自血漿中分離出的用于增強記憶力的混合物及其制備方法和應用

自血漿中分離出的用于增強記憶力的混合物及其制備方法和應用
【專利摘要】本發明公開了一種自血漿中分離出的用于增強記憶力的混合物及其制備方法和應用。該混合物包括多種蛋白質和多種小分子，所述混合物的SDS?PAGE變性膠電泳包括至少30個條帶，其中在分子量大于48kD的條帶中包括明顯可見的7個條帶，所述7個條帶的分子量從小到大依次是56kD，68kD，77kD，115kD，175kD，250kD和289kD。該混合物的制備方法依次包括血漿收集、密度梯度離心、透析、一次濃縮、去高峰度蛋白、陰離子交換以及二次濃縮步驟。本發明制備的該混合物不僅可以起到增強記憶力的作用，還可以用于預防、改善和治療阿爾茲海默癥。
【專利說明】
自血漿中分離出的用于増強記憶力的混合物及其制備方法和 應用
技術領域
[0001 ]本發明涉及一種血漿分離物，具體地，涉及一種自血漿中分離出的用于增強記憶 力的混合物及其制備方法和應用，該混合物可用于預防、改善和治療阿爾茲海默癥，并具有 增強記憶力的作用。
【背景技術】
[0002] 阿爾茲海默綜合癥又叫阿爾茲海默癥，其特點是病人的記憶和認知能力逐漸喪 失。病人在確診后3到9年內死亡，占臨床死亡病例的50 %到56 %。該病病因目前的認識是大 腦內積累的異常折置的beta-淀粉樣蛋白和Tau蛋白導致了阿爾茲海默癥。
[0003] 阿爾茲海默癥目前市場上的藥物主要是西藥，其特征是必須長期堅持服用，然而 卻療效微小，只能緩解部分癥狀，不能控制病情的發展。長期服用的另外一個缺陷是藥物副 作用大，同時病人產生藥物依賴性。為此市場上急需療效更好，副作用性更低的藥物。
[0004] 目前的最新研究表明：給年老老鼠持續注射年輕老鼠的血漿能提升年老老鼠的認 知水平（Villeda S.A.Young blood reverses age-related impairments in cognitive function and synaptic plasticity in mice.Nature Medicine 2014;20:659-663)〇為 此，血漿中可能含有某些物質能有效的提升阿爾茲海默癥患者的認知水平。但是，這些物質 的具體組分、以及分離獲取方法還未見報道。

【發明內容】

[0005] 針對現有技術的缺陷，本發明的目的之一在于提供一種自血漿中分離出的用于增 強記憶力的混合物。
[0006] 本發明的目的之二在于提供上述混合物的制備方法。
[0007] 本發明的目的之三在于提供上述混合物的應用。
[0008] 為了實現上述目的，本發明采用了以下技術方案：
[0009] -種自血漿中分離出的用于增強記憶力的混合物，所述混合物包括多種蛋白質和 多種小分子，所述混合物的SDS-PAGE變性膠電泳包括至少30個條帶，其中在分子量大于 48kD的條帶中包括：分子量從小到大依次是56kD，68kD，77kD，115kD，175kD，250kD和289kD 的條帶。
[0010] 在上述混合物中，作為一種優選實施方式，所述混合物的FPLC鑒定具有4個峰，對 應的蛋白大小分別是：250kD，120kD，I OOkD和80kD。
[0011] 在上述混合物中，作為一種優選實施方式，通過蛋白質譜分析，所述混合物至少含 有30個蛋白，包括白蛋白，球蛋白，角蛋白，纖維蛋白原和轉運蛋白；通過小分子質譜分析， 所述混合物還至少含有20個小分子。
[0012] 在上述混合物中，作為一種優選實施方式，通過蛋白質譜分析，所述混合物所含蛋 白如下：
[0013] 血漿銅藍蛋白 I型富半胱氨酸清除受體M130 補體5 L-乳酸脫氫酶A鏈 附睪分泌蛋白Li51 酪氨酸蛋白激酶受體UFO 維生素 D結合蛋白 生長分化因子_1] 血管緊張肽原變體 6 -磷酸葡萄糖異構酶 Beta-2-糖蛋白〗 抗白細胞蛋白酶 蛋白AMBP 生長分化因子8 生長分化因子5 巢蛋白-1 N-乙酰胞壁酸-L-丙氨酸酰胺酶 可溶性富半胱氨酸清潔受體蛋白SSC5D 血清淀粉樣蛋白P 泛素-40S-核糖體蛋白S27a 脂多糖結合蛋白 層黏連蛋白亞基beta.-1 生長分化因子15 超氧化物歧化酶 膜丙氨酸氨肽酶變體 鋅指蛋白688 APOLl蛋白 二肽酶 載脂蛋白D 補體Is亞基 肝羧酸酯酶1 尾鉚釘蛋白插入受體WRB 4-羥基苯丙酮酸加雙氧酶 磷脂酰乙醇胺結合蛋白4
[0014] 在上述混合物中，作為一種優選實施方式，通過小分子質譜分析，所述混合物所含 的小分子如下： L-棕櫚酰肉堿 肌酸酐 硫胺素 己酰肉堿 L-大冬酰胺 肉堿 麥角硫因 氨基乙磺酸 甘油磷脂酰膽堿 L-酪氨酸 2-甲基丁酰肉堿 D-色氨酸 7-甲基鳥嘌呤 L-I丙氦酸 13Ζ-?「酰胺/BE-汴酰胺 膽堿 油酸酰胺 Γ酰肉堿 腺苷 5-氨基戊酸 脫氧鳥嘌呤 甜菜堿 胞嘧啶 泛酸 (3S) -3,6-二氨基己酸/(33,58)-3,5-二氨基己酸 3-甲基組氨酸
[0015] L-賴氨酸 L-脯氨酸 次黃嘌呤 L-乙酰肉堿 L-精氨酸 丙酰肉堿 L-絲氨酸 4-嘧啶甲胺/2-氛基甲革嘧啶 4-羥基脯氨酸 L-組氮酸 N-乙酰-L-丙氨酸 醋甲膽堿 L-谷氨酰胺 核糖胸核苷 焦谷氨酸 二甲基甘氨酸 吡咯烷酮羧酸 L-Alpha-氨基丁酸 N6,N6,N6-三甲基.-L-賴氮酸 L-異亮氨酸 L-犬尿氨酸 L-亮氨酸 Nl-乙酰亞精胺 N-Alpha-乙酰賴氨酸 N-甲基-L-谷氨酸 4-三甲基氨基酸 煙酰胺 乙酰膽堿 L-蘇氨酸/L-卨絲氨酸 D-谷氨酰甘氨酸 L-甲硫氨酸 （S ) -1-吡咯啉-5-羧酸/1-吡咯啉 -2-羧酸 N-乙酰鳥氨酸 4-胍基丁酸 2- 氧代-6-氨基Q酸 甜菜堿醛 3- 羥基-2甲基吡啶-5-羧酸 脫氧腺苷 3-羥基鄰氨基苯甲酸 D-谷氨酸 5'-甲基硫腺嘌呤 十一烷酰肉堿 L-半胱氨酸 鳥嘌呤
[0016] 癸酰肉堿 咪唑乙酸 谷胱甘肽 L-哌啶酸/N4-乙酰氨基r醛 腺嘌呤 N-乙酰谷氨酰胺 非對稱二甲基箱氨酸 植物鞘氨醇 η-正十五胺 吡哆醛 胍乙酸 酵母氨酸 馬氨酸 鞘氨醇 瓜氨酸 胸腺嘧啶 肌酸。
[0017] 在上述混合物中，作為一種優選實施方式，所述血漿來源于哺乳動物;優選地，所 述血漿來源于人。
[0018] 上述自血漿中分離出的用于增強記憶力的混合物的制備方法，作為一種優選實施 方式，所述制備方法依次包括:血漿收集步驟、密度梯度離心步驟、透析步驟、一次濃縮步 驟、去高峰度蛋白步驟、陰離子交換步驟以及二次濃縮步驟。
[0019] 在上述制備方法中，作為一種優選實施方式，在所述血漿收集步驟中，利用抗凝管 收集血液，再通過離心收集上清液，得到血漿;優選地，所述離心轉速為500-1500g，離心時 間為10-30分鐘。
[0020] 在上述制備方法中，作為一種優選實施方式，在所述密度梯度離心步驟中，將所述 血漿收集步驟得到的血漿與Percoll溶液、Forcol溶液或蔗糖溶液混合，建立密度梯度并離 心，之后將離心管中最上層紅色部分去掉，得到密度梯度離心后產物，其中所述離心的條件 為:轉速為10000-30000g，時間為2-20h;優選地，所述Percoll溶液、Forcol溶液或蔗糖溶液 的濃度為40-60%，所述Percoll溶液、Forcol溶液或蔗糖溶液與所述血漿的體積比為（10-15):(卜3) 〇
