Aids細胞吸附治療儀的制作方法

Aids細胞吸附治療儀的制作方法
【專利摘要】一種用于醫學領域的AIDS細胞吸附治療儀，其特征在于制備能分離血漿、單個血細胞和因寄居HIV而形成的多核巨細胞的血液和血漿分離器，以外源基因轉染技術制備能結合HIV的CD4+T細胞株，擴增后配制于細胞凍存液，使細胞濃度達80％，灌注高生物相容性材料制成的吸附器，其中的CD4+T細胞株起吸附HIV的作用，吸附器與分離器共同構成體外循環裝置的關鍵部件，當血液流經血液分離器時，含有HIV的多核巨細胞被濾除，進而被血漿分離器分離的血漿流經吸附器時，其中的HIV被吸附細胞吸附清除，凈化后的血漿與血漿分離器所分離的單個血細胞匯合后回輸，從而達到清除血細胞內、外HIV的治療目的。
【專利說明】
A IDS細胞吸附治療儀
技術領域
[0001] 本發明涉及醫學領域中AIDS細胞吸附治療儀的制備及應用，主要用于艾滋病患者 血細胞內、外艾滋病毒的清除，從而達到治療的目的。
【背景技術】
[0002] 艾滋病是由人類免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus，HIV)引起的傳 染病，在全球廣泛流行，根據世界衛生組織(WHO)和聯合國艾滋病規劃署的有關報告，自 1981年美國發現首例艾滋病病例以來，至今全球有208個國家和地區受到了艾滋病的嚴重 威脅，約有4000萬人感染了艾滋病，死亡人數已超過2000萬，每天約有6000人成為艾滋病感 染者，同時每天約有300多人死于艾滋病。在中國HIV感染者正處于高速增長期，目前已遠超 過100萬。艾滋病已經成為繼腫瘤、心腦血管疾病、結核病、糖尿病后又一個人類面臨的重大 感染性疾病，已成為全球關注的嚴重的公共衛生和社會問題。
[0003] 人類免疫缺陷病毒是一種感染人類免疫細胞的慢病毒(Lentivirus)，屬反轉錄病 毒的一種，直徑約120納米，大致呈球形。病毒外膜是類脂包膜(來自宿主細胞），并嵌有病毒 的蛋白gpl20與gpAUgpAl是跨膜蛋白，gpl20位于表面，并與gp41通過非共價作用結合。向 內是由蛋白pl7形成的球形基質(Matrix)，以及蛋白p24形成的半錐形衣殼(Capsid)，衣殼 在電鏡下呈高電子密度，內含有病毒的RNA基因組、酶(逆轉錄酶、整合酶、蛋白酶）以及其他 來自宿主細胞的成分。
[0004] HIV進入人體后，首先被巨噬細胞吞噬，但HIV很快改變了巨噬細胞內某些部位的 酸性環境，創造了適合其生存的條件，不但不被殺滅反而在其內繁殖。因為CD4是HIV的受 體，所以經巨噬細胞內繁殖的HIV通過其囊膜蛋白gpl20并在gp41的輔助下（gp41起著橋的 作用，利用自身的疏水作用介導病毒囊膜與細胞膜融合)進入CD4+細胞(細胞、單核巨噬細 胞、樹突狀細胞等），在細胞內迅速增殖，每天產生1〇 9~1〇1()病毒顆粒，并不斷進入其他正常 的和再生的CD4+細胞內復制，制造更多的病毒感染細胞，使外周血CD4+T細胞持續破壞、減 少。HIV的gpl20與CD4受體結合可直接激活受感染的細胞凋亡，甚至感染HIV的T細胞表達的 囊膜抗原也可啟動正常T細胞，通過細胞表面CD4分子交聯間接地引起CD4+細胞的大量破 壞，結果造成以CD4+T細胞缺損為中心的嚴重免疫缺陷，患者主要表現:外周淋巴細胞減少， T4/T8比例配置，對植物血凝素和某些抗原的反應消失，遲發型變態反應下降，NK細胞、巨噬 細胞活性減弱，IL2、γ干擾素等細胞因子合成減少。CD4+T細胞是最重要的免疫細胞，感染 者一旦失去了大量CD4+T細胞，整個免疫系統就會遭到致命的打擊，對各種疾病的感染都失 去抵抗力。HIV進入宿主CD4+細胞后也可以表現為長期潛伏而不表現出臨床癥狀，其基因組 RNA反轉錄成雙鏈DNA，與病毒整合酶進入宿主細胞核內，在整合酶的作用下，雙鏈DNA整合 到宿主細胞基因組內，被整合的病毒DNA稱為前病毒，可潛伏數月甚至多年不復制，造成 AIDS數月至多年的潛伏期。在AIDS的潛伏期，HIV主要在淋巴結的巨噬細胞和樹突狀細胞內 繁殖，這些細胞是體內的HIVIC存庫，可釋放至外周血或轉染外周血中的CD4+T細胞，有絲分 裂原、抗原、TNF、IL-2和淋巴素(LT)都能激發HIV前病毒基因在感染的CD4+T細胞內轉錄復 制。經大量增殖后，HIV病毒顆粒不斷從被破壞的感染細胞釋放并游離于血液，然后再進入 其他細胞繼續感染過程。
[0005] HIV感染后可刺激機體生產囊膜蛋白（Gpl20，Gp41)抗體和核心蛋白（P24)抗體。在 HIV攜帶者、艾滋病病人血清中測出低水平的抗病毒中和抗體，其中艾滋病病人水平最低， HIV攜帶者最高，說明該抗體在體內有保護作用。但抗體不能與單核巨噬細胞內存留的病毒 接觸，且HIV囊膜蛋白易發生抗原性變異，原有抗體失去作用，使中和抗體不能發揮應有的 作用。在潛伏感染階段，HIV前病毒整合入宿主細胞基因組中，因此HIV不會被免疫系統所識 另IJ，所以僅依靠自身免疫功能無法將其清除。另外一個很重要的原因應該是，根據抗體殺 滅、清除抗原的機理推測，免疫性抗體與抗原結合后，如果要產生免疫效應，要么通過激活 補體，介導ADCC效應溶解細胞性抗原，但HIV不是細胞性抗原；要么通過趨化作用吸引吞噬 細胞吞噬清除抗原，但HIV反而在吞噬細胞內被保護、增殖;要么抗體與抗原結合起中和作 用，使之失去感染力，但HIV抗原結構多變，往往使抗體難以識別。
[0006] 從目前已用于臨床的艾滋病治療方法看，效果不那么理想：（1)HIV逆轉錄酶抑制 劑:僅能防止尚未感染HIV的易感細胞感染，對已感染的細胞沒有治療作用，且毒副作用較 多，包括腺粒體毒性、骨髓抑制、紅細胞性貧血、粒細胞和血小板減少、胰腺炎，加之交叉耐 藥性的產生，這類藥已不單獨使用，主要做聯合用藥，且易產生耐藥變株，導致臨床療效下 降或失效。（2)HIV蛋白酶抑制劑：易產生藥物性肝損傷、脂質代謝紊亂等毒副作用及耐藥 性。（3)HIV整合酶抑制劑:通過抑制HIV病毒DNA與宿主細胞DNA整合而發揮作用，與HIV逆轉 錄酶抑制劑和蛋白酶抑制劑聯合同時使用對抗病毒有協同作用。（4)抑制HIV病毒進入抑制 劑:包括阻斷gpl20與CD4結合、阻斷HIV與輔助受體結合、作用于gp41膜亞單位及作用于T淋 巴細胞表面CC趨化因子受體5(CCR5)來阻斷HIV進入宿主細胞，但對肝和心臟有副作用。（5) 細胞因子治療：主要用于調節T細胞動態平衡。（6)HIV疫苗治療：由于HIV的特殊性，如固有 免疫不足以抵御HIV及其靶向破壞免疫系統，病毒突變迅速，導致至今尚未開發出真正安全 有效的疫苗。（7)基因治療:HIV基因治療的研究從未間斷，包括反義技術、RNA誘餌、RNA干 擾、細胞內抗體、顯性陰性突變體、自殺基因等，但進入II期臨床試驗階段的基因療法幾乎 沒有。（8)單克隆抗體被動免疫療法:通過下調CD4+T細胞表面CCR5來降低HIV的易感性、延 緩艾滋病的進展和減少HIV的擴散，中和單克隆抗體2G12、2F5和4E10應用于HIV感染者具有 良好的耐受性和安全性，能延緩但不能阻止病毒的反彈(9)過繼性免疫細胞治療:體外大量 培養HIV自體的CD4+T細胞時會導致病毒大量擴增，增加病毒感染的CD4+T細胞數量，而回輸 CD4+T細胞可能會增加體內病毒復制的場所，導致病毒載量反彈，總體上看，過繼性免疫細 胞治療無明顯的毒副作用，也未取得滿意的治療效果。
[0007] ⑶4分子是HIV的受體，HIV易感于⑶4+T細胞，⑶4+T細胞是T淋巴細胞的一種，平均 壽命一般為7天左右，但某些T細胞特別是經永生化成細胞系(株)后可長期存活、無限擴增。 國外文獻報道，猴腎病毒40(SV40)可以使某些人類細胞發生永生化。Poulin DL、Kung AL和 Sullivan CS等研究表明，SV40T抗原基因的導入能加快轉化細胞的生長速率，永生化細胞 在體外多次傳代后，仍具有相對穩定的增殖特性和功能狀態，同時也能保留其原始細胞的 許多分化表型。Rei lly用猿猴病毒大T抗原基因轉化來建立血管平滑肌細胞株，構建細胞 模型以研究肝素對血管平滑肌的抑制作用機制。Su等利用經SV40轉化的角化上皮細胞株， 構建細胞模型來分析上皮細胞內蛋白質合成的調控作用。Miquel等用SV40轉化的角化上皮 細胞株，作為細胞模型研究層粘連蛋白5介導的細胞粘附作用。Webber等用經SV40轉化的前 列腺上皮細胞株作為細胞模型來研究前列腺上皮細胞的生理功能和分泌功能。Racusen等 用經Adl2-SV40轉化腎小管上皮細胞模型來研究近曲小管的損傷和疾病。Hougton等用SV40 轉化建立骨髓基質細胞株作為細胞模型以研究在一定培養條件下，細胞具有向脂肪細胞和 成骨細胞的雙向分化的潛能，進一步研究骨質疏松的機制。國外研究還表明，導入外源性人 端粒酶逆轉錄酶(hTERT)可以使細胞保持正常表型及分化特征。近年來已利用hTERT成功建 立了某些細胞的永生化細胞系，基本保持染色體穩定、分化正常、接觸抑制、無致瘤性等相 對正常的生長特征。在口腔醫學領域，日本學者Kamata、Fu j i ta和Fu j i i轉染hTERT建立了永 生化人牙齦成纖維細胞、牙周細胞、牙髓細胞系和牙囊細胞系，細胞群體倍增數達150次以 上，細胞均表現原有的生物學特性，誘導培養后都可以表達來源細胞的相關蛋白。Kitagawa 等轉染hTERT建立了人成牙骨質細胞系，細胞倍增達200次以上，細胞分化標志物如堿性磷 酸酶、I型膠原等表達穩定。因研究工作的需要，幾乎每種疾病都有各自的細胞模型。如糖尿 病細胞模型、癌細胞細胞模型、轉基因細胞模型、絕經期綜合癥細胞模型、子宮內膜細胞模 型、癲癇細胞模型、電子細胞模型、酒精性癡呆細胞模型、腦水腫細胞模型等。所以，可制備 CD4+T細胞株，經大量培養后，用于制備治療艾滋病的吸附器，以CD4+T細胞吸附HIV和產生 細胞因子來治療艾滋病患者。
