一種抗腫瘤藥物制劑組合的制作方法

一種抗腫瘤藥物制劑組合的制作方法
【專利摘要】本發明提供一種抗腫瘤藥物制劑組合，其包括IFN?β與IDO抑制劑，或者IFN?β與AhR抑制劑。本發明提供的抗腫瘤藥物制劑組合不但可以將分化的腫瘤細胞殺滅，而且可以將進入休眠的腫瘤細胞殺滅，具有徹底清除腫瘤細胞的效果。
【專利說明】
一種抗腫瘤藥物制劑組合
技術領域
[0001 ]本發明涉及一種藥物制劑組合，尤其涉及一種抗腫瘤藥物制劑組合。
【背景技術】
[0002]惡性腫瘤作為一種嚴重威脅人類生命健康的疾病，近年來尋找有效、毒副作用小的治療方法已成為醫學研究的重中之重。
[0003]腫瘤的生物治療是繼手術、放療和化療之后的第四大腫瘤治療技術，其運用生物技術和生物制劑對從病人體內采集的免疫細胞、或免疫因子進行體外培養和擴增后回輸到病人體內的方法，來激發，增強機體自身免疫功能，達到治療腫瘤的目的。其安全性高、殺瘤特異性強、無毒副作用的優點，被稱為瘤學科的“綠色生物療法”。
[0004]腫瘤休眠(tumor dormancy)是臨床上普遍存在的一種現象，也是惡性腫瘤細胞的生物學特征之一，休眠細胞的長期存在是惡性腫瘤難以徹底根治的主要原因，也是導致腫瘤復發和遠處轉移的根源之一。
[0005]由于對腫瘤休眠的機制認識不清，使用目前治療腫瘤的方法，雖然能夠暫時實現臨床上對腫瘤的治愈，但是若干月或年后，由于休眠的腫瘤細胞沒有被有效殺滅，腫瘤又會復發或者轉移。
[0006]因此，如何提供可以將休眠的腫瘤細胞殺滅，達到徹底清除腫瘤的作用成為有待解決的問題。

【發明內容】

[0007]本發明提供了一種抗腫瘤藥物制劑組合，包括IFN-β與IDO抑制劑，或者IFN-β與AhR抑制劑。聯合使用上述制劑不但可以將分化的腫瘤細胞殺滅，而且可以將進入休眠的腫瘤細胞殺滅，具有徹底清除腫瘤細胞的效果。
[0008]在本申請的方案中，所述IFN-β與IDO抑制劑，或IFN-β與AhR抑制劑，作為整體稱作本發明的抗腫瘤藥物制劑組合。
[0009]在本申請的方案中，IFN-β可以是商業購買的IFN-β制劑，或者是由腺病毒載體攜帶的IFN-β制劑；IDO抑制劑包括各種競爭性及非競爭性吲哚胺2，3-雙加氧化酶抑制劑(indoleamine 2,3-d1xygenase)抑制劑;AhR抑制劑包括各種芳經受體(arylhydrocarbonreceptor)完全或者部分措抗劑。
[0010]在本發明的一個【具體實施方式】中，所述IDO抑制劑包括1-甲基色氨酸(1-methyl-tryptophan)，簡稱 1-MT。
[0011 ]進一步的，所述AhR抑制劑包括二甲基甲酰胺，簡稱DMF。
[0012]更進一步的，所述抗腫瘤藥物制劑組合中的IFN-β、IDO抑制劑以及AhR抑制劑為單位制劑。
[0013]本發明的所述抗腫瘤藥物制劑組合中的IFN-β、IDO抑制劑以及AhR抑制劑為單位制劑。所述單位制劑為滿足一次給藥所需有效成分的制劑，如一單位(針)針劑等。患者一次施用所需的藥物的量可以方便地通過計算患者的體重和該患者一次用藥所需單位體重劑量的乘積得到。例如，在制備藥物的過程中，一般認為成人體重為50-70kg，可以通過實驗動物與人的單位體重劑量之間的等效劑量換算關系來確定用藥量。例如，可以根據FDA、SFDA等藥品管理機構提出的指導意見，也可參考(黃繼漢等，“藥理試驗中動物間和動物與人體間的等效劑量換算”，《中國臨床藥理學與治療學》，2004Sep;9(9):1069-1072)來確定。在本發明的實施方式中，可以使用按照人和小鼠的體表面積折算系數0.0026來換算人和小鼠的劑量。
