝品組合物，它用于抗氧化作用、皮膚衰老抑制、促進皮膚彈性或改善皺紋，它含有從由中國紫荊提取物組成的組中或由上述提取物中分離出的化學式1～20表示的化合物中選擇的一種化合物，所選擇的化合物作為組合物的有效成分。
本發明的化妝品組合物包含從中國紫荊提取物中分離的活性組分，該活性組分選自由以下化學物組成的組化學式1(異甘草素)、化學式2(2’，4’-二羥基-4-甲氧基查耳酮)、化學式3(甘草素)、化學式4(白藜蘆醇)、化學式5(云杉鞣酸醇)、化學式6(沒食子酸)、化學式7(沒食子酸甲酯)、化學式8(沒食子酸乙酯)、化學式9(楊梅黃酮)、化學式10(阿福豆堿)、化學式11(櫟素)、化學式12(楊梅苷)、化學式13(楊梅黃酮-3-O-(2″-O-沒食子酰基)-α-L-鼠李吡喃糖苷)、化學式14(丁香亭-3-O-蕓香糖苷)、化學式15(丁香亭-3-O-(2″-O-沒食子酰基)-蕓香糖苷)、化學式16((+)-兒茶素)、化學式17((-)-表兒茶素(Epicatechin)-3-O-沒食子酸酯)、化學式18((-)-表倍兒茶素(Epigallocatechin)-3-O-沒食子酸酯)、化學式19((-)-lyoniresinol 3α-O-β-D-吡喃木糖苷)和化學式20((+)-lyoniresinol-3α-O-β-D-吡喃葡糖苷)表示的化合物。
中國紫荊的提取物或從該提取物中分離的活性成分具有優異的諸如過氧化作用抑制活性和清除自由基活性之類的抗氧化活性，因此它可以有效用作化妝品組合物，該組合物具有抑制皮膚衰老、改善皮膚彈性或皺紋護理作用，這是因為該組合物能夠保護皮膚并延長細胞壽命的緣故。
本發明的化妝品組合物可以用作基礎皮膚護理的原材料，如軟性洗劑、營養洗劑、營養乳膏劑、香精、面膜(pack)或浴粉，或者可以用作皮膚的外用制劑。
制備化妝品組合物時，在考慮乳化作用和經濟效率之后就要確定油成分的含量。作為油成分，可以使用從由植物油、礦物油、硅油和合成油組成的組中選擇的一種或多種油。此外，為了提高乳化作用，可以加入0.1-5重量％的表面活性劑和高級醇。可利用普通的表面活性劑如非離子表面活性劑，而至于高級醇，可以單獨使用具有12～20個碳數的醇，或者將該醇與其它種類的醇混合使用。
為制備化妝品組合物，可以以0.001～5重量％將諸如卡波姆(carbomer)、膨潤土、黃原膠等之類的增稠劑中的至少一種添加到水性組分中以調節粘度或凝固。
為制備化本發明的妝品組合物，也可以增添諸如高級脂肪酸、維生素等之類的藥物性質以及諸如UV保護劑、抗氧化劑、防腐劑、香料、著色劑、pH值調節劑等之類的用于化妝品的其它常用添加劑。
在本發明的優選實施方案中，通過使用本發明的中國紫荊提取物，可以制備軟性洗劑、粘稠溶液、乳狀洗劑和乳膏劑(見表9～表11)。
為了制備含有中國紫荊提取物的化妝品組合物，向普通組合物中，另外加入1-15重量％的提取物，更優選加入2-10重量％。
本發明還提供用于抗氧化作用和皮膚抗衰老的藥物組合物，該組合物含有本發明的中國紫荊提取物，該提取物作為有效成分。
用于抗氧化作用和皮膚抗衰老的藥物組合物含有作為有效成分的本發明中國紫荊提取物，該藥物組合物對于治療或預防由氧自由基對細胞成分氧化而引起的各種疾病是非常有用的。目標疾病是癌癥、衰老、冠心病、高血脂癥、動脈硬化癥、多發性硬化、自身免疫腦脊髓炎、腦溢血、早老性癡呆癥(Alzheimer′s disease)和腸炎，但是目標疾病未必總是限制于這些疾病。
含有中國紫荊提取物的藥物組合物可以另外包含稀釋劑、崩解劑、甜味劑、潤滑劑、香料等，通常可以制備成片劑、膠囊、粉末、粒劑、混懸劑、乳劑、糖漿劑的形式以及其它液體形式。
尤其是，含有本發明中國紫荊提取物作為有效成分的藥物組合物可以制備成片劑、錠劑、糖錠、水溶或油性混懸劑、粉末或顆粒、乳劑、硬或軟膠囊、糖漿劑或酏劑的形式，以用于口服。為了制備片劑或膠囊形式，可以包含諸如乳糖、蔗糖、山梨(糖)醇、甘露糖醇(manitol)、淀粉、支鏈淀粉、纖維素或明膠之類的粘合劑；諸如磷酸二鈣之類的稀釋劑、諸如玉米淀粉或甘薯淀粉之類的崩解劑；諸如硬脂酸鎂、硬脂酸鈣、硬脂酰富馬酸鎂或聚乙二醇蠟之類的潤滑劑。為了制備膠囊形式的制劑，還可向上述物質中加入液體載體如脂肪油。
包含本發明的中國紫荊提取物的藥物組合物可以是非腸道施用的。非腸道施用的方式有靜脈注射、肌內注射或皮下注射。為了制備適用于非腸道施用的組合物，本發明的中國紫荊提取物應該與穩定劑或緩沖劑在水中混合，以制備溶液或混懸劑形式，最后以安瓿或小瓶形式配制。
本發明的有效劑量是考慮活性成分在活體內的吸收、失活速率、排泄速度、年齡、性別和病人的其它條件、疾病的嚴重性等而確定的。通常，如果是口服，則每1kg重量建議使用2～200mg的本發明提取物，一天一次或多次，更優選劑量為10～100mg。
本發明也提供了中國紫荊提取物的制備方法。
本發明中國紫荊的制備方法由下列步驟構成1)用醇對中國紫荊的粉碎粉末進行粗提；2)按順序使用己烷、乙酸乙酯和丁醇，對上述步驟1)的醇粗提物進行提取；3)將上述步驟2)中獲得的乙酸乙酯級分或丁醇級分進行甲醇∶水的密度梯度柱色譜；和4)通過將在上述步驟3)中獲得的具有抗氧化劑活性的級分進行柱色譜、TLC或HPLC，獲得最終的抗氧化劑提取物。
在步驟1)中，醇優選甲醇、乙醇、丙醇或丁醇中的一種，其中，更優選乙醇。如果優選乙醇，則更優選60％的乙醇。在本發明的優選實施方案中，通過研究濃度為0～100％乙醇的中國紫荊粗提物級分清除DPPH自由基的活性，證實60％乙醇的粗提物具有最高的活性(見圖2)。
附圖簡述參考附圖，可最好地理解本發明優選實施方案的應用，其中圖1是示出在從中國紫荊中獲得乙醇粗提物后，按順序進行己烷、乙酸乙酯和丁醇的提取工藝的示意圖。
圖2是示出從中國紫荊獲得的乙醇粗提物的清除DPPH自由基活性的圖，其中乙醇濃度為0～100％(每個粗提物之間相差10％)。
圖3是示出己烷、乙酸乙酯、丁醇和水級分中的每一種以及乙醇提取物的清除DPPH自由基活性的圖。
圖4所示為從乙酸乙酯級分中分離具有抗氧化活性的化合物的工藝。
圖5所示為從丁醇級分中分離具有抗氧化活性的化合物的工藝。
圖6a所示為一組DNA損傷的細胞照片，反映出本發明的中國紫荊提取物或從該提取物中分離的化合物對于保護細胞抵抗UV輻射的作用。
圖6b所示為表示DNA損傷的相對熒光強度，反映出本發明的中國紫荊提取物或從該提取物中分離的化合物對于保護細胞抵抗UV輻射的作用。
圖7所示為一組表示裸鼠皮膚損傷的照片，證實了本發明的中國紫荊提取物或從該提取物中分離的化合物對于保護細胞抵抗UV輻射的作用。
圖8所示為用本發明的中國紫荊提取物或從該提取物中分離的化合物延長細胞壽命。
圖9所示為DNA印跡分析產生的一組照片，證實了本發明的中國紫荊提取物或從該提取物中分離的化合物降低了端粒的縮短速度。
圖10所示為端粒的縮短速度，表明本發明的中國紫荊提取物或從該提取物中分離的化合物延長了端粒的長度。
圖11所示為一組示出中國紫荊的花、葉、根皮(root bark)、莖的照片。
