脫氫洛伐他汀在制備抗炎癥性腸病藥物中的應用

脫氫洛伐他汀在制備抗炎癥性腸病藥物中的應用
【專利摘要】本發明公開了脫氫洛伐他汀在制備抗炎癥性腸病藥物中的應用，本發明通過建立小鼠急性炎癥性腸病模型、觀察脫氫洛伐他汀對炎癥性腸病的治療作用等試驗，首次揭示脫氫洛伐他汀對葡聚糖硫酸鈉誘導的小鼠炎癥性腸病的防治作用及作用機制。脫氫洛伐他汀通過抑制NF?κB信號通路，明顯抑制促炎因子TNF?α、IL?6、IL?17的水平，提高抗炎因子IL?10的水平，而發揮對4％DSS誘導的小鼠炎癥性腸病的保護作用。
【專利說明】
脫氫洛伐他訂在制備抗炎癥性腸病藥物中的應用
技術領域
[0001] 本發明涉及藥物領域，具體是脫氫洛伐他汀在制備抗炎癥性腸病藥物中的應用。
【背景技術】
[0002] 他汀類藥為輕甲基戊二酸單酰輔酶A (3-hydroxy-3-me thy I-glutary I CoA，HMG-CoA)還原酶的特異競爭性抑制劑，可減少膽固醇的生物合成，具有顯著的降脂療效，為降脂 藥物中的首選藥物。并通過改善內皮功能、抗血小板聚集、抑制動脈粥樣硬化等作用降低心 血管病的發病率和病死率。近年來的研究發現他汀類藥尚具有抗炎和免疫調節作用，在許 多風濕、類風濕性疾病及自身免疫性疾病中發揮一定療效。
[0003] 脫氫洛伐他汀(dehydrolovastatin，DLVT)為近年獲得的他汀類家族的新成員，是 洛伐他汀的脫氫衍生物，已獲得國家發明專利授權。兩藥的結構式如下所示。我們前期對 DLVT的急性毒性實驗研究表明，其小鼠灌胃給藥最大耐受量為2000mg · kg^1，相當于洛伐他 汀臨床上成人一天最大劑量的128倍，表明其毒性較低。前期研究表明DLVT除了具有和LVT 一樣的的降脂作用外還對非特異性炎癥及佐劑性關節炎有作用。
[0004] 洛伐他汀立體化學結構式如（1)所示：
[0005]
[0006] 脫氫洛伐他汀立體化學結構式如(2)所示：
[0007]
[0008] 炎癥性腸病（inflammatory bowel disease，IBD)是一種病因和發病機制都尚未 完全明確的非特異炎癥性疾病，包括潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis，UC)和克羅恩病 (Crohn's diseaSe，CD)，是一種遺傳因素、環境因素和免疫因素共同參與的腸道持續性炎 癥疾病。近年來，在世界范圍內，IBD的發病率和死亡率逐年上升。該病病理變化復雜，臨床 癥狀多樣，若未及時得到緩解及治愈，引發為癌變的可能性極大。因此，被世界衛生組織列 為現代難治疾病之一。常用的治療藥物有氨基水楊酸類藥物、糖皮質激素、免疫抑制劑和一 些中藥，但至今尚無理想的藥物，開發標本兼治、安全有效的藥物有著重要的實際價值。
[0009] IBD病因尚未完全闡明，主要是侵及腸黏膜的慢性非特異性炎性疾病，以連續方式 逐漸進展可能與免疫異常、腸道菌群失調、遺傳及精神狀態等多種因素有關。目前認為腸黏 膜免疫功能失調，促炎性細胞因子分泌增多，導致炎癥級聯放大反應是其主要的發病機制。

【發明內容】

[0010]本發明的目的在于提供脫氫洛伐他汀在制備抗炎癥性腸病藥物中的應用，以解決 上述【背景技術】中提出的問題。
[0011] 為實現上述目的，本發明提供如下技術方案：
[0012] 脫氫洛伐他汀在制備抗炎癥性腸病藥物中的應用。
[0013] /七4古公昍進一生fth古安.日、次/4>-、'/丁的古伙化學結構式如下戶斤示：
[0014]
[0015] 作為本發明進一步的方案:脫氫洛伐他汀用于4%DSS誘導小鼠炎癥性腸病的有效 劑量為33.6mg · kg-1 · d-1。
