褐指藻提取物促進皮膚細胞的蛋白酶體活性的用途的制作方法

專利名稱：褐指藻提取物促進皮膚細胞的蛋白酶體活性的用途的制作方法
技術領域：
本發明主要涉及褐指藻(alga Phaeodactylum)，特別是三角褐指藻(algaPhaeodactylum tricomutum)的提取物作為化妝品的用途，它能促進皮膚細胞，特別是角質細胞、成纖維細胞或黑色素細胞(優選人)的蛋白體活性，含有它的化妝品組合物以及化妝品護理方法。
本發明進一步主要涉及褐指藻，特別是三角褐指藻的提取物在制造化妝品組合物中的用途，該組合物用于保護皮膚不受UV暴露的不利影響或用于防止和/或延緩皮膚老化效應的出現。
背景技術：
現在非常多的研究者在致力于尋找在抗人衰老的方法。特別是在化妝品領域中，其中正在進行努力防止，或至少延緩明顯皮膚老化效應的出現，如皺紋，失去彈性或膚色等。
或多或少長時期地暴露于太陽輻射，并且主要是紫外線，由于其中期或長期的有害結果現在為眾所周知。盡管皮膚的色素形成提供防止UVA(波長從320納米至400納米)的直接保護以及防止UVB(波長從290納米至320納米)的延遲保護，長期對紫外線的暴露會導致光化性紅斑或日光性彈性纖維病，加速皮膚老化效應如皺紋的出現，并且有時甚至導致皮膚癌的形成。公認的，大部分的UVA穿過表皮，導致氧化種類如自由基，或氧的還原形式的產生，其在皮膚中在各種水平上反應而損傷皮膚細胞，特別是角質細胞，成纖維細胞或黑色素細胞。這導致炎癥現象或特別地以皺紋形式出現的光化性老化。
已經公認很長時間，皮膚防止UV射線的局部保護通常是通過使用在防曬產品或抗衰老產品中的物理過濾物(filter)和/或化學過濾物實現的。
從Friguet B.等在Ann.N.Y Acad.Sci.2000，908，143-54，標題為“Protein degradation by the proteasome and its implication in aging”的出版物中也已知蛋白酶體是一種已知其在細胞凈化中作用的多催化蛋白復合體，它的主要功能是將通過氧化作用被損害的蛋白從細胞中清除。這個消除伴隨著多肽的形成，該多肽隨后被細胞代謝。因此，如由Petropoulos，Friguet等在Journal of Gerontol.Biol.Sci.2000，55A，no.5，B220-B227，標題為“Increase of oxidatively modified protein is associated with a decreaseof proteasome activity and content in aging epidermal cells”中所描述，蛋白酶體從細胞清除出無用的成分，其通過積累阻礙細胞的最優機能。

