一種grpr靶向性分子探針及其制備方法

一種grpr靶向性分子探針及其制備方法
【專利摘要】本發明屬于診斷顯像劑領域，涉及一種GRPR靶向性分子探針及其制備方法。具有通式M?X?JMV594，其中M是信號組分，X是連接體，JMV594是GRPR的靶向親和組分；所述JMV594是多肽序列D?Phe?Gln?Trp?Ala?Val?Gly?His?Sat?Leu?NH2，所述的信號組分M，為放射性同位素與金屬螯合劑、熒光染料、量子點、順磁性材料、超順磁性材料、磁性納米粒子、超聲微泡、光聲納米顆粒的一種或者幾種材料的結合。本發明的GRPR靶向性分子探針可以作為影像顯像劑或放射治療藥物，具有良好的藥代動力學特性和生物學分布特征，檢測結果更加準確，臨床應用更有前景。
【專利說明】
一種GRPR靶向性分子探針及其制備方法
技術領域
[0001]本發明屬于診斷顯像劑領域，特別涉及一種GRPR靶向性分子探針及其制備方法。
【背景技術】
[0002] 常用的分子影像技術包括核磁共振成像(Magnetic resonance imaging，MRI)，計 算機X射線斷層成像(CT)，正電子發射斷層掃描成像(positron emission tomography, PET)，單光子發射型計算機斷層成像（single photon emission computed tomography, SPECT)，光學成像(包括多光子成像、近紅外一區成像、近紅外二區成像和共聚焦成像等)和 超聲成像。每種顯像技術在靈敏度、原理、分辨率和采集時間等方面各有優缺點。
[0003] 表1各種成像模式比較
[0004]
[0005] 分子影像的核心是實時獲取高質量、特異靶點分子的圖像，因此它需要設計各種 靶向性好、腫瘤攝取高、顯像信噪比高的分子探針，以滿足臨床研究的需求。而相對于納米 分子探針，目前多肽小分子探針仍是臨床應用的最佳選擇。多肽小分子探針通常通過肝臟 和腎臟系統代謝，清除時間較短，從而避免由于長期保留在肝臟和腎臟產生的相關毒性。因 此高性能的多肽小分子探針的設計和制備成為近年來分子影像學科中最活躍的研究領域。
[0006] 腫瘤形成是在各種致瘤因素的作用下，細胞生長調控發生嚴重紊亂的結果。近幾 年來，研究表明胃泌素釋放肽(GRP)作為一種生長因子在多種腫瘤組織中異常表達，并以自 主分泌、異常分泌、神經內分泌等方式作用于其特異性受體(GRPR)，從而影響多種信號傳導 途徑，直接刺激腫瘤的生長。GRPR表達情況與腫瘤的性質、類型、分化程度、級別、侵襲力等 息息相關。GRPR在正常組織和腫瘤組織中的激活作用有重要的生長效應，且在惡性腫瘤中 的表達比在正常的人體組織更為普遍。在多種人類癌癥細胞中異常或過度表達，包括在小 細胞肺癌、非小細胞肺癌、前列腺癌、乳腺癌、神經膠質母細胞瘤和肺癌等。例如研究證明在 人胃、小腸和直腸腫瘤組織中，84%的腫瘤表達GRPR。因此GRPR成為熱門的腫瘤標志物應用 于癌癥的早期診斷和治療。
[0007] 蛙皮素(Bombesin，BBN)是一種由14個氨基酸殘基組成的生物活性多肽，具有廣泛 的生物學功能，大量研究證明，BBN與GRPR具有很高的納摩爾親和力。但是天然的BBN在體內 存在代謝不穩定性，有鑒于此，基于BBN結構研究人員開發各種BBN多肽類似物構建的小分 子探針尤其是放射性核素標記( 111ln、68Ga、mLU、64C U和99TC等）的PET探針已在臨床前實驗 和臨床實驗中得到廣泛的應用。其中氨基酸序列（Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2)的BBN類似物:JMV594構建的小分子探針一直被認為是最有前途的腫瘤受體GRPR靶向 顯像和治療造影劑。例如64Cu標記NODAGA偶聯的JMV594的PET小分子探針在體外和體內具有 良好的穩定性，并且活體顯像結果表明在4小時后腫瘤對該探針攝取值為3.5±1.0%ID/g。 但是，對于臨床應用而言，該類分子探針普遍存在腫瘤攝取率不高，腫瘤/本底對比度低，主 要通過腎臟代謝，藥代動力學不佳等缺點。因此如何開發腫瘤攝取高、腫瘤/本底對比度高 和藥代動力學性質突出的GRPR靶向的小分子探針仍然是一項具有挑戰性的工作。