[0021] 在上述制備方法中，作為一種優選實施方式，在所述透析步驟中，將所述密度梯度 離心后的產物放入透析袋或管中進行透析，透析后收集透析袋或管中的產物，作為透析產 物;其中所述透析時使用的透析緩沖液為Tr i S-鹽酸緩沖液，磷酸緩沖液或HBS緩沖液;優選 地，所述Tris-鹽酸緩沖液的濃度為0.2-200mM、pH值為7.0-9.2，所述磷酸緩沖液的濃度為 1.0-500mM、pH值為6.0-9.2，所述HBS緩沖液的濃度為0.5-500mM、pH值為6.4-8.4;更優選 地，所述透析緩沖液為lmM、pH值為8的Tris鹽酸緩沖液;透析時間為20-72h，透析體積比是 1:100-1:10000ο
[0022] 在上述制備方法中，作為一種優選實施方式，在所述一次濃縮步驟中，將所述透析 產物進行濃縮，得到一次濃縮后產物，其中濃縮前體積是濃縮后體積的10倍以上;優選地， 所述濃縮是采用濃縮管離心的方式進行的，所述濃縮管允許1.5-2.5KD的物質通過，所述離 心時轉速為2000-4000g。
[0023] 在上述制備方法中，作為一種優選實施方式，在所述去高峰度蛋白步驟中，采用去 高峰度蛋白試劑盒將一次濃縮后產物中的高峰度蛋白去掉，得到去高峰度蛋白產物;優選 地，所述去高峰度蛋白試劑盒中的洗脫緩沖液對去高峰度蛋白柱子上的一次濃縮后產物進 行洗脫時得到的洗脫液，為所述去高峰度蛋白產物;優選地，去掉的所述高峰度蛋白的含量 是5mg/ml〇
[0024] 在上述制備方法中，作為一種優選實施方式，在所述陰離子交換步驟中，將所述去 高峰度蛋白產物加到陰離子交換柱中，用含有20-500mM氯化鈉的TriS-鹽酸緩沖液進行梯 度洗脫，當洗脫體積為15-35ml時開始收集洗脫液，當洗脫體積為40-85ml時停止收集洗脫 液，收集得到的洗脫液為陰離子交換后產物;優選地，所述Tris-鹽酸緩沖液的濃度為0.2-200mM、pH{t*7.0-9.2。
[0025] 在上述制備方法中，作為一種優選實施方式，在所述二次濃縮步驟中，將所述陰離 子交換后產物進行濃縮，得到二次濃縮后產物即所述混合物，其中濃縮前體積是濃縮后體 積的10倍以上;優選地，所屬濃縮是采用濃縮管離心的方式進行的，所述濃縮管允許1.5-2.5KD的物質通過，所述離心時轉速為2000-4000g。
[0026] -種藥物組合物，包含上述混合物和藥學上可接受的載體;優選地，所述藥學上可 接受的載體為:藥學上可接受的緩沖液、蛋白質、明膠、單糖、多糖、氨基酸、螯合劑、糖醇、聚 乙二醇、以及表面活性劑中的一種或多種。更加優選地，所述藥物組合物包括如下組分:1倍 體積的上述混合物，9倍體積的8.5wt %NaCl或1.5M、pH7.0的I3BS;進一步地，所述藥物組合 物中還包括白蛋白、葡萄糖以及谷氨酰胺，其中，所述白蛋白在所述藥物組合物中的質量體 積百分比為2%，所述葡萄糖在所述藥物組合物中的質量體積百分比為1%，所述谷氨酰胺 在所述藥物組合物中的質量體積百分比為3%。
[0027] -種緩釋制劑，包含上述混合物或者上述藥物組合物、以及藥學上可接受的生物 相容物質;優選地，所述緩釋制劑的劑型為脂質體、微球、水凝膠、微型滲透栗或微膠囊。
[0028] 上述混合物、上述藥物組合物以及上述緩釋制劑在預防、改善或/和治療記憶力減 退類疾病的藥物中的應用，優選地，所述記憶力減退類疾病為阿爾茲海默癥。
[0029] 上述混合物、上述藥物組合物以及上述緩釋制劑在增強記憶力藥物中的應用。
[0030] 包含上述混合物、上述藥物組合物或者上述緩釋制劑的試劑盒。
[0031]相比于現有技術，本發明具有如下有益效果：
[0032] 1、本發明制備的該血漿組分可以用于預防、改善和治療阿爾茲海默癥，該血漿組 分經驗證可以延緩阿爾茲海默癥的疾病進程并有可能逆轉阿爾茲海默癥的病理性嚴重程 度，此外其還可以起到增強記憶力的作用。
[0033] 2、本發明提供的從血漿中分離出的混合物可以比血漿和目前藥物更有效的提升 阿爾茲海默癥患者的認知水平。與此同時，長期服用這種血漿組分可以大大降低長期服用 西藥帶來的副作用和藥物依賴。
【附圖說明】
[0034] 圖1:雞尾酒組分1(即本發明的從血漿中分離出的混合物）制備陰離子柱層析結 果。小鼠血漿經過密度梯度離心、透析、濃縮和去高峰度蛋白后，進行陰離子柱層析。使用陰 離子柱SourceQ吸附蛋白，再用含500mM氯化鈉的Tris緩沖液進行梯度洗脫，得到洗脫曲線。 當洗脫體積為35毫升時開始收集洗脫液，當洗脫體積為45毫升時停止收集洗脫液。收集的 洗脫液經過濃縮后即為雞尾酒組分I。
[0035]圖2:雞尾酒組分ISDS-變性膠電泳鑒定結果。泳道M:蛋白分子量標準;泳道1-3:雞 尾酒組分。
[0036]圖3:雞尾酒組分IFPLC鑒定結果。雞尾酒組分制備好后，其蛋白組分用FPLC檢測， 蛋白峰為紫外280nm處的吸光度。
[0037] 圖4:雞尾酒組分I促進原代海馬細胞增值的活性圖。往原代海馬細胞的培養基里 分別加入雞尾酒組分I，其他血漿組分A和B，以及未處理的血漿，作為實驗組。對照組海馬細 胞只加 DMEM培養基。一天后在顯微鏡下對海馬細胞進行計數，計算實驗組細胞數目占對照 組細胞數目的比例。
[0038] 圖5:雞尾酒組分I促進原代海馬細胞之間突觸形成的活性圖。往原代海馬細胞的 培養基里分別加入雞尾酒組分I，其他血漿組分A和B，以及未處理的血漿，作為實驗組。對照 組海馬細胞只加 DMEM培養基。一天后在顯微鏡下對突觸數目進行計數，計算實驗組突觸數 目占對照組突觸數目的比例。
[0039] 圖6:雞尾酒組分I提升阿爾茲海默癥小鼠的記憶力動物模型數據圖。將雞尾酒組 分I系統地注射到阿爾茲海默癥小鼠模型中。通過水迷宮實驗，評價給藥對阿爾茲海默癥小 鼠記憶力的提升作用。
[0040] 圖7:不同處理后的原代海馬細胞圖。往原代海馬細胞的培養基里分別加入雞尾酒 組分I，其他血漿組分A和B，以及未處理的血漿，作為實驗組。對照組海馬細胞只加 DMEM培養 基。一天后在顯微鏡下對海馬細胞進行成像。圖中（a)，（b)，（c)，（d)，（e)分別是雞尾酒組分 I、其他血漿組分A、B、未處理的血漿、DMEM培養基（即對照組)處理后的原代海馬細胞。
【具體實施方式】
[0041] 為了更好地對本發明的技術特征和效果進行說明，下面采用【具體實施方式】對本發 明進行詳細說明，但本發明并不限于此。
[0042] 本發明提供的一種從血漿中分離出的混合物，所述混合物包括多種蛋白質和多種 小分子，所述混合物的SDS-PAGE變性膠電泳包括至少30個條帶，其中在分子量大于48kD的 條帶中包括明顯可見的7個條帶，所述7個條帶的分子量從小到大依次是56kD，68kD，77kD， 115kD，175kD，250kD和289kD。
[0043] 所述混合物的FPLC鑒定具有4個明顯峰。所述混合物的制備過程包括如下步驟:透 析、一次濃縮、去高峰度蛋白、陰離子交換、二次濃縮。經過以上步驟制備的混合物經過FPLC 純化鑒定具有4個明顯的峰（詳見圖3)，即橫坐標在8-18之間的4個峰，從左到右4個明顯的 峰對應的蛋白大小分別是：250kD，120kD，IOOkD和80kD。
[0044] 通過蛋白質譜分析，所述混合物至少含有30個蛋白，包括白蛋白，球蛋白，角蛋白， 纖維蛋白原和轉運蛋白；通過小分子質譜分析，所述混合物還至少含有20個小分子。
[0045] 具體地，通過蛋白質譜(比如MS/MS)分析鑒定，所述混合物所含蛋白如下表1。
[0046] 耒1蛋白席譜?吹加 MS /MS析鑒宙潤合物所含蛋白結里

[0049] 通過小分子質譜分析(比如UPLC-MS/MS)鑒定，所述混合物所含的小分子如下表2。 1 表2 MS2確認混合物中存在的小分子