實施例如下面實施例所示解釋本發明的實用并當前優選的實施方案。
然而，要意識到本領域普通技術人員在考慮本公開的基礎上是可以在本發明的精神和范圍之內進行修改和改進的。
實施例1從中國紫荊中提取有效成分<1-1>抗氧化活性級分的初步分離為了從中國紫荊中提取具有抗氧化活性的有效成分，按在圖1示意圖中出現的工藝進行實驗。具體地，使用粉碎機將1Kg陰干的中國紫荊的葉和莖碾碎成粉末，該粉末在室溫用乙醇(EtOH)提取兩次，兩次之間相隔兩周時間。對于該提取物，向其中逐步加入0～100％的乙醇(每次遞增10％)以制備乙醇溶液。所制備的乙醇溶液用于提取。通過使用DPPH(1，1-二苯基-2-Pycryl-偕腙肼)(Taco，T.等，Biosci.Biotech.Biochem.，1994，58，1780-1783；Na，M.K.等，Nat.Prod.Sci.，2002，8，26-29)的方法對提取物的抗氧化活性進行研究。DPPH是一種穩定的自由基，它示出作為自由基在517nm處的最大光密度。但是，當其被清除時，它就失去了吸光度。基于該觀點，可以使用DPPH測定抗氧化活性。更具體而言，根據不同濃度從中國紫荊中獲得每種乙醇提取物，再用DMSO(Sigma)分別稀釋到3.125、6.25、12.25、25和50μg/ml。然后，每種溶液以每種10μl分配進入96孔板中，再向其中加入190μl DPPH(Sigma，St.Louis，Mo，USA)溶液，該溶液的乙醇濃度為2×10-4M/ml。該板在室溫只放置30分鐘。最后，在517nm測定OD517。用于對照，加入DMSO以代替樣品，并研究光密度的變化。清除DPPH自由基的活性通過下面<數學式1>計算，而能夠清除50％的DPPH的樣品濃度定作IC50。
<數學式1>
清除DPPH自由基的活性(％)＝(A對照-A樣品)/A對照×100A對照對照組的光密度(沒有加入樣品)，A樣品實驗組的光學密度(加入樣品)。
結果，清除DPPH的活性根據劑量而增加。0％、10％、20％和90％的乙醇提取物顯示出低的清除自由基活性，而30％、40％、50％、60％、70％、80％和100％的乙醇提取物總體上表示出高的清除自由基活性。尤其是在60％乙醇提取物的情況下，清除自由基活性隨著提取物的濃度增加而變得非常高，在所有乙醇提取物中，IC50是最低的(26.6)，這情況反映出該提取物具有最高的抗氧化活性(表1和圖2)。
<表1>
在確認60％乙醇提取物具有最高的清除DPPH自由基的活性之后，用不同提取劑獲得各種提取物。具體地，60％的乙醇提取物懸浮在蒸餾水中，再用己烷提取三次。在減壓下濃縮該己烷提取物，獲得11g的己烷級分(下面稱作‘Fr’)。殘余懸浮液用乙酸乙酯(EtOAc)提取三次。在減壓下將其濃縮，獲得25g的乙酸乙酯級分(下面稱作‘EtOAc Fr’)。剩余懸浮液再用水-飽和的丁醇(BuOH)提取三次。將該提取液在減壓下濃縮，獲得19g的丁醇級分(下面稱作‘BuOH Fr’)。而20g的殘余級分當作是水級分(圖1)。
為了在上述獲得的己烷Fr、EtOAc Fr和BuOH Fr中確定具有抗氧化活性的級分，使用各個級分的各個提取物用上述方法測定清除DPPH自由基的活性。此時，已知具有高的清除DPPH自由基活性的維生素E用作對比組。
結果，EtOAc Fr和BuOH Fr的IC50分別為24.0和27.0μg/ml，這結果表明具有與對比組維生素E(IC5024.9μg/ml)相類似的活性。但是，其它級分表示出弱的活性(圖3)。
<1-2>抗氧化活性級分的二次分離在上述實施例<1-1>結果的基礎上，將EtOAc Fr和BuOH Fr進行柱色譜，這兩者級分都具有高活性。將所獲得的級分再次進行抗氧化活性測試，以選擇具有高抗氧化活性的級分。
首先，使用甲醇∶水(1∶4→1∶0)作為流動相，使EtOAc Fr(25g)通過YMC柱色譜(柱尺寸5×30cm)，獲得11個亞級分(Fr.1～Fr.11)。在上述的11個亞級分中將Fr.1(3.6g)再進行YMC柱色譜(柱尺寸3×30cm)，獲得了5個亞級分(Fr.1-1～Fr.1-5)。選擇Fr1-1(450mg)用于HPLC[柱μBondapakTMC18(3.9×300mm，水)，流動相ACN∶0.1％TCA(16∶18)，流動速度1ml/min，UV280nm]，分別獲得18mg和21mg的具有保留時間(以下稱為“tr”)為11.1分鐘和6.2分鐘的化合物，這兩種化合物分別命名為′CCEA111′和′CCEA112′。
其次，對Fr.1-2(500mg)進行HPLC[YMC-Pack ODS-A柱(20×250mm)，流動相甲醇∶水(3∶7)，流動速度6ml/min，UV254nm]級分收集，獲得77mg具有16分鐘tR的化合物以及19mg具有24分鐘tR的化合物，這兩種化合物分別命名為′CCEA1211′和′CCEA1212′。
第三，對Fr.3(4.8g)進行HPLC[YMC-Pack ODS-A柱(20×250mm)，流動相ACN∶0.1％TCA(25∶75)，流動速度6ml/min，檢測器UV(280nm)]級分收集，獲得19mg具有24.5分鐘tR的化合物，該化合物命名為′CCEA33′。
接著，Fr.4(4.0g)通過硅膠柱色譜(4×25cm，230-400目，流動相氯仿∶甲醇(85∶15))分成6個亞級分(Fr.4-1～Fr.4-6)。其中，Fr.4-1(320mg)用于HPLC收集[流動相氯仿∶甲醇(35∶65)，流動速度6ml/min.，UV254nm]，獲得30mg具有25分鐘tR的化合物，并將該化合物命名為′CCEA413′。同樣，Fr.4-4(1g)也用于收集HPLC[流動相甲醇∶水(1∶1)，流動速度6ml/min.，UV254nm]，獲得57mg具有15分鐘tR的化合物，并將該化合物命名為′CCEA442′。
Fr.6(2.2g)通過硅膠柱色譜(3×30cm，230-400目，流動相氯仿∶甲醇(10∶1))分成3個亞級分(Fr.6-1～Fr.6-3)。其中，Fr.6-2(200mg)用于HPLC收集[流動相甲醇∶水(1∶1)，流動速度6ml/min.，UV254nm]，獲得25mg具有20分鐘tR的化合物，并將該化合物命名為′CCEA622′。
接著，將Fr.8(2.1g)進行硅膠柱色譜(流動相氯仿∶水(10∶1))，獲得20mg化合物，并將該化合物命名為′CCEA82′。將上述CCEA82分離之后，殘余級分溶解在甲醇中。進行重結晶，獲得10mg化合物，并將其命名為′CCEA83′。
Fr.9(2.8g)通過硅膠柱色譜(流動相氯仿∶甲醇(15∶1))分成2個亞級分。其中，將Fr.9-1(220mg)用于收集HPLC[流動相甲醇∶水(4∶1)，流動速度6ml/min.，UV254nm]，獲得32mg具有25分鐘tR的化合物，并將該化合物命名為′CCEA913′(圖4)。