【發明內容】

[0008] 本發明所要解決的技術問題是提供一種GRPR靶向性分子探針及其制備方法。該類 探針包含靶向GRPR受體肽JMV594和信號組分，兩者之間通過不同的連接基團連接從而改善 該類化合物在腫瘤部位攝取，腫瘤/本底信號比值以及調節該類化合物體內藥代動力學特 性，從而達到更好的顯像診斷效果。
[0009] 本發明的分子探針可以具有以下通式：
[0010 ] M-X-JMV594，其中Μ是信號組分，X是連接體，JMV594是GRPR的靶向親和組分；
[0011] 所述 JMV594 是多肽序列 D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sat-Leu-NH2,其結構 如下：
[0012]
[0013]所述的信號組分M，為用于ΡΕΤ/CT顯像的放射性同位素(例如Wu^Ga^lu^Tc 等）與金屬螯合劑(D0TA、D0TAGA、DTPA、PCTA、ΝΟΤΑ、NODAGA、TETA、CB-TE2A等）、熒光染料(包 括傳統的近紅外I區和近紅外II區熒光染料）、量子點、順磁性材料、超順磁性材料、磁性納 米粒子、超聲微泡、光聲納米顆粒的一種或者幾種材料的結合。
[0014]所述的連接體X，為以下任一種或者兩種的結合：
[0015]
[0016] η為0-18的整數。
[0017] 本發明還提供所述GRPR靶向性小分子探針的制備方法，所述制備方法包括以下步 驟：
[0018] 1)JMV594 多肽合成
[0019] 采用固相Fmoc合成方法，從ΜΒΗΑ樹脂開始逐步合成JMV594，多肽合成完畢后，TFA/ Tips/H20(95:2 · 5:2 · 5)條件下從樹脂上切下（D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH2)，粗產品用制備HPLC分離純化后經過質譜分析確認為預期產物JMV594。
[0020] 2)X-JMV594合成
[0021] a)當X為單一連接體41，42，六3時：
[0022] 將上述步驟獲得的JMV594溶于DMF中，依次加入過量的A1，A2，A3和HBTU，室溫攪拌 過夜，獲得的粗產品通過制備HPLC分離純化后經過質譜分析確認為預期產物SCH。
[0023] b)當X為兩種連接體組合：B1+C1，B2+C1，B3+C1，B4+C1，B1+C2，B2+C2，B3+C2，B4+ C2,
[0024] 將上述步驟獲得的JMV594多肽溶于DMF中，依次加入過量的B和HBTU，室溫攪拌過 夜，獲得的粗產品通過制備HPLC分離純化后經過質譜分析確認為預期產物ZH。
[0025]將上述步驟獲得的ZH溶于DMF中，依次加入過量的C，室溫攪拌2-4h后，通過制備 HPLC分離純化后經過質譜分析確認為預期產物ZHS。
[0026] 3)M-X-JMV594 的制備
[0027] a)用于PET顯像/放射治療的分子探針M-X-JMV5 94制備（其中Μ =放射核素的螯合 劑，例如ΝΟΤΑ，N0DAGA，D0TA，D0TAGA 等）
[0028]將上述步驟獲得SCH或者ZHS溶于DMF中，依次加入過量的放射核素螯合劑活性酯 和DIPEA，室溫攪拌2-12h，通過制備HPLC分離純化后經過質譜分析確認為預期產物。
