Sn?38的緩釋結合物的制作方法

Sn?38的緩釋結合物的制作方法
【專利摘要】本發明描述一種SN?38的結合物，其提供最佳藥物釋放速率并最小化相應葡糖醛酸的形成。所述結合物通過β消去機制從聚乙二醇釋放SN?38。
【專利說明】
SN-38的緩釋結合物
技術領域
[0001] 本發明涉及用于抗癌藥SN-38的緩釋系統。
【背景技術】
[0002] 喜樹堿類似物SN-38(7_乙基-10-羥基喜樹堿)是抗癌藥伊立替康(irinotecan)的 活性代謝物。其具有比伊立替康強約1〇〇〇倍的活性，但其因極差水溶性（17uM)和快速清除 而尚未具有治療可用性。
[0003]
[0004] 伊立替康自身可在臨床上使用并且已在白血病、淋巴瘤、結腸直腸癌、肺癌、卵巢 癌、子宮頸癌、胰腺癌、胃癌和乳癌中顯示活性。若干研究已顯示，喜樹堿的抗腫瘤作用總體 上歸功于拓撲異構酶I的抑制，并且功效與保持這種酶的抑制達延長的時間（"抵達標靶時 間（time over target)"）有關。為保持喜樹堿的有效濃度達足夠時間，通常需要投與極高 劑量的藥物來對抗系統中藥物的相對快速清除速率。此導致在投與后早期出現較高的最大 藥物濃度(C max)，其被認為引起毒性，例如作為伊立替康的劑量限制性毒性的威脅生命的腹 瀉。由于SN-38的高效力，因此需要呈延時輸注液形式以足夠抑制拓撲異構酶I但低于毒性 濃度的穩態濃度提供藥物。通過栗使用伊立替康的延時輸注液的臨床試驗已確證了此假 說，然而其并非SN-38的可用治療策略，因為其在給藥調配物中的溶解性差。
[0005] 伊立替康通過肝臟羧酸酯酶轉化為SN-38,然后通過肝臟UGT1A代謝成其10-葡糖 苷酸SN-38G。葡糖苷酸化作用促進膽汁排泄并且腸內細菌葡糖苷酸酶引起SN-38G重新轉化 為SN-38。除非腸內UGT1A使藥物轉化回惰性SN-38G，否則SN-38可對腸造成毒性作用。因此， SN-38G可作為毒性SN-38的來源并且防止由SN-38引起的嚴重腹瀉。總體上，SN-38的高濃度 導致轉化成SN-38G的葡糖苷酸化作用增加、SN-38G到腸內的排泄增加和導致腸胃毒性的細 菌性去葡糖苷酸化。
[0006] 從可溶性長壽命循環結合物中而非從例如伊立替康等前藥中緩釋SN-38似乎提供 了這些問題的解決方案，并且各種結合策略已應用于SN-38。通過氧-20甘胺酸酯結合到聚 (乙二醇）（PEG)(美國專利8，299，089)提供了因酯水解而相對快速地(t 1/2 = 12h)釋放游離 SN-38的相對水溶性結合物。已公開另一連接到多元醇聚合物的可快速釋放SN-38的酯連接 化學物(美國專利公開案2010/0305149 A1)。通過連接到氧-10的酯鍵結合到聚谷胺酸-PEG 嵌段共聚物提供再次通過酯水解釋放游離SN-38的膠束結合物（PCT公開案W02004/ 039869)。歸因于酯在水性介質中的不穩定性，可能受到血漿中的酯酶加速，因此所述用于 SN-38的基于酯的結合策略并不適用于支持SN-38的低劑量、長期暴露，并且SN-38的濃度通 常低于投藥之間的有效濃度。所述結合物通常以高濃度投與，從而得到較高的最大SN-38濃 度并且導致高濃度的SN-38G形成。
[0007] PCT公開案W02011/140393已公開具有更可控釋放速率的PEG-SN-38結合物。這些 結合物通過β消除機制以通過選擇適當連接子而在寬范圍內可控制的速率釋放SN-38。將高 分子偶合到此藥物是通過疊氮基與環狀炔烴的縮合產物，從而產生相對不溶性結合物。本 文要求的亞屬因簡單酰胺鍵的存在而具有改良的溶解性，并且在室溫下在體外緩沖液中穩 定。現已出乎預料地發現，通過適當選擇釋放速率，可降低SN-38G的體內形成，并同時提供 活性SN-38的長期暴露。本發明提供了設計成通過非酶促β消除機制以一定速率釋放游離 SN-38的結合物，所述速率可實現SN-38的低劑量、長期暴露方案并且進一步減少在投與過 程中形成的SN-38G量。

【發明內容】

[0008] 本發明提供了設計成通過非酶促β消除機制以緩慢速率釋放游離SN-38的結合物， 所述緩慢速率可實現SN-38的低劑量、長期暴露方案并且進一步減少在投與過程中形成的 SN-38G量。本發明還提供了用于制造所述結合物的方法和其用于治療特征為細胞過度增殖 的疾病和病癥的方法。
[0009]因此在一個方面中，本發明提供了具有式(I)的結合物：
[0010]
[0011] 其中PEG為平均分子量在20,000Da與60,000Da之間的聚乙二醇，其為直鏈或分支 鏈，并且當q為2到8時，其為多臂；
[0012] q = l 到 8;
[0013] X 為〇、順、（012)^〇(：(=0)(012)^或順(：（=0)(012)^，其中111=1到6;
[0014] R1為CN或S〇2NR22，其中各R2獨立地為烷基、芳基、雜芳基、烷基烯基、烷基芳基或烷 基雜芳基，各者任選經取代，或可連接在一起形成環；
[0015] Y = C0R3或S02R3，其中R3 = 0H、烷氧基或NR42，其中各R4獨立地為烷基、經取代的烷 基，或可連接在一起形成環；以及
[0016] L 為(CH2)r 或(CH2CH2〇)P(CH2)r，其中 r=l 到 10 并且 p=l 到 10。
[0017] 在第二方面中，本發明提供了用于制備式(I)結合物以及其中間物的方法。
[0018] 在第三方面中，本發明提供了使用式（I)結合物緩釋SN-38的方法。
[0019]在第四方面中，本發明提供了通過控制從結合物釋放SN-38的速率，使在投與SN-38后所形成的SN-38葡糖甘酸的量最少的方法。
[0020]在第五方面中，本發明涉及溶解SN-38的包含PEG和DMS0的調配物和其使用方法。
【附圖說明】
[0021 ]圖1展示游離SN-38從本發明結合物的釋放。
[0022]圖2展示一種用于制備本發明的疊氮基-連接子-SN-38(VII)中間物的方法。
[0023]圖3展示一種使用三甲基膦和乙酸在THF/水中使疊氮基-連接子-SN-38(VII)還原 成胺-連接子-SN-38 (VIII)的方法。
[0024]圖4展示一種用于制備本發明結合物(I)的方法，其中R1為CN，Y為C0NEt2，q = 4，X為 CH2，L為(CH2)5，并且PEG為具有季戊四醇核的4臂聚（乙二醇）。
[0025] 圖5顯示一種式（I)結合物的詳細結構，其中R1為CN，Y為⑶NEt2，q = 4，XSCH2，IJ% (CH2)5,并且PEG為平均分子量40,000(n~225)的4臂聚（乙二醇）。
[0026]圖6顯示從本發明結合物釋放SN-38的體外釋放動力學，其中R1為CN，Y為C0NEt2，q = 4，X為CH2，L為(CH2)5,并且PEG為平均分子量40,000的4臂聚（乙二醇）。歸因于10-0加勺電 離作用，SN-38具有pK a~8.6;在形成酚鹽后，SN-38的UV/Vis吸光率最大值位移到414nm。當 通過10-OH結合時，SN-38在414nm下不顯示吸光率。因此，在414nm下的吸光率的增加為從所 述結合物形成游離SN-38的量度。使用在pH 9.4時為0.0025711^1^的一級速率常數將所指示 的曲線與實驗數據擬合。此相當于在pH 7.4時釋放ti/2為450小時。