將BuOH Fr(19g)進行YMC柱色譜(柱尺寸5×30cm，流動相甲醇∶水(0∶1→1∶0)，獲得8個亞級分(Fr.1-Fr.8)。
Fr.2(3.8g)進行硅膠柱色譜(流動相氯仿∶甲醇∶水(70∶30∶5)，柱尺寸3×30cm，230-400目)，獲得5個亞級分(Fr.2-1～Fr.2-5)。在那些級分中，Fr.2-3(420mg)用于收集HPLC[流動相乙腈∶水(18∶82)，流動速度6ml/min.，UV254nm]，以獲得Fr.2-3-1和Fr.2-3-2。Fr.2-3-1再次用于收集HPLC[流動相乙腈∶水(10∶90)，流動速度6ml/min.，UV254nm]，獲得32mg具有15分鐘tR的化合物，并將該化合物命名為′CCBt231′。
Fr.5(3g)進行硅膠柱色譜(3×30cm，230-400目，流動相氯仿∶甲醇∶水(70∶30∶5))，獲得4個亞級分(Fr.5-1～Fr.5-4)。其中，F r.5-2(300mg)用于收集HPLC[流動相甲醇∶水(35∶65)，流動速度6ml/min.，UV254nm]，產生20mg具有25分鐘tR的化合物以及13mg具有30分鐘tR的化合物。這兩種化合物命名為′CCBt521′和′CCBt522′。將Fr.5-3(600mg)進行YMC柱色譜(柱尺寸3×30cm，流動相30％甲醇)，以將其分成4個級分(Fr.5-3-1～Fr.5-3-4)。在那些亞級分中，使Fr.5-3-3的沉析物純化以獲得29mg化合物，并將該化合物命名為′CCBt533′。
Fr.6(3.2g)再次進行YMC柱色譜(柱尺寸3×30cm)以分成4個亞級分(Fr.6-1～Fr.6-4)。其中，Fr.6-2(370mg)用于收集HPLC[流動相甲醇∶水(3∶7)，流動速度6ml/min.，UV254nm]，產生具有26分鐘tR的化合物(9mg)以及具有28分鐘tR的化合物(16mg)。這兩種化合物命名為′CCBt622′和′CCBt623′。將Fr.6-4(200mg)也用于收集HPLC(流動相甲醇∶水(4∶6)，流動速度6ml/min.)，產生具有18分鐘tR的化合物(5mg)，該化合物命名為′CCBt641′。
Fr.7(1.9g)進行硅膠柱色譜(流動相氯仿∶甲醇，柱尺寸3×30cm)分離，產生4個亞級分(Fr.7-1～Fr.7-4)。Fr.7-2(50mg)用于Sepadex LH-20柱色譜(流動相80％甲醇，柱尺寸3×30cm)，以分成5個亞級分(Fr.7-2-1～Fr.7-2-5)。其中，Fr.7-2-2溶解在甲醇中以再次重結晶，獲得化合物(9mg)并將該化合物命名為′CCBt722′。此外，通過使Fr.7-2-4提取的沉析物純化獲得另外的化合物(10mg)，該化合物命名為′CCBt724′(圖5)。
<1-3>分離化合物的結構分析研究在上述實施例<1-2>中分離的21種級分的結構。具體地，使用電熱熔點儀(Electrothermal Eng.Ltd.，AZ 9003)研究熔點，使用DIP-370數字偏振計(JASCO)研究旋轉程度，使用IR記錄-100分光光度計(JASCO)研究IR光譜，用串連質譜計(Jeol，JMS HX-110/110A)進行質量分析，使用NMR分光光度計(Bruker，NMR AMX-600光譜儀)進行NMR分析，而使用STAR 3400 CX GC(Varian)根據出廠說明進行氣相色譜分析。鑒于上述測試的所有結果(熔點、旋轉度、IR光譜、質量和NMR)，確定化合物結果。
結果，化合物根據結構分成如下表2所示的查耳酮、1，2-二苯乙烯、酚酯(phenolic)、黃酮醇、黃烷醇、木酚素類。每一個化合物都被證實為由<化學式1>～<化學式20>表示的化合物。尤其地，<化學式15>表示的化合物(丁香亭-3-O-(2″-O-沒食子酰基)-蕓香糖苷)具有以下解釋的性質，從這些性質可以確定該化合物為新化合物。
<化學式15的性質>
淺黃色粉末，FeCl3，Mg-HCl，Zn-HCl測試陽性，陽性FAB-MSm/z 823[M+H]+[a]D-80(c 0.1，MeOH)IR Vmaxcm-13400(-OH)，1650(C＝O)，1610，1500，1455(芳香C＝C)，1200，1020(糖苷C-O)UVλmaxnm(log ε)257(3.60)，360(3.82)1H-NMR(600MHz，DMSO-d6)7.46(2H，s，H-2，6)，6.91(2H，s，沒食子酰基-2，6)，6.48(1H，d，J＝1.8Hz，H-8)，6.21(1H，d，J＝1.8Hz，H-6)，5.48(1H，d，J＝7.2Hz，.糖苷-1)，4.49(1H，s，鼠李-1)，3.84(6H，s，OMe-3，5)，3.70(1H，d，J＝10.2Hz，糖苷-6)，3.38(1H，d，J＝10.2Hz，糖苷-6)，1.00(3H，d，J＝5.0Hz，鼠李-6)
13C-NMR(150MHz，DMSO-d6)156.3(C-2)，133.1(C-3)，177.3(C-4)，161.1(C-5)，98.6(C-6)，164.0(C-7)，93.9(C-8)，156.4(C-9)，104.0(C-10)，119.7(C-1)，106.9(C-2，6)，147.4(C-3，5)，138.6(C-4)，100.8(糖苷-1)，76.4(糖苷-2)，74.9(糖苷-3)，70.1(糖苷-4)，74.3(糖苷-5)，66.7(糖苷-6)，101.0(鼠李-1)，70.2(鼠李-2)，70.3(鼠李-3)，71.7(鼠李-4)，68.3(鼠李-5)，17.6(鼠李-6)，165.3(C＝0)，120.4(沒食子酰基-1)，108.7(沒食子酰基-2，6)，145.3(沒食子酰基-3，5)，137.9(沒食子酰基-4)。
<表2>
實施例2清除DPPH自由基活性的測試為了研究在上述實施例1分離并含有<化學式1>-<化學式20>表示化合物的提取物的抗氧化活性，通過在上述實施例1中所使用的相同方法測定它們的清除DPPH自由基的活性。此時，BHA(叔丁基-4-羥基苯甲醚)和α-生育酚、合成抗氧化劑用作陽性對照。
結果，酚酸和黃酮類化合物顯示出依賴于劑量的強清除自由基活性。而1，2-二苯乙烯化合物顯示出較強的清除自由基活性。具體地，包括沒食子酸的沒食子酸酯具有強的活性。例如，由以下表示的化合物的IC50值分別為5.1±0.4、5.3±0.3、7.0±1.1、6.8±0.5、6.7±0.4和8.6±0.7g/ml<化學式6>(沒食子酸)、<化學式7>(沒食子酸甲酯)、<化學式8>(沒食子酸乙酯)、<化學式17>((-)-表兒茶素(epicatechin)-3-O-沒食子酸酯)、<化學式18>((-)-表倍兒茶素(epigallocatechin)-3-O-沒食子酸酯)和<化學式13>(楊梅黃酮-3-O-(2-O-沒食子酰基)-α-L-鼠李吡喃糖苷)，這表明在活性上這些化合物之間沒有大的差異，并且它們中的所有物質與α-生育酚(IC5025.4±0.9g/ml)和BHA(IC5015.3±0.6g/ml)相比，顯示出顯著更強的清除自由基活性，而α-生育酚和BHA兩者都用于陽性對照(表3)。