[0008] 凝膠中抗原-抗體沉淀反應于1905年首先應用于研究利澤甘氏現象，1932年應用 于鑒定細菌菌株，1946年Oudin在試管中進行免疫擴散試驗，用于分析抗原混合物，1948年 Elek和Ouchterlony分別建立了瓊脂雙向雙擴散法，用于同時鑒定、比較兩種以上抗原或抗 體。凝膠中抗原-抗體沉淀反應的介質凝膠瓊脂或瓊脂糖是一種含有硫酸基的多糖體，高溫 時能溶于水，冷后凝成凝膠，內部形成一種多孔的網狀結構，而且孔徑很大，可允許大分子 物質(分子量可達百萬以上）自由通過。孔徑的大小還決定于瓊脂濃度，瓊脂濃度大，孔徑相 對較小，瓊脂濃度小，孔徑相對較大。1%瓊脂凝膠的孔徑約為85nm，由于瓊脂或瓊脂糖具有 很好的化學穩定性，凝膠后含水量大，透明度好，來源方便，易處理，因此是一種很好的擴散 介質。抗原和抗體的分子量一般都在20萬以下，在凝膠中從高濃度區域向低濃度區域擴散 時所受的阻力很小，基本上呈自由擴散形式。當抗原與相應抗體經擴散后在凝膠中相遇，形 成抗原抗體復合物，若兩者在相遇處比例適當，則形成最大的復合物。由于復合物的分子量 增大，顆粒增大，因而不再繼續擴散而產生沉淀，呈現出線狀或帶狀，這種沉淀就形成了一 個"特異性屏障"，凡在免疫學上與其相同的抗原或抗體分子不能通過，而性質不同的那些 分子可以通過這個屏障而繼續擴散，直到形成它們自己的復合物為止。此種反應稱為瓊脂 凝膠或免疫擴散，是目前用已知抗體檢測未知量相應抗原的常規實驗診斷項目，也是《中國 藥典》2010版中規定用于流感病毒疫苗血凝素含量檢測的標準方法。通常將一定量的羊抗 人Ig抗血清成分混合于瓊脂凝膠中，制成含有特異性羊抗人Ig抗血清的瓊脂板，待凝固后 打孔，并在相應孔中加入待檢人血清（IgG，IgA，IgM等），使待檢血清在瓊脂板中向四周擴 散，在抗原和抗體濃度比例合適處發生結合，形成肉眼可見的白色沉淀環而不再擴散。由此 可見，當一種溶液通過半固體凝膠時，其中的大分子溶質就被分子篩作用的凝膠孔阻留在 凝膠中，特別是其中的抗原能被預先固定在凝膠中的抗體結合而被吸附在凝膠中。
[0009] 總之，各種藥物及生物制品無法有效殺滅體內的艾滋病毒，且價格貴，副作用大， 至今尚無治療艾滋病的有效方法，已成為久攻不克的世界性難題。

【發明內容】

[0010] 為了解決久攻不克的艾滋病治療領域的世界性難題，本發明人提出了本發明。
[0011] 本發明的目的是要提供AIDS細胞吸附治療儀;另一目的是要提供AIDS細胞吸附治 療儀的制備及應用方法。
[0012] 本發明的目的是這樣實現的：制備能濾除多細胞結合而成的含有HIV的大體積細 胞的血液分離器及能分離單個血細胞和血漿的血漿分離器，以外源基因轉染的方法構建 CD4+T細胞株和/或以CD4+T細胞表面特有分子抗體作為細胞生長刺激劑擴增，取CD4+T細胞 株配制于細胞凍存液，灌注高生物相容性材料制成的能防止細胞及其碎片濾出并能為細胞 株吸附HIV提供場所的細胞吸附器，其中CD4+T細胞株被固定在吸附器中，起吸附HIV的作 用，所制備的艾滋病細胞吸附器進而與血液、血漿分離器組合并附加計算機調控程序而制 備AIDS細胞吸附治療儀，體外循環中的血液被治療儀中的血液分離器濾除大體積的多核巨 細胞，進而被血漿分離器分成血漿和單個血細胞，血漿經吸附器濾除HI V后與單個血細胞匯 合后回輸。
[0013] 本發明以血液、血漿分離器和細胞吸附器為主件構成，其中血液分離器的孔徑為 150~250ym、50~150ym、15~40ym、8~15ym、5~8ym、3~5ym、1~2ym，能濾除血液中因感染 HIV而形成的多核巨細胞或多細胞聚合體，血漿分離器能分離中等體積的單個血細胞和血 漿，吸附器中的吸附劑由CD4+T細胞株制成，配制于細胞凍存液后便于長期低溫保存備用， 因 CD4+T細胞表面的CD4分子是HIV的受體而成為HIV的易感細胞，與HIV相遇時能吸附HIV， 被吸附的HIV隨⑶4+Τ細胞被固定于吸附器中，且吸附器出口處特制的篩網也具有阻留HIV 的作用，所以在艾滋病細胞吸附治療的體外循環中，含有大量HIV的大體積細胞首先被血液 分離器濾除，而血漿中游離的HIV被細胞吸附器清除，凈化后的血漿與中等體積的單個血細 胞匯合后回輸，從而清除結合在細胞表面和細胞內的HIV以及游離于血漿的HIV，以實現以 體外濾除HIV的方法替代長期以來無法有效殺滅HIV的常規體內抗逆轉錄藥物治療方法。
【具體實施方式】
[0014] 圖1是根據本發明提出的AIDS細胞吸附治療儀的應用示意圖。
[0015] 圖2是根據本發明提出的血液分離器的內部結構示意圖。
[0016] 圖3是根據本發明提出的血漿分離器的內部結構示意圖。
[0017] 圖4是根據本發明提出的細胞吸附器的內部結構示意圖。
[0018] 圖1中，動脈血路管（1)的一端與動脈血管相連通，另一端經肝素和血液栗(2)與含 有廢液出口（5)的血液分離器(3)相連，血液分離器(3)經血液出口（4)、血液栗(6)、循環管 路(7)與血漿分離器(8)相連，血漿分離器(8)的血漿出口經血漿栗(9)和血路管（10)與兩個 并聯的吸附器（11)和吸附器（12)相連，兩個吸附器的出口管路（13)與血漿分離器(8)的血 細胞出口管路（14)匯合后經靜脈管路（15)匯流體循環。
[0019] 圖2表示圖1中的血液分離器(3)的內部結構。圖2中，分離器（1)的內腔(2)的管壁 上有很多微孔(3)，多核巨細胞(4)不能濾過微孔(3)而被阻留在內腔(2)，從而可被清除，能 通過微孔(3)的中、小體積的單個血細胞(5)進入外腔(6)，然后經出口（7)流出，進而經圖1 所示的血漿分離器(8)分離出血細胞和血漿。
[0020] 圖3表示圖1中的血漿分離器(8)的內部結構。圖3中，1是血漿分離器，2是血漿分離 器內腔，3是血漿分離器內腔管壁上的微孔，4是不能通過微孔(3)的單個血細胞，5是能通過 微孔(3)的血漿化學成份，6是血漿分離器外腔，7是血漿流出口，8是具有可開關閥門的血細 胞出口。
[0021] 圖4中，1為吸附器，2為固定于吸附器中的⑶4+T細胞株，3為與血漿一起進入吸附 器的HIV，4為HIV被固定于吸附器中的⑶4+T細胞株吸附后不再下移的結合物，5為⑶4+T細 胞株產生的細胞因子。
[0022 ]下面結合圖1、圖2、圖3和圖4,對本發明提出的AIDS細胞吸附治療儀的實施方案作 詳細的描述。
[0023] 一、⑶4+T細胞株的制備
[0024] 1、主要試劑與儀器:CD4、⑶8免疫磁珠(德國美天旎生物技術有限公司）；異硫氰酸 熒光素 CD4-FITC、CD8-FITC、IgGl-FITC(Immunotech公司）；淋巴細胞分離液(上海恒信生化 試劑有限公司）；乙二胺四乙酸(EDTA)、0.2%臺盼藍染色液(上海生工生物工程技術服務公 司）；新生牛血清(Hyclone公司）;MiniMACS磁力分離系統(德國美天旎生物技術有限公司）； EpicsXL型流式細胞儀(美國BeckmanCoulter公司）。