[0027]圖7顯示在對大鼠（平均n = 3)靜脈內投與200mg/kg結合物（7mg/kg SN-38)后，結 合物（正方形）和從式（I)結合物中釋放的游離SN-38(圓形）的體內含量，其中R1為CN，Y為 C0NEt2，q = 4，X為CH2，L為(CH2)5,并且PEG為平均分子量40,000的4臂聚（乙二醇）。如實例5 中描述，使用體內釋放ti/2 = 400h生成曲線。
[0028]圖8顯示在對大鼠（平均n = 3)靜脈內投與200mg/kg結合物（7mg/kg SN-38)后，從 式（I)結合物中形成的游離SN-38(圓形）和SN-38葡糖苷酸(正方形）的體內含量，其中R1為 CN，Y為C0NEt2，q = 4，X為CH2，L為(CH2)5，并且PEG為平均分子量40，000的4臂聚（乙二醇）。
【具體實施方式】
[0029]在一個方面中，本發明提供了具有式(I)的結合物：
[0030]
[0031] 其中PEG為平均分子量在20,000Da與60,000Da之間的聚乙二醇，為直鏈或分支鏈 且當q為2到8時為多臂；
[0032] q = l 到8;
[0033] X 為〇、NH、（CH2)m、0C( =0) (CH2)m 或NHC( =0) (CH2)m，其中m= 1 到6;
[0034] R1為CN或S02NR22，其中各R2獨立地為烷基、芳基、雜芳基、烷基烯基、烷基芳基或烷 基雜芳基，各者任選經取代，或可連接在一起形成環；
[0035] Y =⑶R3或S02R3且R3 = 0H、烷氧基或NR42,其中各R4獨立地為烷基、經取代的烷基， 或可連接在一起形成環；以及
[0036] L 為(CH2)rS(CH2CH20)P(CH 2)r，其中 r=l 到 10 且 p=l 到 10。
[0037] 術語「烷基」定義為具有1到8個碳原子，或在一些實施例中具有1到6個或1到4個碳 原子的直鏈、分支鏈或環狀飽和烴基。
[0038] 術語「烯基」定義為具有1到6個或1到4個C和一或多個碳碳雙鍵的非芳香族直鏈、 分支鏈或環狀不飽和烴。
[0039]術語「炔基」定義為具有1到6個或1到4個C和一或多個碳碳三鍵的非芳香族直鏈、 分支鏈或環狀不飽和烴。
[0040] 術語「烷氧基」定義為鍵結到氧的烷基，包括甲氧基、乙氧基、異丙氧基、環丙氧基、 環丁氧基和類似基團。
[0041 ]術語「芳基」定義為具有6到18個碳，優選6到10個碳的芳香族烴基，包括例如苯基、 萘基和蒽基等基團。術語「雜芳基」定義為含有至少1個N、0或S原子的包含3到15個碳，優選 含有至少1個N、0或S原子的3到7個碳的芳香族環，包括例如吡咯基、吡啶基、嘧啶基、咪唑 基、噁唑基、異噁唑基、噻唑基、異噻唑基、喹啉基、吲哚基、茚基和類似基團。
[0042]術語響素」包括溴、氟、氯和碘。
[0043] 當基團「任選經取代」時，所述取代基包括1到3個相同或不同且可包括鹵素、氨基、 羥基和硫氫基的取代基，以及包含呈酯、酰胺形式或呈游離羧基形式的羧基的取代基。此目 錄無意涵蓋全部，且任何非妨礙性的取代基都可包括在那些已任選存在的取代基中。
[0044] 如本文使用，除非另作說明，否則「一」、「一個」等意欲指代一者或多于一者。此外， 當提供整數的范圍時，所有中間整數意欲如同特定描述般包括在內。
[0045] PEG可為平均分子量在20，000與60，000 (即包括約400到約1500個環氧乙烷單元） 之間或30，000到50，000之間的直鏈、分支鏈或多臂聚（乙二醇），其中至少一個聚合物末端 可經羧酸酯官能團終止。這些PEG可以衍生物形式購得（例如自N0F和健凱科技有限公司 (Jenkem Technologies)購得），在這些衍生物中，C = 0基團經活化用于與如N-羥基琥?白酰 亞胺等胺或硝基苯基酯或Ν-羥基琥珀酰亞胺基碳酸酯或硝基苯基碳酸酯反應。這些高分子 量PEG由分子量的高斯分布（即多分散)構成，且因此包含環氧乙烷單元數量的分布;其通過 平均分子量描述，平均分子量在本文中意欲涵蓋具有所述平均分子量的工業供應物質中常 見的分子量和環氧乙烷單元的分布。4臂PEG的典型多分散指數(PDI)小于或等于1.1，并以 PDI=MW/Mm計算，其中Mw重量平均摩爾質量，以EMi2Ni/EMiNi計算，Mm數量平均摩爾質量，以 Σ MiNi/ Σ Ni計算，其中在樣本中Μ為物質i的分子量并且N為物質i的數量。可通過所屬領域 中已知的技術，例如凝膠滲透色譜法HPLC或質譜分析（見例如美國專利公開案2010/ 0126866 A1)測量PDI。多臂PEG可從多種核心單元，包括季戊四醇、六甘油和三季戊四醇開 始形成，
[0046]
[0047] 來提供多種配置和臂總數。PEG的至少一個臂是通過連接基團X由羧酸酯官能團終 止以允許連接子-SN-38的連接。X用于將羧酸酯官能團連接到PEG，且因此可為包括0、ΝΗ、 (01 2)以0(：(=0)(012\或順(：（=0)(012)4其中111=1到6)的典型連接基團中的任一者。在本 發明的某些實施例中，X為〇、NH、（CH 2)m或NHC(=0)(CH2)m。在本發明的一個實施例中，X為 (CH 2)m〇
[0048] 在本發明的某些具體實施例中，所述PEG具有40,000±4,000Da(即包含從約800到 1000個總環氧乙烷單元)的平均分子量。在一個實施例中，所述PEG為具有季戊四醇核和40， 000 ± 4，OOODa平均分子量的4臂聚合物，其中各臂因此包含平均225 ± 25個環氧乙烷單元， 并由羧酸酯基終止，并具有式(III)。
[0049]
[0050] 其中n = 200到250且m=l到6。雖然相關的結合物先前已公開于PCT公開案W02011/ 140393中，但我們出乎預料地發現，PEG通過更具親水性的酰胺鍵連接到連接子-SN-38時， 其所提供的結合物具有比先前公開的結合物(其中PEG通過疊氮化物與二苯并氮雜環辛炔 (DBC0或DIB0C)之間的1，3-偶極環加成連接)改善的溶解性和粘度性質。
[0051] L為具有式(CH2)r或(CH2CH20) P(CH2)r的連接基團，其中r=l到10且p=l到10。