如果供電子基團放置在苯環的鄰位上，則苯氧自由基變得容易穩定，這情況導致清除自由基活性的增加(Cuvelier，M.E.，Richard，H.，Berset，C.，Biosci.Biotechnol.Biochem.56324-325(1992)；Kikuzaki，H.，等，J.Agric.Food Chem.502161-2168(2002))。因為沒食子酰基放置在鄰近3個羥基的位置上，因此該基團顯示強清除自由基活性，這情況可有效地使酚氧自由基穩定。如表3所示，除沒食子酰基外，由以下表示的黃酮類化合物也證實具有強的清除自由基活性<化學式16>((+)-兒茶素)、<化學式9>(楊梅黃酮)、<化學式10>(阿福豆堿)、<化學式11>(櫟素)和<化學式12>(楊梅苷)，這情況似乎是因為酚取代基使在黃酮類結構中的酚氧自由基穩定的緣故。總之，含有供電子能力大的取代基的化合物可以增加清除自由基活性，這情況與Pekkarinene等的報道一致(Pekkarinen，S.S.，et al.，J.Agric.Food Chem.473036-3043(1999))。
<表3>
實施例3脂質過氧化作用的抑制活性的測試為了測定在上述實施例1分離并含有<化學式1>-<化學式20>表示化合物的抗氧化活性，研究了這些化合物的脂質過氧化作用的抑制活性。脂質氧化產生諸如脂質氫過氧化物、共軛脂肪酸(HODEs)、環氧脂肪酸、丙醛(MDA)和4-羥基壬烯醛(4-HNE)之類的氧化物，這樣就導致了對構成細胞的生物膜的直接損傷或與其它細胞組分的間接反應。因此，脂質的氧化被認為是變性疾病和衰老的主要原因之一(Esterbauer，H.等，FreeRadic.Biol.Med.，1991，1181-128；Esterbauer，H.，Cheeseman，K.H.，MethodsEnzymol.，1990，186407-421；Jira，W.，等，Chem.Phys.Lipids，1996，84165-173；Jira，W.等，Biosci，1998，531061-1071)。通常，在細胞的電子轉遞系統如線粒體或微粒體中產生的過氧化物自由基在體內通過酶反應轉變成H2O2，還通過諸如過氧化氫酶或谷胱甘肽過氧化物酶之類的酶轉變成無害的水。但是，作為其它原因增加的活性氧，H2O2通過Fenton反應()或金屬-催化的Haber-Weiss反應()產生的羥自由基(HO·)，這情況就導致了脂質過氧化物的產生。該脂質過氧化物再次與金屬離子在體內反應，從而生成脂質自由基(L·)或脂質過氧自由基(LOO·)，這導致了脂質過氧化物的鏈反應(Halliwell，B.，Gutteridge，J.M.C.，Free radicals in biology and medicine，3rd Edition，Oxford University Press，Oxford，1999；Halliwell，B.，Gutteridge，J.M.C.，Biochem.J.，1999，2191-14；Harman，D.，Free radical theory ofaging.Alan R Liss，New York，1986，3-49；Stadtman，E.R.，Levine，R.L.，Ann.NY Acad.Sci.，2000，899191-208)。因此，具有供電子能力的化合物被認為是具有脂質過氧化作用抑制的活性。
脂質過氧化作用的抑制活性可以通過光譜法進行量化，在該光譜法中由羥自由基導致的脂質氧化作用產生的丙醛與硫代巴比妥酸(下面稱作‘TBA’)反應，所述羥自由基是Fe2+/抗壞血酸反應體系的最終產物。具體地，10μl由<化學式1>-<化學式20>表示的各個化合物與50μl具有10mg/ml的蛋白濃度的小鼠腦組織均漿和740μl的50mM磷酸鹽緩沖液(pH7.4)混合。然后，向其中加入0.1mM FeSO4.7H2O2和1mM抗壞血酸的混合物(200μl)，隨后在37℃反應30分鐘。向該反應溶液中加入250μl的20％三氯乙酸(下文稱作‘TCA’)(Sigma)以終止反應。然后，加入250μl的1％TBA(Sigma)，該混合物在100℃反應10分鐘。該反應溶液用10,000rpm離心10分鐘，隨后測定OD532。根據下面<數學式2>計算每個樣品的脂質過氧化作用的抑制活性，而將足以抑制50％的脂質過氧化的濃度確定為IC50。BHA和α-生育酚用于比較組，而沒有向對照組中加入樣品或溶液。
<數學式2>
脂質過氧化作用的抑制活性(％)＝(A對照-A樣品)/(A對照-A空白)×100A對照對照組的光密度(沒有加入樣品)，A樣品實驗組的光密度(加入樣品)，A空白沒有加入樣品、TCA和TBA的組的光密度。
結果，黃酮類、1，2-二苯乙烯和酚酯化合物表現出強的依賴劑量的脂質過氧化作用抑制活性。具體地，1，2-二苯乙烯的由<化學式5>(云杉鞣酸醇)表示的化合物被證明具有與BHA(IC500.11±0.02g/ml)一樣強的活性(IC500.09±0.01g/ml)，BHA是已知作為強的脂質過氧化作用抑制劑。而多數黃酮類化合物都表示出強的脂質過氧化作用抑制活性。具體地，由以下表示的化合物的IC50值分別為0.95±0.06、2.9±0.06、1.0±0.08、6.21±0.40、5.27±0.32和4.73±0.41g/ml<化學式9>(楊梅黃酮)、<化學式17>((-)-表兒茶素-3-O-沒食子酸酯)、<化學式18>((-)-表倍兒茶素-3-O-沒食子酸酯)、<化學式11>(櫟素)、<化學式12>(楊梅苷)和<化學式13>(楊梅黃酮-3-O-(2-O-沒食子酰基)-α-L-鼠李吡喃糖苷)，這些化合物比α-生育酚的脂質過氧化作用的抑制活性更好(表4)，該α-生育酚用作陽性對照。類似上述實施例2的DPPH清除自由基活性，脂質過氧化作用的抑制活性似乎與酚氧自由基的穩定化相關。即，在苯環上放置越多的供電子基團，酚氧自由基越易于變得穩定，這種情況會導致活性的增加。尤其地，黃酮類化合物的結構不僅有助于酚氧自由基的穩定，而且也有助于金屬離子的螯合，這是因為該化合物具有強的脂質過氧化作用抑制活性的緣故。
<表4>