[0029] b)用于其他模態顯像的分子探針M-X-JMV594制備（其中M =其他模態顯像的信號 組分）
[0030]將上述步驟獲得SCH或者ZHS溶于DMF中，依次加入過量的信號組分的活性酯分子 和DIPEA，室溫攪拌2-12h，通過制備HPLC分離純化后經過質譜分析確認為預期產物。
[0031]本發明的GRPR靶向性化合物，可用于對對象待測位置實施光學成像(包括近紅外I 區，近紅外II區）、正電子發射斷層成像、單光子發射斷層成像、磁共振成像、光學成像、超聲 成像等。
[0032]本發明開發的一類GRPR靶向性影像/放射治療分子探針，具有良好的藥代動力學 特性和生物學分布特征，檢測結果更加準確，臨床應用更有前景。
[0033]本發明靶向特異性分子探針具有如下優點：
[0034] 1)具有GRPR靶向特異性，確保GRPR分子成像靶向檢測的準確性。
[0035] 2)GRPR的活體可視化，確保GRPR分子成像檢測的安全，無創和直觀性。
[0036] 3)分子探針與靶向GRPR的高親和力，從而確保在幾個血液循環周期后，探針在靶 點達到理想的聚集狀態。
[0037] 4)分子探針檢測GRPR的高靈敏度，從而確保其產生的生物學影響或藥理學作用盡 量低。
[0038] 5)GRPR活體分子成像的高對比度，從而確保高靶/背景比值和信號/噪聲比值。 [0039] 6)分子探針的高活體穩定性。
[0040] 7)GRPR活體分子成像的高腫瘤攝取值，從而確保拿到高質量顯像。
[0041] 8)分子探針的生產過程簡便易行，成本低，確保分子探針的臨床轉化。
【附圖說明】
[0042] 圖1為68Ga標記N0DAGA-SCH1和N0DAGA-JMV594分子探針的結構示意圖。
[0043] 圖2為HPLC分析68Ga-N0DAGA-SCHl和68Ga-N0DAGA-JMV594分子探針在體外小鼠血 清穩定性結果。
[0044] 圖3為N0DAGA-SCH1和N0DAGA-JMV594分子探針在前列腺癌PC-3細胞中IC50值以 及 68Ga-N0DAGA-SCHl和68Ga-N0DAGA-JMV594分子探針在不同時間點（0.5h，lh，2h)前列腺癌 PC-3細胞攝取值。
[0045] 圖4為68Ga-N0DAGA-SCHl和68Ga-N0DAGA-JMV594分子探針在前列腺癌模型的PET/ CT顯像。
[0046] 圖5為68Ga-N0DAGA-SCHl和68Ga-N0DAGA-JMV594分子探針在體內主要器官的生物 學分布。
[0047] 圖6為近紅外II區GRPR靶向分子探針SCH1100的結構示意圖。
[0048]圖7為SCH1100分子探針在前列腺癌模型的近紅外II區顯像
【具體實施方式】
[0049]實施例 1:合成化合物 68Ga-N0DAGA-JMV594
[0050]
[0051 ]在2mL試管中稱取多肽JMV594( 1 · 13mg，0 · Olmmol)和N0DAGA-NHS酯（0 · 95mg， 0.02mmo 1，2.0當量)溶于DMF溶劑中，加入2當量的DIPEA。室溫反應4小時后。反應液直接用 制備HPLC純化后真空冷凍干燥得到的產物為白色固體粉末N0DAGA-JMV594，0.80mg，收率 55% DMS計算值:C7qHi〇3Ni7〇i8+( [M+H] +): 1470 · 8，實測值:ESI-MS:m/z 1470 · 8。
[0052] 2nmol的N0DAGA-JMV594化合物溶解于lmL NaOAc緩沖液(ρΗ = 4·5)在37°C下加入 2mCi核素68Ga標記反應15min。標記后的化合物68Ga-N0DAGA-JMV594用HPLC純化后，氮氣吹 干有機溶劑乙腈，PBS溶液稀釋后，直接用于細胞攝取實驗和活體成像實驗。
[0053] 實施例 2:合成 68Ga-N0DAGA-SCHl