[0055] 所述血漿來源于哺乳動物，比如人、鼠等;優選地，所述血漿來源于人。
[0056] -種上述從血漿中分離出的混合物的制備方法，該混合物是通過對血漿進行一系 列處理后獲得的，處理步驟依次包括血漿收集、密度梯度離心、透析、一次濃縮、去高峰度蛋 白、陰離子交換以及二次濃縮步驟。具體如下：
[0057] 本發明中使用的各種培養基和常用試劑均采用常規方法配制，實施例中涉及的分 子生物學操作如未注明具體試驗條件和方法，請參照SambrookJ等主編，科學出版社，2002， 分子克隆實驗指南(第三版)或相應產品的說明書。
[0058] 在所述血漿收集步驟中，利用抗凝管收集血液，通過離心收取上清，從而獲得血 漿;優選地，所述離心的轉速為 500_1500g(比如 510g、600g、700g、800g、900g、1000g、1100g、 1200g、1300g、1400g、1480g)，離心時間為 10-30分鐘（比如12min、15min、20min、25min、 28min)〇
[0059] 在所述密度梯度離心步驟中，將所述血漿收集步驟得到的血漿與Percoll溶液或 Ficoll溶液或蔗糖溶液混合建立密度梯度并離心，之后將離心管中最上層紅色部分去掉， 得到密度梯度離心后產物，其中所述離心的條件為:轉速為10000-30000g(比如10010g、 10500g、IlOOOg、12000g、13000g、14000g、15000g、16000g、17000g、18000g、19000g、20000g、 2100(^、2200(^、2300(^、2400(^、2500(^、2600(^、2700(^、2900(^)，離心時間為2-2011(比如 3111；[11、5111；[11、10111；[11、15111；[11、18111；[11);優選地，所述?61'0011溶液或？;[0011溶液或鹿糖溶液的濃 度為40-60 % (比如41 %、45 %、50 %、52 %、55 %、58 % )，所述Perco 11溶液或Fi co 11溶液或 蔗糖溶液與所述血漿的體積比為（10-15): (1-3)(比如10.5:1、12:1、13:1、14:1、14.8:1、 10·5:2、12:2、13:2、14:2、14·8:2、10·5:3、12:3、13:3、14:3、14·8:3)。通過密度梯度離心可 以去除血漿中少量的具有較強的毒性的紅色色素小分子。
[0060] 不同濃度的Perco 11溶液的配制方法:先用9 (體積)份Perco 11原液(Pharmacia公 司產品）與1 (體積)份8.5wt %NaCl或1.5M PBS混合達到生理性滲透壓，此時得到的為100% Perco11溶液，然后用生理溶液(0.85wt %NaCl或0.15M PBS)稀釋100 %Perco11溶液到所需 濃度。
[0061 ] 不同濃度的Ficoll溶液的配制方法:先用9 (體積)份Fi co 11原液(Pharmac ia公司 產品）與1 (體積)份8.5wt %NaCl或1.5M PBS混合達到生理性滲透壓，此時得到的為100 % Fi co 11溶液，然后用生理溶液(0.85wt % NaCl或0.15M PBS)稀釋100 % Fi co 11溶液到所需濃 度。
[0062 ]不同濃度的鹿糖溶液的配制方法:在室溫將鹿糖固塊(Pharmac i a公司產品）加入 至8.5wt %NaCl或1.5M PBS溶液中至飽和，邊加邊攪拌。飽和蔗糖溶液濃度為2.3M，即為 100%蔗糖溶液。然后用生理溶液(〇.85wt%NaCl或0.15M I3BS)稀釋100%蔗糖溶液到所需 濃度。
[0063]在所述透析步驟中，將所述密度梯度離心后產物放入透析袋或管中進行透析，透 析后收集透析袋或管中的產物，作為透析產物，用于之后的一次濃縮步驟，其中所述透析時 使用的透析緩沖液為0.2-200mM、pH7.0-9.2的Tris-鹽酸緩沖液（比如：0.3mM、pH7.0的 Tris-鹽酸緩沖液，lmM、pH7.0的Tris-鹽酸緩沖液，20mM、pH7.0的Tris-鹽酸緩沖液，50mM、 pH7.0的Tris-鹽酸緩沖液，10011^、？!17.0的1^8-鹽酸緩沖液，15011^、？!17.0的1^8-鹽酸緩 沖液，18011^、？!17.0的1^8-鹽酸緩沖液，19511^、？!17.0的1^8-鹽酸緩沖液，0.31111、？!18.0的 Tris-鹽酸緩沖液，lmM、pH8.0的Tris-鹽酸緩沖液，30mM、pH8.0的Tris-鹽酸緩沖液，60mM、 pH8.0的Tris-鹽酸緩沖液，90mM、pH8.0的Tris-鹽酸緩沖液，150mM、pH8.0的Tris-鹽酸緩沖 液，18OmM、pH8 · 0 的 Tr i S-鹽酸緩沖液，195mM、pH8 · 0 的Tr i s-鹽酸緩沖液，0 · 3mM、pH9 · 0 的 Tris-鹽酸緩沖液，lmM、pH9.0的Tris-鹽酸緩沖液，30mM、pH9.0的Tris-鹽酸緩沖液，60mM、 pH9.0的Tris-鹽酸緩沖液，90mM、pH9.0的Tris-鹽酸緩沖液，150mM、pH9.0的Tris-鹽酸緩沖 液，180mM、pH9.0的Tris-鹽酸緩沖液，195mM、pH9.0的Tris-鹽酸緩沖液，），1.0-500mM、 pH6.0-9.2的磷酸緩沖液（比如：1.5mM、pH6.5的磷酸緩沖液，30mM、pH6.5的磷酸緩沖液， 90mM、pH6.5的磷酸緩沖液，160mM、pH6.5的磷酸緩沖液，200mM、pH6.5的磷酸緩沖液，300mM、 pH6.5的磷酸緩沖液，400mM、pH6.5的磷酸緩沖液，460mM、pH6.5的磷酸緩沖液，490mM、pH6.5 的磷酸緩沖液，1.5mM、pH7.5的磷酸緩沖液，30mM、pH7.5的磷酸緩沖液，90mM、pH7.5的磷酸 緩沖液，160mM、pH7.5的磷酸緩沖液，200mM、pH7.5的磷酸緩沖液，300mM、pH7.5的磷酸緩沖 液，400mM、pH7.5的磷酸緩沖液，460mM、pH7.5的磷酸緩沖液，490mM、pH7.5的磷酸緩沖液， 1.5mM、pH8.5的磷酸緩沖液，30mM、pH8.5的磷酸緩沖液，90mM、pH8.5的磷酸緩沖液，160mM、 pH8.5的磷酸緩沖液，200mM、pH8.5的磷酸緩沖液，300mM、pH8.5的磷酸緩沖液，400mM、pH8.5 的磷酸緩沖液，460mM、pH8.5的磷酸緩沖液，490mM、pH8.5的磷酸緩沖液，1.5mM、pH9.0的磷 酸緩沖液，30mM、pH9.0的磷酸緩沖液，90mM、pH9.0的磷酸緩沖液，160mM、pH9.0的磷酸緩沖 液，200mM、pH9.0的磷酸緩沖液，300mM、pH9.0的磷酸緩沖液，400mM、pH9.0的磷酸緩沖液， 460mM、pH9 · 0 的磷酸緩沖液，490mM、pH9 · 0 的磷酸緩沖液）或0 · 5-500mM、pH6 · 4-8 · 4HBS 的緩 沖液（比如：lmM、pH6.5HBS的緩沖液，50mM、pH6.5HBS的緩沖液，100mM、pH6.5HBS的緩沖液， 150mM、pH6 · 5HBS的緩沖液，200mM、pH6 · 5HBS的緩沖液，250mM、pH6 · 5HBS的緩沖液，300mM、 pH6.5HBS 的緩沖液，350mM、pH6.5HBS 