發明內容
本發明的一個主要目標是解決在提供新型化妝品中存在的新技術問題，該化妝品能夠促進皮膚細胞，特別是優選人的角質細胞、成纖維細胞或黑色素細胞的蛋白酶體活性。
本發明的另一個主要目標是解決在提供新型化妝品中存在的新技術問題，該化妝品能夠保護皮膚不受UV暴露的不利影響或用于防止和/或延緩皮膚老化效應的出現。
本發明的另一個目標是解決在提供一種方法中存在的技術問題，其互補通過常規UV過濾物(filter)的保護，特別是通過參與細胞的正確機能，促進它們解毒來輔助它們的作用。
所有的這些技術問題由本發明第一次以一種簡單，便宜和可靠的方法解決了，該方法可以在化妝品中工業化規模應用。
因此，按照第一個特征，本發明涉及褐指藻，特別是三角褐指藻的提取物作為化妝品的用途，它能促進皮膚細胞，特別是角質細胞、成纖維細胞或黑色素細胞(優選人)的蛋白酶體活性。
按照第二個特征，本發明進一步涉及褐指藻，特別是三角褐指藻的提取物在制造化妝品組合物中的用途，該組合物用于保護皮膚不受UV暴露的不利影響或用于防止和/或延緩皮膚老化。
按照第三個特征，本發明進一步包括一種化妝品組合物，該組合物促進皮膚細胞，特別是優選人的角質細胞、成纖維細胞或黑色素細胞的蛋白酶體活性，或用于保護皮膚不受UV暴露的不利影響或用于防止和/或延緩皮膚老化，其特征在于它包括作為其化妝品活性劑之一的褐指藻，特別是三角褐指藻的提取物，其任選地在化妝品可接受的賦形劑中，皮膚護理優選是在暴露UV線之前的預防護理或在暴露UV線之后的恢復護理。
按照第四個特征，本發明進一步包括一種化妝品皮膚護理的方法，其特征在于它包括有效量的褐指藻，特別是三角褐指藻的提取物對需要其的人皮膚的適宜區域的局部施用，按照局部施用是在暴露UV線之前或之后實行，目的是獲得預防或恢復效果。產生的整體效果是在所述皮膚區域上的抗衰老效果，特別是通過改善皮膚的硬度和彈性，延緩皺紋的出現或減少它們的深度。
在本發明特征之中任何一個的框架內，褐指藻，特別是三角褐指藻的提取物可在化妝品組合物中存在，基于最終化妝品組合物的總重，其濃度大約為0.01％-10％，特別是約為0.1％-5％。
已指出褐指藻，特別是三角褐指藻是來源于溫帶氣候的硅藻。該藻因為其高生長率而著名，使得某些工業如農業食品工業將它作為一種給多種產品增加營養的脂類的快速來源，或還作為一種水產養殖的食物使用。
在第一個實施方案中，提取物是通過使用極性萃取溶劑和/或非極性萃取溶劑萃取得到。
褐指藻，特別是三角褐指藻的提取物可以通過使用極性萃取溶劑和/或非極性萃取溶劑萃取獲得，特別是C1-C6醇或水-醇混合物，C2-C6多羥基醇如乙二醇，氯化的溶劑如氯仿或二氯甲烷，有機酸的C3-C6酯如乙酸乙酯，C6-C10烷烴如庚烷，C5-C8醚如二異丙基醚。
在本發明一個優選的變體中，此提取物是通過使用任選地已經呈堿性的醇或水/醇混合物萃取褐指藻，特別是三角褐指藻獲得，所述醇選自異丙醇，乙醇和甲醇。
所選醇優選是異丙醇或乙醇。
通常，優選在任何萃取操作之前冷凍藻。冷凍優選在大約-40℃至-20℃的溫度下實施并且優選大約1-7天時間。優選使用該預先步驟是為了在與將來的萃取溶劑接觸時產生熱沖擊，以促進從硅石(來源于藻細胞骨架)的傾析。然后讓藻與萃取溶劑接觸。
在一個優選的變體中，冷凍藻直接浸沒于加熱過的萃取溶劑中。
在室溫下將藻在萃取溶劑中浸軟(macerated)也是優選的。
在一個優選的變體中，在室溫下將藻浸漬優選約5-80分鐘的一段時期，特別優選約20-40分鐘的一段時期。
在另一個優選變體中，萃取是在回流下進行。
在除此以外另外一個優選變體中，萃取可在惰性氣氛下，優選氮飽和氣氛下進行。這使得有可能特別避免明顯的活性分子的氧化降解。
該提取物優選在惰性氣體如氮氣下包裝，并且也可以加入抗氧化劑以保護活性分子。
在以優選變體中，每100g藻(以藻的干重表示)使用萃取溶劑的量是大約0.1-20升，優選大約2-10升。
在另一個優選變體中，在使用已經呈堿性的醇或水-醇混合物萃取的情形中，上述藻提取物是在下列系列步驟以后獲得的，其中的一些上面已經描述a)如上所述將藻冷凍并隨后將其浸漬于萃取溶劑中，b)將藻浸軟，c)例如使用氫氧化鈉溶液或氫氧化鉀溶液使萃取溶劑呈堿性，至pH值為10-14，優選13，d)從醇或水-醇相除去不溶物，e)加蒸餾水于醇或水-醇相，f)產生的水-醇溶液用非極性溶劑通過液-液方法洗滌，該溶劑與醇或水-醇相是不溶混的，例如庚烷，己烷和環己烷，g)去除含有非極性溶劑的相h)例如使用水性硫酸溶液或水性鹽酸溶液，將除去含非極性溶劑的相之后回收的水-醇相酸化至pH值為1-3，優選pH為2，i)酸化后得到的溶液使用非極性溶劑進行液-液萃取，該溶劑與醇或水-醇相不混溶，例如庚烷，己烷和環己烷，j)將水-醇相除去，和k)將除去水-醇相之后回收的含有非極性溶劑的相進行蒸發，產生不含非極性溶劑的油，按照本發明該油是理想的提取物。
使用已經呈堿性并接著被酸化的醇，使得可以獲得具有在化妝品組合物中可接受的視覺和味覺特征(黃色和可接受的氣味)的提取物。
在本發明的第二個優選實施方案中，上述藻的提取物是通過用超臨界CO2萃取獲得。使用這種特殊的溶劑意味著藻已經預先凍干。
從下列解釋性的描述，本發明的其它特征、目的和優點將變得顯而易見，這些描述是參照本發明的幾個實施例和比較活性測試以及化妝品組合物配方的實施例給出的，化妝品組合物的配方設計是通過舉例說明的方式簡單地給出，因此不應該以任何方式限制本發明的范圍。
除非另外說明，實施例中的比例是作為重量百分比表示。溫度是攝氏度并且壓力是大氣壓力。
具體實施例方式
本發明實施例1-褐指藻，特別是三角褐指藻按照本發明的提取物的制備1.1)通過第一種方法，用一種極性溶劑如異丙醇(IPA)萃取按照實施方法的優選模式，整個提取是在惰性氣氛(氮飽和)下進行以避免活性分子的明顯降解。
在此實施例中使用250kg生物量(三角褐指藻)。
將該生物量在-20℃冷凍，然后浸漬于異丙醇(IPA)中，伴隨攪拌在80℃-83℃回流。熱擊使得有可能促進從硅石的傾析(來源于藻細胞骨架)。
使用溶劑的量為每升包含在生物量中的水10升IPA。這樣，對于30％的干物質比例，上述250kg的生物量是由75kg干物質和175kg水組成。在此情形下使用的IPA量為1750kg。
在被冷卻到約50℃之前，整體(生物量+IPA)在大約80℃回流半小時，同時攪拌。
在生物量和IPA被冷卻至約50℃后，整體被轉移至GUEDU過濾器，以便將提取過的生物量和溶解在IPA中的藻提取物分離。
提取液在間歇式反應器中濃縮(濃集因數＝71.5)。濃縮過的提取物具有油的表觀。
油狀提取物隨后以每kg油10kg溶劑的比例被吸收在冷IPA中。持續攪拌20分鐘。然后過濾汁(這使得有可能去除殘遺粘性淤渣)。
通過加入沸石和活性碳，在室溫下在80升的Schott反應器中分兩批進行30分鐘的脫色和除臭處理。加入的沸石(ABSENT2000，由UOP提供)量為0.94kg并且加入的活性炭(CXV，由CECA提供)量為1.6kg。木炭對沸石的比例為1.7。
然后通過在紙上的過濾將沸石和活性炭除去。
通過在IPA中的儲液加入抗氧化劑(DL-α-生育酚終濃度為0.05％重量并且棕櫚酸抗壞血酸酯終濃度為0.05％重量)。
含有抗氧化劑的濾液隨后通過分批法在惰性氣體如氮氣下濃縮，直至獲得一種褐色油。