[0025] 2、單個核細胞(PBMC)的分離(密度梯度離心法）：取自血液中心貯存的新鮮血或新 生兒廢棄的臍帶血，取其中20mL血樣(500IU/mL2mL肝素鈉抗凝)抗凝，PBS液將血液稀釋2~ 3倍，充分混勻后將6mL抗凝血用滴管沿管壁緩慢疊加于已加入4mL淋巴細胞分離液的10mL 離心管中水平離心機中水平離心(400r/min，20 °C) 35min;離心后管內分為3層，上層為血衆 和PBS液，下層主要為紅細胞和粒細胞，中層為淋巴細胞分離液，在上、中層界面處有一以單 個核細胞為主的白色云霧層狹窄帶為PBMC，用毛細吸管插到云霧層，吸取PBMC置入另一 50mL離心管中，加入5倍以上體積PBS離心（300r/min，20°C ) lOmin，棄上清50mLPBS重懸細 胞，離心（350r/min，20°C ) 15min，棄上清，加入Buf f er(PBS+0 · 5 %新生牛血清+2mmol/ LEDTA，pH7.2) 2mL重懸細胞，取15uL細胞懸液加入血球計數板上顯微鏡下計數4個大方格內 的細胞（PBMC)總數。③CD4+T細胞和CD8+T細胞的分離純化：PBMC細胞懸液均分至兩個 1.5mLEppendorf管，離心（300r/min，20°C) lOmin，棄去上清，重懸細胞每 80uLBuffer 含細胞 數1〇7個，每1〇7個細胞加20uLCD4MicroBeads或CD8MicroBeads，充分混勻，在4~8°C孵化 15min，用 lmLBuf f er 洗滌細胞，離心（300r/min，20°C) lOmin，棄去上清 500uLBuf f er 重懸細 胞，將MS分離柱放置在MACS分離器的磁場中，以500uLBuffer漂洗，將500uL細胞懸液通過分 離柱，用500uLBuff er沖洗分離柱重復操作3次，收集流出液，流出液中含非CD4+T淋巴細胞 或非CD8+T淋巴細胞，自分離器中取出分離柱，用1000uLBuffer加壓沖洗分離柱，收集流出 液，此為⑶4+T淋巴細胞或⑶8+T淋巴細胞(細胞活力檢測:細胞純化前后分別取15uL細胞懸 液與等體積臺盼藍溶液混合，顯微鏡下觀察不著色發亮者為活細胞，著色脹大者為死細胞， 計算200個細胞中活細胞的百分比）。
[0026] 3、體外擴增CD4+T細胞
[0027] 有文獻報道利用T細胞表面CD3分子的單克隆抗體作為細胞生長的刺激劑，大量培 養艾滋病患者分離的T細胞后，作為自身治療性細胞回輸。但HIV也隨著HIV感染細胞的培養 繁殖而在胞內增殖，增量T細胞的回輸也導致了增量HI V的回輸。本發明以SV40和/或hTERT 永生化CD4+T細胞，并以CD3單克隆抗體為細胞生長刺激劑，大量擴增CD4+T細胞。
[0028]以CD3單克隆抗體為細胞生長刺激劑的方法是:將抗CD3單抗(CD4+T細胞同時含有 CD3分子)包被到培養板上刺激單個核細胞(淋巴細胞)生長，稱為抗CD3抗體包被法，可獲得 很好的擴增效果，應用這種方法擴增的淋巴細胞已用于腫瘤的二期臨床治療并取得了一定 的療效。國外文獻報道[Shimizu等]亦用此方法培養了 5例晚期艾滋病患者的淋巴細胞，培 養4周就可獲得1000倍的擴增，且擴增的細胞群中CD4+/CD8+T均可大量擴增(CD4+T細胞更 明顯）。另一種是抗⑶3/⑶28雙抗交聯法，即將抗⑶3/⑶28雙抗交聯于滋珠上作為刺激劑培 養HIV感染者外周血單個核細胞(淋巴細胞），可以擴增大量的CD4+T細胞，并且擴增的CD4+T 細胞具有對抗HIV感染的能力，其培養過程中病毒也低于檢測水平，之后發現這可能與CD28 提供了第二信號，選擇性誘導分泌大量的Thl細胞因子和趨化因子有關，用此方法擴增的 CD4+T細胞已用于HIV感染者的臨床治療回輸，無風險但效果一般。
[0029] 以hTERT永生化CD4+T細胞的方法是：以內切酶EcoR I和Xho I雙酶切質粒pCIneo-hTERT和載體pLXSNneo,以Ligation Mix連接經PCR擴增、凝膠電泳分離的hTERT和pLXSNneo 酶切產物，構建pLXSNneo-hTERT重組子，轉化DH5a感受態細胞以擴增、純化并挑取耐氨芐青 霉素菌落抽提質粒，以脂質體轉染法導入離體傳代呈對數生長的T淋巴細胞，使重組子與細 胞的DNA整合，并擴大培養經G418篩選的陽性重組子的克隆，篩選細胞形態、生長曲線、染色 體核型、裸鼠致瘤試驗、轉染細胞端粒酶活性、hTERT mRNA表達產物、免疫組織化學染色、細 胞增殖周期及細胞凋亡率符合永生化細胞特性并與原代細胞相同或相近者作為hTERT永生 化的⑶4+T細胞。
[0030] 以SV40永生化⑶4+T細胞的方法是：以T4 DNA連接酶連接同時經BamHI酶切的 pcDNA3. 1(-)DNA和PCR擴增、瓊脂糖凝膠電泳分離的SV40LTag DNA，構建SV40LTag-pcDNA3.1(-)重組質粒，轉化DH5a大腸桿菌感受態細胞以擴增、純化并挑取耐氨芐青霉素的 菌落抽提質粒，以脂質體轉染法導入體外培養的T淋巴細胞，使重組子與細胞的DNA整合，以 G418篩選的含陽性重組子的細胞，作傳代、擴大培養，篩選細胞形態、細胞生長曲線、染色體 核型、裸鼠致瘤試驗、轉染細胞DNA中SV40大T基因檢測、mRNA表達產物測定及DNA序列測定 結果符合永生化細胞特性并與原代細胞相同或相近者作為SV40永生化的CD4+T細胞。
[0031] ①以hTERT永生化CD4+T細胞的具體方法
[0032] (I )hTERT的提取：（i)酶切pClneo-hTERT: hTERT位于質粒pClneo-hTERT的EcoRI與 Sail位點之間，pLXSNneo載體多克隆位點(MCS)含EcoRI與Xhol酶切位點。市售購買pCIneo-hTERT質粒，溶解于適量的超凈H 20或TE緩沖液中，加2uL10 X酶切緩沖液和18uL H20,加限制 性內切酶EcoR I和Xho I各0.5ul，37°C溫育lh，75°C加熱15min，滅活酶，加入5uL電泳加樣 緩沖液(也可通過加入0.5mol/L EDTA)終止反應，按常規PCR法擴增hTERT后，收取擴增物以 備電泳。（ii)hTERT電泳:取電泳級瓊脂糖以電泳緩沖液配成10%瓊脂糖凝膠，倒入已封好 的凝膠灌制平臺上，插上樣品梳，待膠凝固后從制膠平臺上除去封帶，拔出梳子，放入加有 足夠電泳緩沖液的電泳槽中，緩沖液高出凝膠表面大約1mm，用適量的10 X加樣緩沖液制備 hTERT1酶切樣品，然后用移液器將樣品加入樣品孔中，并同時做合適的標準對照物，接通電 極，使hTERT向陽極移動，然后在l-10V/cm(80V)凝膠的電壓下電泳至足夠分離hTERT片段的 距離時（30min)，關閉電源。（i i i )hTERT純化與回收:從瓊脂糖中分離hTERT條帶:在長波紫 外光源下將含目標hTERT片段的凝膠條帶切下裝入透析袋中，向透析袋內加入2ml電泳緩沖 液，使之浸沒凝膠，并排空汽泡，將透析袋水平放入電泳槽(長度方向與電泳平行），加入適 量緩沖液將透析袋浸沒(約6-7mm)，接通電源，150伏電洗，在紫外燈下觀察待hTERT全部移 出凝膠，改變電場方向繼續通電1分鐘，從透析袋中吸出緩沖液于l-5ml Eppendorf管中，加 入1.5倍體積正丁醇，混勻抽提去EB，在臺式離心機上最高速2分鐘，吸去上層正丁醇溶液， 如此重復二次，自下層hTERT的溶液中加入等體積酚氯仿（2個）抽提2次，上清轉入另一 Eppendorf管中加入1/10倍體積3M NaAc、2倍體積預冷無水乙醇，于20°C過夜，12000g，4°C 下離心10分鐘，得hTERT沉淀，棄上清，加入70%乙醇洗滌2次后棄干乙醇，加入50μ1 TE溶解 hTERT。此外，還可用低熔點瓊脂糖凝膠法、hTERT濾膜插片法等將目的hTERT片段從凝膠中 分離、純化出來。
[0033] (II)hTERT 與 pLXSNneo 載體的連接：取 9μ1 上述純化的 hTERT 成份（0.1-5yg)、lyl 10mmol/L ATP、10ul Ligation Mix或大腸桿菌DNA連接酶、2ul pLXSNneo空載體混合，15°C 溫育24h，構建pLXSNneo-hTERT重組子。