實施例4清除羥自由基活性以及清除一氧化氮活性的測定羥自由基(HO·)通過金屬離子或過氧化物自由基的反應產生。由于強的反應活性，羥自由基在體內會導致對DNA、蛋白質和脂質的氧化性損傷。而一氧化氮(NO·)與過氧化物自由基反應，從而產生過氧亞硝酸根(ONOO-)，該過氧亞硝酸根也具有強的反應活性。因此，一氧化氮在體內表示出類似于羥自由基的反應(Yan，L.J.，Sohal，R.S.，Free Radic.Biol.Med.，2000，291143-1150)。因此，為了研究在上述實施例1分離并由<化學式1>至<化學式20>表示化合物的抗氧化活性，本發明人根據Halliwell方法(Halliwell，B.等，Anal Biochem.，1987，165，215-219)測定了清除羥自由基活性。具體地，每個化合物與10μl溶解在DMSO的樣品、磷酸鹽緩沖液(20mM，pH7.4)、5.6mM脫氧核糖、0.1mM FeCl3、1mM H2O2和0.1mM抗壞血酸混合，使總體積為1ml，然后該混合物在37℃反應60分鐘。向該反應溶液中加入250μl的20％TCA以及250μl的1％TBA溶液(溶解在50mM的NaOH中)，隨后在95℃熱反應5分鐘。反應完畢后，測定OD532。通過下面<數學式3>計算清除羥自由基的活性。BHA和α-生育酚用作陽性對照。
<數學式3>
清除羥自由基的活性(％)＝(A對照-A樣品)/(A對照-A空白)×100A對照對照組孔的光密度(沒有加入樣品)，A樣品實驗組孔的光密度(加入樣品)，A空白沒有加入樣品、TCA和TBA的孔的光密度。
結果，與對照組相比，黃酮類、1，2-二苯乙烯和酚酯的化合物表示出12.7-54.0％的清除羥自由基活性。具體地，由<化學式17>((-)-表兒茶素-3-O-沒食子酸酯)、<化學式18>((-)-表倍兒茶素-3-O-沒食子酸酯)、<化學式7>(沒食子酸甲酯)、<化學式8>(沒食子酸乙酯)和<化學式13>(楊梅黃酮-3-O-(2-O-沒食子酰基)-α-L-鼠李吡喃糖苷表示的化合物(其中所有的沒食子酰基被取代)表示出顯著更高的清除氧自由基活性(表5)。
另一方面，由<化學式18>((-)-表倍兒茶素-3-O-沒食子酯)，<化學式17>((-)-表兒茶素-3-O-沒食子酯)，<化學式16>((+)-兒茶素)和<化學式9>(楊梅黃酮)表示的化合物表現出較高的清除一氧化氮的活性(表5)。
<表5>
實施例5清除過氧自由基活性的測定過氧化物自由基(O2-)自身具有少量的反應活性，但是它易于改變成H2O2，而H2O2可產生具有強反應活性的羥自由基，或者它與一氧化氮(NO·)反應以產生也具有強反應活性的過氧亞硝酸根(ONOO-)。因此，過氧化物自由基可能是SH-基氧化、蛋白質酪氨酸的硝化、脂質過氧化作用和DNA損傷的原因。為了測定在上述實施例1中制備并由<化學式1>-<化學式20>表示化合物的抗氧化活性，測定這些化合物的清除過氧化自由基(O2-)的活性，因為過氧化物自由基是許多有害活性氧的前體。主要地，通過研究超氧化物岐化酶(SOD)的活性進行清除超氧化物自由基的測定，超氧化物岐化酶是一種通過過氧化物的歧化作用清除過氧化物的酶。在本發明中，測定樣品抑制由黃嘌呤/黃嘌呤氧化酶的酶反應制備的過氧化物產物的活性以及抑制通過硝基藍四唑的還原產生甲月替的反應()的其它活性。具體地，96-孔平板的孔內填充有50μl的4mM的黃嘌呤(Sigma)、50μl的250mM NBT(Sigma)、50μl的50mM磷酸鹽緩沖液(pH值為7.8，1mM EDTA)以及10μl各個樣品，向該混合物中加入40μl黃嘌呤氧化酶以誘發反應。反應完成后，按預定收集各個反應溶液，并用ELISA讀數器測定OD550。如下面的<數學式4>所示，通過比較NBT還原與對照組還原的降低計算各個樣品的清除過氧化物自由基的活性，而IC50確定為能夠清除50％過氧化物自由基的樣品濃度。α-生育酚和咖啡酸用于陽性對照以與其它物質比較抗氧化活性。
<數學式4>
清除過氧化物自由基的活性(％)＝(A對照-A樣品)/(A對照-A空白)×100A對照對照組孔的光密度(沒有加入樣品)，A樣品實驗組孔的光密度(加入樣品)，A空白沒有加入樣品、TCA和TBA的孔的光密度。
結果，黃酮類、1，2-二苯乙烯和酚酯的化合物表現出優異的清除自由基活性，其與劑量有關。具體地，由下面所表示的黃烷-3-醇化合物的IC50值分別為11.9±2.1、24.0±3.5和13.2±2.5g/ml<化學式17>((-)-表兒茶素-3-O-沒食子酸酯)、<化學式18>((-)-表倍兒茶酸-3-O-沒食子酸酯)和<化學式15>(楊梅黃酮-3-O-(2-O-沒食子酰基)-a-L-鼠李吡喃糖苷)，這反映出類似與咖啡酸的強活性，所述咖啡酸是有效的過氧化物自由基清除劑(IC5011.0±1.8g/ml)。而且，黃酮類和酚酯酚酯化合物表現出優異的清除過氧化物自由基的活性。具體地，由<化學式9>(楊梅黃酮)、<化學式16>((+)-兒茶素)、<化學式7>(沒食子酸甲酯)和<化學式8>(沒食子酸乙酯)表示的化合物的IC50值分別為12.1±1.1、16.5±2.0、16.5±1.4和15.8±1.6g/ml。另一方面，查耳酮化合物具有較弱的清除活性。具有使得酚氧自由基穩定的結構的化合物被證實具有優異的清除過氧化物自由基的活性，所述酚氧自由基是在與過氧化物反應的期間產生。尤其是沒食子酰基被取代的化合物顯示出強的活性(表6)。
<表6>
實施例6保護細胞免受由叔丁基氫過氧化物誘發的氧化性損傷的活性當叔丁基氫過氧化物進入細胞時，其新陳代謝成為自由基中間體，因此它引起脂質過氧化物作用，從而導致細胞損傷。這種現象與由累積在細胞和組織中的氧化應激所引起的現象相似。因此，事實上，該現象對于評價抑制氧化應激引起的衰老的作用是非常有效的。HEK-N/F是新生兒的一種表皮細胞系，它用1.5mM的叔丁基氫過氧化物處理3小時。結果，細胞的存活率顯著降低11.2±1.2％。但是，當上述分離的化合物在其中另外由50.0g/ml濃度處理，檢測到強的細胞保護活性。尤其是當由<化學式5>(云杉鞣酸醇)表示的化合物一起處理時，細胞存活率達到84.7±6.9％，這反映出有非常強的細胞保護活性。此外，由<化學式9>(楊梅黃酮)和<化學式11>(櫟精)表示的黃酮-3-醇化合物表現出61.0±4.5％和48.1±5.7％的細胞存活率。而由<化學式6>(沒食子酸)、<化學式7>(沒食子酸甲酯)和<化學式8>(沒食子酸乙酯)所表示化合物的細胞保護活性分別為41.5±3.1％、43.0±5.6％和43.1±4.1％。從該結果看，本發明的來自中國紫荊的化合物提取物被證實能夠通過保護細胞抵抗氧化應激來抑制由氧化應激引起的衰老以及抑制由過氧化作用誘發的細胞死亡。
<表7>
實施例7保護細胞抵抗由UV輻照引發的氧化應激的活性<7-1>保護細胞抵抗UV輻照的作用(體內)UV輻照由于增加了細胞內的活性氧而誘發DNA損傷和DNA蛋白結合。當HEK-N/F細胞被35mJ/cm2的UVB輻照時，細胞核內的DNA鏈被切割。斷裂鏈與乙啡啶同型二聚體(Et2)(DNA鏈插入熒光染料)聯合，測定熒光范圍以確定DNA損傷的數量。具體地，HEK-N/F細胞在無血清的KGM培養基(Clonetics)中培養，將該細胞接種在24-孔板的孔中，接種量為0.5-4×104細胞/2cm2。然后，該細胞培養18小時，隨后樣品在其中處理2小時。該細胞用PBS洗滌之后，使用UV反射照射儀(transilluminator)(Spectronics UV反射照射儀EBF-260，最大波長312nm；半峰強度范圍，297-328nm)對該細胞進行輻照。暴露于UV的細胞再培養1-7小時，然后，加入5M的乙啡啶同型二聚體(Et2，Millipore)。30分鐘之后，用Millipore微型板熒光計Cytofluor 2350(激發485nm，發射645nm)測定熒光。