[0016] 作為本發明進一步的方案:所述抗炎癥性腸病中促炎因子包括TNF-a、IL_6與IL-17,抗炎因子為IL-10。
[0017] 與現有技術相比，本發明的有益效果是：
[0018] 本發明通過建立小鼠急性炎癥性腸病模型、觀察脫氫洛伐他汀對抗炎癥性腸病的 治療作用等試驗，探討脫氫洛伐他汀對葡聚糖硫酸鈉誘導的小鼠抗炎癥性腸病的防治作用 及作用機制，首次揭示脫氫洛伐他汀對IL-6、IL-10、IL-17、TNF-a及NF-kB的影響。脫氫洛伐 他汀通過抑制NF-kB信號通路，對TNF-a、IL-6、IL-17等促炎因子表現出明顯的抑制作用，而 可以提高抗炎因子IL-10的水平而發揮抗炎癥性腸病的作用，脫氫洛伐他汀治療炎癥性腸 病具有標本兼治、安全有效的功效。
【附圖說明】
[0019 ]圖1模型組和空白組小鼠體重的變化；
[0020] 圖2 4%DSS誘導小鼠炎癥性腸病活動指數；
[0021] 圖3 DLVT和LVT對4%DSS誘導的小鼠疾病活動指數的影響。
[0022] 圖4 DLVT和LVT對4%DSS誘導的小鼠結腸組織病理學影響(HEX 100)圖，（a)正常 對照，（b)模型對照，（c) SASP，（ d)DLVT，（ e) LVT;
[0023] 圖5 DLVT和LVT對4%DSS誘導的小鼠結腸組織NF-κΒ表達的影響（SPX 200)圖，（a) 空白對照組，（b)模型對照，（c) SASP，（ d)DLVT，（ e) LVT。
【具體實施方式】
[0024]下面將結合本發明實施例，對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述， 顯然，所描述的實施例僅僅是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發明中的 實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都 屬于本發明保護的范圍。
[0025] 實施例1
[0026] -、實驗性抗炎癥性腸病動物模型的建立 [0027] 1材料和方法
[0028] 1.1實驗動物：
[0029] 清潔級昆明小鼠（雄性），體重22-25克，由重慶醫科大學實驗動物中心提供。
[0030] 1.2主要試劑和藥品：
[0031] 葡聚糖硫酸鈉鹽（Dextran sulfate sodium salt，DSS，Mff:36000-50000)(美國MP Biomedicals)
[0032] 大便隱血試劑盒(南京建成生物工程研究所）
[0033] 1.3主要儀器：
[0034] 電子天平
[0035] A2000S型電子分析天平（德國Sartorius)
[0036] Sigma_3k低溫離心機(美國Sigma)
[0037] -80 °C超低溫冰箱(德國）
[0038] UV-225紫外-可見分光光度計（日本）
[0039] BH-2型光學顯微鏡（日本Olympus)
[0040] 1.4溶液的配制：
[0041 ] 0.5%的羧甲基纖維素鈉：
[0042] 4%DSS水溶液的配制:稱取40gDSS溶解于雙蒸水，并定容到1000ml。
[0043] 4%的中性甲醛（10 %中性福爾馬林)溶液的配制：甲醛(40% ) 100mL，無水磷酸氫 二鈉6 · 5g，磷酸二氫鈉4 · Og，蒸餾水900ml。
[0044] 2 方法
[0045] 2.1小鼠炎癥性腸病動物模型的建立：