[0034] (III)pLXSNne〇-hTERT重組子的純化、擴增、鑒定：（i)大腸桿菌感受態的制備：其 基本方法是用冰預冷的CaCl2或多種2價陽離子等處理細菌，使之進入感受態得以轉化，用 CaCl2制備新鮮或冷凍的大腸桿菌感受態細胞，常用于成批制備感受態細菌，本法適用于大 多數大腸桿菌菌株，操作過程簡述如下:從37°C培養16~20h的新鮮平板中挑取一個單菌落 (如大腸桿菌DH52)，或lml新鮮的16~20h過夜培養物，轉到一個含有lOOmlLB培養基的1L或 500ml燒瓶中，于37°C劇烈振搖培養約2~3h(旋轉搖床200~300r/min)，每隔20~30min測 量0D600值~0.4,在無菌條件下將細菌轉移到一個，用冰預冷的50ml聚丙烯離心管中，在冰 上放置10~20min，于4°C用SorvallGS2轉頭(或與其離心管相配的轉頭）以4000r/min離心 10min，以回收細胞，倒數培養液，將管倒置lmin以使最后殘留的痕量培養液流盡，以10ml用 冰預冷的O.lmMCaCl道懸每份沉淀，放于冰上，于4°C用SorvallGS3轉頭（或與其相應的轉 頭）以4000r/min離心10min，以回收細胞，倒出培養液，將管倒置lmin以使最后殘留的痕量 培養液流盡，每50ml初始培養物用2ml冰預冷的0.1M CaCl2重懸每份沉定，此時，可以迅速 將細胞分裝成小份，液氮中冰凍，-70°C貯存備用。（ii)以感受態大腸桿菌純化、擴增 pLXSNneo-hTERT重組子：用冷卻的無菌吸頭從每種感受態細胞懸液中各取200μ1轉移到無 菌的微量離心管中，每管加 DNA或連接反應混合物(體積彡10μ1，DNA彡50ng)，輕輕旋轉以混 勻內容物，在冰中放置30min，將離心管放到預加溫到40 °C的循環水浴中的試管架上，放置 90s~2min，不要搖動試管，快速將管轉移到冰浴中，使細胞冷卻1~2min，每離心管加800μ 1S0C培養基，用水浴將培養基加溫到37°C，然后將管轉移到37°C搖床上，溫育45min使細菌 復蘇，并且表達質粒編碼的抗生素抗性標記基因，將適當體積(每90mm平板可達200μ1)已轉 化的感受態細胞轉移到含200mmol/LMgS04和相應抗生素的S0B培養基上，將平板置于室溫 至液體被吸收，倒置平皿，于37°C培養，12~16h后可出現菌落。（iii)篩選、擴增重組子：用 無菌牙簽或滅菌接種針挑選單個菌落接種于5mL無菌的LB培養基或豐富培養基(如超級肉 湯或TB超級肉湯培養基）中，培養過夜后，再加入到500mL含LB培養基(含有適當抗生素）的 2L燒瓶中，再于37°C培養至飽和狀態(OD600~4,為提高產量，應采用表面積較大及帶折流板 的燒瓶以盡量增大通氣度，振搖速度應大于400r/min)，于4°C，6000g離心10min，用4mL GTL 溶液重懸沉淀，并轉移到一個容積多20mL的高速離心管中（細菌沉淀可以在-20°C或-70°C 無限期保存），加入lmL新配的含25mg/mL溶菌酶的GTE溶液，重懸沉淀，于室溫放置10min，加 入10mL新配NaOH/SDS溶液，并且輕輕混勻直至液體變得均一、清亮而粘稠，于冰上放置 lOmin，加入7.5mL乙酸溶液，用吸管輕輕攪拌直至粘稠度下降并形成大的沉淀，于冰上放置 lOmin，于4°C，20 OOOg離心10min，將上清輕輕倒入至另一個干凈的離心管中，如果有可見 的飄浮物可用數層紗布過濾，加入0.6倍體積的異丙醇，顛倒混勻，室溫放置5~lOmin，于室 溫，1500g離心10min，加入2mL 70%乙醇輕輕洗滌沉淀，然后短暫快速離心，吸去乙醇，真空 干燥(沉淀可在4°C長期保存hGv)重組質粒的鑒定與擴增:挑取平皿上的單菌落，接種于 3ml含100ug/ml氨芐青霉素 LB培養基中，37°C，250r/min搖床中培養，14h后收集培養物，4 °C、10000r/min離心5min，按試劑盒說明書小量提取并純化重組質粒；以EcoRI和HindllI雙 酶切重組質粒反應體系：限制性內切酶各0.5ul、10Xbuffer 2ul、重組質粒10ul、加水補足 至20ul，37°C酶切lh。酶切產物于80V電壓條件下進行0.8%瓊脂糖電泳，時間3〇11^11，凝膠成 像系統拍照；按常規測定重組質粒的序列；重組質粒經酶切、測序鑒定準確后，將含有該質 粒的細菌接種至LB培養液中，擴增培養，按大劑量質粒抽提試劑盒說明書進行大劑量質粒 抽提純化，紫外分光光度計測定質粒濃度及純度后備用。
[0035] (IV)⑶4+T細胞:從本發明"(2)⑶4+T細胞的制備"取樣制備。
[0036] (V)CD4+T細胞預培養:將上述細胞接種于含5~10nm〇l/L胰島素、20%胎牛血清的 RPMI1640液中，或接種于含20%胎牛血清、5~10nm〇l/L胰島素的低糖DMEM細胞培養基中， 一般接種于3ml新鮮配制的培養基（1.6% 1M HEPES緩沖液；15%胎牛血清(FBS); 1 %青霉素 和鏈霉素 :PRMI 1640補足到100% )，置于37°C，體積分數5%⑶2培養箱內，培養1-2天，離 心，去上清液，備用。
[0037] (VI)pLXSNneo-hTERT重組子導入T淋巴細胞及擴大培養:在1.5ml微量離心管中制 備下列溶液：管A，將pLXSNneo-hTERT重組子溶于100μ1無血清培養液中；管B，將20μ1 Lipofectamine溶于80μ1無血清培養液中，將管Α和管Β混勾，室溫下靜置45min，用無血清培 養液洗滌上述T淋巴細胞2次。在Lipofectamine-pLXSNneo-hTERT混合物中加入lml無血清 培養液，輕輕混勻，滴加至上述T淋巴細胞中，加入lml無血清培養液(胎牛血清濃度為20ml/ L)，在C02培養箱培養10h，吸出轉染液，加4ml完全培養液(胎牛血清濃度為20 % )，繼續培養 20h，棄去培養液，更換濃度為400mg · I/1的G418培養液繼續培養，8天后選擇活細胞作擴大 培養后，再加大G418濃度到800mg · Γ1，將能在高濃度的G418環境中穩定生長的細胞繼續進 行擴增培養。培養9天左右鏡下觀察，可見淋巴細胞明顯增大，出現聚集現象。如果細胞增長 慢，或細胞密度低，或培養液pH值呈酸性，吸出半量培養液，進行等量換液。當總量達到14ml 時轉移到75ml培養瓶中，每2-3周加入5-10ml新鮮培養基。細胞培養至9-10周（約第75代）， 仍處于對數生長期，即細胞增加數量與培養時間呈倍增關系，死亡細胞少于10% (通過讀取 培養容器的刻度判斷細胞數量的增加情況;通過臺盼藍染色法鑒別死細胞和活細胞。因為 正常的活細胞，胞膜結構完整，能夠排斥，使臺盼藍不能夠進入胞內；而喪失活性的細胞，胞 膜的通透性增加，可被臺盼藍染成藍色，可判斷為細胞已經死亡。方法是每周吸取一定量的 細胞培養懸液，與臺盼藍染色劑混合后置室溫5~10分鐘，然后制成細胞薄片，在顯微鏡下 計數1000個細胞總數，計算著色的死細胞和不著色的活細胞的百分比）。此后隨著培養代數 的增加和培養時間的延長，細胞數量的增加變慢、死亡細胞越來越多，直至細胞不再增加， 甚至溶解、減少、全部死亡。當總量達到45ml時，置50ml離心管中，離心1500轉，10分鐘，棄上 清后，加入3ml凍存培養基（5%二甲基亞楓(dimethyl sufoxide)，95%FBS)混勻，成細胞懸 浮液(細胞濃度約為l〇5/ml)。凍存管分裝，lml/管，置-20°C2h，再置-70°C2h，然后凍存在- 196°C液氮中（或立即置零下80度，1-2小時后移入液氮罐中）。
[0038] (VII)永生化⑶4+T細胞生物學特性的鑒定：（i)觀察細胞形態:可見淋巴細胞明顯 增大，出現聚集現象，具有淋巴母細胞化特征。（ii)觀察細胞生長曲線:取生長較好的轉染 細胞，制成細胞懸液，經計數，分別取1.4 X 104細胞接種于30個含15FBS低糖DMEM培養基培 養瓶。每天取2瓶細胞進行計數，計算均值，連續觀察直至細胞數量明顯下降，培養3天后每 隔2天給未計數的細胞換液，采用同樣方法觀察轉染細胞在h印ato ZYME-SFM無血清培養基 中的生長情況。結果以培養時間為橫軸，細胞數量為縱軸(對數），描繪在半對數座標上制成 曲線后即成該細胞的生長曲線，永生化細胞系呈典型的"S"特征或"穹隆"形成；（iii)檢查 染色體:通過分析染色體核型，如果染色體核型為二倍體"46，XX"或"46，XY"，則說明該細胞 系沒有發生惡性轉化(同時可用流式細胞儀分析細胞系中是否出現異常的DNA群體，如果沒 有，也說明細胞系未出現瘤性特征）。染色體核型分析方法是：按5mL培養液中加入預熱的 250ug/ml秋水仙素100ul，混勻后置37°C培養箱4小時，經離心、去上清液、低滲、固定、制片、 G顯帶后分析染色體核型；（iv)流式細胞術檢測:檢測第19代細胞系中合成、分裂的細胞比 例，如果其增殖能力明顯比未建系的正常細胞增強，說明是hTERT整合、表達的結果。（vii) DNA序列測定:按常規測序儀檢測，顯示hTERT基因序列。（v)轉染細胞DNA中hTERT檢測：如以 免疫組織化學檢測，hTERT轉染的細胞核內染色可見大量棕色顆粒，表明hTERT已整合入細 胞內；（vi )mRNA表達產物測定:取100μΙ體系的PCR擴增產物，用凝膠回收試劑盒(Takara，日 本）回收產物，取2ylDNA溶液稀釋100倍，測濃度，余下的DNA及上、下游引物各10μ1進行測 序。
[0039] (VIII )hTERT介導⑶4+Τ細胞庫：篩選并繼續傳代、擴大培養經上述鑒定后符合永 生化細胞特性并與原代細胞相同或相近的細胞，取生長狀態良好、處于對數生長期的不同 世代的細胞，經離心分離（1200r/min，6min)，用含二甲亞砜的凍存液0.5~lml重懸細胞，細 胞密度為5 X 105個/ml，加入凍存管，經4 °C，0.5h; -20 °C，2h; -70 °C，過夜，入-196 °C液氮凍 存，以此法構建生物學特性穩定的永生化⑶4+T細胞庫備用。