結果，如圖6a和圖6b所示，在用中國紫荊提取物以及由<化學式9>(楊梅黃酮)和<化學式5>(云杉鞣酸醇)表示的化合物處理的組中所看到的熒光各自為54.7％和66.7％，該熒光比對照的熒光低。因此，中國紫荊提取物和由該提取物分離出的活性成分被證實可通過抑制由UV輻照引發的氧化應激而顯著降低DNA損傷。
<7-2>保護皮膚組織抵抗UV輻照(體內)的活性5-6周齡的雌性無毛小鼠(SKH-hr-1)在24±2℃、50±10％的相對濕度和12小時的白天/黑夜循環下飼養14天。在實驗之前30-60分鐘，在小鼠的5個位置上皮下注射樣品，并且用UVB輻照該小鼠背部。每組5只小鼠，將其放進籠子中(20×15×5cm)，并用UV燈(HP-15M，280-400nm，最大波長312nm；Atto公司，日本)在15cm的距離處以15kJ/m2的量對小鼠進行UVB輻照。在UV輻照24小時之后，切下小鼠的背部皮膚，并保存在-70℃，直到測定過氧化作用時為止。
UVB輻照在皮膚組織中導致了嚴重的脂質過氧化作用，因此，過氧化脂質含量的測定就是皮膚損傷的測定。具體而言，UVB輻照在SKH-1無毛小鼠的背部皮膚上。48小時之后，切下其背部皮膚組織，通過硫代巴比妥酸(TBA)方法測定脂質過氧化作用。為勻漿，將該小鼠的背部皮膚置于10×50mM K-P緩沖溶液中。
同樣，對氫過氧化作用進行研究。冷凍背部皮膚切片放置在0.1MTris-HCl緩沖溶液(pH7.5)中，該緩沖液含有1mg/ml的葡萄糖和1mg/ml二氨基聯苯胺(DAB)，該冷凍背部皮膚切片在37℃培養5-6小時。皮膚切片用蒸餾水洗滌后，溶液用2％甲基綠染色60分鐘。細胞核染色成藍色，并且在顯微鏡下觀察到了DAB-過氧化物酶(褐色)。
UV輻照在皮膚組織中誘發活性氧種類的產生，從而導致DNA損傷、蛋白質氧化和脂質過氧化，這些就是諸如炎癥、癌癥、衰老等之類皮膚損傷的原因。如圖7所示，用90mJ/cm2的UVB輻照引發嚴重的皮膚損傷。但是，當中國紫荊提取物和由<化學式5>(云杉鞣酸醇)表示的化合物各自以50mg/kg的量進行預處理時，SKH-1無毛小鼠的皮膚損傷可顯著減少。因此，中國紫荊提取物及其活性成分即由<化學式5>(云杉鞣酸醇)表示的化合物必須具有保護皮膚細胞免于氧化應激的活性、抑制脂質過氧化作用的活性以及清除自由基的活性。而且，保護皮膚免于UVB輻照的活性似乎是由該抗氧化活性產生的。二氨基聯苯胺(DAB)通過在組織中與過氧化物酶反應產生茶褐色的DAB-過氧化物酶。因此，可觀察到由UVB輻照產生的H2O2。如圖7所示，在90mJ/cm2的UVB輻照下，可觀察到更多的茶褐色DAB-過氧化物酶，但是當SKH-1無毛小鼠的皮膚組織用中國紫荊的提取物以及由<化學式5>(云杉鞣酸醇)表示的化合物以各自50mg/kg的量進行預處理，則在H2O2產生在SKH-1無毛小鼠的皮膚組織中得到顯著抑制。
從脂質過氧化作用的研究可證實，在由UVB輻照的組中平均TBARS(硫代巴比妥酸反應性物質)含量約為0.68nmol/mg蛋白質，該含量是沒有被UVB輻照的對照組過氧化作用(0.32±0.05nmol/mg蛋白質)的2倍(表8)。在用中國紫荊提取物以及由<化學式5>(云杉鞣酸醇)表示的化合物處理的組中，在皮膚中的脂質過氧化作用依賴處理劑量減小。具體而言，在相同濃度下，由<化學式5>表示的化合物比用于陽性對照的MAP(鎂-L-抗壞血酸基-2-磷酸鹽)表現出更高的活性。
<表8>
實施例8細胞壽命的延長在用溴化尿苷處理其成纖維細胞(皮膚的另一種主要成分)以后，從新生嬰兒包皮中獲得HEK-N/F細胞。然后，該細胞在提供有10％FBS的DMEM培養基中培養。而HEK-N/F細胞在培養過程中以1∶4的比例連續稀釋。在細胞用樣品處理之前，該細胞生長達到3倍PDL(群體倍增水平)。在培養過程中，每個樣品施用3g/ml。培養基每隔三天用新鮮培養基替換，該新鮮培養基補充有包含等量濃度樣品的培養液。培養之后，本發明的中國紫荊提取物、<化學式5>(云杉鞣酸醇)表示的化合物以及<化學式9>(楊梅黃酮)表示的化合物進行處理，隨后進行細胞分裂研究。
結果，證實了所有的中國紫荊提取物以及它的活性成分都具有延長細胞壽命的效果。沒有處理對照的細胞平均壽命為約35天，而用3μg/ml的中國紫荊提取物處理組的平均壽命為約42天，后者壽命約為前者的1.2倍。而且，用其它活性成分、<化學式9>(楊梅黃酮)表示的化合物以及由<化學式5>(云杉鞣酸醇)表示的化合物處理的組用于培養的平均壽命分別為56天和76天，這兩者壽命分別是對照組壽命的1.6倍和2.1倍(圖8)。因此，中國紫荊的提取物以及從該提取物中分離的活性成分都被證實具有延長細胞壽命的作用。
實施例9細胞壽命的延長以及端粒的延長在上述實施例8中，中國紫荊的提取物以及從該提取物中分離的活性成分都被證實具有延長細胞壽命的作用。因此，在本實施例中，研究壽命的延長作用與端粒長度之間的關系。具體而言，使用核酸提取試劑盒(IsoQuick核酸提取試劑盒，ORCA研究公司)，從不同年齡的各個細胞中提取基因組DNA，所提取DNA溶解在Tris-EDTA溶液(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH8.0)之后，在4℃儲存。將2μl的10×H緩沖溶液(TaKaRa)、2μl所提取的染色體組DNA溶液和蒸餾水在1.5ml的試管中混合，并使最終體積為19μl。然后，向其中加入1μl的限制酶HinfI(6U/l，TaKaRa)。該混合物在37℃反應3-4小時，隨后進行電泳。對于電泳，電橋區域的瓊脂糖(type I，Sigma)凝膠濃度被調節為1％，而底座區域(bed region)的瓊脂糖凝膠濃度被調節為0.8％以制備凝膠板(Marisol KS-8405，20X14cm)，并且使用1×Boyer′s緩沖溶液(50mM Tris-HCl，20mM乙酸鈉，2mMEDTA，18mM NaCl，pH 8.0)。裝入0.5μg的1Kb DNA梯(ladder)作為標記物。向所有的樣品中加入3μl的上樣緩沖液，隨后用35V/cm進行電泳20小時。在電泳完成之后，該凝膠用溴化乙錠(2μg/ml)染色15分鐘，染色可以使用UV確定。然后，該凝膠浸泡在0.25N HCl中，再振蕩15分鐘。該凝膠用蒸餾水洗滌兩次。凝膠進入變性溶液中(0.2N NaOH，0.6MNaCl)，隨后在室溫搖動25分鐘。然后，該凝膠用蒸餾水洗滌三次。在填充有6×SSC的印跡裝置中，按順序裝填硝化纖維素膜(Optitran BA-S 85，Schleicher & Schuel)、3mm濾紙、紙巾、玻璃板和重物(2kg)，然后印跡過夜。印跡完成之后，膜濾紙吸收3×SSC，然后將水均勻排去。標記膜上的孔位置。將該膜放置在濾紙之間，隨后在80℃烘焙過夜。然后，在65℃與變性鮭精DNA(Wako)進行預混合，之后在50℃通過將雜交緩沖液(1×Denhan溶液，1M NaCl、50mM Tris-HCl，10mM EDTA，0.1％SDS，50g/ml變性鮭精DNA)與5-末端[32P]-標記的(TTAGGG)4進行雜交。該雜交膜浸泡在洗滌溶液(4×SSC/0.1％SDS)中，然后在55℃振蕩15分鐘。干燥之后，該膜覆蓋上覆蓋物，并放置在附裝有X-射線膠片(Scientific ImagingFilm，Kodak)和光增強屏的盒子中。放射自顯影在-80℃進行過夜。基于顯影膠片和膜的位置，孔位置用魔術筆進行標記。TRFs的密度峰用激光密度計(UltroScan XL，Pharmacia)檢測，并計算其遷移率。