[0046] 小鼠隨機分組，適應性喂養7天，第8天自由飲用4%DSS水溶液，連續7d。在這期間， 每天定時稱量小鼠體重，進行隱血試驗和觀察糞便性狀。結腸組織取樣:第8天，頸椎脫臼處 死小鼠，剪開腹腔，清理出結腸，剪下距離肛門處Icm剪下結腸2cm(直腸至升結腸），測量長 度。冰冷生理鹽水反復沖洗干凈，用清潔濾紙吸干水分。然后將結腸樣本剪為兩段:直腸端 段(約Icm)置入4°C4%甲醛溶液固定24h，常規石蠟包埋，切片，切片厚約6μπι，ΗΕ染色。余下 部分編號，稱重，用鋁箱包好，立即放入液氮(-196Γ)中速凍，轉入低溫冰箱(-80°C)存放。
[0047] 2.2觀察指標：
[0048] 2.2.1臨床癥狀觀察評分/疾病活動指數，評分標準(表1)。
[0049] 表1DAI評分標準
[0051 ] 2.2.2形態學觀測
[0052] 光鏡下觀察各組標本切片，每組15個視野（X 100, X 200)進行組織學損傷評分，求 其平均值，評分標準見表2。
[0053]表2組織學損傷評分標準

[0055] 2.2.3結腸組織髓過氧化物酶(MPO)活性的測定
[0056] 取結腸組織塊在冰冷生理鹽水中漂洗干凈，干凈濾紙吸干，準確稱重后，立即用眼 科剪子剪碎，置于冰浴的玻璃勻漿器中，加入0.86%生理鹽水后勻漿，按重量體積比為1:9 加勻漿介質制備成10%的組織勻漿。參照試劑盒方法測定結腸組織勻漿中MPO的活性。 [0057] 3統計學處理
[0058]實驗數據用SPSS12.0統計軟件處理，各組資料用（（X土s)表示，采用單因素方差分 析和非參數WiIcox on秩和檢驗，比較各組資料間的差異，P<0.05為差異有顯著性。
[0059] 4結果
[0060] 4 · 1小鼠體重變化
[0061 ] 模型組和空白組小鼠體重的變化見圖1模型組和空白組小鼠體重的變化。可看出 空白對照組小鼠體重增加比較平穩，而模型組小鼠從造模后第三天開始，小鼠體重不僅不 增加反而呈下降趨勢。
[0062] 4.24 % DSS誘導小鼠炎癥性腸病的臨床癥狀
[0063]小鼠臨床癥狀觀察發現:正常對照組小鼠活動、毛色、大小便、生長均正常。模型組 小鼠，在飲用4%DSS溶液2d后，部分小鼠排便出現隱血陽性，4-5d幾乎所有小鼠糞便隱血陽 性，6-7d呈強陽性，甚至血便；同時伴有小鼠活動減少，體重明顯減輕;糞便松軟，或腹瀉發 生，與人類IBD臨床癥狀表現相似，表明4%DSS誘導小鼠炎癥性腸病模型成功。如圖2所示， 4%DSS模型組小鼠，3d后DAI開始出現持續顯著增高。模型小鼠明顯瘦弱，肛門周圍毛色散 亂，有血樣大便的痕跡。
[0064] 4.34%DSS誘導的小鼠炎癥性腸病病理形態學改變
[0065]如附圖3(b)所示，光鏡下觀察DSS模型組小鼠結腸上皮黏膜損傷明顯:黏膜上皮糜 爛，腺體隱窩結構破壞;杯狀細胞丟失，伴有中性粒細胞、淋巴細胞、漿細胞等大量炎性細胞 浸潤。正常對照組黏膜上皮完整，隱窩結構、杯狀細胞正常，見圖3(a)所示。
[0066] 4 · 44 % DSS誘導的小鼠結腸組織中MPO活性
[0067] 模型組的MPO明顯升高，與正常組相比有顯著差異，見表3:4%DSS誘導的炎癥性腸 病小鼠 MPO的活性。
[0068] 表34%DSS誘導的炎癥性腸病小鼠 MPO的活性（5土S:) Luu/u」 ''F<_u. U丄定」^normalgEt:!:牛父。
[0071 ] 5 討論