[0052] R1為CN或S02NR22，其中各R2獨立地為烷基、芳基、雜芳基、烷基烯基、烷基芳基或烷 基雜芳基，各者任選經取代，或可連接在一起形成環。在一些實施例中，各R2獨立地為烷基。 R1控制結合物釋放SN-38的速率，如PCT公開案W02011/140393和PCT申請案PCT/US12/54293 中所述，這些案件以引用的方式并入本文中。為支持低劑量、長期暴露療程，從結合物釋放 SN-38的速率應使得體內釋放半衰期在約100與約1000小時之間，優選在約300與約800小時 之間，最優選為約400到約500小時。應注意，體內釋放速率可比在pH 7.4，37°C下測得的相 應體外釋放速率快達約3倍。在某些實施例中，R1為CN。在這個實施例中，已測得體外和體內 (大鼠）釋放半衰期為400h。在某些其它實施例中，R 1為S02NR22。在某些特定實施例中，R1為 S02NR22,其中各R2獨立地為甲基、乙基、烯丙基、芐基、2-甲氧基乙基或3-甲氧基丙基，或NR 22 形成嗎啉基、2,3_二氫吲哚基或1，2,3,4-四氫喹啉基。
[0053] Y為使結合物穩定以對抗過早釋放的吸電子取代基。在某些實施例中，Y為C0R3或 S02R3，其中R3 = 0H、OR4或NR42，其中各R4獨立地為烷基、經取代的烷基，或兩個R 4可連接在一 起形成環。在一些實施例中，Y在對位。Y用于穩定連接到SN-38的N-CH2-0，因此使藥物從所 述結合物自發裂解的速率降到最低。在某些實施例中，Y為C0NR 42，且在某些特定實施例中Y 為⑶N(CH2CH3)2、⑶N(CH2CH 2)20或S02N(CH2CH2) 20,其中（CH2CH2)20與N組合為嗎啉基。從β消 除作用和SN-38釋放得到的對氨基苯甲酸酯和對氨基磺酰胺通常認為具有低毒性。
[0054] 在本發明的特定實施例中，提供具有結構(II)的式(I)結合物：
[0055]
[0056] 其中m= 1到6且η= 100到375(即平均分子量在20，000Da與60，000Da或30，000Da到 50，OOODa之間的PEG)。在本發明的更特定實施例中，提供具有式（II)的結合物，其中m= 1到 3。在本發明的甚至更特定實施例中，m= 1且n = 200到250或~225，使得平均PEG分子量為約 40,000〇
[0057]在本發明的另一方面中，提供用于制備式（I)結合物的方法。一種先前在PCT公開 案W02011/140393中公開的用于制備疊氮基-連接子-SN-38中間物的方法展示于圖2中。因 此，例如通過使用光氣或光氣等效物，例如三光氣，在例如吡啶等溫和堿的存在下使中間物 轉化成氯甲酸酯，隨后與苯胺NH 2-C6H4-Y反應，將疊氮醇（IV)轉化成氨基甲酸酯(V)。或者， (V)可通過利用異氰酸酯〇CN-C 6H4-Y處理（IV)來直接形成。隨后使用由瑪朱姆巴(Majumdar) ("含羧酸藥物的N-烷基-N-烷氧基羰基氨基甲基(NANA0CAM)前藥"，生物有機化學與醫藥化 學通訊(Bioorg Med Chem Letts) (2007) 17:1447-1450)所公開的方法的修改，使氨基甲酸 酯（V)進行N-氯甲基化，其中使氨基甲酸酯（V)與多聚甲醛在三甲基氯硅烷和例如四氫呋 喃、1，2_二氯乙烷、二噁烷或甲苯等惰性溶劑的混合物中接觸。在一優選實施例中，所述惰 性溶劑為甲苯。催化劑三甲基氯硅烷以超過(V)l到10倍摩爾超量，優選4倍摩爾超量存在。 所述反應可在20 °C與100 °C之間，優選40 °C與60 °C之間，更優選50 °C的溫度下，在惰性氛圍 下進行，且所述反應進程可通過反應性N-(氯甲基）氨基甲酸酯（VI)轉化為穩定物質而監 控，例如通過將反應混合物的等分式樣稀釋到包含足量三烷胺堿的乙醇中以中和三甲基氯 硅烷，隨后用HPLC分析所得N-(乙氧基甲基)-氨基甲酸酯。
[0058]通過N-(氯甲基)氨基甲酸酯(VI)使SN-38的酚系0H烷基化以產生疊氮基-連接子-SN-38(VII)，展示于圖2中。可使用多種堿以使所述酚去質子化并且因此實現烷基化，包括 烷氧化物，例如第三丁醇鉀(K〇tBu);金屬酰胺，例如雙(三甲基硅烷基酰胺)鋰(LiHMDS);金 屬氫化物;例如NaH;脒，例如1，8-二氮雜二環[5.4.0]^_7_烯(DBU);和磷腈堿。在優選實 施例中，所述堿為ΚΟΙ。首先使含于合適溶劑中的SN-38與堿在-20°C與25°C之間，優選-20 °(：與5°(：之間，更優選4°C的溫度下接觸，以產生酚鹽。隨后使所述酚鹽與N-(氯甲基)氨基甲 酸酯(VI)在-20°C與25°C之間，優選-20°C與5°C之間，更優選4°C的溫度下接觸，以產生疊氮 基-連接子-SN-38 (VII)的溶液。合適的溶劑包括THF、DMF和其混合物。
[0059]如圖3中所示，通過使疊氮化物還原，疊氮基-連接子-SN-38 (VII)轉化為氨基-連 接子-SN-38(VIII)。此還原可通過許多方法達成，包括在例如鈀或鉑等金屬催化劑的存在 下的催化氫解作用;使用膦，例如三烷基膦或三芳基膦的施陶丁格(Staudinger)還原;或在 硅烷存在下的銦還原作用。當使用強堿性三烷基膦，例如三甲基膦時，加入足量酸以緩和所 述反應的堿度，且因此避免β消去連接子過早裂解。在一優選實施例中，使用含于THF/水中 的三甲基膦-乙酸使(VII)轉化為(VIII)。
[0060]如圖4中所示，使胺-連接子-SN-38(VIII)連接到活化的PEG以提供結合物（I)。適 當活化的PEG具有經胺反應性官能團，例如N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)酯、五鹵代苯基酯或硝 基苯酯終止的聚合物鏈以產生其中X不存在的式(I)結合物，和經N-羥基琥珀酰亞胺基碳酸 酯、碳酸五鹵代苯基酯或碳酸硝基苯基酯終止的聚合物鏈以產生其中X為0的式(I)結合物。 或者，在肽偶合劑（例如碳化二亞胺（如DCC或EDCI)或鱗試劑（如Β0Ρ或PyBOP)或脲鑰試劑 (如HATU或HBTU))的存在下，可使用其中聚合物鏈由羧酸終止的PEG。偶合是在水性或無水 條件下（優選無水)在例如乙腈、THF、DMF或二氯甲烷等合適溶劑中進行。在一優選實施例 中，在0與25°C之間的溫度下，于THF溶劑中，使用具有由NHS酯終止的聚合物鏈的活化PEG。 [0061 ]可使用所屬領域中已知的方法純化所得結合物。例如，可通過加入醚性溶劑，例如 乙醚或甲基叔丁醚(MTBE)從反應混合物中沉淀所得結合物。還可通過透析或通過尺寸排阻 色譜法純化所得結合物。
[0062]在第三方面中，本發明提供了使用式（I)結合物緩釋SN-38的方法。在一個實施例 中，從所述結合物中釋放SN-38的半衰期是在100與1000小時之間，優選在300與500小時之 間，且更優選在約400小時。
[0063]在本發明的另一實施例中，提供了提供SN-38的連續、低劑量暴露給需要此暴露的 患者的方法，所述方法包括對所述患者投與本發明結合物。在一更特定實施例中，提供了一 種其中保持游離SN-38的濃度在每周一次投與之間落于15nM與5nM之間的方法。
[0064]在本發明的另一實施例中，提供了一種用于控制在結合物投與之間觀測到的SN- 38的Cmax/Cmin比率的方法。所得的Cmax/Cmin比率在每周一次投與之間小于或等于10,更優選 小于或等于5,且更優選約2.5。