[0040] ②以SV40永生化⑶4+T細胞的具體方法
[00411 (I) SV40大T抗原DNA的提取：（i ) SV40DNA酶切：從市售購買含有大T抗原基因的 SV40冰凍干粉或SV40質粒，溶解于適量的H20或TE緩沖液中，加2uL10X酶切緩沖液和18uL H20，加限制性內切酶BamH I (l-5U/ugDNA)，37°C溫育lh，75°C加熱15min，滅活酶，加入5uL 電泳加樣緩沖液(也可通過加入0. 5mo 1 /L EDTA)終止反應以備電泳。（i i) SV40DNA電泳：取 電泳級瓊脂糖以電泳緩沖液配成10%瓊脂糖凝膠，倒入已封好的凝膠灌制平臺上，插上樣 品梳，待膠凝固后從制膠平臺上除去封帶，拔出梳子，放入加有足夠電泳緩沖液的電泳槽 中，緩沖液高出凝膠表面約1_，用適量的10 X加樣緩沖液制備DNA樣品，然后用移液器將樣 品加入樣品孔中，并同時做合適的DNA分子量標準對照物，接通電極，使DNA向陽極移動，在 1-lOV/cm凝膠的電壓下電泳至足夠分離DNA片段的距離時，關閉電源。（iii)從瓊脂糖中分 離約2600bp SV40大T抗原DNA:在300-360nm長波紫外光源下(使用長波紫外光源以防止DNA 損傷)將含目標DNA片段的凝膠條帶切下裝入透析袋中，向透析袋內加入2ml電泳緩沖液，使 之浸沒凝膠，并排空汽泡，將透析袋水平放入電泳槽(長度方向與電泳平行），加入適量緩沖 液將透析袋浸沒(約6_7mm)，接通電源，150伏電洗，在紫外燈下觀察待DNA全部移出凝膠，改 變電場方向繼續通電1分鐘，從透析袋中吸出緩沖液于l-5ml Eppendorf管中，加入1.5倍體 積正丁醇，混勻抽提去EB，在臺式離心機上最高速2分鐘，吸去上層正丁醇溶液，如此重復二 次，自下層言DNA的溶液中加入等體積酸氯仿(2個)抽提2次，上清轉入另一Eppendorf管中 加入1/10倍體積3M NaAc、2倍體積預冷無水乙醇，于20°C過夜，12000g，4°C下離心10分鐘， 得DNA沉淀，棄上清，加入70 %乙醇洗滌2次后棄干乙醇，加入50μ1 TE溶解DNA。此外，還可用 低熔點瓊脂糖凝膠法、DNA濾膜插片法等將目的DNA片段從凝膠中分離、純化出來。
[0042] (II)SV40大Τ抗原DNA與pcDNA3· 1基因載體的連接:取9μ1上述DNA成份(0 · l-5yg)、 10μ1 2X連接緩沖液、ΙμL 10mmol/L ATP、T4 DNA連接酶(20~500粘性末端單位)或大腸桿 菌DNA連接酶、pcDNA3.1空載體混合，15 °C溫育24h，構建成SV40T/pcDNA3.1重組子。
[0043] (III)SV40T/pcDNA3.1重組子的擴增、分離與鑒定：（i)大腸桿菌感受態的制備:其 基本方法是用冰預冷的CaCl2或多種2價陽離子等處理細菌，使之進入感受態得以轉化，用 CaCl2制備新鮮或冷凍的大腸桿菌感受態細胞，常用于成批制備感受態細菌，本法適用于大 多數大腸桿菌菌株，操作過程簡述如下:從37°C培養16~20h的新鮮平板中挑取一個單菌落 (如大腸桿菌DH52)，或lml新鮮的16~20h過夜培養物，轉到一個含有lOOmlLB培養基的1L或 500ml燒瓶中，于37°C劇烈振搖培養約2~3h(旋轉搖床200~300r/min)，每隔20~30min測 量0D600值~0.4,在無菌條件下將細菌轉移到一個，用冰預冷的50ml聚丙烯離心管中，在冰 上放置10~20min，于4°C用SorvallGS2轉頭(或與其離心管相配的轉頭）以4000r/min離心 10min，以回收細胞，倒數培養液，將管倒置lmin以使最后殘留的痕量培養液流盡，以10ml用 冰預冷的O.lmMCaCl道懸每份沉淀，放于冰上，于4°C用SorvallGS3轉頭（或與其相應的轉 頭）以4000r/min離心10min，以回收細胞，倒出培養液，將管倒置lmin以使最后殘留的痕量 培養液流盡，每50ml初始培養物用2ml冰預冷的0.1M CaCl2重懸每份沉定，此時，可以迅速 將細胞分裝成小份，液氮中冰凍，_70°C貯存備用，用冷卻的無菌吸頭從每種感受態細胞懸 液中各取200yl轉移到無菌的微量離心管中，應在每管中加 DNA或連接反應混合物(體積< 10μ1，DNA彡50ng)，輕輕旋轉以混勻內容物，在冰中放置30min，將離心管放到預加溫到40°C 的循環水浴中的試管架上，放置90s~2min，不要搖動試管，快速將管轉移到冰浴中，使細胞 冷卻1~2min，每離心管加800ylS0C培養基，用水浴將培養基加溫到37°C，然后將管轉移到 37°C搖床上，溫育45min使細菌復蘇，并且表達質粒編碼的抗生素抗性標記基因，將適當體 積(每個90mm平板可達200μ1)已轉化的感受態細胞轉移到含200mmol/LMgS04和相應抗生素 的S0B培養基上，將平板置于室溫至液體被吸收，倒置平皿，于37°C培養，12~16h后可出現 菌落。（ii)重組子的篩選、擴增與提取：用無菌牙簽或滅菌接種針挑選單個菌落接種于5mL 無菌的LB培養基或豐富培養基（如超級肉湯或TB超級肉湯培養基）中，培養過夜后，再加入 到500mL含LB培養基(含有適當抗生素）的2L燒瓶中，再于37°C培養至飽和狀態(OD600~4,為 提高產量，應采用表面積較大及帶折流板的燒瓶以盡量增大通氣度，振搖速度應大于400r/ min)，于4°C，6000g離心10min，用4mL GTL溶液重懸沉淀，并轉移到一個容積彡20mL的高速 離心管中（細菌沉淀可以在_20°C或-70°C無限期保存），加入lmL新配的含25mg/mL溶菌酶的 GTE溶液，重懸沉淀，于室溫放置10min，加入10mL新配NaOH/SDS溶液，并且輕輕混勻直至液 體變得均一、清亮而粘稠，于冰上放置l〇min，加入7.5mL乙酸溶液，用吸管輕輕攪拌直至粘 稠度下降并形成大的沉淀，于冰上放置l〇min，于4°C，20 000g離心10min，將上清輕輕倒入 至另一個干凈的離心管中，如果有可見的飄浮物可用數層紗布過濾，加入0.6倍體積的異丙 醇，顛倒混勾，室溫放置5~10min，于室溫，1500g離心10min，加入2mL 70 %乙醇輕輕洗滌沉 淀，然后短暫快速離心，吸去乙醇，并真空干燥(沉淀可在4 °C長期保存hGii)重組子的鑒 定:上述從感受態大腸桿菌中提取的DNA(含重組子SV40T/pcDNA3.1)，同上法用限制性內切 酶BamH I進行酶切，10g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定，獲得大小約2600bp及5600bp的2條帶，前者 符合GenBank中SV40T片段的大小。
[0044] (IV)⑶4+T細胞:從本發明"(2)⑶4+T細胞的制備"取樣制備。
[0045] (V)CD4+T細胞預培養:將上述細胞接種于含5~10nm〇l/L胰島素、20%胎牛血清的 RPMI1640液中，或接種于含20%胎牛血清、5~10nm〇l/L胰島素的低糖DMEM細胞培養基中， 一般接種于3ml新鮮配制的培養基（1.6% 1M HEPES緩沖液；15%胎牛血清(FBS); 1 %青霉素 和鏈霉素 ;PRMI 1640補足到100% )，置于37°C，體積分數5%⑶2培養箱內，培養1-2天，離 心，去上清液，備用。
[0046] (VI )SV40T/pcDNA3.1的導入及擴大培養:在1.5ml微量離心管中制備下列溶液:管 A，將SV40T/pcDNA3.1溶于100μ1無血清培養液（胎牛血清濃度為20ml/L)中；管B，將20μ1 Lipofectamine溶于80μ1無血清培養液中，將管Α和管Β混勾，室溫下置45min。用無血清培養 液洗滌上述1'淋巴細胞2次。在1^口<^6(^3111；[116-3￥401'/^00嫩3.1混合物中加入11111無血清培 養液，輕輕混勻，再滴加至上述T淋巴細胞中，然后加入lml無血清培養液(胎牛血清濃度為 20ml/L)，在⑶ 2培養箱培養1 Oh，吸出轉染液，加4ml完全培養液(胎牛血清濃度為20% )，繼 續培養20h，棄去培養液，更換濃度為400mg · I/1的G418培養液繼續培養，8天后選擇活細胞 作擴大培養后，再加大G418濃度到800mg · I/1，將能在高濃度的G418環境中穩定生長的細胞 繼續進行擴增培養。培養9天左右鏡下觀察，可見淋巴細胞明顯增大，出現聚集現象。如果細 胞增長慢，或細胞密度低，或培養液pH值呈酸性，吸出半量培養液，進行等量換液。當總量達 到14ml時轉移到75ml培養瓶中，每2-3周加入5-10ml新鮮培養基。細胞培養約6-8周（約第55 代），仍處于對數生長，即培養時間與細胞增加數量呈倍增關系，死亡細胞少于10%(通過讀 取培養容器的刻度判斷細胞數量的增加情況;通過臺盼藍染色法鑒別死細胞和活細胞。因 為正常的活細胞，胞膜結構完整，能夠排斥，使臺盼藍不能夠進入胞內；而喪失活性的細胞， 胞膜的通透性增加，可被臺盼藍染成藍色，可判斷為細胞已經死亡。方法是每周吸取一定量 的細胞培養懸液，與臺盼藍染色劑混合后置室溫5~10分鐘，然后制成細胞薄片，在顯微鏡 下計數1000個細胞總數，計算著色的死細胞和不著色的活細胞的百分比）。此后隨著培養代 數的增加和培養時間的延長，細胞數量的增加變慢、死亡細胞越來越多，直至細胞不再增 加，甚至溶解、減少、全部死亡。當總量達到45ml時，置50ml離心管中，離心1500轉，10分鐘， 棄上清，加入31111凍存培養基(5%二甲基亞楓((1;[11161:1171811；1；'(?丨(16)，95%?135)混勾，成細胞 懸浮液（細胞濃度約為l0 5/ml)。凍存管分裝，lml/管，置-20°C2h，再置-70°C2h，然后凍存 在_196°C液氮中（或立即置零下80度，1-2小時后移入液氮罐中）。