該油此后將被稱為三角褐指藻按照本發明的提取物E1。1.2)通過第二種兩步方法萃取，極性溶劑/乙醇，然后液-液萃取，極性溶劑(水-乙醇)，非極性溶劑(庚烷)萃取是從將來源于250kg的生物量(三角褐指藻)的49.8kg冷凍干物質，即大約20％的干物質分散于539kg96％的無水乙醇中開始，用9kg的30.5％水性氫氧化鈉溶液使無水乙醇呈堿性。在乙醇的回流點浸軟30分鐘后，在氮氣下將整體冷卻至18℃。
在氮氣下通過過濾分離不溶物并隨后將其去除。
151kg蒸餾水被加入到573.9kg的濾液中。緩慢攪拌該水-醇相10分鐘，然后通過液-液方法用162kg庚烷洗滌。丟棄液-液分配的庚烷上層相。回收下層相，因為它包含鹽形式的脂肪酸，這是由于在萃取開始時進行的堿化。再重復兩次庚烷洗滌操作并系統地回收下層相。
通過加入2.8kg的硫酸酸化以此方式獲得的720kg下層相，直至pH為2.2，從而將脂肪酸轉變為酸的形式。在氮氣下攪拌整個溶液10分鐘，然后使用非極性溶劑進行液-液萃取，所述非極性溶劑在此情形下是158kg庚烷。重復庚烷洗滌操作5次以回收總共697kg的庚烷相，該相來源于五種含游離脂肪酸的級分。此相在旋轉式蒸化器上蒸發至干燥，然后通過分子蒸餾以表示為0.65kg油的量得到按照本發明的活性提取物。
產生的油是一種均勻液體并且在顏色上是暗黃。
該油此后將被稱為三角褐指藻按照本發明的提取物E2。實施例2-按照本發明的提取物，即上述實施例1.2的E2，在UV輻射不存在或存在時作為促進人皮膚細胞，特別地角質細胞的蛋白酶體活性的試劑的效果評價在本實施例中用到的褐指藻提取物是在通過上面實施例1.2上下文中描述的萃取方法得到的提取物E2。
下面描述的研究是在正常人角質細胞(NHK)上進行的。
按照本發明的提取物E2在皮膚細胞上的作用是以兩種不同方式檢測，或者基于蛋白酶體三種蛋白水解活性，或者通過測定氧化蛋白的量，其在或多或少的程度上作為蛋白酶體活性變異的函數而積累。
1)檢測的原理1.1)表征蛋白酶體活性的3種酶活的測定第一種類型的檢測涉及三種表征蛋白酶體的活性類胰凝乳蛋白酶活性，后谷氨酸水解酶(postglutamic hydrolase)活性和最后類胰蛋白酶活性。而且它們是通過3個不同催化位點承載的。蛋白酶體的每種多肽活性是通過使用對于每種活性特異的熒光多肽底物，在對于蛋白酶體特異的抑制劑的存在和不存在時測定的。因而檢測的原理在于使用分光熒光計跟蹤熒光隨時間的增強，這是由于來源于熒光多肽的熒光團的釋放。
1.2)氧化蛋白量的測定第二種類型的測量是用作對酶活測定的補充，以便通過一種常規檢測方法評價氧化蛋白的量。所述量隨蛋白酶體活性反向變化，因此該測定使得可以衡量按照本發明的化妝品對蛋白酶體活性的作用。
用于檢測氧化蛋白的Oxyblot(Western blot)技術是以如Leammli U.K.在“Cleavage of structural protein during the assembly of the head of thebacteriophage T4”，Nature，1970，277，680-685中所描述的常規方式進行。
使用了該公知技術的涉及膜上蛋白免疫檢測的部分，從與抗體保溫起特別改編。它在2.6)中描述。
在UV暴露的情形下，用劑量分別為10焦耳/cm2和0.05焦耳/cm2的UVA和UVB輻射人角質細胞的原代培養物。這些數值對于所有實驗是恒定的。
1.3)蛋白(蛋白酶體)量的測定在通過Oxyblot進行的活性測定同時，平行實施另一個蛋白檢測技術以系統地確定在每個樣品的每一等分部分中存在的蛋白量。這個技術以Bradford方法的名字為人所知。在此它是以一種如Bradford M.在“Arapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities ofprotein utilizing the principle of protein-dye binding”，Anal.Biochem.72，248(1976)中所描述的常規方式使用。由于對于活性檢測所選擇的實驗方案，系統地實施該技術。事實上，下面描述的實驗是對具有不同等分體積的恒定量的蛋白進行的，隨后將不同等分體積補足至200μl(恒定總體積)。
2)材料和方法2.1)正常人角質細胞(NHK)的培養正常人角質細胞(NHK)的培養物是產生于皮膚樣品。
在第一步中樣品在PBS(磷酸鹽緩沖鹽水-Sigma)(50ml管)中漂洗4次。隨后通過在兩個連續70％乙醇的浴器中浸泡3秒凈化。當已經凈化樣品后，將其放置于含PBS的培養皿中。裁剪出1mm寬的長條，小心去除最大量的脂肪組織和真皮。當它們變得可利用時，將長條放置于含PBS的培養皿中。為了能夠從表皮上回收角質細胞，在37℃下將長條放置于胰蛋白酶在PBS中的25％溶液中4小時。
然后通過用手術刀刮削長條從表皮上分離真皮，獲得的表皮懸浮在含有DMEM(Dulbecco Modified Eagle’s Medium-Gibco)+10％ of FCS(Fetal Calf Serum-Eurobio)的試管中。在懸浮液均化之后，丟棄包含角膜細胞的表面部分，在篩子上過濾剩余物。
濾過部分在176g離心5分鐘。殘余物用NHK-D培養基(DMEM+10％FCS+0.4μg/ml氫化可的松+10ng/ml EGF(表皮生長因子)+10-9M霍亂毒素)吸收。細胞進行計數并且隨后以細胞/瓶的比率接種。
培養24h后，改變培養基，用PBS漂洗細胞，并且將K-SFM增殖培養基(Gibco)用于剩余的培養。
以完全常規的方式傳代培養角質細胞，但需要在60-70％匯合時將它們傳代以便它們保持它們的增殖能力。這樣，當細胞是60-70％匯合時，丟棄維持液并用PBS漂洗細胞簇。讓細胞與3ml胰蛋白酶/EDTA溶液接觸；然后，當細胞脫離后，用含10％ FCS(Eurobio)的培養基抑制胰蛋白酶。均化，回收細胞懸浮液并接著在室溫下20g離心5分鐘。只用培養基吸收產生的殘余物。為了維持，接種是如上以106細胞/75cm2的比率在保持在上述條件下的通氣燒瓶中進行。在大約十天后獲得匯合并且細胞可以擴增6-7代。
在想要檢測一種物質在這些角質細胞上的活性的情形中，試驗將在上述的匯合時刻在含有角質細胞的培養基上進行。
2.2)裂解緩沖液制備裂解緩沖液首先需要制備下列溶液1.5M Tris-HCl，pH＝7.5將45.375g Tris堿(sigma；T1503)溶解于200ml蒸餾水中，用12N的HCl調節pH值至7.5，然后補足至250ml。
1M蔗糖溶液(Merck；ref.7654)溶解8.55g蔗糖于25ml蒸餾水中。
2mM MgSO4溶液(Sigma；ref.M7506)溶解0.01g的MgSO4于20ml蒸餾水中。
4％Triton X100溶液(Sigma；ref.X100)溶解0.8g Triton X100于20ml蒸餾水中，然后分成0.5ml等分部分并保存在-20℃。
40mM PMSF溶液(Sigma；ref.P7626)溶解14mg PMSF于2ml無水乙醇中，分成50μl等分部分并保存在-20℃。
0.5mg/ml亮抑酶肽溶液(Sigma；ref.L2884；-20℃保存)分成50μl等分部分并保存在-20℃。
1M DL-二硫蘇糖醇溶液(Sigma；ref.D0632；4℃保存)將0.154g DL-二硫蘇糖醇溶解于1ml蒸餾水，分成10μl等分并保存在-20℃。
為了制備100ml裂解緩沖液，首先需要制備在表1中描述的所謂的不完全溶液，將其分成4.39ml的等分部分(即將其分為每個都等于4.39ml的小體積)并在-20℃保存表1制備裂解緩沖液的不完全溶液