結果，端粒隨細胞分裂的進行而逐漸變得更短。如圖9所示，對照組中的端粒在第14.8次分裂之后縮短了8.0kbp，此后沒有更多分裂。相反，在使用中國紫荊的提取物或從該提取物中分離的活性成分處理的組中，端粒長度在分裂進行比對照組中更多次之后達到臨界點(在本發明中約為8.0kbp)。只要端粒DNA的長度小于臨界點(對于人類皮膚角化細胞，其臨界點推測為7.9-8.4kb)，細胞分裂就將繼續進行。因此，已證實通過延緩端粒縮短速度(意味著延遲到達臨界點)就可以延長細胞循環。對照組的最大PDL為14.1，而使用中國紫荊提取物、<化學式9>(楊梅黃酮)表示的化合物以及<化學式5>(云杉鞣酸醇)表示的化合物處理的組的PDL分別為17.2、23.1和29.9，這說明最大PDL被顯著延長。
基于細胞分裂頻率和端粒長度之間的關系，可計算端粒縮短速度。結果，與對照組相比，使用中國紫荊提取物、<化學式9>(楊梅黃酮)所表示化合物以及<化學式5>(云杉鞣酸醇)所表示化合物處理的組的速度各自延遲1.2倍、1.6倍和2.1倍(圖10)。因此，中國紫荊提取物及其活性成分對于皮膚細胞壽命延長的作用被證實是由延遲端粒縮短速度而產生的。
制備實施例1含有中國紫荊提取物的化妝品組合物的制備本發明人制備了含有中國紫荊提取物作為有效成分的化妝品組合物(制備1～制備6)，該化妝品組合物如下面的表9和表11所示。除中國紫荊提取物之外，可以另外包括通常用于制備化妝品的其它提取物。其它提取物的實例有桑樹皮、褐藻類、獨活、薏苡屬、牡丹、馬齒莧(Portulacaoleracea Linne)、柿子葉、榛子提取物和積雪草提取物。
首先，本發明人通過下列常用方法制備了含有本發明的中國紫荊提取物的軟性洗劑以及粘性溶液，該軟性洗劑以及粘性溶液以表9中所例舉的下列成分為基礎。
<表9>
軟性洗劑以及粘性溶液的制備
其次，本發明人通過下面的常用方法制備了含有中國紫荊提取物的乳狀洗劑和其它洗劑，該洗劑的構成由下表10所列出。
<表10>
乳狀洗劑以及其它洗劑的制備
接著，本發明人通過下面的常用方法制備了含有中國紫荊提取物的乳膏劑，該乳膏劑的構成由下表11所列出。
<表11>
乳膏劑的制備
制備實施例2制備具有抗氧化活性和抗衰老活性的藥物組合物本發明人制備了一種具有抗氧化和抗衰老活性的藥物組合物，它含有作為有效成分的中國紫荊提取物。
<2-1>糖漿劑的制備按如下制備含有2％(重量/體積)的本發明中國紫荊提取物作為有效成分的糖漿劑。
中國紫荊提取物、糖精和糖溶解在80g的溫水中。然后，該溶液冷卻。甘油、糖精、調味劑、乙醇、山梨酸和蒸餾水一起混合制備溶液，然后向其中加入上述冷卻的溶液。向混合物中加入水使其總體積為100μl(表12)。
<表12>
<2-2>片劑的制備按如下制備每個含有15mg的提取物作為有效成分的片劑。
250g的中國紫荊提取物與175.9g乳糖、180g馬鈴薯淀粉以及32g膠體狀硅酸混合。向該混合物中加入10％明膠溶液，然后充分粉碎以通過14目的篩子。將粉碎混合物干燥，再向其中加入160g的馬鈴薯淀粉、50g滑石粉和5g硬脂酸鎂以制備片劑(表13)。
<表13>
如上所述，由于本發明中國紫荊提取物的強抗氧化活性，因此含有該提取物作為有效成分的藥物組合物可以用于預防和治療與過氧化作用相關的疾病。
下面，解釋能夠應用含本發明中國紫荊提取物的藥物組合物的具體疾病。
然而，要意識到本領域普通技術人員在考慮本公開內容之上是可以在本發明的精神和范圍之內作出修改和改進的。
可應用實施例1癌癥癌癥是由很多原因導致的，但其最主要原因被認為是活性氧。即，活性氧破壞細胞并且使被破壞的細胞不能修復，由此導致細胞機能失常，因而產生癌癥(Ames，B.N.，Science，1983，221，1256-1264)。順便提及，包含在水果中的苯酚酸對于肝癌是有益的(Sun，J等，J Agric Food Chem，2002，4；50(25)，7449-7454)，包含在西紅柿制備中的番茄素對于乳癌是有益的(Hadley CW等，Exp Biol Med，2002，227(10)，869-80)，而isoverbascoside具有對胃癌有益的作用(Chen RC等，Acta Pharmacol Sin，2002，23(11)，997-1001)，同樣該抗氧化劑也被認為是對其它癌癥有效的。因此，該抗氧化劑可以有效用于各種癌癥的防止和治療，具有優異抗氧化活性的本發明藥物組合物對于癌癥的防止和治療也是有效的。
可應用實施例2衰老在通常新陳代謝過程中產生的活性氧隨機并不可逆地破壞了諸如脂質、蛋白質和糖或DNA之類的細胞成分，因而細胞受到氧化性損傷。該損傷的長期累積就導致衰老，甚至導致死亡(Harman，D，Free radical theoryof aging，1986，3-49)。相反，通過不同條件的各種方法，例如限制飲食、限制運動等來研究減少氧消耗而延長壽命，即意味著減少基礎新陳代謝率(Medvedev，Z.A.，Biol Rev.，1990，65，375-398；Loe，J.等，J.Biol.Chem.，1971，32，103-121；Sohal，R.S.，Aging，1982，5，21-24)。也就是說，清除活性氧是延遲衰老的一種途徑，因此迄今為止一直在發展消除活性氧的抗氧化劑。因此具有優異抗氧化活性的本發明藥物組合物可用于延遲衰老。
可應用實施例3冠心病、高膽甾醇血、動脈硬化當膽固醇合酶抑制劑用于治療有冠心病和有高膽甾醇血的病人時，在低密度脂質中膽固醇含量降低，但是因為泛醌Q10的合成被抑制，因而低密度脂蛋白仍然被保護，這表明該試劑對于防止活性氧的過氧化作用并不是非常有效，而且對于治療上述疾病也不是非常有效。相反，當抗氧化劑如西立伐他汀或普羅布考施用于那些病人時，病人的低密度脂蛋白迅速降低(Lankin VZ等，Bull Exp Biol Med，2002，134(1)，39-42)。在另外的臨床試驗中，將去氫吡啶鈣拮抗劑拉西地平(也是一種抗氧化劑)施用于具有動脈粥樣硬化的患者。結果，血壓降低，在血管壁中的膽固醇減少，動脈粥樣硬化的損傷尺寸減小(Haller H等，Drugs R D，2002，3(5)，311-23)。因此，抗氧化活性被證明對于預防和治療與膽固醇相關的血管疾病如冠心病，高膽甾醇血和動脈硬化是非常有效的。因此，具有優異抗氧化活性的本發明藥物組合物對于預防和治療與膽固醇相關的血管疾病如冠心病，高膽甾醇血和動脈硬化是非常有效的。