[0072]據已有文獻報道，DSS可誘導炎癥性腸病。一種為急性期炎癥性腸病模型，方法為 5%DSS水溶液給小鼠自由飲用，連續7天，國內外也有文獻報道用3-5%DSS誘導結腸炎的； 我們在預實驗的時候，曾嘗試對該造模方式加以改進:采用給小鼠5%DSS溶液灌胃（0.8ml/ 只，bidX4d)，但實驗動物并沒有出現任何臨床癥狀，提示出現這種情況有兩種可能：一是 DSS攝入的量不夠，二是這種造模給藥方式，不能在腸腔內維持一定的濃度，產生對上皮組 織的毒性作用。所以，我們基于對預實驗的觀察，以及相關文獻的報道，認為采用灌胃這種 方式給予小鼠 DSS溶液誘導腸炎是不太可能的，因為即使增加 DSS溶液的濃度，采取0.8ml/ 只，每天3次的給藥方式，每天攝入的溶液體積也只有2.4ml，而正常小鼠一般飲水3-6ml/ 天。因此，我們根據預實驗的情況和相關的文獻報道，讓小鼠自由飲用4%DSS溶液，連續7d 造模，誘導實驗性腸炎;通過觀察小鼠臨床癥狀，腸黏膜損傷以及炎性細胞浸潤情況，以疾 病活動指數(disease activity index,DAI)，結腸組織病理學評分和MPO活性評估4%DSS 誘導的小鼠 IBD模型是否成功。MPO是主要存在于中性粒細胞嗜天青顆粒中的一種酶，其活 性反映了中性粒細胞的浸潤數目和活性，已被公認為評價組織炎癥嚴重程度的一個指標。 [0073]預實驗讓小鼠自由飲用5%DSS溶液，第3天臨床癥狀開始出現，如稀便、血便，第4 天開始陸續有小鼠死亡，說明5 % DSS濃度太高。前期研究用3.5 % DSS溶液效果不明顯。 [0074] 實驗結果顯示，模型組小鼠飲用4%DSS溶液3d，開始有糞便出現隱血陽性;4-5d， 小鼠出現活動度明顯減少、體毛凌亂;大便松軟、稠狀;體重減輕，糞便隱血陽性程度增強； 6-7d，可見肉眼血便，有腹瀉發生，小鼠活動、進食及體重明顯減少。光鏡下觀察結腸病理切 片顯示，結腸黏膜上皮糜爛，幾乎全部隱窩結構被破壞，杯狀細胞丟失，部分病灶表面僅少 許上皮殘留。炎癥主要累及黏膜和黏膜下層，少數可達漿膜層;模型組小鼠結腸組織MPO活 性較正常小鼠顯著增高，浸潤的炎性細胞以中性粒細胞為主，伴有單核巨噬細胞，少量淋巴 細胞，單核細胞。在一些病變較輕的部位，可見到部分隱窩破壞、變形，排列紊亂，杯狀細胞 減少。模型組MPO的活性明顯增加。
[0075] 以上提示我們用4%DSS誘導小鼠結腸炎是可靠的，模型是成功的。
[0076] 二、脫氫洛伐他汀對葡聚糖硫酸鈉誘導小鼠實驗性炎性腸病的防治作用研究
[0077] 1實驗材料
[0078] 1.1實驗動物：
[0079] 雄性昆明小鼠，體重22-25克，由重慶醫科大學實驗動物中心提供。
[0080] 1.2主要試劑和藥品：
[00811葡聚糖硫酸鈉(美國MP公司）
[0082]柳氮磺吡啶腸溶片(上海福達制藥有限公司批準文號：國藥準字H31020840)
[0083]大便隱血試劑盒(南京建成生物工程研究所）
[0084]髓過氧化物酶(MPO)測定試劑盒(南京建成生物工程研究所）
[0085] 脫氫洛伐他汀(dehydrolovastatin，DLVT)，由重慶大新藥業股份有限公司提供， 外觀呈乳白色蓬松狀粗粉末，微溶于水。批號：201401001。洛伐他汀（1〇抑5^ &^11，1^1')，由 重慶大新藥業股份提供。批號:201401001。
[0086] IL-6、IL-10、IL-17、TNF-aELISA 試劑盒 R&D 公司
[0087] 1.3主要儀器：
[0088] 電子天平
[0089] A2000S型電子分析天平
[0090] XiangYiH165_W 離心機
[0091] -80 °C超低溫冰箱(德國）
[0092] Rayto RT-6500酶標分析儀 [0093] BH-2型光學顯微鏡（日本Olympus)
[0094] 2 方法
[0095] 2 · 1實驗動物分組：
[0096] 將50只昆明小鼠，雄性，隨機分為5組，即正常對照組(normal )、炎癥性腸病模型組 (model)、陽性藥物（SASP，250mg · kg-1 · d-4、脫氫洛伐他汀(DLVT，33.6mg · kg-1 · d-〇和洛 伐他汀(LVT，33.6mg · kg< · cf1)，每組各10只。各藥物處理組小鼠灌胃相應藥物，正常組和 模型組給予等體積0.5 %的羧甲基纖維素鈉，每日1次，連續給藥IOd，第三天開始，除正常對 照組以外，其余各組自由飲用4%DSS水溶液，每天更換一次，直到實驗結束，見表4動物分組 及給藥方案。