[0054]
[0055] 在2mLia；官中稱取多肱S(JHU 1 · 25mg，0
· Olmmol)和NOUAGA-NHS酷（? · 95mg, 0.02mmo 1，2.0當量)溶于DMF溶劑中，加入2當量的DIPEA。室溫反應2小時后。反應液直接用 制備HPLC純化后真空冷凍干燥得到的產物為白色固體粉末N0DAGA-SCH1，1.30mg，收率 80% DMS計算值：C78Hii9Ni8〇i9+( [M+H] + ): 1611 · 9，實測值:MALDI-T0F-MS: 1611 · 9。
[0056] 2nmo 1的N0DAGA-SCH1化合物溶解于lmL NaOAc緩沖液(pH = 4 · 5)在37 °C下加入 2mCi核素68Ga標記反應15min。標記后的化合物68Ga-N0DAGA_SCHl用HPLC純化后，氮氣吹干 有機溶劑乙腈，PBS溶液稀釋后，直接用于細胞攝取實驗和活體成像實驗。
[0057] 實施例3:合成化合物68Ga-N0DAGA-ZHSl
[0058]
[0059] 在2mL試管中稱取多妝ZH1 (1 · 28mg，0 · Olmmol)和化合物Cla(0 · 56mg，0 · 02mmo1 , 2.0當量)溶于DMF溶劑中。室溫反應2小時后。反應液直接用制備HPLC純化后真空冷凍干燥 得到的產物為白色固體粉末ZHS1，1.13mg，收率75% DMS計算值：C74HmN18〇16+( [M+H] +): 1506 · 8，實測值:ESI-MS: 1506 · 9。
[0060] 在2mL試管中稱取多肽ZHS1 (1 · 56mg，0 · Olmmol)和NODAGA-NHS酯（0 · 95mg， 0.02mmo 1，2.0當量)溶于DMF溶劑中，加入2當量的DIPEA。室溫反應4小時后。反應液直接用 制備HPLC純化后真空冷凍干燥得到的產物為白色固體粉末NODAGA-ZHS1，1.5Omg，收率 80% DMS計算值:C89Hi34N2i〇23+( [M+H] + ): 1865 · 0，實測值:ESI-MS: 1865 · 3。
[0061 ] 2nmo 1的N0DAGA-ZHS1化合物溶解于lmL NaOAc緩沖液(pH = 4 · 5)在37 °C下加入 2mCi核素68Ga標記反應15min。標記后的化合物68Ga-NODAGA-ZHSl用HPLC純化后，氮氣吹干 有機溶劑乙腈，PBS溶液稀釋后，直接用于細胞攝取實驗和活體成像實驗。
[0062] 實施例4:合成化合物68Ga-N0DAGA-ZHS2
[0063]
[0064] 在2mL試管中稱取多妝ZH1(1.28mg，0.01mmol)和化合物C3_l(0.15mg，0.015mmol， 1.5當量)溶于DMF溶劑中。室溫反應1小時后。反應液直接用制備HPLC純化后真空冷凍干燥 得到的產物為白色固體粉末ZHS2，1.06mg，收率78% DMS計算值：C68H1()()N15〇 13S+( [M+H] + ): 1365.7,實測值:ESI-MS: 1365.4。
[0065] 在2mL試管中稱取多肽ZHS2( 1 · 36mg，0 · Olmmol)和N0DAGA-NHS酯（0 · 95mg， 0.02mmo 1，2.0當量)溶于DMF溶劑中，加入2當量的DIPEA。室溫反應2小時后。反應液直接用 制備HPLC純化后真空冷凍干燥得到的產物為白色固體粉末N0DAGA-ZHS2，1.37mg，收率 80% DMS計算值:C83Hi23Ni8〇2〇S+( [M+H] + ): 1722 · 8，實測值:ESI-MS: 1722 · 3。