裂解緩沖液或所謂的完全溶液在使用前使用4.39ml不完全溶液+500μl4％ Triton 100X+10μlof1M DTT+50μl 0.5mg/ml亮抑酶肽+50μl40mM PMSF即時制備。
2.3)Bradford法檢驗蛋白步驟是常規的并且要求下列校準范圍的制劑從BSA儲液50μg/ml(BIORAD；標準蛋白；ref.500-0006)每管中加入200μl考馬斯藍G250。
所述考馬斯藍是在使用前通過稀釋儲液至1/5即時制備。
為了制備樣品，從裂解緩沖液中回收細胞，接著在測定它們的蛋白濃度之前進行超聲處理。
如果樣品的蛋白濃度大于3mg/ml，需要將它們稀釋至1/100，然后用700μl水和200μl考馬斯藍稀釋100μl的細胞提取液。如果濃度低，則需要取10μl細胞提取物和790μl水以及200μl考馬斯藍。樣品被旋渦振蕩。在等待5分鐘后，在BMG FLUOstar分光熒光計上在595nm處很快地讀出結果。所述結果在表2中比較。
表2蛋白質的檢驗(Bradford法)校準

2.4)測試樣品的制備2.4.1)活性檢測樣品的制備在說明書結尾處的圖解1中描述了培養的一般原理，基于提取物E2的處理和使用UVA和UVB的輻射。在不同時間按照2.1)回收并按照2.2)裂解在培養物中的NHK，這取決于設計的實驗，即在用按照本發明的提取液處理之前或之后和/或在UV輻射之前或之后。試圖分析的蛋白酶體存在于這些細胞裂解物的上清液中。
不同類型的樣品如下-I1＝參比+只有提取液E2-I2＝參比+提取液E2在UV前-I3＝參比+提取液E2在UV后每次將每一體積的上清液分成三等分并且將同一個樣品的等分放置于一個微平板讀數器上。加入對于各種活性特異的熒光多肽底物(作為蛋白量的函數)。下面描述的分光熒光計操作是用恒定總體積，但對于每個樣品不同體積Vi的等分部分進行的。對于不同的Vi使用恒定量的蛋白意味著引入的蛋白量必須首先通過在2.3)中描述的Bradford法檢查。
因而其目的就是記錄引入的每mg蛋白質存在蛋白的量。
2.4.2)測量氧化蛋白量實驗的樣品的制備應用的一般培養原則和圖解1中所描述的一樣。Oxyblot(Western blot)技術，或蛋白質電泳，致使樣品Ii在凝膠上遷移。然后將它們轉移至膜上，其與期望抗體保溫。為了測量氧化蛋白的量，與抗-二硝基苯(抗-DNP)多克隆抗體進行保溫以檢測蛋白質的羰基基團，該基團在進行活性測試之前已經反應。
2.5)蛋白酶體酶活的檢測a)介紹為了檢測蛋白酶體的酶活，用PBS漂洗培養的NHK細胞兩次，然后在對蛋白酶體特異的抑制劑，即MG132(N-Cbz-Leu-Leu-leucinal)存在或不存在時，通過使用對每種活性特異的熒光多肽底物確定蛋白酶體的各種肽酶活性。多肽底物如下針對類胰凝乳蛋白酶活性的Leu-Leu-Val-Tyr-氨基甲基香豆素(LLVY-amc)，針于后谷氨酸水解酶(postglutamichydrolase)活性的Leu-Leu-Glu-β-萘胺(LLE-na)和針對類胰蛋白酶活性的Leu-Ser-Thr-Arg-amc(LSTR-amc)。檢測的原理在于使用分光熒光計跟蹤熒光隨時間的增強，這是由于來源于熒光多肽的熒光團氨基甲基香豆素或β-萘胺(na)的釋放。
為了測量UV對蛋白酶體的影響，用恒定劑量的10J/cm2UVA和0.05J/cm2UVB輻射在培養物中的正常人角質細胞，或NHK，此后在輻射后的不同時間回收并裂解它們。
b)蛋白酶體三種蛋白水解酶活性類胰凝乳蛋白酶，后谷氨酸水解酶和類胰蛋白酶活性是對從細胞裂解物提取的蛋白酶體測量，測量使用在下列濃度下的熒光多肽作為底物12.5μM的LLVY-amc，150μM的LLE-na和40μM的LSTR-amc。對于測量的每個系列，需要與對每種活性特異的熒光底物進行另外的保溫。這些活性是與對蛋白酶體特異的抑制劑，即20μM的MG132(N-Cbz-Leu-Leu-leucinal)平行測定的，以檢測與蛋白酶體無關的活性的比例。
2.5.1)測定LLVY(類胰凝乳蛋白酶)活性的方法下面給出的這個方法的原理，除了試劑，它對于三種活性是相同的。
所謂的類胰凝乳蛋白酶活性是與胰凝乳蛋白酶活性類似的活性，它通過在芳香族氨基酸，在此情形中酪氨酸之后的切割而表示。蛋白酶體(LLVY活性)N-琥珀酰-LLVY-amc→N-琥珀酰-LLVY+熒光amc熒光素是通過切割反應釋放。因此，在第一步中，通過讀取分光熒光計(FLUOstar(BMG))可以獲得表示為熒光單位每分鐘(FU/min)的粗結果。熒光單位是儀器的函數，因此是任意的。
我們任意地選擇以樣品中存在的每mg蛋白(蛋白酶體)每min釋放pmol的amc表示蛋白酶體活性。為此，取自NHK培養物的每個樣品的蛋白(蛋白酶體)量首先通過Bradford方法檢驗。實驗是使用不同的體積Vi進行的，只不過總反應體積保持恒定為200μl。一條amc校準曲線也被預先確定，以便能夠使由儀器在給定的樣品Ii上產生的結果與那些蛋白量已知的結果相互關聯。
為了這個目的使用下列試劑-25mM TRIS緩沖液，pH7.5-用于校準曲線7-氨基-4-甲基香豆素(amc)(SigmaA9891)20mM儲液(3.5 mg/1 ml DMSO)-用于活性測定熒光底物N-琥珀酰-Leu-Leu-Val-Tyr-7-酰氨基-4-甲基香豆素(SigmaS6510)10mM在DMSO中的儲液amc校準范圍是通過將amc儲液在TRIS緩沖液中稀釋至4μM制備的。每個數量一式兩份分配至96-孔平板。
使用200ul TRIS緩沖液跑一個空白。然后在350nm的激發波長和440nm的發射波長處在分光熒光計上迅速讀出結果。
獲得的用于校準曲線(斜率a的直線)的結果在下面表3中比較
表3amc校準曲線