[0014]在本發明的方案中，針對體重為20g的小鼠，IFN-β以5X 14-1.3 X 15U的量施用給小鼠，IDO抑制劑以15-20mg的量施用給小鼠(例如對于20g的小鼠，將IDO抑制劑用水配制為5mg/mL的溶液，小鼠每天灌服該溶液3_4mL)，IDO抑制劑以5mg/kg小鼠體重的量施用。
[0015]更進一步的，根據針對小鼠的實驗，針對人(例如50_70kg體重)的所述IFN-β單位制劑中包括I X 17?5 X 17U的IFN-β;所述IDO抑制劑單位制劑中包括4?8g的IDO抑制劑；所述AhR抑制劑中包括27-50mg的AhR抑制劑。
[0016]進一步的，所述IDO抑制劑為1-MT。
[0017]更進一步的，所述AhR抑制劑為DMF。
[0018]本發明提供的抗腫瘤藥物制劑組合的給藥方式為:對患腫瘤個體施用所述抗腫瘤藥物制劑組合，例如，靜脈、腹腔內或者瘤內注射IFN-β，并聯合口服或瘤內注射給藥IDO抑制劑;或者靜脈、腹腔內或者瘤內注射IFN-β，并聯合灌胃或瘤內注射給藥AhR抑制劑。
[0019]本發明還提供了一種治療腫瘤的方法，包括患有腫瘤的個體施用所述抗腫瘤藥物制劑組合的過程。具體過程為靜脈、腹腔內或者瘤內注射IFN-β，并聯合口服或瘤內注射給藥IDO抑制劑;或者靜脈、腹腔內或者瘤內注射IFN-β，并聯合灌胃或瘤內注射給藥AhR抑制劑。
[0020]根據本發明的方案，可以根據需要控制抗腫瘤藥物制劑組合中的IFN-KIDO抑制劑以及AhR抑制劑的量，方便對不同階段的腫瘤患者的給藥。
[0021]IFN-β(即β-干擾素)是一種由哺乳動物細胞產生的細胞因子，尤其在機體受到病毒攻擊時，體內會大量生成該因子，以對抗病毒攻擊。在本
【申請人】研究中發現，單獨的IFN-β只能殺死部分的腫瘤細胞，而沒有被IFN-β殺死的腫瘤細胞獲得干細胞特性，并進入休眠狀態，由于這些休眠腫瘤細胞的存在，腫瘤在若干年后又會復發或者轉移，因此，僅單獨施用IFN-β不足以完全清除腫瘤細胞。本
【申請人】經過大量實驗研究出乎意料的發現，將IFN-β與IDO抑制劑或AhR抑制劑，組合給藥，能夠實現對休眠的腫瘤細胞殺傷。
[0022]綜上，本發明方案具有以下效果:
[0023]1、本申請的抗腫瘤藥物制劑組合聯合IFN-β與IDO抑制劑或AhR抑制劑，不但可以將分化的腫瘤細胞殺滅，而且可以將進入休眠的腫瘤細胞殺滅，具有徹底清除腫瘤細胞的效果。
[0024]2、本發明的抗腫瘤藥物制劑組合通過具有安全性高、無毒副作用的優點。
[0025]3、通過該組合可以降低IFN-β臨床用量，從而減少該藥物引起的副反應。
【附圖說明】
[0026]圖1Α-1，不同劑量IFN-1H秀導Β16腫瘤細胞進入休眠的光鏡圖片；圖1Α-2:Β16腫瘤細胞在不用刺激因素下細胞相對克隆大小的半定量分析。圖1B-1，細胞周期測定結果顯示IFN-β導致B16腫瘤細胞的細胞周期停滯于G0/G1期。圖1B-2顯示了定量分析G1/S比值。圖1C，經IFN-1H秀導處于休眠的腫瘤細胞其對葡萄糖消耗降低。圖lD，IFN-13不導致腫瘤細胞衰老。
[0027]圖2A-1顯示了B16腫瘤細胞在不用刺激因素下細胞克隆形態的變化；圖2A-2顯示了B16腫瘤細胞在不用刺激因素下細胞相對克隆大小的半定量分析。圖2B顯示了B16腫瘤細胞在不用刺激因素下克隆數變化。圖2C-1顯示了 B16腫瘤細胞在不用刺激因素下細胞克隆形態的變化；圖2C-2顯示了B16腫瘤細胞在不用刺激因素下細胞相對克隆大小的半定量分析。圖2D顯示了 B16腫瘤細胞在不用刺激因素下克隆數變化。