[0065] 如圖6中所示，其中TOG為平均分子量40，000的4臂聚乙二醇（季戊四醇核）的式 (II)結合物「即其中q = 4; X為CH2; R1為CN; Y = C0NEt2; PEG為平均分子量40，000的4臂聚（乙 二醇）；L為(CH2)5的式（I)]在37°C下置于pH 9.4的緩沖液中時，以具有4.5小時半衰期的一 級過程釋放SN-38。已證實，本文使用的β消除連接子顯示依賴pH的一級釋放速率，從而在生 理pH( 7.4)下釋放的相應半衰期可計算為450小時。
[0066]如圖7中所示，當通過靜脈內注射對大鼠投與相同結合物時，游離SN-38釋放，且濃 度對時間曲線與具有約51小時的終末半衰期的結合物的濃度對時間曲線平行。比較其與直 接靜脈內投與SN-38，直接靜脈內投與SN-38顯示在大鼠中7與34分鐘之間的終末半衰期(渥 美以七81111^)等人，"在對大鼠單一靜脈內給與14(：^38后，3138[( + )-(43)-4，11-二乙基-4,9_二羥基-1H-哌喃并[3':6,7]_吲哚嗪并[l，2-b]喹啉-3，14(4H，12H)_二酮](伊立替 康的活性代謝物）的藥代動力學"，生物醫藥公告（Biol. Pharm. Bull. )(1995) 18 :1114-1119;加藤(Kato)等人，"帕尼培南(Panipenem)不改變伊立替康的活性代謝物SN-38和非活 性代謝物SN-38葡糖苷酸（SN-38G)在大鼠中的藥代動力學"，抗癌研究(Anticancer Res.) (2011)31:2915-2922)。因此，本發明結合物顯著延長SN-38的體內半衰期。
[0067] 從結合物釋放的藥物的含量和觀測到的終末半衰期為所述結合物和藥物的藥代 動力學參數的組合的結果，終末半衰期為在簡單一室模型中的結合物消除速率和藥物釋放 速率的總和(桑蒂(Santi)等人，"通過控制從高分子結合物的化學釋放延長治療劑的可預 測且可調整半衰期"，美國科學院院報(Proc.Natl .Acad. Sci.USA) (2012) 109:6211-6216)。 為測定這些參數，使用其中所述結合物分布在兩室之間并可在被清除前釋放游離SN-38的 藥代動力學模型分析數據。為建立結合物自身的清除速率(k el)，對大鼠靜脈內投與類似的 穩定結合物(其中不存在CH2CN的式(II))，并使用兩室模型得到藥代動力學參數。
[0068] 如圖7中所示，濃度對時間數據與結合物（II)以約400小時半衰期體內釋放游離 SN-38-致。在給大鼠單一注射200mg/kg(包含7mg/kg SN-38)的結合物（II)后，觀測到在7 天內，SN-38的血漿含量跨度為210到20nM(即Cmax/C min=10)。所述結合物和相應游離SN-38 的終末半衰期受到所述結合物于大鼠中的相對快速消除速率的限制。PEG結合物的消除速 率為物種依賴性，此歸因于腎臟過濾的差異速率，在小鼠中，40，000-Da PEG的終末半衰期 為約12小時，在大鼠中為24到48小時，在人體內為72到120小時。此外，通常藥物消除速率在 人類患者中比在大鼠中慢(見例如卡德維爾(Caldwell)等人，"藥物發現中藥代動力學參數 的異速生長比例：能否從體內大鼠數據預測人類CL、Vss和tl/2?"，歐洲藥物代謝與藥代動 力學雜志（Eur J Drug Metab Pharmacokinet.)(2004)29:133-143)。因此，預期從式（I)結 合物釋放的SN-38的終末半衰期在人類中比在嚙齒動物中大體上更長，盡管歸因于血液pH 值的稠度，預期藥物從結合物的釋放速率相對不依賴于物種。雖然本發明結合物和游離SN-38 于人類患者中的實際藥代動力學參數未知，但使用異速生長比例估算這些值提供了在人 類患者中Cmax/C min~2.5的估算值，如以下實例5中所述。SN-38前藥伊立替康于人類患者中 的延時輸注已指示，如果SN-38的血漿含量保持在約5nM與15nM之間達延長的時間，那么可 得到最大的功效。因此大鼠藥代動力學數據預示本發明結合物可實現連續低量、有效濃度 的SN-38的釋放。
[0069] 意外地，用式（II)結合物處理大鼠后觀測到的SN-38G含量極低，(^\下3~-386/5~-38彡0.1。這與酯連接的伊立替康結合物處理(C max下SN-38G/SN-38~15;埃爾頓(Eldon)等 人，"NKTR-102(拓撲異構酶抑制劑-聚合物結合物)于罹患晚期實體腫瘤患者中的群體藥代 動力學"，美國臨床腫瘤學會學報(American Society of Clinical Oncology Poster)8E (2011))形成對比，或與酯連接的3^38結合物處理（在(^\下3^386/3^38~1;帕特奈克 (Patnaik)等人，"EZN-2208(新型抗癌劑)于罹患晚期惡性腫瘤患者中：1期劑量遞增研究"， 美國癌癥研究學會學報(American Association for Cancer Research Poster)C221 (2009))形成對比。因此看來，當釋放極緩慢時，SN-38葡糖醛酸化效率較低。依照此假設，當 在大鼠中檢測具有R^PhSO?的結合物時，如預期般觀測到SN-38的較快釋放(t 1/2= 10h)，并 伴隨較高起始濃度的游離SN-38和較高的Cmax下SN-38G/SN-38 = 0.2。
[0070] 因此，在第四方面中，本發明提供了用于通過控制SN-38從結合物釋放的速率，使 投與SN-38后所形成的SN-38葡糖苷酸的量最少的方法。在本發明的一個實施例中，提供了 用于使投與SN-38后所形成的SN-38葡糖苷酸的量最少的方法，其中提供了特征為SN-38釋 放半衰期超過100小時的結合物。在一更特定實施例中，SN-38釋放半衰期在100與1000小時 之間。在一優選實施例中，SN-38釋放半衰期在300與500小時之間。在一更優選實施例中， SN-38釋放半衰期約為400小時。
[0071] 本發明結合物可使用多種所屬領域中已知的醫藥上可接受的賦形劑加以調配，并 可便捷地在具有最適用于結合物穩定性的pH值的水性緩沖液中調配。在本發明的一實施例 中，所述結合物在pH值在4到6之間的水性緩沖液中調配。已出乎預料地發現，所述式（I)結 合物比公開于W02011/140393中的相關結合物在水性緩沖液中明顯更可溶(見以下實例2)， 因此可對需要這些化合物治療的患者實現更大范圍的給藥。
[0072]預期本發明結合物可用于SN-38或SN-38的前藥(例如伊立替康)具有可用性的任 何情況。目前，伊立替康用于治療多種癌癥，包括白血病、淋巴瘤、結腸直腸癌、肺癌、卵巢 癌、子宮頸癌、胰腺癌、胃癌和乳癌，因此可預期本發明結合物可同樣使用。
[0073] 在展示于實例6中的一替代實施例中，當賦形劑包括PEG和DMS0時，SN-38的調配物 提供溶解形式。其尤其適用于例如連續輸注。PEG對DMS0的比率從90:10到10:90變化，但也 可為75:25、25 :75或50:50或其中間值。可用的PEG組分范圍為約PEG100(100)到PEG(600)。