的緩沖液，450mM、pH6.5HBS 的緩沖液，495mM、pH6.5HBS 的緩沖液，lmM、pH7.5HBS的緩沖液，50mM、pH7.5HBS的緩沖液，100mM、pH7.5HBS的緩沖液， 150mM、pH7 · 5HBS的緩沖液，200mM、pH7 · 5HBS的緩沖液，250mM、pH7 · 5HBS的緩沖液，300mM、 pH7 · 5HBS 的緩沖液，350mM、pH7 · 5HBS 的緩沖液，450mM、pH7 · 5HBS 的緩沖液，495mM、pH7 · 5HBS 的緩沖液，150mM、pH8.2HBS的緩沖液，200mM、pH8.2HBS的緩沖液，250mM、pH8.2HBS的緩沖 液，300mM、pH8 · 2HBS的緩沖液，350mM、pH8 · 2HBS的緩沖液，450mM、pH8 · 2HBS的緩沖液， 495mM、pH8.2HBS的緩沖液）；所述透析袋或管的孔徑為0.2-0.3nm;優選地，所述透析緩沖液 為lmM、pH = 8的Tris鹽酸緩沖液;更優選地，所述透析的時間為20-72h(比如21h、25h、30h、 35h、40h、45h、55h、65h、7Ih)，透析體積比（即透析袋中物質與處于透析袋外部的透析緩沖 液的體積比）是1:100-1:10000(比如1:150、1:500、1:1000、1:1500、1:2500、1:3500、1: 4000、1:5000、1:6000、1:7000、1:8000、1:9000、1:9500)。通過透析步驟，可以去除上一步密 度梯度離心中的介質即蔗糖、Percoll或Ficoll，以防止該介質對下游產品制備產生不良影 響。
[0064] 在所述一次濃縮步驟中，將所述透析步驟得到的產物進行濃縮，得到一次濃縮后 產物，其中濃縮前體積是濃縮后體積的至少10倍(比如：15倍、30倍、40倍、50倍、70倍、90倍、 100倍）；所述濃縮的具體方法包括濾膜濃縮和濃縮管濃縮。優選地，所述濃縮是采用濃縮管 離心的方式進行的，所述濃縮管允許1.5-2.5KD(比如1.6KD、1.8KD、1.9KD、2. OKD、2.2KD、 2.41?)的物質通過，所述離心時轉速為2000-400(^(比如210(^、230(^、250(^、3000 8、 320(^、350(^、380(^)。該步驟的目的是讓血漿組分體積變小，從而更高效的實現下一步中 高峰度蛋白的去除。
[0065] 在所述去高峰度蛋白步驟中，采用去高峰度蛋白試劑盒將一次濃縮后產物中的高 峰度蛋白去掉，從而得到去高峰度蛋白產物;優選地，所述去高峰度蛋白試劑盒中的洗脫緩 沖液對去高峰度蛋白柱子上的一次濃縮后產物進行第一次洗脫時得到的洗脫液，即為所述 去高峰度蛋白產物。該步驟的目的是去掉血漿中含量是5mg/ml的高峰度蛋白，以防止血漿 中的有效組分無法發揮功效。
[0066] 在所述陰離子交換步驟中，將所述去高峰度蛋白產物加到陰離子交換柱中，用含 有氯化鈉(20_500mM)的Tri s鹽酸緩沖液(0.2-200mM，pH7.0-9.2)進行梯度洗脫，當洗脫體 積為15-35ml時（比如16ml、20ml、25ml、30ml、34ml)開始收集洗脫液，當洗脫體積為40-85ml 時（比如57ml、60ml、65ml、75ml、83ml)停止收集洗脫液，收集得到的洗脫液即為陰離子交換 后產物。其中，含有氯化鈉（20-500mM)的Tri s鹽酸緩沖液(0 · 2-200mM，pH7 · 0-9 · 2)可以是： 含有25mM氯化鈉的lmM、pH7.2的Tris鹽酸緩沖液，含有25mM氯化鈉的lmM、pH8.2的Tris鹽酸 緩沖液，含有251^氯化鈉的1禮、？!19.0的1^8鹽酸緩沖液，含有10〇1111氯化鈉的11111、？!17.2的 Tris鹽酸緩沖液，含有IOOmM氯化鈉的lmM、pH8.2的Tris鹽酸緩沖液，含有IOOmM氯化鈉的 111^、？!19.0的1^8鹽酸緩沖液，含有20〇11^氯化鈉的111^、？!17.2的1^8鹽酸緩沖液，含有 200mM氯化鈉的lmM、pH8.2的Tris鹽酸緩沖液，含有200mM氯化鈉的lmM、pH9.0的Tris鹽酸緩 沖液，含有40〇11^氯化鈉的111^、？!17.2的1^8鹽酸緩沖液，含有40〇11^氯化鈉的111^、？!18.2的 Tris鹽酸緩沖液，含有400mM氯化鈉的lmM、pH9.0的Tris鹽酸緩沖液，含有490mM氯化鈉的 111^、？!17.2的1^8鹽酸緩沖液，含有49〇11^氯化鈉的111^、？!18.2的1^8鹽酸緩沖液，含有 490mM氯化鈉的lmM、pH9.0的Tris鹽酸緩沖液，含有30mM氯化鈉的100mM、pH7.2的Tris鹽酸 緩沖液，含有150mM氯化鈉的100mM、pH7.2的Tris鹽酸緩沖液，含有400mM氯化鈉的100mM、 pH7.2的Tris鹽酸緩沖液，含有480mM氯化鈉的100mM、pH7.2的Tris鹽酸緩沖液，含有30mM氯 化鈉的190mM、pH7.2的Tris鹽酸緩沖液，含有150mM氯化鈉的190mM、pH7.2的Tris鹽酸緩沖 液，含有400mM氯化鈉的190mM、pH8.2的Tris鹽酸緩沖液，含有480mM氯化鈉的190mM、pH9.0 的Tris鹽酸緩沖液。該步驟的目的是去除血漿組分中帶負電荷的成分，以防止這些成分對 疾病的毒害作用，帶負電荷成分的存在幾乎會導致血漿組分沒有療效。收集洗脫體積為上 述范圍內的洗脫液可以獲得療效顯著的血漿成分。
[0067] 在所述二次濃縮步驟中，將所述陰離子交換后產物進行濃縮，得到二次濃縮后產 物即所述混合物，其中濃縮前體積是濃縮后體積的至少10倍(比如：15倍、30倍、40倍、50倍、 70倍、90倍、100倍）;所述二次濃縮的具體方法包括濾膜濃縮和濃縮管濃縮。優選地，所述濃 縮是采用濃縮管離心的方式進行的，所述濃縮管允許1.5-2.5KD(比如1.6KD、1.8KD、1.9KD、 2.01(0、2.21(0、2.41(0)的物質通過，所述離心時轉速為2000-400(^(比如210(^、2300 8、 250(^、300(^、320(^、350(^、380(^)。二次濃縮的目的是提高雞尾酒組分的濃度和粘度，從 而提尚單位成分的療效。
[0068] -種藥物組合物，包含上述混合物和藥學上可接受的載體。所述藥學上可接受的 載體可以為:藥學上可接受的各種常用緩沖液(比如磷酸鹽、檸檬酸鹽以及其他有機酸緩沖 液）、蛋白質(如白蛋白和免疫球蛋白，其可大大提升產品的穩定性）、明膠、單糖、多糖、氨基 酸、螯合劑（如EDTA)、糖醇（如甘露醇）、聚乙二醇、以及表面活性劑如TWEEN和PLURONICS中 的一種或多種。
[0069] 優選地，所述藥物組合物包括如下組分：1倍體積的上述混合物（即二次濃縮后產 物），9倍體積的8.5wt % NaC 1或1.5M PBS (pH7.0)。更優選地，所述藥物組合物中還包括白蛋 白、葡萄糖以及谷氨酰胺，其中，所述白蛋白在所述藥物組合物中的質量體積百分比為2% (w/v)，所述葡萄糖在所述藥物組合物中的質量體積百分比為l%(w/v)，所述谷氨酰胺在所 述藥物組合物中的質量體積百分比為3%(w/v)。
[0070] 所述藥物組合物的劑型可以是:溶液劑、注射劑、靜脈注射乳劑、糖漿劑、膠漿劑、 混懸劑、微球劑、微囊、片劑、散劑、顆粒、丸劑、凍干粉、氣霧劑、噴霧劑。