[0097]表4動物分組及給藥方案
[0100] 2.2小鼠炎癥性腸病的評價
[0101]小鼠臨床癥狀觀察發現:正常對照組小鼠活動、毛色、大小便、生長均正常。模型組 小鼠，在飲用4%DSS溶液2d后，部分小鼠排便出現隱血陽性，4-5d幾乎所有小鼠糞便隱血陽 性，6-7d呈強陽性，甚至血便；同時伴有小鼠活動減少，體重明顯減輕;糞便松軟，或腹瀉發 生，與人類IBD臨床癥狀表現相似，表明4 % DSS誘導小鼠 IBD模型成功。4 %DSS模型組小鼠， 3d后DAI開始出現持續顯著增高。模型小鼠明顯瘦弱，肛門周圍毛色散亂，有血樣大便的痕 跡。
[0102] 2.3小鼠血清中細胞因子的檢測
[0103] 給藥第10天，摘除眼球取血。離心取血清，按照ELISA(雙抗體兩步夾心酶聯免疫吸 附法)試劑盒說明書操作，分別檢測小鼠血清中IL-6、IL-10、IL-17、TNF-α水平。
[0104] 具體操作如下：
[0105] (1)準備:標準品稀釋和配制生物素抗體工作液和酶結合物工作液。將濃縮洗滌液 用雙蒸水稀釋（1:20)，加入標準品稀釋液1.0 ml至凍干標準品中（濃度為10ng/ml)，再配成 1000、500、250、125、62.5、31.25、15.625、7.8、0pg/ml 濃度。
[0106] (2)取出冷凍血清解凍，12000\8,311^11。從11^-6、11^-10、11^-17、了嚦-€[試劑盒取出 所需板條，除空白孔外，分別將標本和不同濃度標準品（100μΙ/孔)加入相應孔中，用封板封 住反應孔，37°C孵育90min。
[0107] (3)洗板:甩盡孔內液體，每孔加洗滌液350μ1，靜置30sec，在厚迭吸水紙上拍干， 洗板5次。
[0108] (4)除空白孔外，加入生物素化抗體工作液（100μΙ/孔），用封板膠封住反應孔，37 °C 孵育 60min。
[0109] (5)洗板 4 次。
[0110] (6)除空白孔外，加入酶結合工作液（100μΙ/孔），用封板膠封住反應孔，37°C孵育 30min〇
[0川](7)洗板4次。
[0112] (8)加入顯色劑100μΙ/孔，避光37°C孵育10_20min。
[0113] (9)加入終止液100μ 1 /孔，混勻后在450nm波長處測量OD值。
[0114] 2.4小鼠結腸組織病理形態學觀察及小鼠結腸組織MPO活性檢測
[0115] 結腸組織塊在冰冷生理鹽水中漂洗干凈，干凈濾紙吸干，準確稱重后，立即用眼科 剪子剪碎，置于冰浴的玻璃勻漿器中，加入〇. 86%生理鹽水后勻漿，按重量體積比為1:9加 勻漿介質制備成10%的組織勻漿。參照試劑盒方法測定結腸組織勻漿中MPO的活性。
[0116] 2.5小鼠結腸組織病理檢查
[0117] 結腸組織10 %的甲醛溶液固定，石蠟包埋切片制作的標本，蘇木精一伊紅(HE)染 色，光鏡下觀察組織病理學變化。
[0118] 2.6NF-KB免疫組化染色
[0119] 將石蠟標本作結腸橫截面連續切片，貼附于經多聚氨酸處理過的載玻片上，置入 60°C烘箱過夜。待樣品收齊后，采用免疫組化SP法染色。具體操作步驟下：
[0120] (1)石蠟切片常規脫蠟至水：50°C左右二甲苯I30min，二甲苯Π 30π?η，100%、 95%、85%、70%酒精、蒸餾水各5min，再在蒸餾水中浸泡5min。