[0028]圖3A顯示了聯合施用IFN-β和1-MT能抑制大體積的黑色素瘤(7mm X 7mm)生長；圖3B顯示了聯合施用IFN-β和DMF也能抑制大體積的黑色素瘤(7mmX7mm)生長；圖3C顯示了聯合施用IFN-β和1-MT或DMF能抑制NOD-SCID小鼠大體積黑色素瘤(7mm X 7mm)生長；圖3D顯示了聯合施用IFN-β和1-MT或DMF能抑制NOD-SCID小鼠皮下注射MCF7導致的大體積腫瘤(7mmX 7mm)的生長。
【具體實施方式】
[0029]下述實施例中使用的各種腫瘤細胞、藥物及實驗動物:
[0030]B16小鼠黑色素瘤細胞系、MCF-7人乳腺癌細胞系，均可從美國ATCC中心或中國典型物保藏中心CCTCC購買。
[0031]C57BC/L小鼠(4-6周齡)或者NOD-SCID小鼠，購自中國醫學科學院協和醫學院實驗動物中心。
[0032]IDO抑制劑(1-MT)購自美國SIGMA公司；AhR抑制劑(DMF )，購自美國SIGMA公司。IFN-β，3D纖維蛋白軟凝膠，DMEM培養基，PBS均可商購獲得。
[0033]實施例1:1FN-β導致B16黑色素瘤細胞進入休眠。
[0034]1、實驗步驟:
[0035]對照組(PBS):將3000個B16腫瘤細胞種植于位于24孔板上的3D纖維蛋白軟凝膠中(單個含凝膠孔中凝膠體積為250yL，凝膠上面加入的普通培養基(DMEM培養基)是lmL)，用普通培養基加PBS(其加入的體積很小只有I微升)培養3-5天；
[0036]實驗組(IFN-β):將3000個B16腫瘤細胞種植于3D纖維蛋白軟凝膠中，用普通培養基培養2天后，將該普通培養基換成普通培養基+IFN-β的培養基，IFN-β的濃度分別為Ing/mL，5ng/mL或者10ng/mL，刺激B16腫瘤細胞2-4天后，觀察細胞生長情況、進行細胞周期測定、收集不同時間點細胞上清液測定葡萄糖濃度、以及利用SA-13-gal原理通過檢測β-半乳糖苷酶來判斷IFN-β是否引起Β16腫瘤細胞衰老。
[0037]其中IFN-β為多500U/ng。細胞周期測定以及β-半乳糖苷酶檢測是將Β16腫瘤細胞從3D纖維蛋白軟凝膠中通過消化纖維蛋白而分離出來，形成單細胞懸液，然后根據試劑盒說明書進行的。
[0038]已知該3D纖維蛋白軟凝膠不利于正常腫瘤細胞的生長，但適合用于篩選腫瘤再生細胞(TRC)，即具有干細胞特性的腫瘤細胞，也可稱為腫瘤干細胞。正常的腫瘤細胞中本身也含有恒定比例的腫瘤干細胞。只有腫瘤干細胞能在3D纖維蛋白軟凝膠中形成細胞克隆。
[0039]2、實驗結果:
[0040]相比對照組，經Ing/mL的IFN-β刺激2-4天后，B16腫瘤細胞克隆大小不變。隨培養時間延長，對照組腫瘤細胞克隆逐漸變大；而經5ng/mL或者10ng/mL IFN-β刺激后，腫瘤細胞克隆大小隨時間延長維持不變(見圖1A-1到圖1A-2)。
[0041 ] 細胞周期測定結果顯示，IFN-β導致B16腫瘤細胞周期阻滯于G0/G1期，其G1/S期比值相比于對照組明顯增高(見圖1B-1到圖1B-2)。
[0042]葡萄糖測定結果顯示，IFN-1H秀導進入休眠的B16腫瘤細胞對葡萄糖的消耗相比未休眠細胞明顯降低(見圖1C)。
[0043]并且，IFN-β并不導致B16腫瘤細胞衰老(見圖1D)。
[0044]實施例2:抑制IDO信號通路逆轉IFN-β導致的腫瘤休眠(本發明抗腫瘤藥物制劑組合的體外細胞實驗)。
[0045]1、實驗步驟:
[0046]對照組I (I3BS):將3000個正常B16腫瘤細胞種植于位于24孔板上的3D纖維蛋白軟凝膠中(單個含凝膠孔中凝膠體積為250yL，凝膠上面加入的普通培養基是ImL)，用普通培養基+PBS (其加入的體積很小只有I微升)培養2-4天；