[0071] 所述藥物組合物可以按照如下方式給藥:靜脈滴注、靜脈注射、肌肉注射、腹腔注 射、肝動脈注射、皮下包埋、鼻粘膜給藥和口服。給藥劑量是〇.〇l-lml/kg(比如:0.02ml/kg、 0·05ml/kg、0·lml/kg、0·4ml/kg、0·6ml/kg、0·8ml/kg、0·9ml/kg)。
[0072] -種緩釋制劑，包含:上述混合物或者上述藥物組合物、以及藥學上可接受的生物 相容物質;優選地，所述緩釋制劑的劑型為脂質體、微球、水凝膠、微型滲透栗或微膠囊。
[0073] 上述混合物、上述藥物組合物和/或上述緩釋制劑在預防、改善或/和治療記憶力 減退類疾病的藥物中的應用;優選地，所述記憶力減退類疾病是阿爾茲海默癥。
[0074] 上述混合物、上述藥物組合物和/或上述緩釋制劑在增強記憶力藥物中的應用。
[0075] -種包含上述混合物、上述藥物組合物和/或上述緩釋制劑的試劑盒。所述試劑盒 中還可以含有陰性對照或陽性對照等。
[0076] 下面通過實施例對本發明混合物的制備、鑒定和應用進行說明。以下實施例中使 用的原代海馬細胞是按照如下參考文獻培養的：Guo, W.，Y.Ji，et al.(2014). "Neurona 1 activity alters BDNF-TrkB signaling kinetics and downstream functions·〃J Cell Sci 127(Pt 10):2249-2260。
[0077] 實施例1:混合物的制備
[0078] (I)從成年小鼠采血，收集血漿
[0079] 將100只成年的C75BL/6品系的小鼠（該小鼠也可以使用其他品系實驗動物代替， 比如:BALB/cA品系的小鼠，DBA/2品系的小鼠，SD大鼠 ，Wi s tar大鼠）用20 vo 1 %的二氧化碳 (即二氧化碳含量為20vol%的氣體)麻醉，然后用采血針從小鼠眼部放血至采血管(采血管 為抗凝管）內，邊放血邊搖晃采血管，防止血液凝固。將含有血液的采血管放入離心機，設定 轉速為l〇〇〇g，離心30分鐘。然后用移液器小心吸取上清，即為收集到的血漿。
[0080] (2)從小鼠血漿中分離出雞尾酒組分即本發明的混合物
[0081 ] (a)密度梯度離心
[0082]首先將血漿進行密度梯度離心:往總體積為13毫升的離心管內加入12毫升濃度為 50%的Percoll，然后再加入1毫升的小鼠血漿；將離心管放入超速離心機，設定轉速為 12000g，設定溫度為4攝氏度，離心5個小時。密度梯度離心后，用移液器去除離心管中最上 層紅色部分，將離心管中剩余的血衆組分連同Percol 1-起進行透析。
[0083] (b)透析
[0084]透析選用一般的透析袋，透析袋孔徑約為0.25納米。將密度梯度離心后獲得的血 漿組分連同Percoll-同加入到透析袋中，然后將透析袋放入IL的燒杯中，燒杯中透析袋外 加入IL的ImM Tris鹽酸緩沖液(pH8.0)，邊攪拌邊透析。透析溫度為4°C，透析時間為24小 時。透析結束后，將透析袋中的剩余的血漿組分作為透析產物，待進行一次濃縮。
[0085] (c) 一次濃縮
[0086]將透析后的血漿組分加入到體積為2毫升的濃縮管中，濃縮管允許大小為2千道爾 頓的物質通過。將濃縮管放入離心機中，設定轉速為3000g，設定溫度為4°C，啟動離心機，開 始濃縮，直到最終體積為500微升。之后，將剩余的透析后的血漿再次加入該離心管中以使 血漿組分的體積達到2mL，以相同的參數進行離心，再次濃縮至最終體積為500微升。如此循 環濃縮，直到將透析后的血漿組分最終濃縮到體積為500微升。將該500微升血漿組分作為 一次濃縮產物，記為血漿組分A，待進行去高峰度蛋白處理。
[0087] (d)去高峰度蛋白
[0088] 去高峰度蛋白采用BIO-RAD公司生產的型號為163-3006的去高峰度蛋白試劑盒， 將濃縮后獲得的500微升血漿加入到去高峰度蛋白的柱子中，然后將該柱子放到4°C的冰 箱，放置5個小時。之后往柱子中加入2毫升的沖洗緩沖液，4攝氏度離心5分鐘，離心轉速為 10000g。然后再往柱子中加入500微升的洗脫緩沖液，4°C放置30分鐘，然后4°C離心5分鐘， 離心轉速為l〇〇〇〇g，之后洗脫下來的血漿組分即為去高峰度蛋白后的血漿組分，記為血漿 組分B，將該血漿組分B待用陰離子交換柱進一步純化。
[0089] (e)陰離子交換
[0090]將去除過高峰度蛋白后的500微升血漿組分加到陰離子交換柱Source Q中，用含 有500mM氯化鈉的Tr i s鹽酸緩沖液(200mM，pH8.0)進行梯度洗脫，其中陰離子交換柱的填料 為Q Sepharose(購自GE Healthcare)，平均粒度為3微米，陰離子交換柱體積為25毫升，洗 脫速度為4ml/min，上樣速度為3ml/ml。當洗脫體積為35毫升時開始收集洗脫液，當洗脫體 積為45毫升時停止收集洗脫液;此部分洗脫液具有療效活性。收集的洗脫液作為陰離子交 換產物，待進行二次濃縮后。參見圖1，其為陰離子柱層析結果，使用陰離子柱Source Q吸附 蛋白，再用氯化鈉梯度溶液洗脫，本圖為洗脫曲線。
[0091] (f)二次濃縮
[0092] 將陰離子交換后的血漿組分加入到體積為2毫升的濃縮管中，濃縮管允許大小為2 千道爾頓的物質通過，將濃縮管放入離心機中，設定轉速為3000g，設定溫度為4°C，啟動離 心機，開始濃縮，直到最終體積為500微升。之后，將剩余的陰離子交換后的血漿再次加入該 離心管中以使濃縮罐中溶液的體積為2毫升，以相同的參數進行離心，再次濃縮至最終體積 為500微升。如此循環濃縮，直到將陰離子交換后的血漿組分最終濃縮到體積為500微升。該 500微升的血漿組分，即為從小鼠血漿中分離得到的雞尾酒組分，將其命名為雞尾酒組分I。 [0093]實施例2:實施例1制備的雞尾酒組分ISDS-PAGE變性膠電泳鑒定
[0094] 從上述雞尾酒組分里取出2微升，在紫外280nm下測定其吸光度，從而計算雞尾酒 組分的蛋白濃度。取一定體積的雞尾酒組分，與1微升5X蛋白上樣緩沖液(購自北京蘭博利 德生物技術有限公司，貨號D621)混合，即為需要進行電泳的樣品，該樣品里面有10微克的 蛋白質。將電泳樣品升溫至100°c，加熱20分鐘使蛋白質變性，然后立即將樣品放到冰上，等 待5分鐘后開始跑SDS-PAGE變性還原膠(所述SDS變性還原膠的配制方法如下：30(w/v) %的 丙烯酰胺Acr-Bis (購自 GE Heal thcare)取 1 · 3ml、1 · 5M TriS-鹽酸緩沖液（pH8 · 8，購自 GE Healthcare)取 1.3ml、10(w/v)% 的SDS取0.05ml、10% (w/v)過硫酸銨（購自 GE Healthcare)取0 · 05ml、TEMED(購自GE Healthcare)取0 · 003ml、以及水取2 · 3ml，共計5ml， 混合后在室溫即可凝固成膠）。跑膠時，每個泳道的蛋白上樣量為10微克，設定跑膠電壓為 100V，開始跑膠，跑膠時間為1小時。跑完膠后，用考馬斯亮藍染色液(該染色液的制備方法 為:將2.5g考馬斯亮藍R-250溶于500ml 95%乙醇溶液，加入100mL 85 %的乙酸溶液，然后， 用蒸餾水補充至1000ml，此染液放4°C至少6個月保持穩定)對膠進行染色，可以發現雞尾酒 組分里至少含有10條肉眼可見多肽（圖2)，其分子量分別為從小到大依次是31kD，56kD， 681^)，771^)，1151^)，1281^)，1651^)，1751^)，2501^)和2891^)。其中在分子量大于481^)的條帶中包 括明顯可見的7個條帶，所述7個條帶的分子量從小到大依次是56kD，68kD，77kD，115kD， 175kD，250kD和289kD。