為了測定LLVY活性，固定體積的細胞裂解物(通過Bradford法測定以便每次相同量的蛋白質最終被導入)被一式兩份導入96-孔平板。實際上，這是樣品的最低蛋白濃度(其必須相當于20μg蛋白質)。用TRIS緩沖液將體積補足至100μl。
樣品然后保溫，加入100μl針對LLVY活性的熒光多肽底物，其首先已經在TRIS緩沖液中被稀釋至25μM(為了12.5μM的最終濃度)。
然后在355nm的激發波長和460nm的發射波長處在分光熒光計上迅速讀出結果，增益為40，每2分鐘讀一次共30分鐘。
粗結果表示為FU/min，該單位是儀器的函數。
測定是在含有Vi體積細胞裂解物的200μl的恒定反應體積上進行的，其作為裂解物蛋白(蛋白酶體)濃度的函數被固定。
在使用前即時測定的蛋白濃度表示為μg/μl。
基于校準范圍，通過使用下列經驗公式活性可以表示為每分鐘每mg蛋白釋放的amc(以pmol表示)

(a＝4.568.104)對于分為等分部分的每個樣品Ii，要求測定釋放的amc量并將其表示為pmol/min/mg蛋白。這是通過使用校準曲線完成。在分光熒光計上迅速讀出的量與上述曲線斜率的比值給我們提供了表示為μmol/l/min蛋白的最初的中間結果。
然后足以用最終反應體積(200μl)乘這個值，并除以要測定的樣品Ii等分體積Vi，并除以在使用前即刻通過Bradford方法測定的蛋白量。于是最后結果除了調節因子可表示為pmol/min/mg蛋白。
Ri＝(N.Vt/Vi.Qi).系數N＝每升每分鐘釋放的蛋白摩爾量Vt＝終反應體積(200μl)Vi＝樣品Ii的等分體積(μl)Qi＝通過Bradford方法測定的蛋白量(μg)如果應用上述方式，Ri代表研究蛋白(蛋白酶體)的量，任意的表示為pmol/min/mg引入蛋白(蛋白酶體)。
2.5.2)測定LSTR活性(類胰蛋白酶活性)的方法研究下列切割反應蛋白酶體(LSTR)活性Nt-Boc-LSTR-amc→Nt-Boc-LSTR+熒光amc通過使用下列試劑首先進行amc校準，使用一個相同的公式可以獲得LSTR活性-25mM TRIS緩沖液，pH7.5-用于校準曲線7-氨基-4-甲基香豆素(amc)(SigmaA9891)20mM儲液(3.5mg/1ml DMSO)在設定在350nm的激發波長和440nm的發射波長處的分光熒光計上很快地讀出原始結果。
-用于活性測定熒光底物N-t-Boc-Leu-Ser-Thr-Arg7-7-酰氨基-4-甲基香豆素(SigmaB4636)在DMSO中10mM的儲液胰蛋白酶抑制劑MG132(Z-Leu-Leu-Leu-CHO)(親和性，ZW8440)在DMSO中的20mM儲液獲得的用于校準曲線的結果(斜率b的直線)在下面表4中比較表4amc校準曲線

對于活性測定，在355nm(激發波長)和460nm(發射波長)處在FLUOstar(BMG)上讀出結果，增益為30，每2分鐘讀一次共30分鐘。
結果也可以使用與先前那個類似的另一個經驗公式獲得

(b＝1.728.104)2.5.3)測定LLE活性(后谷氨酸水解酶活性)的方法研究下列切割反應蛋白酶體(LLE活性)N-CBZ-LLE-na→N-CBZ-LLE+熒光na按照相同的方案進行校準，這次涉及底物β-萘胺(na)，使用下列試劑-25mM TRIS緩沖液，pH＝7.5
-用于校準曲線β-萘酰胺(na)(SigmaN8381)20mM儲液(5.73mg/2ml DMSO)在激發波長333 nm和發射波長410nm處在分光熒光計上讀出結果。獲得的用于na校準曲線(斜率c的直線)的結果在下面表5中比較表5na校準曲線

-用于活性測定熒光底物N-CBZ-Leu-Leu-Glu-β-萘胺(SigmaC0788)10mM在DMSO中的儲液在340nm(激發波長)和410nm(發射波長)處在FLUOstar(BMG)上讀出測量結果，增益為30，每2分鐘讀一次共35分鐘。
使用與先前活性相同的方法，于是使用下列經驗公式可以獲得對LLE活性的測量，其中蛋白(蛋白酶體)量表示為pmol釋放的na/分鐘/mg引入的蛋白(蛋白酶體)

(c＝0.966.104)
2.6)測定積累的氧化蛋白量2.6.1)通過OXYBLOT測定(Western blot)目的是檢測羰基基團(氧化標記)，其已經通過對氧作用敏感的種類(ROS＝活性氧種類)或另外對其它氧化機制如糖化反應/糖氧化反應(glycoxidation)或脂過氧化反應(lipoperoxidation)，按照位點特異性機制敏感的種類被引入到蛋白鏈中。
原理如下。鏈中的羰基基團與2，4-二硝基苯肼(DNPH)反應生成腙衍生物。如對于常規Westem blot，通過在聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離用DNP標記的樣品，然后轉移至硝化纖維膜。然后在第一抗體存在下將膜保溫，該抗體對于與具有羰基基團的蛋白結合的DNP分子是特異的。下一步是用與過氧化物酶偶聯的第二(抗-兔)抗體保溫。顯示是使用在2.6.2)中描述的試劑實現的。
2.6.2)方案所有使用的試劑來源于OXYBLOT試劑盒(Appligene-Oncor，Illkirch，France)。
A-樣品的制備和電泳我們使用來源于5μl輻射過或未輻射過的角質細胞裂解物的15-20μg蛋白。加入10μl 2，4-二硝基苯肼(DNPH)和5μl12％ SDS并接著讓反應在室溫進行15min。隨后加入7.5μl中和液(試劑盒中提供)。樣品然后準備上樣(deposit)。
通過Laemmli的方法(1970)，在變性和還原條件下和在不連續緩沖液中，在濃度為12.5％、1mm厚的聚丙烯酰胺凝膠上低分子量蛋白進行電泳。凝膠含有12.5％的T(T＝丙烯酰胺+二丙烯酰胺)和2.7％的C(C＝(二丙烯酰胺/丙烯酰胺)+二丙烯酰胺)，這使得它可以分離分子量為20-12kDa的蛋白質。使用的儀器來源于Hoefer。下面給出凝膠顯色所要求的所有溶液I)在不連續緩沖液中，在變性和還原條件下用于制備電泳凝膠的緩沖液和溶液單體溶液40％丙烯酰胺/二丙烯酰胺，2.6％ C(Biorad；ref.161-0148)分離凝膠緩沖液1.5M Tris-HCl，pH＝8.8
溶解18.15g Tris堿(Sigma；T1503)于100ml蒸餾水中并用12N的HCL調節pH值至8.8。
濃縮凝膠(stacking gel)緩沖液0.5M Tris-HCl，pH＝6.8溶解6g Tris堿于100ml蒸餾水中并用12N的HCL調節pH值至6.8。
10X遷移緩沖液0.25...Tris，pH＝8.3；1.92M甘氨酸；1％ SDS使用到下列試劑12g Tris堿，57.6g甘氨酸(Research Organics Inc.；5037G)，40ml 10％ SDS(Sigma；L5750)，并用蒸餾水將體積補足至400ml。
這些溶液保存在4℃。
過硫酸銨，(NH4)282O8(Sigma；A1433)濃度為10％，即100mg/ml。將溶液分為等分部分并保存在-20℃。
4X還原性樣品緩沖液2.5ml0.25 M的Tris-HCl，pH＝6.8；0.4g 8％的SDS；2ml 40％的甘油；1ml 20％的β-巰基乙醇；一匙尖0.02％的溴酚藍。該溶液室溫保存。
預染的低分子量標樣(Biorad；ref.161-0305)。這些包括磷酸化酶B(104kDa)，牛血清蛋白(82kDa)，卵清蛋白(48.3kDa)，碳酸酐酶(33.4kDa)，大豆胰蛋白酶抑制劑(28.3kDa)和溶菌酶(19.4kDa)。II)電泳膠含有12.5％T的分離凝膠的制備表6