[0047]對照組2(IFN_f3):將3000個B16腫瘤細胞種植于3D纖維蛋白軟凝膠中，普通培養基培養2天后，在用普通培養基中加入IFN-0(5ng/mL)處理2-4天；
[0048]實驗組:將3000個B16腫瘤細胞種植于3D纖維蛋白軟凝膠中，普通培養基培養2天后，在用普通培養基中加入IFN-f3(5ng/mL)和1-MT(0.2mM或者0.5mM)處理細胞2-4天，或在普通培養基中加入IFN-β和DMF(20yM或者50mM)處理細胞2-4天；
[0049]檢測各組細胞克隆大小及克隆形成數目，其中IFN-β為彡500U/ng。
[0050]2、實驗結果:
[0051 ] B16腫瘤細胞經IFN-β和1-MT聯合刺激后，其克隆大小相比IFN-β單獨處理組明顯減小；并且隨刺激時間延長，其克隆大小越來越小(見圖2A-1到圖2A-2)。計數克隆數目發現，聯合應用IFN-β和1-MT刺激后，B16腫瘤細胞克隆數明顯減少，相比對照組有顯著差異(見圖2B)。
[0052]與此結果類似，B16腫瘤細胞經IFN-β和DMF聯合刺激，其克隆大小相比IFN-β單獨處理組明顯減小;并且隨刺激時間延長，其克隆大小變得越來越小(見圖2C-1到圖2C-2)。克隆數目計數結果顯示，聯合應用IFN-β和DMF刺激后，B16腫瘤細胞克隆數明顯減少，相比對照組有顯著差異(見圖2D)。
[0053]實施例3:聯合應用IFN-β和IDO抑制劑，或聯合應用IFN-β和AhR抑制劑能殺滅腫瘤細胞，特別是能殺滅休眠的腫瘤細胞。
[0054]1、聯合應用IFN-β和IDO抑制劑(參見圖3A)
[0055]I)實驗步驟
[0056]構建荷瘤小鼠:4-6周C57BC/L小鼠40只，隨機分為4組，小鼠體重為20g;每只老鼠皮下接種I X 14Bie黑色素瘤腫瘤細胞，15天后，腫瘤長到7毫米X7毫米，第16天開始分別給予荷瘤小鼠以下不同治療方式:
[0057]對照組I(PBS):對荷瘤小鼠每天僅瘤內注射PBS;
[0058]對照組2(IFN-0):對每只荷瘤老鼠瘤內注射250ng IFN_0(5OOU/ng)，每三天注射一次，共注射3次；
[0059]對照組3( 1-MT):將1-MT按照5mg/mL的劑量溶于荷瘤小鼠的飲用水，每只老鼠每天約飲用3-4mL飲用水，連續給藥1天；
[0060]實驗組I (IFN-β/Ι-ΜΤ):對荷瘤小鼠分別給與IFN-β和1-MT (即聯合應用IFN-β和1-MT)，給藥方法同前。
[0061]接種黑色素瘤細胞第15天后，開始監測腫瘤大小。
[0062]2)實驗結果
[0063]IFN-β或者1-MT單獨用藥引起小鼠黑色素瘤生長緩慢，而聯合應用IFN-β和1-MT則導致明顯的腫瘤生長抑制，表現為給藥9天后小鼠腫瘤體積明顯降低，相比對照組，差異具有顯著性意義(見圖3A)。說明聯合應用IFN-β和1-MT能殺滅腫瘤細胞，特別是能殺滅休眠的腫瘤細胞。
[0064]2、聯合應用IFN-β和AhR抑制劑(參見圖3B)
[0065]I)實驗步驟
[0066]構建荷瘤小鼠:4-6周C57BC/L小鼠40只，隨機分為4組，小鼠體重為20g;每只老鼠皮下接種I X 14Bie黑色素瘤腫瘤細胞，3天后能觀察到腫瘤生成，15天后，腫瘤長到7毫米X 7毫米，第16天開始分別給予荷瘤小鼠以下不同治療方式:
[0067]對照組I(PBS):對荷瘤小鼠每天僅瘤內注射PBS;
[0068]對照組2(IFN-0):對每只荷瘤老鼠瘤內注射250ng IFN_0(5OOU/ng)，每三天注射一次，共注射3次；
[0069]對照組3(DMF):DMF每天給藥5mg/kg小鼠體重，給藥方式為瘤內注射，連續給藥9天；