[0095]實施例3:實施例1制備的雞尾酒組分IFPLC鑒定
[0096] 從雞尾酒組分里取出2微升，在紫外280nm下測定其吸光度，從而計算雞尾酒組分 的蛋白濃度。先用20mM Tris-鹽酸緩沖液(pH 8.0)平衡FPLC柱子(Superdex 200)，之后將 一定體積的雞尾酒組分注射到FPLC柱子中，注射的雞尾酒組分含蛋白質300微克。然后讓雞 尾酒組分以每分鐘1毫升的速度流過FPLC柱子，發現雞尾酒組分里含有明顯可見的4個峰， 參見圖3,峰從左到右4個明顯的峰(橫坐標在8-18之間的4個峰)對應的蛋白大小分別是： 250kD，120kD，IOOkD和80kD。
[0097]實施例4:實施例1制備的雞尾酒組分I蛋白質質譜鑒定
[0098]將雞尾酒組分轉移到FALCON管中，加入兩倍體積的樣品緩沖液(緩沖液的配方為： 7 · 5M尿素 UREA，1 · 5M硫脲THIOUREA，4(w/v) % 3-[ 3-(膽酰胺丙基）二甲氨基]丙磺酸內鹽 CHAPS，0.05 (w/v) %十二烷基硫酸鈉 SDS，IOOmM二硫蘇糖醇DDT，各組分前的所示濃度是其 相應組分在緩沖液中的濃度），并通過3kDa molecular weight cut-off spin columns (Pall GmbH，Austria)離心管離心濃縮。濃縮液用二硫蘇糖醇進行還原反應，得到還原產 物;其中，濃縮液與二硫蘇糖醇的體積比為1:3,反應時間為15分鐘，溫度為室溫。再將該還 原產物與碘乙酰胺進行反應，得到烷基化產物;其中，該還原產物與碘乙酰胺的體積比1:1， 反應時間為15分鐘，溫度為室溫;隨后用胰蛋白酶在37°C進行消化反應過夜，其中烷基化產 物與胰蛋白酶的體積比1:1，得到消化后的肽段。胰蛋白酶消化所得肽段通過C18色譜柱純 化，得到樣品。所得樣品真空離心干燥并隨后保存在-20°C冰箱中用于MS/MS分析。MS/MS分 析具體如下：HPLC用的是Ultimate 3000系統，其中配備了PepMap100 C_18trap column(300 4111\51]1111)和？6。]\^。100018&11&171:;[0&1(301111]111(75以111\25〇1]1111)兩根柱子。質譜儀米用 Amazon speed ETD，MS數據采集范圍為400-1400m/z，MS/MS的肽段處理范圍為100-2800m/ z。隨后，每個MS數據會自動搜索與其匹配的三個質量最好的CID MS/MS峰譜。噴嘴口電壓設 置為1400伏特。氮氣保護的溫度為150°C，流速為3升/分鐘。MS的蛋白質識別和無標記定量 (LFQ)數據分析采用開放源代碼軟件MaxQuantl. 3.0.5。通過搜索SwissProt數據庫(版本 10/2003 20354項)對蛋白質進行鑒定，鑒定結果參見表1。
[0099 ]實施例5:實施例1制備的雞尾酒組分I小分子質譜鑒定
[0100]取200微升的雞尾酒組分樣本放入玻璃瓶內，將玻璃瓶插在冰內15分鐘。再將玻璃 瓶于通風櫥內用1毫升注射器向其中加入800微升甲烷/二氯甲烷混合液（甲烷與二氯甲烷 的體積比為2:1)。然后再將玻璃瓶插放回冰內，超聲粉碎2分鐘。粉碎結束后將玻璃瓶放在 冰上靜置20-30分鐘，之后放在震蕩儀上震蕩混勻1分鐘。然后放在冰箱內靜置5分鐘，看其 分層后再放在震蕩儀上震蕩混勻，共重復3-5次。之后室溫2000rpm離心20分鐘，離心后會分 三層，上層為代謝產物（用M標注），中間為蛋白質，下層為脂類（用LP標注），用250微升的注 射器輕輕吸取玻璃瓶內的上層溶液至一個新的1.5毫升EP管內；用250ul的注射器吸取玻璃 瓶內的下層溶液至另一個新的1.5毫升EP管內。將吸出的下層液體同時放在4 °C離心機內 13000rpm離心10分鐘，吸取上清液至新的1.5毫升EP管內用UPLC-MS/MS高分辨液質聯用分 析儀對小分子代謝產物進行鑒定，Q Exactive Orbitrap質譜儀用于代謝產物的鑒定，其重 要參數如下表3,鑒定結果參見表2。
[0101 ] 表3 Q Exactive Orbitrap質譜儀鑒定參數
[0104] 實施例6:實施例1制備的雞尾酒組分I體外促使原代海馬細胞增值的活性
[0105] 從雞尾酒組分里取出2微升，在紫外280nm下測定其吸光度，從而計算雞尾酒組分 的蛋白濃度。用24孔板培養大鼠來源的原代海馬細胞(本發明中使用的原代海馬細胞的培 養方法均參照以下文獻中記載的方法:Guo,W.，Y.Ji，et al. (2014) ."Neuronal activity alters BDNF-TrkB signaling kinetics and downstream functions·〃J Cell Sci 127 (Pt 10) :2249-2260.)，培養所用培養基為DMEM，培養條件為37°C，5vol%二氧化碳。等到細 胞密度達到每孔4X IO5個細胞時，往培養基里加入雞尾酒組分，每個孔中加入的雞尾酒組 分含蛋白1000微克，作為實驗組1-雞尾酒組分。同時實驗組中還包括以下三組：即往不同孔 的培養基里分別加入蛋白含量為1000微克的小鼠血漿(實施例1的第（1)步制備得到的）、蛋 白含量為1000微克的血漿組分A(實施例1的第(2)步(c)中制備得到的）和蛋白含量為1000 微克的血漿組分B(實施例1的第(2)步(d)中制備得到的），分為命名為實驗組2-小鼠血漿、 實驗組3-血漿組分A、實驗組4-血漿組分B。同時設置對照組，在對照組中，等到細胞密度達 到每孔4 X IO5個細胞時，往孔的培養基中添加100微升的DMEM培養基。之后在原先的條件下 繼續培養細胞24小時，然后在光學顯微鏡下對實驗組和對照組進行細胞計數，計算各實驗 組細胞數目占對照組細胞數目的比例。參見圖4,可以發現相比血漿、血漿組分A和B而言，雞 尾酒組分可以明顯促進原代海馬細胞的增值，細胞數目占對照組細胞數目約為150%。
[0106] 實施例7:實施例1制備的雞尾酒組分I體外促使原代海馬細胞突觸形成的活性
[0107] 從雞尾酒組分里取出2微升，在紫外280nm下測定其吸光度，從而計算雞尾酒組分 的蛋白濃度。用24孔板培養原代海馬細胞，培養所用培養基為DMEM，培養條件為37°C， 5vol %二氧化碳。等到細胞密度達到每孔4 X IO5個細胞時，往培養基里加入雞尾酒組分，每 個孔中加入的雞尾酒組分含蛋白1000微克，作為實驗組1-雞尾酒組分。同時實驗組中還包 括以下三組：即往不同孔的培養基里分別加入蛋白含量為1000微克的小鼠血漿(實施例1的 第（1)步制備得到的）、蛋白含量為1000微克的血漿組分A(實施例1的第(2)步(c)中制備得 到的）和蛋白含量為1000微克的血漿組分B(實施例1的第(2)(d)中步制備得到的），分為命 名為實驗組2-小鼠血漿、實驗組3-血漿組分A、實驗組4-血漿組分B。同時設置對照組，在對 照組中，等到細胞密度達到每孔4 X IO5個細胞時，往孔的培養基中添加100微升的DMEM培養 基。之后在原先的條件下繼續培養細胞24小時，然后在光學顯微鏡下對各實驗組和對照組 進行突觸計數，計算各實驗組突觸數目占對照組突觸數目的比例。參見圖5,可以發現相比 血漿、血漿組分A和B而言，雞尾酒組分可以明顯促進原代海馬細胞形成突觸，突觸數目占對 照組突觸數目約為210%。繼續培養細胞24小時后在顯微鏡下對海馬細胞進行成像，參見圖 7,從圖7中可以看出：相比血漿、血漿組分A和B而言，雞尾酒組分可以明顯促進原代海馬細 胞的增值，突觸形成數目占對照組細胞數目約為210%。