[0047] (VII)永生化⑶4+T細胞生物學特性的鑒定：（i)觀察細胞形態:可見淋巴細胞明顯 增大，出現聚集現象，具有淋巴母細胞化特征。（ii)觀察細胞生長曲線:取生長較好的轉染 細胞，制成細胞懸液，經計數，分別取1.4 X 104細胞接種于30個含15FBS低糖DMEM培養基培 養瓶。每天取2瓶細胞進行計數，計算均值，連續觀察直至細胞數量明顯下降，培養3天后每 隔2天給未計數的細胞換液，采用同樣方法觀察轉染細胞在h印ato ZYME-SFM無血清培養基 中的生長情況。結果以培養時間為橫軸，細胞數量為縱軸(對數），描繪在半對數座標上制成 曲線后即成該細胞的生長曲線，永生化細胞系呈典型的"S"特征或"穹隆"形成；（iii)檢查 染色體:通過分析染色體核型，如果染色體核型為二倍體"46，XX"或"46，XY"，則說明該細胞 系沒有發生惡性轉化（同時可用流式細胞儀分析細胞系中是否出現異常的DNA群體，如沒 有，說明細胞系未出現瘤性特征）。染色體核型分析方法是：按5mL培養液中加入預熱的 250ug/ml秋水仙素 lOOul，混勻后置37°C培養箱4小時，經離心、去上清液、低滲、固定、制片、 G顯帶后分析染色體核型；（iv)流式細胞術檢測:檢測第19代細胞系中合成、分裂的細胞比 例，如果其增殖能力明顯比未建系的正常細胞增強，說明是SV40大T抗原整合、表達的結果。 (viii)DNA序列測定：按常規測序儀檢測，顯示SV40大T抗原DNA序列。（v)轉染細胞DNA中 SV40大T基因檢測：如以免疫組織化學檢測，SV40轉染的細胞核內染色可見大量棕色顆粒， 表明SV40T抗原已整合入細胞內；也可用RT-PCR法檢測T抗原在細胞中的表達，其中T抗原的 引物：上游引物（A4239)5'-GTT ATG ATT ATA ACT GTT ATG-3'，下游引物（S4496)5'-GAA ATG CCA TCT AGT GAT-3'；擴增產物長度為268bp，擴增條件為94°C，5min，即：（94°C，lmin; 55。(：，111^11，-0.5。(：/循環 ；72。(：，111^11)\30、（94。(：，305;40。(：，305,72。(：，305)\15，擴增體 系為5(^1:[]\%2+]2_〇1/1、(1犯138 20(^111〇1/1、引物濃度0.4以111〇1/1、了3911]、模板5以1;實驗組 以第19代細胞的cDNA為模板(參照市售cDNA第一鏈合成試劑盒進行cDNA第一鏈合成，產物-20°C保存）；陰性對照設兩個，分別以無菌水、原代細胞的cDNA做模板，陽性對照以SV40DNA 為模板(參照SDS-蛋白酶K法提取SV40DNA，因為SV40病毒無包膜，不使用SDS破膜，取5μ1進 行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，其余-20°C保存備用）；（vi)mRNA表達產物測定:Τ抗原mRNA RT-PCR產物測序:取100μΙ體系的擴增產物，用凝膠回收試劑盒(Takara，日本）回收產物，取 2μ1 DNA溶液稀釋100倍，測濃度，余下的DNA及上、下游引物各10μ1進行測序。
[0048] (VIII )SV40LT基因介導⑶4+Τ細胞庫:篩選并繼續傳代、擴大培養經上述鑒定后符 合永生化細胞特性并與原代細胞相同或相近的細胞，取生長狀態良好、處于對數生長期的 不同世代的細胞，經離心分離（1200r/min，6min)，用含二甲亞砜的凍存液0.5~lml重懸細 胞，細胞密度為5 X 105個/ml，加入凍存管，經4 °C，0.5h; -20 °C，2h; -70 °C，過夜，入-196 °C液 氮凍存，以此法構建生物學特性穩定的CD4+T細胞庫備用。
[0049] (4)與⑶4+T細胞相似功能顆粒的制備：可將⑶4分子、基因重組的⑶4分子及類似 功能的分子通過常規化學偶聯、交聯、親和吸附等固定于載體上制成包被有CD4分子的顆 粒，或直接取用功能相似的顆粒替代CD4+細胞應用。本發明的CD4+T細胞代表其他CD4+細 胞，包括用其他方法制備永生化⑶4+T細胞。
[0050] 二、艾滋病細胞吸附器的制備
[0051 ] 1、吸附劑的充填
[0052] 將本發明制備的⑶4+T細胞以無菌生理鹽水清洗后，再以1000r/min離心5min(低 速短時離心），取細胞沉淀裝配丙烯酸酯之類高生物相容性材料(與血漿分離器材料相同） 制成的圓柱形反應器，至4/5,然后加細胞凍存液(含30%胎牛血清、12%二甲亞砜的1640培 養液），使細胞濃度達80 %，輕輕搖勻，封口，經4°C，0.5h; -20 °C，2h; -70 °C，過夜，入-196 °C 液氮凍存備用。解凍使用時，需迅速將凍存管投入到已經預熱的37°C水浴中，并不斷搖動， 使管中的液體迅速融化，然后以無菌生理鹽水清洗后使用。
[0053] 2、吸附器的規格
[0054] 吸附器可為底徑小、頂徑大的圓柱形，或方形、漏斗形，容積為200~300ml，進出口 均設有細胞篩網，進口處頂徑篩網目數為800目；出口處底徑篩網目數為2.0~5.0目（2.5~ 5.0目相當于0.1~0.2微米或100~200納米），具體可制成2.0目、2.5目、3.0目、3.5目、4.0 目、4.5目和5.0目的7種不同規格，用以阻擋120納米的HIV病毒或更大的細菌;液體出口處 設置目數為100目（相當于4微米）的細胞濾網，用以阻擋可能濾出的細胞;液體進出口與網 篩之間設有緩沖區，有利于系統循環的穩定性。
[0055] 3、吸附器的材料
[0056]吸附器選用丙烯酸酯之類的高分子材料，要求生物相容性好，幾乎不激活補體、不 引起炎癥反應、不引起白細胞、血小板、血氧分壓、補體C3a、C5a的改變。可通過共價、接枝、 聚合等方法改進材料的結構、調節表面的不均勻性、親水性、減少對凝血及氧化應激的影 響、從而提高生物相容性、減少并發癥的發生。在吸附器內表面加親水凝膠，將2甲基丙烯酰 氧乙基磷酸膽堿-丁基異丁烯酸固化在醋酸纖維素膜上，通過控制濕紡過程，可生成CA/ PMB30、CA/PMB80和CA/PMB30-80,具有較高的血液和細胞相容性。
[0057]三、分離器的制備 [0058](一)血液分離器的制備
[0059] 1、制備原理:①血細胞、細菌、病毒的分子大小:人體血液中有形成份(細胞）的大 小為:正常紅細胞大約為7微米(μπι)，是雙凹圓盤狀的細胞；白細胞分為5種，中性粒細胞約 12μπι，嗜酸性粒細胞略大些，嗜堿性粒細胞與中性粒細胞接近，小淋巴細胞6_8μπι，與紅細胞 近似，單核細胞最大，約15-20μηι。血小板為圓盤形，直徑1~4微米到7~8微米不等，人的血 小板平均直徑為2-4微米，厚0.5~1.5微米。細菌的大小為:球菌的直徑約在0.75-1.25μπι之 間，桿菌長度約在2-5μηι，螺旋菌長約100-200μηι。病毒的大小以納米(nm)為單位[lcm = 10mm，lmm= ΙΟΟΟμηι，1μηι= lOOOnm]，不同病毒間大小差異很大，最小的如植物的聯體病毒 (Gemini viruses)直徑僅 18_20nm，最大的動物痕病毒（Poxviruses)大小達 300_450nm X 17〇-26〇11111，最長的如絲狀病毒科(？;[10￥；[1'丨(1&6)病毒粒子大小為8011111\790-1400011111，多數 單個病毒粒子的直徑在lOOnm左右，艾滋病毒為100-120nm(0.1-0.12ym)。②艾滋病患者血 液中存在的相關成份:多核巨細胞(HIV感染細胞表面的gpl20與CD4+細胞結合而成的大體 積的HIV感染細胞）、gpl20細胞(表面有gpl20但以單個細胞存在的HIV感染細胞）、基因整合 細胞（艾滋病感染初期或潛伏期，整合有HIV雙鏈DNA，但細胞表面沒有gpl20的HIV感染細 胞）、正常白細胞(未感染HIV的單個細胞存在的粒細胞、單核細胞、淋巴細胞）、紅細胞、血小 板、化學成份(蛋白質、糖類、脂類、電解質等）、游離的HIV、細菌及其他微生物。③多核巨細 胞為天然的大體積細胞;gpl20細胞和基因整合細胞可通過抗原和抗體的免疫反應使細胞 凝集為大體積多細胞聚合體;游離的HIV可通過載體顆粒/免疫反應轉變為大體積成份。④ 根據上述3點，可以制備能通過單個細胞但不能通過大體積細胞或顆粒的血液分離器。⑤選 用具有選擇性吸附功能的材料，經本發明的體外血液循環支路篩除血液中的HIV感染細胞。