[0121] (2) 3 % H2O2室溫孵育IOmin。（以消除內源性過氧化物酶的活性，3 % H2O2臨時配 制。）
[0122] (3)蒸餾水洗 2minX3，PBS 浸泡 5min。
[0123] (4)抗原修復:采用熱修復法。將切片置于盛有抗原修復液(0.0 lM枸櫞酸緩沖液 P H 6.0)的玻璃容器中，放在電爐上加熱，控制溶液溫度維持在9 2 °C - 9 8 °C之間，持續10 -15min。停止加熱后，自然冷卻至室溫（約需20-30min，勿將切片從緩沖液中取出），roS洗 5minX3〇
[0124] (5)滴加正常小鼠封閉血清工作液(試劑1)，室溫孵育20min，傾去，勿洗。
[0125] (6)分別滴加一抗NF_kB(1 :100稀釋），4°C過夜。陰性對照組加 PBS緩沖液作陰性對 照。
[0126] (7)PBS 沖洗 5minX3。
[0127] (8)滴加生物素化二抗工作液:生物素標記羊抗小鼠 IgG，37 °C孵育20min。
[0128] (9)PBS 沖洗 5minX3。
[0129] (10)滴加辣根酶標記鏈霉素卵白素工作液(試劑3)，37°C孵育20min。
[0130] (Il)PBS 沖洗 5minX3。
[0131] (12)DAB顯色劑顯色（用法:取Iml雙蒸水，試劑盒中A、B、C試劑各加1滴，混均后滴 加至切片。顯色劑應避光保存，即用即配），自來水洗3min。
[0132] (13)蘇木素復染30秒(復染時間根據染色情況而定），自來水洗3min。
[0133] (14)浸入分化液3-4秒，自來水充分沖洗，60°C烘箱烤干。
[0134] (15)中性樹膠封片。
[0135] 2.7免疫組化染色切片NF-kB蛋白表達的半定量分析
[0136] 顯微鏡下觀察結腸組織各層的表達情況并攝影記錄。陽性標準:NF-kB以胞質或胞 核部分被染成棕黃(褐)色為陽性；陰性對照:采用PBS緩沖液代替一抗，其余步驟完全相同。 采用GD-8型病理影像多媒體分析系統對各組免疫組化的切片隨機采集，每組至少有3個以 上的動物組織切片，選取10個高倍視野(200 X 10)，測定面積積分光密度值(Area integral optical density，AI0D)顯示被檢測指標的染色強度，即表達量。 A〇D=_陽件積分光密度_ +管壁面積（即隨機選定的視野面積)
[0138] 3統計學處理
[0139] 實驗數據用SPSS12.0在統計軟件處理，各組資料用（X土s)表示，采用單因素方差 分析，比較各組資料間的差異，P<〇.05為差異有顯著性。
[0140] 4 結果
[0141] 4. IDLVT和LVT對4%DSS誘導的小鼠體重的變化
[0142] 模型組小鼠從飲用4%DSS第3天起，與空白組小鼠相比，體重明顯下降；其余各給 藥組小鼠體重的下降趨勢均不及模型組。
[0143] 4.2DLVT和LVT對4 % DSS誘導的小鼠臨床癥狀的影響
[0144] 小鼠臨床癥狀觀察發現:正常對照組小鼠行為活躍，生長正常。模型組小鼠，在飲 用4%DSS溶液2d后，部分小鼠糞便出現隱血陽性，4-5d幾乎所有小鼠糞便隱血陽性，6-7d呈 強陽性，甚至血便；同時伴有小鼠活動減少，體重明顯減輕;糞便松軟，或腹瀉發生，與人類 IBD臨床癥狀表現相似，表明4 % DSS誘導小鼠 IBD模型成功。如圖3所示，DSS模型組小鼠，3d 后DAI開始出現持續顯著增高；SASP阻遏DAI增高，DLVT和LVT有相似的明顯改善DSS誘導的 IBD小鼠臨床癥狀的作用。
[0145] 4.3DLVT和LVT對4%DSS誘導的小鼠結腸組織病理形態學的影響