[0108] 實施例8:實施例1制備的雞尾酒組分I有效提升阿爾茲海默癥小鼠的記憶力 [0109] 本實施例米用5XFAD阿爾茲海默癥小鼠模型，訂購于美國jackson laboratory，并 按照動物實驗標準進行繁殖和飼養。每一只實驗模型小鼠都通過鼠尾進行基因鑒定，確保 APP基因和PSl基因的穩定突變。雞尾酒組分通過鼠尾靜脈注射進小鼠體內，給藥組保證30 微克蛋白/次的給藥劑量，在24天內每三天給藥1次，共給藥8次。水迷宮實驗用于檢測小鼠 的學習能力和記憶力，無給藥組為20只14周齡的5XFAD雄性小鼠，在行為學實驗前24天接受 了8次Saline(即生理鹽水)注射，給藥組為20只14周齡5XFAD雄性小鼠，在行為學實驗前24 天接受8次給藥，陰性對照組為20只14周齡的C57BL/6雄鼠，同樣接受Saline注射。
[0110]水迷宮實驗在上午8點到下午1點間進行。水迷宮空間記憶訓練期為4天，每天4次， 每次訓練間隔時間為10分鐘。在實驗中，每四個小鼠被隨機分為一個訓練組。對于每個訓練 組，水迷宮的平臺位置被隨機分配，且在整個訓練中保持不變。訓練中，小鼠從任意位置釋 放入水迷宮中，并允許它在120秒中搜索隱藏的平臺。如果小鼠沒有在120秒內找到平臺，它 將被引導到平臺。每次訓練中找到平臺所用的時間和所經過的距離被智能攝像頭自動記錄 下來。水迷宮測試在最后一次訓練48小時后進行，每只小鼠被釋放入沒有放置平臺的水迷 宮中，并允許其自由活動60秒。其游動路線被智能攝像頭自動記錄下來。測試期比訓練期時 間短一倍，以避免小鼠產生抑郁行為。小鼠在目標象限所花費的時間與其他三個象限所花 費的時間被記錄下來，用于對小鼠記憶力的評估。其結果參見圖6,從圖6中可以看出，給藥 組即注射雞尾酒組分的小鼠目標象限所花費的時間與正常對照組基本相同，說明雞尾酒組 分對阿爾茲海默癥小鼠記憶力有明顯的提升作用。
[0111] 實施例9雞尾酒組分Π 的制備
[0112] 除步驟(2)_(e)不同于實施例1以外，其他制備步驟均與實施例1相同，在本實施例 中，步驟(2)_(e)具體如下：
[0113]陰離子交換：
[0114] 將去除過高峰度蛋白后的500微升血漿組分加到陰離子交換柱Source Q中，用含 有200mM氯化鈉的Tris鹽酸緩沖液(100mM，pH8.0)進行梯度洗脫，其中陰離子交換柱的填料 為Q Sepharose(購自GE Healthcare)，平均粒度為3微米，陰離子交換柱體積為25毫升，洗 脫速度為4ml/min，上樣速度為3ml/ml。當洗脫體積為20毫升時開始收集洗脫液，當洗脫體 積為80毫升時停止收集洗脫液。收集的洗脫液作為陰離子交換產物，待進行二次濃縮后。
[0115] 該實施例得到的雞尾酒組分，命名為雞尾酒組分Π 。
[0116] 實施例10雞尾酒組分III的制備
[0117] 除步驟(2)_(a)不同于實施例1以外，其他制備步驟均與實施例1相同，在本實施例 中，步驟(2)_(a)具體如下：
[0118] 密度梯度離心
[0119] 首先將血漿進行密度梯度離心:往總體積為13毫升的離心管內加入10毫升濃度為 40 %的蔗糖，然后再加入3毫升的小鼠血漿;將離心管放入超速離心機，設定轉速為30000g， 設定溫度為4攝氏度（°C )，離心20個小時。密度梯度離心后，用移液器去除離心管中最上層 紅色部分，將離心管中剩余的血漿組分連同蔗糖一起進行透析。
[0120] 實施例11雞尾酒組分IV的制備
[0121] 除步驟(2)_(a)不同于實施例1以外，其他制備步驟均與實施例1相同，在本實施例 中，步驟(2)_(a)具體如下：
[0122] 密度梯度離心
[0123] 首先將血漿進行密度梯度離心:往總體積為13毫升的離心管內加入11毫升濃度為 60 %的Ficol 1，然后再加入2毫升的小鼠血漿；將離心管放入超速離心機，設定轉速為 15000g，設定溫度為4攝氏度，離心10個小時。密度梯度離心后，用移液器去除離心管中最上 層紅色部分，將離心管中剩余的血漿組分連同Ficoll-起進行透析。
[0124] 實施例12
[0125] 按照實施例2-5的鑒定方法分別對雞尾酒組分Π -IV進行鑒定，雞尾酒組分Π -IV 的SDS-PAGE蛋白電泳結果表明，雞尾酒組分Π -IV里均含有分子量從小到大依次是31kD， 56kD，68kD，77kD，115kD，128kD，165kD，175kD，250kD和289kD的 10條肉眼可見多肽，且在分 子量大于48kD的7個條帶非常清晰，其分子量從小到大依次是56kD，68kD，77kD，115kD， 175kD，250kD和SSgkD 13FPLC鑒定結果表明，雞尾酒組分Π -IV均有蛋白大小分別是250kD、 120kD、IOOkD和80kD的峰。蛋白質質譜和小分子質譜鑒定結果表明，雞尾酒組分Π -IV中均 含有表1和表2所不的蛋白質和小分子。
[0126] 實施例13
[0127] 按照實施例6的方法分別檢測雞尾酒組分Π -IV體外促使原代海馬細胞增值的活 性。
[0128] 檢測結果表明，雞尾酒組分Π -IV也可以明顯促進原代海馬細胞的增值，其中，雞 尾酒組分π組的細胞數目是對照組細胞數目的5倍;雞尾酒組分m組的細胞數目是對照組 細胞數目的6倍;雞尾酒組分IV組的細胞數目是對照組細胞數目的5.5倍。
[0129] 實施例14
[0130] 按照實施例7的方法分別檢測雞尾酒組分II-IV體外促使原代海馬細胞突觸形成 的活性。
[0131] 檢測結果表明，雞尾酒組分II-IV也可以明顯促進原代海馬細胞的增值，其中雞尾 酒組分II組的突觸形成數目是對照組細胞數目的7倍;雞尾酒組分III組的突觸形成數目是 對照組細胞數目的6.5倍;雞尾酒組分IV組的突觸形成數目是對照組細胞數目的8倍。
【主權項】
1. 一種自血漿中分離出的用于增強記憶力的混合物，其特征在于，所述混合物包括多 種蛋白質和多種小分子，所述混合物的SDS-PAGE變性膠電泳包括至少30個條帶，其中在分 子量大于48kD的條帶中包括:分子量從小到大依次是56kD，68kD，77kD，115kD，175kD，250kD 和289kD的條帶。2. 根據權利要求1所述的自血漿中分離出的用于增強記憶力的混合物，其特征在于，所 述混合物的FPLC鑒定具有4個峰，對應的蛋白大小分別是:250kD，120kD，lOOkD和80kD。3. 根據權利要求1所述的自血漿中分離出的用于增強記憶力的混合物，其特征在于，通 過蛋白質譜分析，所述混合物至少含有30個蛋白，包括白蛋白，球蛋白，角蛋白，纖維蛋白原 和轉運蛋白；通過小分子質譜分析，所述混合物還至少含有20個小分子。4. 根據權利要求3所述的自血漿中分離出的用于增強記憶力的混合物，其特征在于，通 過蛋白質譜分析，所述混合物所含蛋白如下： 血漿銅藍蛋白 I型富半腕氮酸清除受體M130 拂體5 心乳酸脫氨酶A鏈 附睪分泌蛋白Li51 酪氨酸蛋白激酶受體UFO 維生素 D結合蛋白 生長分化因子U 血管緊張膚原變體 6-憐酸葡萄糖異構酶 Beta-2-糖蛋白I 抗白細胞蛋白酶 蛋白AMBP 生長分化因子8 生長分化因子5 巢靈白-1 N-石醜胞壁酸-丙氨酸醜胺酶 可溶性富半腕氨酸清潔受體蛋白SSC5D 血清淀粉樣蛋白P 泛素-40S-核髓體蛋白S27a 脂多糖結合蛋白 層黏連蛋白亞基be化-1 生長分化因子15 超氧化物歧化酶 膜丙氨酸氨化酶變體 鋒指蛋白688 APOL1蛋白 二膚酶 載脂蛋白D 補體Is亞基 肝綾酸釀酶1 尾柳釘蛋白插入受體WRB 4-超基苯丙麗酸加觀氧酶 憐脂醜己醇胺結合蛋白4。