[0074] 除非另外指示，否則所有參考文獻均以全文引用的方式并入本文中。
[0075] ^lj
[0076] 綜述:使用具有二極管陣列檢測的島津(Shimadzu)HPLC系統實施HPLC。反相使用 恒溫在40°C的Phenomenex_?Jupiter 5um 300A4.6X 150mm柱，和在 1 .OmL/min的流動速率 下乙腈于含有0.1 %TFA的水中的20%到100%梯度。尺寸排阻HPLC使用在40°C下以50:50的 乙臆/水/〇 · 1 %TFA運行的Phenomenex?BioSep? S-2000柱。使用e = 22，500M-Vm-1 通過在 乙腈中363nm下UV吸光率，定量含有SN-38的溶液。SN-38從浩瑞(Haorui)(中國）購得。
[0077] 制法 A
[0078] 6-疊氮基-1-己醇
[0079]
[0080] 在溫和回流下加熱6-氯-1-己醇（50 · Og，366mmol)和疊氮化鈉(65 · Og，lOOOmmol) 于400ml水中的混合物，歷時19小時。冷卻到周圍溫度后，用EtOAc3 X 200ml萃取混合物。用1 X 100mL水、1 X 100mL飽和NaCl水溶液洗滌萃取物，然后用MgS〇4干燥，過濾，并蒸發，產生 44.98(86%)無色油。 1!1-匪1?(4001泡，〇0(：13):53.66(2!1，13付，了 = 6!^)，3.27(2!1，^ = 7·2Hz)，1·55-1·66(m，4H)，1·38-1·44(m，2H)。
[0081 ]制法 B
[0082] 6-疊氮基己醛
[0083]
[0084] 向經強力攪拌的在冰上冷卻的6-疊氮基-1-己醇(7.2g，50.0mmol)于100mL二氯甲 烷中的溶液中加入三氯異氰尿酸（12.2g，5 2.5mmo 1)。向所得的懸浮液中滴加 TEMPO (0.080g，0.5 lmmo 1)于2mL二氯甲烷中的溶液。在4 °C下10分鐘后，使懸浮液升溫到周圍溫度 并再攪拌30分鐘。TLC分析（30%Et0Ac/己烷）指示完全反應。使用二氯甲烷使懸浮液濾過 lcm硅藻土墊。用2X100mL 1M Na2C〇3、lX100mL水、lXIOOmL 1 N HC1 和lXIOOmL飽和NaCl 水溶液洗滌濾液，然后用MgS04干燥，過濾，并蒸發以產生9.8g淡橘色油狀物。將其溶解于小 份體積的二氯甲烷中，并使用〇到20%Et0Ac/己烷梯度在Si0 2(80g)上進行色譜分析，得到 6.678(47.3111111〇1;95%)呈無色油狀的醛。 1!1-匪1?(4001抱，〇)(：13):39.78(1!1，^=1.6!^)， 3.29(2H，t，J = 6.8Hz)，2.47(2H，dt，J = 1.6,7.6Hz)，l .59-1.71(m，4H)，1.38-1.46(m，2H)。
[0085] 制法 C
[0086] 7-疊氮基-1-氰基-2-庚醇
[0087]
[0088] 在N2下于-78°C下，向100mL無水THF中加入1.6M正丁基鋰于己烷中的溶液（35mL， 49mmo 1)。在急流中加入乙腈（3 · 14mL，60mmo 1)并強力攪拌，導致形成白色懸浮液。15分鐘 后，使懸浮液升溫到_20°C，歷時超過1小時。冷卻回_78°C后，加入6-疊氮基己醛（6.67g， 47mmol)，得到黃色溶液。將其再攪拌15分鐘，然后使其升溫到-20°C并通過添加20mL飽和 NH4C1水溶液中止。用EtOAc稀釋后，用水、IN HC1、水和飽和NaCl水溶液依次洗滌混合物，然 后用MgS04干燥，過濾，并蒸發，產生8.0g黃色油狀物。將其溶解于小份體積的二氯甲烷中， 并使用〇到40%Et0Ac/己烷梯度在Si0 2(80g)上進行色譜分析，得到6.0g(21.6mmol;84%) 呈無色油狀的產物。4-匪1?(4001抱，(16-0150):55.18(1!1，(1，1 = 5抱），3.69(1!1，111)，3.32(2!1， t，J = 6Hz)，2.60(lH，dd，J = 4.8,16.4Hz)，2.51(lH，dd，J = 6.4,16.4Hz)，1.55(2H，m)，1.42 (2H，m)，1.30(4H，m)。
[0089] 制法 D
[0090] N，N_二乙基4-硝基苯甲酰胺
[0091]
[0092] 于30分鐘內，向經攪拌的冰冷的二乙胺（15.5mL，150mmol)和氫氧化鈉（6 . Og， 150mmo 1)于150mL水中的溶液中滴加4-硝基苯甲酰氯（18 · 6g，1 OOmmo 1)于1 OOmL乙腈中的溶 液。加入完成后，待混合物升溫到周圍溫度并再攪拌1小時。用3X 100mL CH2C12萃取混合物， 并用1 X 100mL水、1 X 100mLl N HC1和鹽水洗滌組合的萃取物。用MgS〇4干燥后，過濾混合物 并蒸發至干，得到結晶塊體。從80/20己烷/乙酸乙酯的再結晶得到20.0g呈淡黃色晶體狀的 產物（90%)。 1!1-匪1?(4001抱，〇)(：13):38.27(2!1，111)，7.54(2!1，111)，3.57(2!1，1^9，了 = 6.8抱）， 3.21 2H，br q，J = 6.8Hz)，1.27(3H，br t，J = 6.8Hz)，1.12(3H，br t，J = 6.8Hz)。
[0093] 制法 E
[0094] 4-(N，N_二乙基甲酰胺基)苯胺
[0095]
[0096] 向經強力攪拌的在冰上冷卻的N，N-二乙基4-硝基苯甲酰胺（20.0g，90mmolWP 1.0g 10 %鈀/木炭于400mL甲醇中的混合物中加入甲酸銨(20.0g，317mmo 1)。所述反應升溫 并伴隨劇烈氣體逸出。1小時后，TLC (60/40己烷/EtOAc)指示起始物質完全轉化。使混合物 濾過硅藻土墊并蒸發，得到結晶固體。將其懸浮于水中并通過真空過濾收集。使產物自水再 結晶并干燥，得到 14.14g(83%)白色晶體。1H-匪R(400MHz，CDCl3)J7.22(2H，m)，6.65(2H， m)，3.81(2H，br s)，3.42(4H，br s)，1.17(6H，t，J = 6.8Hz)。
[0097] 制法 F
[0098] 4-(N，N_二乙基甲酰胺基)苯基氨基甲酸1-氰基-7-疊氮基-2-庚酯
[0099]