含有4％T的濃縮凝膠的制備表7

分離凝膠的制備可以在前一天或同一天但無論如何在遷移之前兩小時灌該凝膠。
將兩塊凝膠灌入所用的模子。該裝置是通過順序疊加下列各項組裝紅色封條，加過黑色潤滑脂的黑封條，一塊塑料，一個大平板，一塊塑料，一塊氧化鋁平板，墊板(白色的用于1mm凝膠；黑色用于1.5mm凝膠)，一塊玻璃平板，一塊塑料，一塊氧化鋁平板，墊板，一塊玻璃平板，三塊塑料，然后蓋子。產生的裝置用夾子固定在一起并放置于平面區域上。
使用P5000移液管將凝膠灌注至離準備濃縮凝膠的梳子的底部大約0.5mm處。將梳子移去并隨后輕輕地加水以便凝膠是平坦的(±0.5ml水/凝膠)。
用鋁覆蓋裝置并且在聚合過程中不應移動。
濃縮凝膠的制備將分離膠(在鋁和玻璃平板之間)從模子移開并放置在電泳儀器上。如果只有一塊凝膠，這必須用一塊玻璃平板替換。
將梳子插入至鋁平板和玻璃平板中間。隨后用巴斯德(Pasteur)聚乙烯轉移移液管(Biorad，ref.223-9528)灌凝膠。在聚合之前，檢查凝膠的高度并且如果樣品體積較高對其進行調整。凝膠聚合一小時。
樣品的制備在回收包含在器皿中的細胞之前，用PBS漂洗它們兩次。在最后漂洗后，盡可能的去除PBS。通過刮擦將細胞回收至裂解緩沖液(cf.圖解1)中(最低5.106細胞/ml裂解緩沖液)。將裂解物冷凍于-80℃。
在上樣之前，將解凍的裂解物超聲處理并隨后檢測上述樣品中的蛋白。
上樣的體積取決于蛋白量(最大蛋白量60μg；最大體積＝25μl，最小體積＝5μl)。按照預備試驗，各個樣品的上樣體積相當于10μg蛋白。
在分離膠聚合的同時測定蛋白。上樣將250ml遷移緩沖液灌注于凝膠上，在凝膠，玻璃平板和電泳儀器之間，以及槽內。
隨后樣品在10,000g離心5min，然后上樣。與0.3μg HSP32(TEBU，ref.SPP-730，分為0.1μg/ml的等分并在-20℃冷凍)一起，另外加樣10μl預染過的標樣(Biorad，預染過的SDS-PAGE標樣，ref.161-0305)。遷移電泳是在室溫下，在制冷下進行，在濃縮膠遷移過程中使用非限制的300V電壓和使用恒定電流強度(15mA)。一旦樣品已到達分離凝膠，電流強度降低到10mA。
當遷移前沿到達凝膠的底部時停止電泳(大約1小時30分鐘的遷移)。
B-將蛋白轉移至膜上并且封閉特定結合位點當遷移結束，在室溫下，伴隨攪拌，讓凝膠在轉移緩沖液中平衡20分鐘，本方法是基于該緩沖液上的，所述緩沖液由Towbin H.，Staehelin T.和Gordon J.在“Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gelsto nitrocellulose sheetsprocedure and some applications”，Proc.Natl.Sci.，USA 1979，76，4350-4354中描述。
讓具有良好機械強度和高蛋白固定容量的聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(Biorad，reff. 162-0184)在100％的甲醇中浸濕直至它透明，然后在轉移緩沖液中平衡直至它完全浸漬(20min)。
將先前在轉移緩沖液中浸濕的一張厚過濾紙(Biorad，ref.17033960)，PVDF膜和凝膠導入半干的轉移儀器(Biorad)中，并且將另一濕過濾紙片放置于正極。注意必須保證用玻璃棒除去不同層之間的氣泡，以避免任何轉移的風險。隨后用作為陰極的蓋子密封儀器。
在非限制電流強度(5.5mA/cm2，250mA)和恒定電壓(15V)下讓蛋白遷移30分鐘。
然后將膜放置于用于封閉特定結合位點的溶液中，伴隨攪拌，4℃過夜，該溶液包括在TBS-T緩沖液(25ml)中的10％(25g)的脫脂乳(Régilait)。
C-抗原-抗體反應在PVDF膜上的蛋白質的免疫檢測借助于其底物使用ECL(增強的化學發光)試劑盒顯示過氧化物酶。
在封閉非特異位點后，在TBS-T中將膜漂洗15分鐘一次，5分鐘兩次。
隨后讓該膜在室溫下，攪拌下與稀釋至1/150的抗-DNP兔初級抗體接觸一小時。
隨后在TBS-T將其漂洗15分鐘一次，5分鐘兩次以去除過量的沒有被固定的游離抗體。
然后讓其與在TBS-T(5ml)中稀釋至1/5000的抗兔二級抗體(Amersham；ref.NA934；stored at 4℃)在室溫下，攪拌下接觸一小時。
在保溫一小時后，用TBS-T緩沖液快速漂洗兩次，隨后用TBS-T緩沖液15分鐘漂洗一次和最后5分鐘四次。
在排水之后，將其以蛋白質側面，即向上放置于食品級的薄膜(SARAN)上。
使用高敏感性的檢測試劑盒，通過化學發光(Amersham；ECL Westernblotting，ref.RPN2106)使用魯米諾作為過氧化物酶的底物使膜顯影。在過氧化物酶和放大器的作用下，魯米諾被氧化并進入到激活的過渡態。其通過發射光子返回至基態，該光子隨后與放置于膜上的放射自顯影薄膜反應。
將檢測試劑盒的兩種溶液各1ml混合(2ml，覆蓋膜的最小體積)。
立即將混合物均勻的傾瀉在膜上并且讓其在室溫下與膜接觸正好1分鐘。
在莎綸食品級的薄膜下保護排干水的膜，將其放置于遮光的盒子中，隨后用預閃蒸過的放射自顯影薄膜覆蓋(Amersham，Hyperfilm ECL，ref.RPN2103)。
在曝光一小時后，回收放射自顯影薄膜，浸漬于薄膜顯影液(radio顯影液，LX24，Kodak)中5分鐘，然后用水漂洗，最后在用水再次漂洗之前通過浸漬于定影液最少5分鐘(radio定影液，AL4，Kodak)定影。
將薄膜干燥并使用軟件Gels Analysts3.01量化記錄的條帶。
3)測試結果3.1)按照本發明的提取物E2對于NHK蛋白酶體活性的影響按照在圖解1中描述的對于參比和對于用按照本發明的提取物處理過的樣品的方案制備這里使用的樣品。取15μl的等分部分并按照2.5)進行活性測定。
在表8，9和10中給出的結果顯示，在加入按照本發明的藻提取物(Ph)7小時后，蛋白酶體的3種肽酶活性增強，這個增強對于它們中的兩個是顯著的(類胰凝乳蛋白酶和類胰蛋白酶活性)。另外，觀測到在用Ph處理7小時的NHK中，胞內氧化蛋白的量比參比細胞少(圖4，泳道1和2)。這說明觀察到的按照本發明的萃取物，對蛋白酶體肽酶活性的刺激作用是通過胞內氧化蛋白比例的降低來表現。實際上，該測試是在細胞裂解物的8μg等分部分上進行的。在輻射7小時后制備3種類型的樣品，I1，I2和I3并且隨后在DNPH的存在下保溫15min。然后用Amersham試劑盒中提供的中和液終止反應。
3.2)UVA+UVB對原代培養物中的NHK的蛋白酶體的影響使用UVA和UVB按照符合圖例1原理的方案輻射按照2.1)的人角質細胞的原代培養物。對于此研究選擇的紫外線劑量對于UVA為10焦耳/cm2對于UVB為0.05焦耳/cm2。在用這兩種劑量的UVA和UVB結合輻射之后，在不同時間測量蛋白酶體的三種肽酶活性。對于這個測試，細胞在輻射后1小時，3小時，7小時和24小時后裂解，并且按照2.3)確定蛋白(蛋白酶體)濃度。按照2.5)進行活性測量，使用的熒光底物濃度對于LLVY-amc是12.5μM，對于LLE-na是150μM，最后對于LSTR-amc是40μM。與MG132(20μM)平行測定這些活性以便計算出獨立于蛋白酶體的活性的比例。在