5. 根據權利要求3所述的自血漿中分離出的用于增強記憶力的混合物，其特征在于， 通過小分子質譜分析，所述混合物所含的小分子如下： k糕擱醜肉堿 肌酸醉 硫胺素 己脫肉堿 以巧冬醜胺 肉堿 麥角硫因 氨基己瞞酸 片油稱脂醜膽堿 以酪氯酸 2-甲基了嚇肉堿 D-色氨酸 7-甲基鳥嗦嶺 以苯丙氨酸 BZ-異醜胺/13E-芥醜胺 膽堿 油酸醜胺 T醜肉堿 腺巧 5-氨基戊酸 脫氧鳥嗎吟 甜菜堿 胞嗦晦 泛酸 (3S) -3,6-二氨基己酸僻S，5S)-3,5-二氨皋曰龍 3-甲基巧氮酸 心賴氯酸 k脯氨酸 次黃噪嶺 以乙醜肉堿 以精氨酸 丙觀肉堿 絲気酸 4-啼巧甲胺任-氨基甲基曝蠟 4-徑基脯氨酸 以組氨酸 N-石酌-L·丙氨酸 醋甲膽堿 以谷氯酣胺 核糖胸核巧 焦谷氯酸 二甲暮甘氨酸 郵咯婉麗猿酸 LAlpha-氨基T酸 N6腫6，N6-蘭甲基-以賴氨酸 心巧亮氨酸 心犬尿氨酸 L-亮氨酸 N1 -芭醜亞精胺 N-Alpha-乙醜賴氨酸 N-甲皂-L-谷氯酸 4-Ξ：甲基氨趣了酸 煙酌胺 玄醜膽喊 心蘇氯酸化-商絲氯酸 D-谷氯醜甘氯酸 L-甲疏氨酸 （S ) -1 -化咯晰-5-殷酸巧-批咯嚇 -2-錢酸 N-石醜鳥氨酸 4-狐基了酸 2- 氧代-6-氨暮己酸 巧菜堿酸 3- 啓基-2甲基郵巧-5-接酸 脫氧腺昔 3-駐基鄰氨基苯甲酸 D-谷氨酸 5'-甲基硫腺囑吟 l·二燒醜肉堿 心半脫氮酸 鳥嚷時 癸醜肉堿 咪哇乙酸 谷腕甘化 心販喧酸/N4-己醜氨基了繼 腺噪嶺 N-己醜谷氯醜胺 非對稱二甲基精氨酸 植物稍氨醇 η-正十五胺 化咳酸 狐石酸 酵母氨酸 鳥氯酸 觸氨醇 瓜氨酸 胸腺嚼瞎 肌酸。6. 根據權利要求1所述的自血漿中分離出的用于增強記憶力的混合物，其特征在于，所 述血漿來源于哺乳動物;優選地，所述血漿來源于人。7. -種權利要求1-6任一所述自血漿中分離出的用于增強記憶力的混合物的制備方 法，其特征在于，依次包括:血漿收集步驟、密度梯度離屯、步驟、透析步驟、一次濃縮步驟、去 高峰度蛋白步驟、陰離子交換步驟W及二次濃縮步驟。8. 根據權利要求7所述的制備方法，其特征在于， 在所述血漿收集步驟中，利用抗凝管收集血液，再通過離屯、收集上清液，得到血漿;優 選地，所述離屯、轉速為500-1500g，離屯、時間為10-30分鐘。9. 根據權利要求7所述的制備方法，其特征在于， 在所述密度梯度離屯、步驟中，將所述血漿收集步驟得到的血漿與化rcoll溶液、Forcol 溶液或薦糖溶液混合，建立密度梯度并離屯、，之后將離屯、管中最上層紅色部分去掉，得到密 度梯度離屯、后產物，其中所述離屯、的條件為:轉速為10000-30000g，時間為2-20h;優選地， 所述Percoll溶液、Forcol溶液或薦糖溶液的濃度為40-60%，所述化rcoll溶液、Forcol溶 液或薦糖溶液與所述血漿的體積比為(10-15): (1-3)。10. 根據權利要求7所述的制備方法，其特征在于， 在所述透析步驟中，將所述密度梯度離屯、后的產物放入透析袋或管中進行透析，透析 后收集透析袋或管中的產物，作為透析產物;其中所述透析時使用的透析緩沖液為化is-鹽 酸緩沖液，憐酸緩沖液或皿S緩沖液;優選地，所述化is-鹽酸緩沖液的濃度為0.2-200mM、pH 值為7.0-9.2，所述憐酸緩沖液的濃度為1.0-500mM、pH值為6.0-9.2，所述皿S緩沖液的濃度 為0.5-500mM、pH值為6.4-8.4;更優選地，所述透析緩沖液為lmM、pH值為8的Tris鹽酸緩沖 液;透析時間為20-7化，透析體積比是1:100-1:10000。11. 根據權利要求7所述的制備方法，其特征在于， 在所述一次濃縮步驟中，將所述透析產物進行濃縮，得到一次濃縮后產物，其中濃縮前 體積是濃縮后體積的10倍W上;優選地，所述濃縮是采用濃縮管離屯、的方式進行的，所述濃 縮管允許1.5-2.51(0的物質通過，所述離屯、時轉速為2000-4000邑。12. 根據權利要求7所述的制備方法，其特征在于， 在所述去高峰度蛋白步驟中，采用去高峰度蛋白試劑盒將一次濃縮后產物中的高峰度 蛋白去掉，得到去高峰度蛋白產物;優選地，所述去高峰度蛋白試劑盒中的洗脫緩沖液對去 高峰度蛋白柱子上的一次濃縮后產物進行洗脫時得到的洗脫液，為所述去高峰度蛋白產 物;優選地，去掉的所述高峰度蛋白的含量是5mg/ml。13. 根據權利要求7所述的制備方法，其特征在于， 在所述陰離子交換步驟中，將所述去高峰度蛋白產物加到陰離子交換柱中，用含有20- 500mM氯化鋼的化is-鹽酸緩沖液進行梯度洗脫，當洗脫體積為15-35ml時開始收集洗脫液， 當洗脫體積為40-85ml時停止收集洗脫液，收集得到的洗脫液為陰離子交換后產物;優選 地，所述Tris-鹽酸緩沖液的濃度為0.2-200mM、pH值為7.0-9.2。14. 根據權利要求7所述的制備方法，其特征在于，在所述二次濃縮步驟中，將所述陰離 子交換后產物進行濃縮，得到二次濃縮后產物即所述混合物，其中濃縮前體積是濃縮后體 積的10倍W上;優選地，所屬濃縮是采用濃縮管離屯、的方式進行的，所述濃縮管允許1.5- 2.5KD的物質通過，所述離屯、時轉速為2000-4000g。15. -種藥物組合物，包含權利要求1-6任一所述的混合物和藥學上可接受的載體。16. 根據權利要求15所述的藥物組合物，其特征在于，所述藥學上可接受的載體為：藥 學上可接受的緩沖液、蛋白質、明膠、單糖、多糖、氨基酸、馨合劑、糖醇、聚乙二醇、W及表面 活性劑中的一種或多種。17. 根據權利要求15所述的藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物包括如下組分：1 倍體積的權利要求1 -5任一所述的混合物，9倍體積的8.5wt %化Cl或1.5M、pH7. ο的PBS;優 選地，所述藥物組合物中還包括白蛋白、葡萄糖W及谷氨酷胺，其中，所述白蛋白在所述藥 物組合物中的質量體積百分比為2%，所述葡萄糖在所述藥物組合物中的質量體積百分比 為1 %，所述谷氨酷胺在所述藥物組合物中的質量體積百分比為3%。18. -種緩釋制劑，包含權利要求1-6任一所述的混合物或者權利要求15-17任一所述 的藥物組合物、W及藥學上可接受的生物相容物質；優選地，所述緩釋制劑的劑型為脂質 體、微球、水凝膠、微型滲透累或微膠囊。19. 權利要求1-6任一所述的混合物、權利要求15-17任一所述的藥物組合物W及權利 要求18所述緩釋制劑在預防、改善或/和治療記憶力減退類疾病的藥物中的應用，優選地， 所述記憶力減退類疾病為阿爾茲海默癥。20. 權利要求1-6任一所述的混合物、權利要求15-17任一所述的藥物組合物W及權利 要求18所述緩釋制劑在增強記憶力藥物中的應用。21. -種包含權利要求1-6任一所述的混合物、權利要求15-17任一所述的藥物組合物 或者權利要求18所述緩釋制劑的試劑盒。
【文檔編號】A61K35/16GK106074600SQ201610474296
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月24日
【發明人】崔文宏
【申請人】田野