[0100] 在惰性氛圍下，向經攪拌的在冰上冷卻的1-氰基-7-疊氮基-2-庚醇（4.60g， 25臟〇1)和三光氣（12.58,42111111〇1)于2001^無水1'冊中的溶液中滴加吡啶（4.011^，50111111〇1) 〇 在冰上攪拌白色懸浮液，歷時15分鐘，然后待其升溫到周圍溫度并再攪拌30分鐘。TLC分析 (60:40己烷/乙酸乙酯）指示起始物質完全轉化成高-Rf產物。過濾并蒸發懸浮液，且用 100mL無水乙醚溶解殘余物，過濾并蒸發，得到呈棕色油狀的粗制氯甲酸酯（4.54g，74%)。 向氯甲酸酯（18.6mmol)和4-(N，N_二乙基甲酰胺基）苯胺（3.858,2〇111111〇1)于10〇1111^無水 CH2C12中的溶液中加入三乙胺(3.5mL，25mmol)。攪拌1小時后，用IN HC1 (2 X )、水(2 X )和鹽 水（1 X )洗滌混合物，然后用MgS04干燥，過濾并蒸發得到油狀物，其在靜置時結晶。用60/40 己烷/乙酸乙酯洗滌結晶塊體。濃縮洗滌物，并使用0到80%乙酸乙酯/己烷梯度在二氧化硅 上進行色譜分析。濃縮產物洗脫液，并與初始結晶物質組合。使組合的產物自1:1的乙酸乙 酯/己烷再結晶以得到呈白色結晶固體狀的氨基甲酸酯(4.4g，2步驟44%)</Η-匪R(⑶Cl 3， 400MHz):δ7.45-7.35(4H，m)，6.888(lH，brs)，5.000(lH，m)，3.52(4H，br)，3.288(2H，t，J= 6.8Hz)，2.841(lH，dd，J = 5.2，17Hz)，2.327(lH，dd，J = 4.4，17Hz)，1.88(lH，m)，1.75(lH， m)，1.63(2H，m)，1.45(4H，m)，1.18(6H，br)。
[0101] 制法 G
[0102] N-(氯甲基)氨基甲酸酯
[0103]
[0104] 在吣氛圍下，將N_(氯甲基)-4_(N，N-二乙基甲酰胺基)_苯基氨基甲酸7-疊氮基-1-氰基-2-庚酯（2.0(^，5.0111111〇1)、多聚甲醛（22511^，5.5111111〇1，1.5當量）、三甲基氯硅烷 (2.5mL，20.0 mmo 1，4.0當量)和25mL無水甲苯的懸浮液置于配備磁力攪拌棒并用橡膠隔膜 帽密封的50mL RBF中。在50°C油浴中加熱所述密封燒瓶，歷時24小時，此時可得到澄清的黃 色溶液。使溶液冷卻到周圍溫度并蒸發。將殘余物再溶解于10mL無水甲苯中，過濾并蒸發， 得到包含殘余甲苯的呈不穩定黃色油狀的粗制N-(氯甲基）-氨基甲酸酯（預期2.68g， 119 % )。將此物質溶解于1 OmL無水THF中并在N2下儲存。通過加入5uL到1. OmL于乙醇中的 4mM N，N_二異丙基乙胺，隨后用反相HPLC分析（Phenomenex Jupiter 300A4.6X 150mm Cis; 1 · OmL/min;于10分鐘內從20 %到100 % CH3CN/H20/0 · 1 % TFA梯度)可證實N-(氯甲基)氨基甲 酸酯的形成。起始氨基甲酸酯在第8.42分鐘時洗脫，并顯示Xmax243nm;產物N-(乙氧基甲 基)_氨基甲酸酯在第8.52分鐘時洗脫并顯示Xmax231nm;未知雜質在第8.04分鐘時洗脫并顯 示Xmax245nm。在240nm下的峰值積分指示約89%的N-(乙氧基甲基）-氨基甲酸酯。iH-NMR (400MHz，CDCl3)j7.39(4H，m)，5.54(lH，d，J=12Hz)，5.48(lH，d，J=12Hz)，4.99(lH，m)， 3.51(4H，br)，3.26(2H，t，J=6.8Hz)，2.79(lH，m)，2.63(lH，m)，1.85(lH，m)，1.73(lH，m)， 1.60(2H，m)，1.43(4H，m)，1.16(6H，br)。
[0105] 制法 H
[0106] 疊氮基-連接子-SN-38 [0107；
[0108] 將SN_38(1.00g，2.55mmol;浩瑞)懸浮于lOmL無水吡啶中，然后在真空下濃縮至干 (浴溫50°C )。用10mL無水THF重復此步驟。在N2氛圍下，將所得淡黃色固體溶解于50mL無水 THF和50mL無水DMF中，然后在冰上冷卻。加入1.0M第三丁醇鉀的THF溶液（2.55mL， 2.55mmol)，形成初始為深綠色然后變為濃稠橘色懸浮液。15分鐘后，加入N-(氯甲基)-氨基 甲酸酯(7.5mL，2.8mmo 1)的THF溶液。在4 °C下15分鐘后，待淡橘色混合物升溫到周圍溫度。1 小時后，HPLC分析(5uL的樣本+lmL的乙腈/0.1%TFA)指示86/14產物/SN-38。用200mL乙酸 乙酯稀釋淡黃色混合物，用2 X 100mL水、100mL飽和NaCl水溶液洗滌，用MgS〇4干燥，過濾并 蒸發。通過用水濕磨油狀殘余物來除去過量DMF，并將殘余物溶解于50mL乙腈中，過濾并蒸 發，得到2.96g黃色玻璃狀物。使用各200mL的己烷、己烷中20 %、40 %、60 %、80 %和100 %丙 酮的分級梯度在Si02(80g)上對殘余物進行色譜分析，得到經純化的疊氮基-連接子-SN-38 (1.66g，81 % )。將所述物質溶解于50mL丙酮中，并攪拌滴加45mL 0.1 %乙酸的水溶液，直到 混合物變得渾濁。攪拌后，分離出固體物質。然后加入另外5mL 0.1%乙酸的水溶液以完全 沉淀。攪拌2小時后，通過真空過濾收集固體，用水洗滌，并干燥，得到1.44g(70%)的淡黃色 粉末。^-NMRHOOMHzADCls) :δ8.15( lH，d，J = 9.2Hz)，7.60(lH，s)，7.48( lH，dd，J = 2， 9Hz)，7.40(4H，m)，7.25(lH，d，J = 2)，5.75(2H，br)，5.73(lH，d，J=16Hz)，5.28(lH，d，J = 16Hz)，5.22(2H，s)，4.99(lH，m)，3.84(lH，s)，3.53(2H，br)，3.53(2H，br)，3.17(2H，t，J= 7Hz)，3.12(2H，q，J = 7Hz)，2.74(lH，dd，J=l，17Hz)，2.54(lH，dd，J = 5，17)，1.86(2H，m)， 1.6(lH，m)，1.46(lH，m)，1.37(3H，t，J = 7Hz)，1.25(6H，m)，1.12(4H，m)，1.02(3H，t，J = 7 · 3Hz)。LC-MS: [M+H] + = 805 · 3 (C44H51N8O8的計算值=805 · 3)。
[0109] 實例 1
[0110] 氨基-連接子-SN-38乙酸鹽
[0111]
[0112] 向疊氮基-連接子-SN-38(1 · 13g，1 · 4mmo 1)和乙酸（0 · 19mL，3 · 3mmo 1)于 1 OmL THF 中的溶液中加入1M三甲基膦的THF溶液(2.9mL，2.9mmo 1)。氣體緩慢逸出。攪拌2小時后，加 入水（1.OmL)并再攪拌混合物1小時。將殘余物分配在乙醚與水之間。用乙酸乙酯洗滌水相1 次，并蒸發所得的澄清黃色水相，得到800mg黃色泡沫。將其溶解于THF中，過濾，并通過UV吸 光率定量，得到包含1.2μπιο1(86%)產物的溶液。ClsHPLC顯示單峰，且LC-MS顯示[M+H] + = 779.3(預期值779.4)。
[0113] 實例2
[0114] 具有m=l且η~225的化合物（III)的SN-38結合物