可應用實施例4多發性硬化和自身免疫性腦脊髓炎ALA(α硫辛酸)是一種抗氧化劑，它施用于具有多發性硬化和自身免疫性腦脊髓炎的模型小鼠，其中施藥后，這兩種病狀減輕。表明氧化應激是多發性硬化和自身免疫性腦脊髓炎的主要原因，因此抗氧化劑能夠有效用于治療所述與神經過分緊張有關的疾病(Marracci GH等，J Neuroimmunol，2002，131(1-2)，104-14)。因此，具有優異抗氧化活性的本發明藥物組合物對于預防和治療與神經有關的疾病如多發性硬化和自身免疫性腦脊髓炎是非常有用的。
可應用實施例5腦溢血和早老性癡呆癥由活性氧引起的氧化應激會氧化細胞成分，由此導致那些細胞機能失常。這些不正常的功能會引起神經細胞的功能性紊亂、伴隨中風、創傷等。如果該氧化應激長時間累積而沒有被合適處理時，就會發展成為嚴重的腦疾病如腦溢血、早老性癡呆癥等。通過使用能夠消除活性氧的抗氧化試劑可以有效治療諸如腦溢血和早老性癡呆癥之類的腦疾病(Perry G et a1.，Comp BiochemPhysiol C ToxicolPhaarmacol，2002，133(4)，507-13；Cecchi C等，Free Radic Biol Med，2002，1533(10)，1372-9；Smith MA等，Free RadicBiol Med，2002，133(9)，1194-9)。因此，具有優異抗氧化活性的本發明藥物組合物對于預防和治療諸如腦溢血和早老性癡呆癥等之類的腦疾病是非常有用的。
可應用實施例6腸炎過量的過氧化副產物會累積在腸炎病人的白細胞中。由腸炎病人中累積的過氧化副產物導致的細胞損傷作為腸感染的首要和次要的病理機理。即，氧化應激導致腸炎癥，發展成為發炎性腸炎(KruidenierL等，AlimentPharmacol Ther，2002，16(12)，1997-2015)。因此，具有優異抗氧化活性的本發明藥物組合物可以有效地用于預防和治療諸如發炎性腸炎等之類的與炎癥相關的疾病。
工業適用性如以上所解釋的那樣，與其它合成抗氧化劑不同，與其它天然抗氧化劑相比，本發明的中國紫荊提取物以及從該提取物分離并由<化學式1>至<化學式20>表示的化合物不會損傷人類，而且具有優異的抗氧化活性，因此它們可以有效抑制細胞內的氧化應激并防止與細胞衰老有關的端粒縮短，由此導致細胞壽命延長。因此，含有上述提取物或化合物作為有效成分的本發明化妝品組合物可以非常有效地用于開發抗皮膚衰老、支撐皮膚彈性和皺紋護理的化妝品。
本領域普通技術人員將意識到在前面描述中所公開的概念和具體實施方案可以容易地用作用于改進或設計其它實施方案的基礎，而該其它實施方案是可實施本發明相同目的的。
本領域普通技術人員也將意識到該等效實施方案是不會背離如所附權利要求所述的本發明精神和范圍的。
權利要求
1.一種中國紫荊的提取物，它具有抗氧化、抗皮膚衰老、保護皮膚彈性和防止皺紋的活性，并且它是通過使用水或醇的水溶液作為提取劑提取的。
2.如權利要求1所述的提取物，其中所述醇的水溶液選自由甲醇水溶液、乙醇水溶液、丙醇水溶液和丁醇水溶液組成的組。
3.如權利要求2所述的提取物，其中所述醇的水溶液為50～80％的乙醇水溶液。
4.如權利要求3所述的提取物，其中所述醇的水溶液為60％的乙醇水溶液。
5.如權利要求1所述的提取物，其中所述提取物含有選自由下列化學式表示的化合物組成的組中的一種或多種化合物<化學式1>(異甘草素)、<化學式2>(2′，4′-二羥基-4-甲氧基查耳酮)、<化學式3>(甘草素)、<化學式4>(白藜蘆醇)、<化學式5>(云杉鞣酸醇)、<化學式6>(沒食子酸)、<化學式7>(沒食子酸甲酯)、<化學式8>(沒食子酸乙酯)、<化學式9>(楊梅黃酮)、<化學式10>(阿福豆堿)、<化學式11>(櫟素)、<化學式12>(楊梅苷)、<化學式13>(楊梅黃酮-3-O-(2″-O-沒食子酰基)-α-L-鼠李吡喃糖苷)、<化學式14>(丁香亭-3-O-蕓香糖苷)、<化學式15>(丁香亭-3-O-2″-O-沒食子酰基)-蕓香糖苷)、<化學式16>((+)-兒茶素)、<化學式17>((-)-表兒茶素-3-O-沒食子酸酯)、<化學式18>((-)-表倍兒茶素-3-O-沒食子酸酯)、<化學式19>((-)-lyoniresinol 3α-O-β-D-吡喃木糖苷)和<化學式20>((+)-lyoniresiol 3α-O-β-D-吡喃葡糖苷)。
6.如權利要求5所述的提取物，其中所述提取物含有0.01～1.00重量％的<化學式6>所示化合物、0.01～1.00重量％的<化學式12>所示化合物以及0.01～0.5重量％的<化學式5>所示化合物。
7.一種化妝品組合物，它用于抗氧化、抗皮膚衰老、保護皮膚彈性和防止皺紋，它含有作為有效成分的權利要求1所述提取物。
8.一種化妝品組合物，它用于抗氧化、抗皮膚衰老、保護皮膚彈性或防止皺紋，它含有選自由從權利要求1的提取物中分離的<化學式1>至<化學式20>所表示的化合物組成的組中的一種或多種化合物作為有效成分。
9.如權利要求7或權利要求8所述的化妝品組合物，其中所述化妝品組合物選自由基礎皮膚護理化妝品如柔性洗劑、營養洗劑、營養乳膏劑、香精、面膜或浴粉組成的組。
10.一種藥物組合物，它用于抗氧化和抗衰老，它含有作為有效成分的中國紫荊提取物。
11.如權利要求10所述的要求組合物，其中所述藥物組合物以注射劑、片劑或糖漿形式制備。
12.一種制備權利要求1的中國紫荊提取物的方法，它由下列步驟構成1)用醇對中國紫荊的粉碎粉末進行粗提；2)按順序使用己烷、乙酸乙酯和丁醇，對上述步驟1)的醇粗提物進行提取；3)將上述步驟2)中獲得的乙酸乙酯級分或丁醇級分進行乙醇水的密度梯度柱色譜；和4)通過將在上述步驟3)中獲得的具有抗氧化活性的級分進行柱色譜、TLC或HPLC，獲得最終的抗氧化提取物。
13.如權利要求12所述的制備方法，其中所述醇為60％的乙醇。
全文摘要
本發明涉及中國紫荊的提取物，它具有抗氧化活性和抗衰老活性并含有化學式1～化學式20的化合物。本發明也涉及化妝品組合物，該組合物用于抗氧化、皮膚衰老防護和改善皺紋，并且含有作為有效成分的提取物。本發明提取物對于氧化性損傷和皮膚損傷具有保護效果以及對與年齡相關的端粒縮短具有抑制作用，因此該提取物可以有效用作皮膚衰老防護化妝品。
文檔編號A61Q19/08GK1731978SQ200380107721
公開日2006年2月8日 申請日期2003年12月4日 優先權日2002年12月27日
發明者羅敏均, 劉載國, 李燦馥, 金鎮杓, 任坤爀, 閔東日, 田永旻 申請人:株式會社韓國新藥, 株式會社韓生化妝品