[0146] 光鏡下觀察DSS模型組小鼠結腸上皮黏膜損傷明顯，黏膜上皮糜爛，腺體隱窩結構 破壞;杯狀細胞丟失，伴有中性粒細胞、淋巴細胞、漿細胞等大量炎性細胞浸潤，見圖4(b)。 SASP、DLVT和LVT組結腸黏膜損傷明顯減輕，上皮結構較完整，腺體隱窩排列較整齊，炎性細 胞浸潤減少，分別見圖4(c)、圖4(d)、圖4(e)。光鏡下觀察各組標本切片，每組15個視野（X 100, X200)按照"表2組織學損傷評分標準"，進行組織學損傷評分，求其平均值，評分結果 見表5 :DLVT和LVT對4%DSS誘導小鼠結腸組織病理形態學的影響。
[0147] 表OTLVT和LVT對4%DSS誘導小鼠結腸組織病理形態學的影響
[0149] **Ρ<〇·〇1 是與 normal 組比較;##Ρ<0·01 是與 model 組比較。
[0150] 4.4DLVT和LVT對4%DSS誘導的小鼠血清中11^-6、11^-10、幾-17、了嚦-〇等細胞因子 影響
[0151] 如表6所示，模型組小鼠血清IL-6、IL-17、TNF_a含量均顯著高于正常對照組(p< 〇. 〇 1)，其余各給藥組小鼠血清IL-6、IL-17、TNF-a含量均顯著低于模型組。模型組小鼠血清 IL-10的含量顯著低于正常對照組，其余各給藥組IL-10的含量顯著高于模型組。
[0152] 表6DLVT和LVT對4%DSS誘導的小鼠血清中IL-6、IL-17、TNF-a的含量的影響G 土 s?n = 10)
[0154] <0.01是與 Normal 組比較;##p<0.01是與 model組比較。
[0155] DLVT和LVT對TNF-α、IL-6、IL_17等促炎因子表現出明顯的抑制作用，而可以提高 抗炎因子IL-10的水平。
[0156] 4. OTLVT和LVT對4%DSS誘導的小鼠結腸組織中MPO的活性
[0157] 小鼠結腸組織MPO活性檢測結果見表7。可見DSS誘導小鼠結腸組織上皮和固有層 中中性粒細胞浸潤顯著增多，MPO活性2.19 ± 0.42U/g，較正常對照組0.92 ± 0.22U/g明顯增 高。SASP明顯抑制中性粒細胞的浸潤和MPO增高(P〈0 · 01)。01^(33 · 6mg/kg)和LVT(33 · 6mg/ kg)亦明顯抑制MPO活性(P〈0.01)。
[0158] 表7DLVT和LVT對4 % DSS誘導的小鼠結腸組織MPO活性的影響
[0161 ] **P〈0 · 01 與 normal組比較;##P〈0 · 01與model組比較。
[0162] 4.6NF-KB免疫組化染色
[0163] 小鼠結腸組織免疫組化染色顯示，正常對照組結腸組織中NF-KB幾乎沒有表達，見 圖5(a)，而DSS誘導模型組小鼠結腸組織中表達NF-kB的陽性細胞數明顯增多，見圖5(b)，呈 棕黃色。SASP組、DLVT組、LVT組小鼠結腸組織中NF-κΒ陽性細胞不僅數量和模型組相比明顯 減少，分別見圖5(c)、圖5(d)、圖5(e)。
[0164] 4.7免疫組化染色切片NF-κΒ蛋白表達的半定量分析
[0165] 顯微鏡下觀察結腸組織各層的表達情況并攝影記錄。采用⑶-8型病理影像多媒體 分析系統對各組免疫組化的切片隨機采集，每組至少有3個以上的動物組織切片，選取10個 高倍視野(200 X 10)，測定面積積分光密度值(Area integral optical density，AI0D)顯 示被檢測指標的染色強度，即表達量。分析結果見表8DLVT和SASP對4%DSS誘導小鼠結腸組 織NF-κΒ表達的影響。 rmw ατ^τλ 陽性積分光密度
[0166] AJOD- ---- 管壁面積（即隨機選定的視野面積） 「01671 丟8m ΛΓΓ和丨ΛΓΓ對4%DS；S；讀導/1、鼠結賜鉑鋇NF-KR丟伏的影晌 LUiOYj . U 丄定·.U