[0115] 將40kDa 4臂四_(琥珀酰亞胺基-羧甲基）_PEG(健凱科技有限公司；lO.Og， 1 .Ommol HSE)、實例1的氨基-連接子-SN-38乙酸鹽（1 .2mmol)和N，N-二異丙基乙胺 (0.21mL，1.2mmol)于75mL THF中的混合物保持在周圍溫度下。通過HPLC監測偶合進程，其 顯示到90分鐘，反應完成。在總計2小時后，將混合物過濾到500mL經攪拌MTBE中。通過真空 過濾收集沉淀物，用MTBE洗滌，并在真空下干燥，得到呈蠟狀淡黃色固體狀的結合物 (10 · lg，95% )。2·Omg樣本于1 ·OmL水中的分光亮度分析顯示0· 17mM的SN-38，其基于以重量 計的計算值〇.175mM SN-38,此指示96%的結合物負載。C18-HPLC分析指示單一主峰（在 363nm處98%的總峰面積;在256nm處97% )，和0.6mol%游離SN-38。
[0116] 所述結合物在10mM乙酸鈉緩沖液(pH 5.0)中可溶解至丨」1.9mM(85mg/mL)。相反，其 中制法Η的疊氮基-連接子-SN-38已通過三唑鍵連接到PEG4〇kD_(DB⑶）4的相應結合物 (TO2011/140393)僅可溶解到0.7mM(32mg/mL)。實例2結合物的溶解度還在0.2N乙酸鹽緩沖 液中在pH 4和pH 5下以及在0.2N磷酸鹽緩沖液中在pH 6、pH 7和pH 8下測試。在所有這些 pH下，發現溶解度>300mg/ml。然而，當結合物溶解時，pH值會輕微改變，且通常上升高過原 始值。因此，當300mg/ml的結合物溶解于pH 4的緩沖液中時，pH變為4.5;溶解于pH 5的緩沖 液中時，pH變為5.4;溶解于pH 6的緩沖液中時，pH變為6.2;溶解于pH 7的緩沖液中時，pH變 為7.2;溶解于pH 8的緩沖液中時，pH變為7.7。
[0117] 當在室溫下將10mg/ml結合物溶解于pH 4到pH 8的緩沖液中和水中并在室溫下保 持7天時，測試穩定性。通過HPLC測試多種緩沖液中的結合物純度。
[0118] 通常，測得第0天的純度稍小于100%，一般在97%左右。如果在水中在任何測試的 pH下于7天內的測量純度發生任何變化，那么變化很小。
[0119] 實例3
[0120] 體外釋放動力學
[0121 ]在37°C下，將實例2的結合物于0.1M硼酸鈉 (pH 9.4)中的溶液保存于密封的UV比 色皿中。隨時間監測因形成游離SN-38酚鹽所致的在414nm下的吸光率增加。數據與單一指 數Amax*(l-eT kt)擬合提供了結合物在pH 9.4下釋放5^38的速率常數1^，其中4_為在完全反 應時的吸光率。如圖6中顯示，游離SN-38的形成遵循在pH 9.4下1^ = 0.0025711^1^(^/2 = 270min)的一級動力學。由于已知這些連接子的釋放速率在氫氧化物中為一級，因此在其它 口田直下的釋放速率可計算為1^(?!1)=1?4*10 (1^9'4)。因此，3138在?!17.4下的速率計算為 2 · 57 X 10-5min-1，或在 pH7 · 4、37 °C 下 ti/2 = 450h。
[0122] 實例4
[0123] 體內藥代動力學
[0124] 將45mg/ml實例2的結合物于10mM乙酸鈉緩沖液(pH 5.0)中的溶液無菌過濾并以 200mg/kg注射到插管的雌性斯普拉格-道利（Sprague-Dawley)大鼠 （n = 3)中，并定期抽取 血液樣本(〇. 3mL)并立即將其加入到30yL的1M檸檬酸鹽/0.1 % Pl:uronic?F68溶液pH4.5中 以降低樣本pH，凝結并穩定剩余的完整結合物。在2到8°C下以約1，500 X g(力）離心這些樣 本，歷時10分鐘以除去紅細胞并得到約150uL血漿。將血漿分成2個等分試樣并轉移到低溫 小瓶并在分析前儲存于-80 °C的冷凍箱中。
[0125] 為分析，在冰上解凍樣本并與包含8ng/mL喜樹堿作為內標的2份體積乙腈/0.5% 乙酸混合。通過在4 °C下，以16，000 X g離心10分鐘除去沉淀的蛋白質。使用40 °C恒溫的 Phenomenex?30〇Ajupiter 5um 150X4.6mm C18HPLC柱，在 1.0mL/min下使用 100mM磷酸 鈉、3mM庚烷磺酸鹽pH 4.0 (緩沖液A)和75 %乙腈的水溶液(緩沖液B)的梯度分析樣本上澄 液（20uL)。所述梯度由以下組成：5%B等濃度持續3min、20%B等濃度持續3min、自20%到 40%8的線性梯度歷時5111丨11、自40%到100%8的線性梯度歷時2111丨11、100%8等濃度持續 3min、5%B等濃度持續3min。樣本洗脫后為二極管陣列檢測器和熒光檢測器，激發設置在 370nm和對于前9分鐘發射設置在470nm，隨后對于最后10分鐘發射設置在534nm。通過將結 合物（吸光率380nm)和SN-38(熒光Ex :370nm，Em:534nm)的峰面積與標準曲線對比計算濃 度。觀測以下保留時間：SN-38,12.7分鐘;喜樹堿，13.2分鐘;和結合物，14.5分鐘。定量的下 限是在10倍信噪比的峰高度下通過熒光檢測而確定為SN-38:在20μ1經乙腈處理的血漿注 射液中0.07pmo 1 (經乙腈處理的血漿中3.3ηΜ，原血漿樣本中1 ΟηΜ)。結合物:在20μ1經乙腈 處理的血漿注射液中2.1 pmo 1結合物(8.4pmo 1 SN-38)(在經乙腈處理的血漿中為1 ΟΟηΜ結 合物;400nM SN-38,在原始的血漿樣本中為300nM(1200nM SN-38))。
[0126] 為獲得完整結合物自血漿的清除率的信息，使用類似的穩定結合物(其中不存在 CH2CN的式（II))以22mg/kg實施相似實驗。
[0127] 依照普約爾（Poujol)等人，"用于人類血漿和唾液中伊立替康和四種主要代謝物 的靈敏HPLC-熒光方法:藥代動力學研究應用"，臨床化學(Clinical Chemistry) (2003)49: 1900-1908的方法測定SN-38葡糖苷酸的濃度。
[0128] 實例5
[0129] 藥代動力學模型化
[0130] 使用兩相模型（其中C(t) =A*exp(-at)+B*exp(-0t)，其中A+B =劑量/Vd)分析結 合物的血衆濃度對時間的數據。使用非線性回歸分析(奈爾德-米德下坡單向法(此1(161·-Mead downhill simplex))擬合數據，然后依照已建立的程序將參數去卷積以提供室之間 轉移的速率(ludPlm)和結合物從中心室消除的速率(k ei)的估算值。實例2的結合物和相應 穩定結合物(其中CH2CN被Η置換)的數據分析得到表1中的數據。
[0131] 表1