圖1，2和3中給出的結果是表示為相對于未輻射參比的％，并且顯示在UVA+UVB暴露后分析的三種肽酶活性降低四倍。該實驗證明在用紫外線輻射之后蛋白酶體的活性受到影響。還可以看到分開輻射和活性測定的時間越長，影響越大(7 h和24h)。
3.3)當其在UVA+UVB輻射之前施用時，藻Ph的提取物對NHK蛋白酶體活性的影響在輻射中和輻射后必需加入抗氧化維生素(50μM的生育酚和1mM的磷酸抗壞血酸酯)以保持提取物E2的功效。用按照本發明的提取物(5μg/ml的劑量+維生素)處理按照2.1)的人角質細胞的原代培養物，然后用UVA+UVB輻射并最終使其裂解。在表11，12和13中包含的結果顯示在用UVA+UVB輻射后，在按照本發明的提取物的存在下，蛋白酶體肽酶活性的降低被完全阻止。因為對于未處理/未輻射的參比NHK和處理/輻射過的NHK24h后的蛋白酶體肽酶活性水平是相同的，基于按照本發明的提取物的化妝品可以保持蛋白酶體的肽酶活性，因此它具有抗UVA+UVB的保護效果。
3.4)在輻射后褐指藻(Ph)的提取物對NHK蛋白酶體活性的影響用UVA和UVB的劑量輻射人角質細胞的原代培養物，隨后用按照本發明的2.5μg/ml提取物E2處理7小時。發現胞內氧化蛋白的量隨UV輻射增加，但當細胞已經用按照本發明的提取物E2處理后，增加程度較小。實驗在3.1)中描述并且結果如圖4中所示(泳道3和4)。使用上述提取物可以更好地去除氧化蛋白。而且，表14，15和16給出的結果顯示，當在輻射后進行處理時，基于按照本發明的提取物E2的處理顯著地恢復3種蛋白酶體活性。這蛋白酶體活性的完全恢復表明，基于Ph的試劑在蛋白酶體活性方面具有對UVA+UVB影響的恢復作用。
如在3.1)中看到，對于用按照本發明的提取物E2處理過的NHK，胞內氧化蛋白的量比在參比樣品中少(cf.圖13，泳道1和泳道2)。這說明在使用按照本發明的提取物E2時，觀測到的對蛋白酶體活性的刺激效果是通過胞內氧化蛋白比例的降低來表現。圖4的泳道3和泳道4顯示，UV輻射確實產生更多量的氧化蛋白(與斑點的亮度成比例)，但這個量在使用所述按照本發明的提取物后顯著減小。
實施例1用于臉的抗衰老日霜

實施例2用于臉的抗皺紋乳-凝膠

實施例3用于身體的硬化乳狀液

實施例4用于臉的抗皺紋乳-凝膠

圖例1
表8(在使用按照本發明的提取物E2處理后測定來源于NHK的蛋白酶體的LLVY活性)