[0060] 2、血液分離器的材料與要求：同本發明的吸附器，選用聚醋無紡布、醋酸纖維、脫 脂棉等，要求生物相容性好，幾乎不激活補體、不引起炎癥反應和白細胞、血小板、血氧分 壓、C3a、C5a的改變。
[0061] 3、血液分離器的型號:血液分離器的外形制備成柱形結構（以醋酸纖維或脫脂棉 等材料作濾芯）、扁平結構（以聚醋無紡布等材料作濾芯)等形狀;孔徑制備成150~250μηι、 50~150ym、15~40ym、8~15ym、5~8ym、3~5ym、1 ~2ym 等型號。
[0062] 4、血液分離器的應用原則:根據艾滋病患者的病情選用不同型號的分離器，原則 上先選用大孔徑型號做預篩濾，然后選用較小孔徑的型號。重度艾滋病患者常發生嚴重的 機會性感染，血液中含有不同大小的成份。如含有特大體積的真菌、螺旋菌、腫瘤細胞及其 他異物，則選用孔徑為150~250μπι或50~150μπι的分離器;如為篩濾HIV感染的單核巨噬細 胞、多核巨細胞、多細胞聚合體及吸附有HIV的顆粒性物質，以及為了置換易受HIV感染的 ⑶4+細胞，則選用15~40μπι、8~15μπι、5~8μπι、3~5μπι之類的型號。這幾種型號近似或小于 血液中單個紅細胞、中性粒細胞、小淋巴細胞的體積，但紅細胞、中性粒細胞及巨噬細胞具 有變形運動的特性，能通過比自身體積更小的微孔。
[0063](二)血漿分離器的制備
[0064] (1)制備原理:根據血細胞和血漿成份的分子大小制備。如人體血液中有形成份 (血細胞）的大小為:正常紅細胞大約為7微米(Mi)，是雙凹圓盤狀的細胞；白細胞分為5種， 中性粒細胞約1 2mi，嗜酸性粒細胞略大些，嗜堿性粒細胞與中性粒細胞接近，小淋巴細胞6-8μπι，與紅細胞近似，單核細胞最大，約15-20μπι。血小板為圓盤形，直徑1~4微米到7~8微米 不等，人的血小板平均直徑為2-4微米，厚0.5~1.5微米。
[0065] (2)材料:可選用聚醋無紡布、醋酸纖維、脫脂棉等，要求生物相容性好，幾乎不激 活補體、不引起炎癥反應、不引起白細胞、血小板、血氧分壓、補體C3a、C5a的改變。可通過共 價、接枝、聚合等方法改進材料的結構、調節表面的微觀不均勻性、親水性、減少對凝血及氧 化應激的影響、從而提高篩濾充分性和生物相容性、減少并發癥的發生。
[0066] (3)型號與規格:就分離器的外形來說，可以醋酸纖維或脫脂棉等材料作濾芯制備 成柱形結構、以聚醋無紡布等材料作濾芯制備成扁平結構等形狀;按待分離的血細胞和血 漿成份的分子大小確定孔徑。本發明所涉及的血漿分離器用性質穩定、生物相容性好、通透 性高的高分子聚合物制成空心纖維型濾器，空心纖維膜直徑為270~370μπι，膜厚度為50μπι， 孔徑為0.2~0.6μπι，纖維長度為13.5~26μπι。該孔僅準許血漿濾過，但能阻擋所有的細胞成 分。
[0067]四、AIDS細胞吸附治療儀的構件
[0068] 1、關鍵構件：（1)血液分離器:用于按體積大小篩除以多核巨細胞或多細胞聚合體 狀態存在的HIV感染細胞，即用于清除血細胞內的HIV; (2)血漿分離器：用于分離單個血細 胞和血漿；（3)細胞吸附器:用于吸附血漿中的HIV。
[0069] 2、附加構件:包括血栗、肝素栗、動靜脈壓和空氣監測、溫度控制系統、除氣系統、 電導率監測系統、超濾監測和漏血監測等部分組成。（1)血栗(Blood Pump):用來推動血液 循環以維持血液凈化治療的順利進行，通常血栗部分往往具有轉速檢測功能，以監測病人 的血流情況，因此血栗轉輪與凹槽間距設定要精確，并需要經常調整，根據血路栗管的情 況，一般將間距設定為3.2~3.3mm，不可太松，否則會造成血流檢測不準;也不可太緊，否則 會造成管路破裂。（2)肝素栗(Heparin Pump):肝素栗相當于臨床上應用的微量注射栗，用 以持續向篩濾管道(病人血液）中注射肝素，由于病人的血液在體外循環與空氣接觸，容易 發生凝血現象，使用肝素栗可以防止凝血的發生。（3)動靜脈壓監測：動脈壓監測主要用以 動態監測血液分離器微孔的堵塞情況，另外用以監測體外循環血栓、凝固和壓力的變化。當 血流不足時，動脈壓就會降低；當有凝血、血栓形成，特別是分離器微孔堵塞時，動脈壓就會 升高;靜脈壓監測用來監測管路血液回流的壓力，當分離器微孔堵塞、凝血、血栓形成、血流 不足以及靜脈血回流針頭脫落時，靜脈壓就會下降，如果血路回流管扭曲堵塞或回流針頭 發生堵塞時，靜脈壓就會升高。（4)空氣監測(Air Detector):用來監測血液流路的空氣氣 泡，一般用超聲波探測的原理，為了避免病人發生空氣栓塞而設置。當監測到有空氣氣泡 時，檢測系統會驅動動、靜脈血路夾來阻斷血流，防止危險的發生。
[0070]總之，在本發明關鍵構件和附加構件的基礎上，引入計算機調控而制成操作的人 性化、治療的個性化、設計的安全性，以及模塊化、自動監測及調控、液晶顯示、自行判斷警 報原因及解除信號等微電腦處理的血液凈化治療儀。
[0071 ]五、AIDS細胞吸附治療儀的連接通路與使用方法
[0072] 1、安裝:如圖1，以無菌操作連接各部件，包括血液分離器、血漿分離器、血漿吸附 器及各循環管路。
[0073] 2、排氣：以無菌生理鹽水充液分離器、吸附器及各循環管路，排除分離器、吸附器 及其循環管路內的氣體、氣泡，仔細檢查，確認無氣體、氣泡后使用。
[0074] 3、通液:將動脈血路管（1)接通艾滋病患者的動脈血管，在操作中再次仔細檢查排 氣是否完全，液流是否通暢，并避免管內流液污染。
[0075] 4、抗凝:從肝素栗(2)向液流中注射抗凝劑(肝素），初次為2500U或20~30U/kg。
[0076] 5、啟動：將動脈血路管（1)的一端與動脈血管相連，將靜脈管路（15)接通靜脈血 管，然后打開血液栗(2)，血流量為100~150ml/min，如圖1當動脈血液經動脈血路管（1)、肝 素和血液栗（2)進入血液分離器(3)時，因 HIV感染而形成的大體積多核巨細胞被阻留在血 液分離器(3)內，單個血細胞和血漿依次經血液出口（4)、血液栗(6)和循環管路(7)流入血 漿分離器(8)，分離的血漿經血漿栗(9)和血路管（10)流入此時開放的吸附器（11)，待充滿 血漿、約10分鐘，開始放出血漿，經出口管路（13)流出，同步向吸附器（12)灌注血漿，在吸附 器（11)內的血漿將近流完時，再次開始灌注血漿，此時吸附器（12)開始放出血漿，兩個并聯 的吸附器(11)和（12)交替進行。如表示圖1中的血液分離器(3)的內部結構的圖2,血液分離 器（1)的內腔(2)的管壁上有很多微孔(3)，多核巨細胞(4)不能濾過微孔(3)而被阻留在內 腔(2)，從而可被清除，能通過微孔(3)的中、小體積的單個血細胞(5)及血漿進入外腔(6)， 然后經出口（7)流出，進而經圖1所示的血漿分離器(8)分離出血細胞和血漿。如表示圖1中 的血漿分離器(8)的內部結構的圖3,血漿分離器(1)的內腔(2)的管壁上有很多微孔(3)，不 能通過微孔(3)的單個血細胞(4)經具有可開關閥門的血細胞出口（8)流出，進入圖1所示的 血細胞出口管路（14);能通過微孔(3)的血漿及其化學成分(5)進入血漿分離器外腔(6)，然 后經血漿流出口（7)、圖1所示的血漿栗(9)和血路管（10)進入吸附器。如表示圖1中吸附器 (11)和（12)內部結構的圖4，當含有HIV(3)的血漿進入吸附器（1)時，其中的HIV(3)被固定 在吸附器中的CD4+T細胞(2)結合成不再下移的CD4+T細胞結合物(4)，未被結合的較大體積 的HIV又被吸附器出口處的篩網阻留，被吸附HIV后的凈化血漿經圖1所示的出口管路（13) 與血漿分離器(8)分離的單個細胞在出口管路（14)匯合后經靜脈管路（15)匯流。如此凈化 血液、清除HIV，直至事先設定的血漿循環量(通常為9L)，治療才宣告結束。整個治療過程均 由電腦控制，并可隨時檢測工作狀態，使用方便、自動化和安全。
[0077]六、AIDS細胞吸附治療儀功效的驗證 [0078] 1、血液分離器濾除HIV感染細胞功效的驗證