丄·^ . no 定·^moae iaicii 牛乂。
[0170] 綜上所述，4%的DSS誘導的急性結腸炎小鼠 DAI顯著增加、結腸組織出現明顯的炎 癥損傷且組織中MPO活力顯著增加，血清中促炎因子TNF-a、IL-6、IL-17的濃度顯著增加而 抗炎因子IL-IO的濃度顯著降低，結腸組織中NF-κΒ表達也顯著增加。經脫氫洛伐他汀和洛 伐他汀治療后可顯著緩解DSS炎癥性腸病小鼠的DAI、改善結腸的組織學損傷、降低結腸組 織中MPO活性，對TNF-α、IL-6、IL-17等促炎因子表現出明顯的抑制作用，而可以提高抗炎因 子IL-10的水平，還NF-kB信號通路發揮抗炎癥性腸病的作用。
[0171] 三、討論
[0172]近年的基礎和臨床研究發現，他汀類藥物抑制類異戊二稀（isoprenoid)中間體如 異戊二稀焦磷酸法尼酯（farnesy Ipyrophosphate，FPP)和類異戊二稀四異戊二稀焦磷酸 (geranylgeranyIpyrophosphate，GGPP)合成，進而抑制細胞內類異戊二稀依賴的蛋白，發 揮抗心血管重構、抗腫瘤、預防癡呆、抗炎和免疫調節等多種作用，因而對身患代謝性疾病 兼有風濕、類風濕性關節炎和炎癥性腸病具有良好臨床療效。
[0173] 在炎癥性腸病整個病理過程中都有細胞因子參與，它們構成了一個細胞因子網 絡，可以互相調控其產生，其中TNF-a、IL-6、IL-17等為促炎因子，而IL-IO則為抗炎因子。 NF-kB是一類具有多向活性的轉錄調控因子，參與多種基因的表達和調控，在炎癥及免疫反 應、細胞增殖、凋亡和感染等方面起著重要的作用。NF-kB/IkB復合物可被細胞因子(TNF-a， IL-Ιβ)、氧化劑、病毒抗原等多種因素激活，NF-κΒ移位進入胞核，啟動相關基因轉錄。
[0174] 本發明中涉及到的英文縮寫的具體名稱如表9所示。
[0175] 表9

[0178] 對于本領域技術人員而言，顯然本發明不限于上述示范性實施例的細節，而且在 不背離本發明的精神或基本特征的情況下，能夠以其他的具體形式實現本發明。因此，無論 從哪一點來看，均應將實施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本發明的范圍由所附權 利要求而不是上述說明限定，因此旨在將落在權利要求的等同要件的含義和范圍內的所有 變化囊括在本發明內。
[0179] 此外，應當理解，雖然本說明書按照實施方式加以描述，但并非每個實施方式僅包 含一個獨立的技術方案，說明書的這種敘述方式僅僅是為清楚起見，本領域技術人員應當 將說明書作為一個整體，各實施例中的技術方案也可以經適當組合，形成本領域技術人員 可以理解的其他實施方式。
【主權項】
1. 脫氨洛伐他汀在制備抗炎癥性腸病藥物中的應用。2. 根據權利要求1所述的脫氨洛伐他汀在制備抗炎癥性腸病藥物中的應用，其特征在 于，脫氨洛伐他汀的立體化學結構式如下所示：3. 根據權利要求1所述的脫氨洛伐他汀在制備抗炎癥性腸病藥物中的應用，其特征在 于，脫氨洛伐他汀用于4%DSS誘導小鼠炎癥性腸病的有效劑量為33.6mg · kg-i · cfi。4. 根據權利要求1所述的脫氨洛伐他汀在制備抗炎癥性腸病藥物中的應用，其特征在 于，所述抗炎癥性腸病中促炎因子包括TNF-a、比-6與IL-17,抗炎因子為IL-10。
【文檔編號】A61P1/00GK106074500SQ201610536669
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年7月8日
【發明人】鄧慶華, 楊元娟, 楊治國, 唐倩, 夏瀛, 胡清偉
【申請人】重慶醫藥高等專科學校