[0070]實驗組(IFN-fVDMF):小鼠分別給與IFN-β和DMF，給藥方法同前。
[0071]黑色素瘤細胞接種后第15天，開始測量腫瘤大小。
[0072]2)實驗結果
[0073]IFN-β或者DMF單獨用藥引起小鼠黑色素瘤生長緩慢，而聯合應用IFN-β和DMF則導致明顯的腫瘤生長抑制，表現為給藥9天后小鼠腫瘤體積明顯降低，相比對照組，差異具有顯著性意義(見圖3B)。說明聯合應用IFN-β和DMF能殺滅腫瘤細胞，特別是能殺滅休眠的腫瘤細胞。
[0074]3、IDO或者AhR抑制劑對NOD-SCID小鼠腫瘤的治療實驗(參見圖3C，圖3D)
[0075]I)實驗步驟
[0076]構建荷瘤NOD-SCID小鼠:6周NOD-SCID小鼠20只，每只小鼠皮下接種I X 104B16小鼠黑色素瘤腫瘤細胞(該腫瘤細胞來自將B16小鼠黑色素瘤腫瘤細胞在3D纖維蛋白軟凝膠培養所形成的腫瘤細胞克隆)，在觀察到腫瘤長到7毫米X7毫米后的第二天，將荷瘤NOD-SCID小鼠隨機分為三組，開始以下述不同方式進行治療:
[0077]對照組1:對第I組荷瘤NOD-SCID小鼠瘤內注射PBS;
[0078]實驗組I:對第2組荷瘤NOD-SCID小鼠瘤內注射IFN_f3(250ng/小鼠/次，每三天注射一次，共注射三次)，并喝水給藥1-MTd-MT按照5mg/mL的劑量溶于小鼠的飲用水，每只老鼠每天約飲用3-4mL飲用水，連續給藥10天)；
[0079]實驗組2:對第3組荷瘤NOD-SCID小鼠瘤內注射IFN_f3( 250ng/小鼠/次，每三天注射一次，共注射三次)和瘤內注射DMF( 5mg/kg，每三天注射一次，共注射三次)。
[0080]黑色素瘤細胞接種后第9天，開始測量腫瘤大小。
[0081 ] 2)實驗結果
[0082]聯合應用正^^和^了，或者聯合應用IFN-β和DMF明顯抑制腫瘤生長，相比對照組P〈0.001 (見圖3C，小鼠黑色素瘤注射到NOD-SCID小鼠皮下)。
[0083]我們將人的MCF-7人乳腺癌細胞注射到NOD-SCID小鼠皮下，也得到類似結果，表現為IFN-γ和1-MT，或者IFN-β和DMF聯合用藥顯著抑制MCF-7導致的腫瘤生長(見圖3D)。說明IDO或者AhR抑制劑抑制腫瘤生長不是通過調節全身免疫反應進行的。
【主權項】
1.一種抗腫瘤藥物制劑組合，其特征在于，包括IFN-β與IDO抑制劑，或者IFN-β與AhR抑制劑。2.根據權利要求1所述的抗腫瘤藥物制劑組合，其特征在于，所述腫瘤包括卵巢癌、乳腺癌、肺癌、胃癌、結腸癌、肝癌、胰腺癌或前列腺癌。3.根據權利要求1所述的抗腫瘤藥物制劑組合，其特征在于，所述IDO抑制劑包括1-MT。4.根據權利要求1所述的抗腫瘤藥物制劑組合，其特征在于，所述AhR抑制劑包括DMF。5.根據權利要求1所述的抗腫瘤藥物制劑組合，其特征在于，所述抗腫瘤藥物制劑組合中的IFN-β、IDO抑制劑以及AhR抑制劑為單位制劑。6.根據權利要求5所述的抗腫瘤藥物制劑組合，所述IFN-β單位制劑中包括IX 17?5XI O7I^IFN-P07.根據權利要求5所述的抗腫瘤藥物制劑組合，所述IDO抑制劑單位制劑中包括4?Sg的IDO抑制劑。8.根據權利要求5所述的抗腫瘤藥物制劑組合，所述AhR抑制劑中包括27-50mg的AhR抑制劑。
【文檔編號】A61K38/21GK106075454SQ201610547830
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年7月12日
【發明人】黃波, 劉玉英, 梁曉雨, 尹曉南, 呂家迪
【申請人】中國醫學科學院基礎醫學研究所