[0079]本發明人按照本發明的基本方法，做了如下的簡易驗證實驗:取疾控中心和傳染 病實驗室生物樣本庫保存的已確診的艾滋病(AIDS)患者的抗凝全血若干份，分別取數份相 同ABO血型的抗凝全血混合成為5例，使血液量足夠大，然后委托浙江省醫院中心血站按成 份輸血的血液成份分離方法，經血液成份分離系統分離出白細胞、紅細胞、血漿，取白細胞 成份按常規離心沉淀，吸棄上清液，以適量的生理鹽水懸浮白細胞沉淀，然后加入合適比例 的gpl20抗體(上海廣銳生物科技有限公司），混勻后置37°C反應5分鐘，然后以孔徑為20~ 30um的血液成份分離系統分離出大體積的白細胞(稱為大白細胞），對濾過的白細胞濾液再 進一步以孔徑為15~25um的血液成份分離系統分離出中等體積的白細胞(稱為中白細胞）， 濾液中的白細胞為小體積的白細胞(稱為小白細胞），分別收集大、中、小白細胞分離懸液， 常規離心沉淀，吸棄上清液，以定量移液器分別吸取等量的大、中、小白細胞沉淀，常規方法 (機械或細胞裂解液)裂解細胞(如用同種裂解液，需加量相等），離心沉淀后取上清液，然后 根據HIV-lp24抗原檢測試劑盒(酶聯免疫法，上海啟發生物科技有限公司）操作，以已知濃 度 0口8/1111、0.5卩8/1111、1卩8/1111、2.5卩8/1111、5卩8/1111、20卩8/1111、40卩8/1111、80卩8/1111的卩24抗原作為 對照，最低檢測限低于5pg/ml，測定范圍0~400pg/ml，線性范圍0 · 5pg/ml~80pg/ml，15min 內450nm測定吸光度（0D)，空白對照校準品吸光度值不高于0.050,0pg吸光度值不高于 0.100，1000pg/ml吸光度不低于1.000，當吸光度>0.12時被認為是陽性，檢測結果(表1)說 明，AIDS患者不同體積大小的白細胞中的HIV-p24含量不同，在大、中、小白細胞中HIV-p24 的平均含量分別為275 · Opg/ml、196 · Opg/ml、126 · 4pg/ml，其中大、小白細胞中HIV-p24平均 含量相差148.6pg/ml，減少了 54.4 % ;在大、中、小白細胞中HIV-P24的總含量分別為 1375 · Opg/ml、979 · 9pg/ml、632 · lpg/ml，其中大、小白細胞中HIV-p24總含量相差742 · 9pg/ ml，減少了54.3 %，經統計學檢驗，t = 2.43，p<0.05。說明AIDS患者體內的大體積白細胞或 經gpl20抗體作用后而形成的大體積白細胞中含有較高含量的HIV，能通過實施本發明的技 術方案被分離清除。
[0080] 表1 AIDS患者外周血大、中、小白細胞中HIV-P24檢測結果(p24:pg/ml)
[0081]
[0082] 2、細胞吸附器(劑)清除HIV功效的驗證
[0083]為了驗證吸附器(主要是⑶4+T細胞株)清除HIV的功效，本發明設計了簡易的測試 方法:取滅菌的2.5 X 300mm魏氏血沉管5支，分別吸取經離心（1000r/min，5min)沉淀的⑶4+ T細胞至200mm刻度，接著吸取經100 °C溶化后保溫在39~41°C備用的0.9 %瓊脂糖C1-4B，達 到約10mm長刻度，置血沉架冷卻后，瓊脂糖成為半固體，能阻止血沉管內細胞流出但不會阻 止小分子的水和化學成份之類的物質通過。另取疾控中心及傳染病實驗室樣本庫保存的艾 滋病患者的5例血漿，各約lOmL，各取9mLAIDS濾前血漿分批次注入血沉管上端空管，待流經 血沉管下層的CD4+T細胞層并從血沉管內流出后，收集流出液，稱為AIDS濾后血漿。取AIDS 濾前血漿和濾后血漿，根據HIV-lp24抗原檢測試劑盒(酶聯免疫法，上海啟發生物科技有限 公司）操作，以已知濃度〇pg/ml、0 · 5pg/ml、lpg/ml、2 · 5pg/ml、5pg/ml、20pg/ml、40pg/ml、 80pg/ml的p24抗原作為對照，最低檢測限低于5pg/ml，測定范圍0~400pg/ml，線性范圍 0.5pg/ml~80pg/ml，15min內450nm測定吸光度（0D)，空白對照校準品吸光度值不高于 0.050,0pg吸光度值不高于0.100，1000pg/ml吸光度不低于1.000,當吸光度>0.12時被認 為是陽性，檢測結果(表1)說明，AIDS血漿濾過含CD4+T細胞的簡易凈化裝置后，部分HIV已 被⑶4+T細胞吸附，經第1次濾過后，HIV總清除率為22.84%，經第2次濾過后，總清除率為 35.31 %，經第3次濾過后，總清除率為41.9%。說明隨著濾過次數的增加，HIV會被不斷地清 除，從而達到治療AIDS目的。
[0084] 表1 AIDS血漿濾過含⑶4+T細胞的簡易吸附裝置前后p24檢測結果(pg/ml)
[0085]
[〇u?6J 上還間易頭驗衣明，已極mv惣梁的外周皿細Μ易酏甘成入懷枳的多後B細Μ，酡 被血液分離器濾除；而血漿中的HIV能被吸附器中的⑶4+Τ細胞株以及吸附器出口處的篩網 清除。表明以血液分離器和血漿吸附器為關鍵部件構成的AIDS細胞吸附治療儀具有顯著的 清除血細胞內、外HIV病毒的治療功效。
【主權項】
1. 一種用于醫學領域的AIDS細胞吸附治療儀，其特征在于，將所制能結合HIV的CD4+T 細胞株以80 %的濃度配制于細胞凍存液，灌注高生物相容性材料制成的出口處設置篩網的 吸附器，所制吸附器與所制血液和血漿分離器構成體外吸附裝置的主件，用于濾除含有HIV 的多核巨細胞和血漿中的HIV。2. 根據權利要求1所述的AIDS細胞吸附治療儀，其特征在于，所述血液分離器的內腔通 過管壁上的微孔與外腔相通，所述微孔的孔徑為1~250μπι，能通過單個血液細胞但不能通 過兩個及以上相互粘合或融合而成的大體積細胞。3. 根據權利要求2所述的AIDS細胞吸附治療儀，其特征在于，所述血液分離器的微孔孔 徑為 150~250ym、50~150ym、15~40ym、8~15ym、5~8ym、3~5ym、1 ~2ym。4. 根據權利要求1-3任一所述的AIDS細胞吸附治療儀，其特征在于，選用微孔孔徑為 150~250μπι、50~150μπι的分離器分離特大體積的真菌、螺旋菌和/或腫瘤細胞;選用微孔孔 徑為15~40μπι、8~15μπι、5~8μπι、3~5μπι的分離器分離HIV感染的單核巨噬細胞、多核巨細 胞、多細胞聚合體、吸附有HIV的顆粒性物質和/或易受HIV感染的CD4+細胞。5. 根據權利要求1所述的AIDS細胞吸附治療儀，其特征在于，所述吸附器由其出口處的 篩網和CD4+T細胞株共同構成分子篩清除及細胞免疫清除HIV的屏障。6. 根據權利要求1所述的AIDS細胞吸附治療儀，其特征在于，所述吸附器的容積為200 ~300ml，進出口均設有細胞篩網，進口處頂徑篩網目數為800目，出口處底徑篩網目數為 2.0~5.0目，液體出口處設置目數為100目的細胞濾網，液體進出口與篩網之間設置促進系 統穩定循環的緩沖區。7. 根據權利要求1所述的AIDS細胞吸附治療儀，其特征在于，所述細胞凍存液為含30 % 胎牛血清、12 %二甲亞砜的1640培養液。8. 根據權利要求1、5任一所述的AIDS細胞吸附治療儀，其特征在于，所述的CD4+T細胞 株以SV40和/或hTERT作為轉染基因、以CD3單克隆抗體和/或CD28雙抗體作為細胞生長刺激 劑制備。9. 一種用于醫學領域的AIDS細胞吸附治療儀吸附劑的制備，其特征在于，以無菌生理 鹽水清洗所制CD4+T細胞株，lOOOr/min離心，洗凈后再作離心沉淀，取沉淀細胞配制于細胞 凍存液，使細胞濃度達80 %，輕輕搖勻，封口，經4°C，0.5h; -20°C，2h; -70°C，過夜，入-196°C 液氮凍存備用，解凍使用時，需迅速將凍存管投入到已經預熱的37°C水浴中，并不斷搖動， 使管中的液體迅速融化，然后以無菌生理鹽水清洗后使用。10. 權利要求1-12任一所述的AIDS細胞吸附治療儀在制備體外吸附裝置中的應用，其 特征在于，所述體外吸附裝置包括動脈血路管（1)的一端經肝素和血液栗(2)與含有廢液出 口（5)的血液分離器(3)相連，血液分離器(3)經血液出口（4)、血液栗(6)、循環管路(7)與血 漿分離器(8)相連，血漿分離器(8)的血漿出口經血漿栗(9)和血路管（10)與兩個并聯的吸 附器（11)和吸附器（12)相連，兩個吸附器的出口管路（13)與血漿分離器(8)的血細胞出口 管路（14)匯合后經靜脈管路（15)匯流。
【文檔編號】A61M1/36GK106039448SQ201610540996
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年7月1日
【發明人】翁炳煥, 李蘭娟, 陳敏, 王麗雅, 錢葉青
【申請人】翁炳煥