[0134] 使用這些參數，然后基于一種模型（其中結合物以速率常數1^釋放游離SN-38,并 以Kdlst = Vd/V。與第二室達成平衡)擬合游離SN-38的濃度數據。使用以下微分方程通過數值 積分生成模型曲線：[0135] Δ [Cc] = (_ki[Cc]_ki2[Cc]_k ei[Cc] +k2i[CP]) At[0136] A[CP] = (ki2[Cc]-k2i[CP])At[0137] A [Dc] = (ki[Cc]-kci[Dc])/(l+Kdist) A t[0138] Kdist = Vd/Vc[0139] 其中[C。]和[CP]分別為中心室和外圍室中結合的SN-38的濃度，[D。]為中心室中游
[0132]
[0133] 離SN-38的濃度，且速率常數如上所述;Kcl為從血漿消除游離SN-38的速率常數，并允許其在 針對此參數所報告的范圍內變化（1.4-3.51Γ1)。對于120h的時間跨度（Δ t = 0.12h)和初始 條件[C。] = Cmax、[ CP ] = 0和[D。] = 0，實施超過1000步的數值積分。SN-38的分布體積Vd設置 為報告值〇. 18L/kg，而對于結合物V。設置為Vd。
[0140] 如圖7中所示，使用這種方法，擬合結合的SN-38和從結合物釋放的游離SN-38的濃 度對時間數據。當自血漿消除游離SN-38的k ci = 2.771Γ1 (t1/2 = 0.25h)時，與實驗數據相當 一致，完全在所報告范圍內，且當ki設定在0.00173^1時，于體外測量所述值(對于SN-38自 結合物的裂解ti/2 = 400h)。
[0141] 使用這種模型，結合物在其它物種中的行為可在給定在那些物種中kel和kcl的值 下來預測。在人類中，還未報告PEG(k el)和SN_38(kcl)消除的值以及分布體積，但可使用異 速生長比例估算其約為 kei = 0.00871^(11/28011)和 kcFOJh-Htvdh)和 Vss = 0.15L/kg (卡德維爾等人，"藥物發現中藥代動力學參數的異速生長比例：能否從體內大鼠數據預測 人類CL、Vss和tl/2?"，歐洲藥物代謝與藥代動力學雜，志(2004)29:133-143·)。在藥代動力 學模型中使用這些值提供了在給定C max/Cmin~2.5下游離5^38的估算濃度范圍。
[0142] 實施 6
[0143] 用于連續輸注的SN-38的調配物
[0144] SN-38的治療投與因這種藥物的水溶解性差(在水中7mg/L，18uM)而受到限制。研 發一種調配物以克服此限制。為測定SN-38在多種調配物中的溶解度，稀釋115mM SN-38的 二甲基亞砜(DMSO)溶液以在多種調配物中得到15mM、1 OmM、5mM和2mM的目標濃度(表2)。在 周圍溫度下靜置16小時后，通過以14，000rpm離心30分鐘除去沉淀的SN-38。以1:200將上清 液稀釋到l〇〇mM硼酸鹽(pH 10.0)中，并使用ε414 = 22，δΟΟΜΛπΓ1在414nm下用分光亮度法測 定SN-38的濃度。結果于表2中給出。
[0145] 表2
[0146] 調配物中賦形劑體積百分數
[0147]
[0148] 在測試的最高濃度下，調配物E和F中的SN-38保持完全可溶。預期可使用除PEG300 以外的聚乙二醇得到相似優點。另外預期，可使用這些醫藥調配物以通過連續輸注投與醫 藥調配物，保持SN-38連續暴露于需要此種暴露的患者。可通過任何醫藥領域中已知的方法 進行這些連續輸注，例如通過使用輸注栗或通過靜脈滴注。
【主權項】
1. 一種式(I)結合物，其中 PEG為直鏈或分支鏈且當q為2到8時為多臂的聚乙二醇； X為0、NH、（CH2)m、OC( =0) (CH2)mSNHC( =0) (CH2)m，其中m= 1 到6; L為(CH2) r或（CH2CH20) P (CH2) r，其中 r = 1 到 10且p = 1 到 10; R1為CN或S02NR22，其中各R2獨立地為烷基、芳基、雜芳基、烷基烯基、烷基芳基或烷基雜 芳基，各者可任選經取代，或兩個R2可連接在一起形成環； Y為C0R3或S02R3，其中R3 = 0H、烷氧基或NR42，其中各R4獨立地為烷基、經取代的烷基，或 兩個R4可連接在一起形成環；以及 q= 1 到8。2. 根據權利要求1所述的結合物，其中X為(CH2)m。3. 根據權利要求1所述的結合物，其中PEG為平均分子量30，OOODa到50，OOODa的聚乙二 醇。4. 根據權利要求1所述的結合物，其中q = 4。5. 根據權利要求1所述的結合物，其中R1 = CN。6. 根據權利要求1所述的結合物，其中PEG為平均分子量30,0000&到50,0000&的多臂聚 乙二醇;X為 CH2; L為(CH2) 6; R1 為 CN; Y為 CONE t2;且q = 4。7. 根據權利要求1所述的結合物，其具有下式：其中m=l到6且η為200到250。8. 根據權利要求7所述的結合物，其中m為1且η約為225。9. 一種醫藥調配物，其包含根據權利要求1到8中任一權利要求所述的結合物與醫藥上 可接受的賦形劑。10. 根據權利要求9所述的調配物，其中所述調配物的pH值在4.0與6.0之間。11. 一種制備根據權利要求1到8中任一權利要求所述的結合物的方法，所述方法包括 以下步驟： (a) 使式(VII)的疊氮-連接子-SN-38還原以產生氨基-連接子-SN-38; (b) 使所述氨基-連接子-SN-38與活化的PEG接觸以產生根據權利要求1所述的結合物； 和 (c) 任選分離所述結合物。12. 根據權利要求1到8中任一權利要求所述的結合物，其用于提供SN-38的連續、低劑 量暴露給需要此類暴露的患者的方法中，所述方法包括對所述患者投與所述結合物。13. 根據權利要求12所述的結合物，其中在所述方法中，游離SN-38的濃度在每周一次 投藥之間保持15nM與5nM之間。14. 根據權利要求12所述的結合物，其中在投藥之間觀測到的Cmax/Cmin在每周一次投藥 之間小于或等于10。15. 根據權利要求14所述的結合物，其中在投藥之間觀測到的Cmax/Cmin在每周一次投藥 之間小于或等于5。16. 根據權利要求1到8中任一權利要求所述的結合物，其用于控制需要SN-38治療的患 者的血漿中SN-38葡糖苷酸含量的方法中，所述方法包括對所述患者投與所述結合物，其中 所得的SN-38G/SN-38比率小于0.2。17. -種醫藥調配物，其包含含于DMSO和聚乙二醇的混合物中的SN-38。18. 根據權利要求17所述的醫藥調配物，其中所述聚乙二醇為PEG300。19. 根據權利要求17所述的醫藥調配物，其中DMSO比例為50%v/v且聚乙二醇為50%v/ Vo20. 根據權利要求17到19中任一權利要求所述的調配物，其用于對需要連續暴露于SN- 38的患者保持連續暴露于SN-38的方法中，所述方法包括通過連續輸注對所述患者投與所 述醫藥調配物。
【文檔編號】A61K47/48GK106061483SQ201480062543
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2014年10月3日
【發明人】加里·阿什利, 埃里克·L·施耐德
【申請人】普洛林克斯有限責任公司