**對于15μl的等分部分，如果p值≤0.05/0.2919X xFU/min則為顯著(S)
表9(在使用按照本發明的提取物E2處理后測定來源于NHK的蛋白酶體的LLE活性)

**對于15μl的等分部分，如果p值≤0.05/1.3794X xFU/min則為顯著(S)
表10(在使用按照本發明的提取物E2處理后測定來源于NHK的蛋白酶體的LSTR活性)

**對于35μl的等分部分，如果p值≤0.05/0.3307X xFU/min則為顯著(S)
表11(在UVA和UVB輻射之前24h使用按照本發明的提取物E2預處理后測定來源于NHK的蛋白酶體的LLVY活性)

**對于20μl的等分部分，如果p值≤0.05/0.2189X xFU/min則為顯著(S)
表12(在UVA和UVB輻射之前24h使用按照本發明的提取物E2預處理后測定來源于NHK的蛋白酶體的LLE活性)

**對于20μl的等分部分，如果p值≤0.05/1.0346X xFU/min則為顯著(S)
表13(在UVA和UVB輻射之前24h使用按照本發明的提取物E2預處理后測定來源于NHK的蛋白酶體的LSTR活性)

**對于50μl的等分部分，如果p值≤0.05/0.2315X xFU/min則為顯著(S)
表14(用UVA和UVB輻射，之后使用按照本發明的提取物E2處理后7h，測定來源于NHK的蛋白酶體的LLVY活性)

**對于20l的等分部分，如果p值≤0.05/0.2189X xFU/min則為顯著(S)
表15(用UVA和UVB輻射，之后使用按照本發明的提取物E2處理后7h，測定來源于NHK的蛋白酶體的LSTR活性)

**對于40μl的等分部分，如果p值≤0.05/0.2894X xFU/min則為顯著(S)
表16(用UVA和UVB輻射，之后使用按照本發明的提取物E2處理后7h，測定來源于NHK的蛋白酶體的LLE活性)

**對于20μl的等分部分，如果p值≤0.05/1.0346X xFU/min則為顯著(S)
權利要求
1.褐指藻，特別是三角褐指藻的提取物作為化妝品的用途，其中所述化妝品能促進皮膚細胞，特別是角質細胞、成纖維細胞或黑色素細胞(優選人)的蛋白酶體活性。
2.褐指藻，特別是三角褐指藻的提取物在制備用于保護皮膚不受UV暴露的不利影響或用于防止和/或延緩皮膚老化效應出現的化妝品組合物中的用途。
3.按照權利要求1或2的用途，其特征在于所述藻提取物以基于最終組合物的總重量大約0.01％-10％的濃度用于化妝品組合物中。
4.按照權利要求1至3中一項的用途，其特征在于上述提取物已經通過使用一種極性萃取溶劑和/或一種非極性萃取溶劑萃取獲得。
5.按照權利要求4的用途，其特征在于一種或多種萃取溶劑是C1-C6醇或水-醇混合物，C2-C6多羥基醇如乙二醇，氯化的溶劑如氯仿或二氯甲烷，有機酸的C3-C6酯如乙酸乙酯，C6-C10烷烴如庚烷，C5-C8醚如二異丙基醚。
6.按照權利要求5的用途，其特征在于上述提取物是通過使用醇或水/醇混合物萃取藻獲得的，其中該醇或水/醇混合物已經任選地呈堿性，所述醇是選自異丙醇，乙醇和甲醇。
7.按照權利要求6的用途，其特征在于上述提取物是通過使用異丙醇萃取藻獲得的。
8.按照權利要求6的用途，其特征在于上述提取物是通過使用乙醇萃取藻獲得的。
9.按照權利要求4至8中一項的用途，其特征在于在萃取藻之前冷凍藻，冷凍優選在大約-40℃至-20℃的溫度下實施并且優選大約1-7天時間，此后讓其與萃取溶劑接觸。
10.按照權利要求9的用途，其特征在于將冷凍過的藻直接浸漬于加熱過的萃取溶劑中。
11.按照權利要求4至10中一項的用途，其特征在于在任何萃取操作之前，于室溫下將藻在萃取溶劑中浸軟。
12.按照權利要求11的用途，其特征在于將藻浸軟大約5-80分鐘的一段時間，特別優選大約20-40分鐘的一段時間。
13.按照權利要求4至12中一項的用途，其特征在于萃取是在回流下進行。
14.按照權利要求4至13中一項的用途，其特征在于萃取是在惰性氣氛下，優選在氮飽和氣氛下進行。
15.按照權利要求6至14中一項的用途，其特征在于上述藻提取物在下列的系列步驟后獲得a)按照權利要求9冷凍藻并隨后按照權利要求10浸漬于萃取溶劑中，所述萃取溶劑是在權利要求6至8中限定的醇或水-醇溶劑，b)按照權利要求11或12浸漬藻，c)例如使用水性氫氧化鈉溶液或水性氫氧化鉀溶液，使萃取溶劑呈堿性至pH值為10-14，優選地pH值為13，d)從醇或水-醇相中除去不溶物質，e)將蒸餾水加入到醇或水-醇相，f)通過液-液方法使用非極性溶劑洗滌產生的水-醇溶液，該非極性溶劑與醇或水-醇相是不混溶的，例如庚烷，己烷或環己烷，g)去除含有非極性溶劑的相，h)例如使用水性硫酸溶液或水性鹽酸溶液，將除去含非極性溶劑相之后回收的水-醇相酸化至pH值為1-3，優選至pH值為2，i)酸化后得到的溶液使用非極性溶劑進行液-液萃取，該溶劑與醇或水-醇相是不混溶的，例如庚烷，己烷和環己烷，j)然后將水-醇相除去，并且k)將除去水-醇相之后回收的含有非極性溶劑的相進行蒸發，產生不含非極性溶劑的油，該油是理想的提取物。
16.按照權利要求4至15中一項的用途，其特征在于每100g藻使用萃取溶劑的量是大約0.1-20升，優選大約2-10升，其中藻是以干重表示。
17.按照權利要求1至3其中一項的用途，其特征在于所述藻提取物已經通過使用超臨界CO2萃取獲得。
18.化妝品組合物，其促進皮膚細胞，特別是角質細胞、成纖維細胞或黑色素細胞(優選人)的蛋白酶體活性，用于保護皮膚不受UV暴露的不利影響或用于防止和/或延緩皮膚老化效應，其特征在于它包含作為化妝品活性劑的褐指藻，特別是三角褐指藻的提取物，其任選地在化妝品可接受的賦形劑之中。
19.按照權利要求18的組合物，其特征在于提取物是例如在權利要求4至17中任何一項所限定的，并且以例如在權利要求3中所限定的濃度存在于在所述組合物中。
20.化妝品皮膚護理的方法，其特征在于它包括化妝品有效量的例如在權利要求1至17中任何一項所限定的藻提取物，以例如在權利要求18或19中所限定的組合物的形式對需要它的人皮膚的適宜區域的局部施用，皮膚護理優選是在暴露UV線之前的預防護理或在暴露UV線之后的恢復護理。
全文摘要
本發明涉及褐指藻，特別是三角褐指藻的提取物作為化妝品的用途，它能促進皮膚細胞，特別是角質細胞、成纖維細胞或黑色素細胞(優選人)的蛋白酶體活性。本發明使得可以制造一種用于保護皮膚不受UV暴露的不利影響或用于防止和/或延緩皮膚老化效應的化妝品組合物。
文檔編號A61Q17/04GK1499957SQ02807855
公開日2004年5月26日 申請日期2002年4月2日 優先權日2001年4月3日
發明者C·尼扎德, B·弗里蓋特, M·莫羅, A－L·比爾托, A·索努瓦, C 尼扎德, 榷, 鋦翹 申請人:Lvmh里爾茲經濟利益集團