[0066] 2nmo 1的N0DAGA-ZHS2化合物溶解于lmL NaOAc緩沖液（pH = 4 · 5)在37 °C下加入 2mCi核素68Ga標記反應15min。標記后的化合物68Ga-N0DAGA-ZHS2用HPLC純化后，氮氣吹干 有機溶劑乙腈，PBS溶液稀釋后，直接用于細胞攝取實驗和活體成像實驗。
[0067] 實施例5:合成化合物68Ga-N0DAGA-ZHS3
[0068]
[0069] 在2mL試管中稱取多肽ZH1 (1 · 28mg，0 · Olmmo 1)和化合物C2(0 · 28mg，0 · 015mmol， 1.5當量)溶于DMF溶劑中。室溫反應1小時后。反應液直接用制備HPLC純化后真空冷凍干燥 得到的產物為白色固體粉末ZHS3，1.17mg，收率80% DMS計算值：[M+H] + ): 1447.7,實測值:ESI-MS: 1447.4。
[0070] 在2mL試管中稱取多肽ZHS3( 1 · 47mg，0 · Olmmol)和NODAGA-NHS酯（0 · 95mg， 0.02mmo 1，2.0當量)溶于DMF溶劑中，加入2當量的DIPEA。室溫反應2小時后。反應液直接用 制備HPLC純化后真空冷凍干燥得到的產物為白色固體粉末N0DAGA-ZHS3，1.44mg，收率 80% DMS計算值:C9qHi25N2q〇2()+( [M+H] + ): 1805 · 9，實測值:ESI-MS: 1806 · 1。
[0071] 2nmo 1的N0DAGA-ZHS3化合物溶解于lmL NaOAc緩沖液（pH = 4 · 5)在37 °C下加入 2mCi核素68Ga標記反應15min。標記后的化合物68Ga-N0DAGA-ZHS3用HPLC純化后，氮氣吹干 有機溶劑乙腈，PBS溶液稀釋后，直接用于細胞攝取實驗和活體成像實驗。
[0072] 實施例6:合成化合物SCH1100
[0074] 在2mL試管中稱取多妝ZH1 (1 · 28mg,0 ·Olmmol)和化合物Clb(0 · 66mg，0 · 015mmol， 1.5當量)溶于DMF溶劑中，加入室溫反應4小時后。反應液直接用制備HPLC純化后真空冷凍 干燥得到的產物ZHS4，1.38mg，收率80% JS計算值:C84H132N18〇21+( [M+H] + ): 1728.9，實測值： ESI-MS:1728.4。
[0075] 化合物Q4-1 (1 · 13mg，0 · 0lmmo 1)溶于DMF溶劑中，加入HBTU(0 · 38mg，0 · 0lmmo 1，1 · 0 當量)在2mL試管中室溫反應4小時后，加入化合物ZHS4 (1.73mg，0.0 lmmo 1)室溫反應過夜。 反應液直接用制備HPLC純化后真空冷凍干燥得到的產物3011100,0.381^，收率30%。1^計 算值：Ci46Hi76N24〇28S4+( [M+H] + ): 2843 · 3，實測值:MALDI-T0F-MS: 2844 · 1。
【主權項】
1. 一種GRPR靶向性分子探針，具有通式M-X-JMV594，其中M是信號組分，X是連接體， JMV594是GRPR的靶向親和組分； 所述眞￥594是多肽序列〇-卩116-6111-1'印-厶1&-\%1-617-]^8-3&1：-1^11-順2， 所述的信號組分M，為放射性同位素與金屬螯合劑、熒光染料、量子點、順磁性材料、超 順磁性材料、磁性納米粒子、超聲微泡、光聲納米顆粒的一種或者幾種材料的結合； 所述的連接體X，為以下任一種或者兩種的結合：n為0-18的整數。2. 權利要求1所述的GRPR祀向性分子探針作為分子影像的顯像劑的用途。3. 根據權利要求2所述的用途，其特征在于，所述的分子影像包括正電子發射斷層成 像、近紅外I區光學成像、近紅外II區光學成像、單光子發射斷層成像、磁共振成像、超聲成 像或光聲成像。4. 權利要求1所述的GRPR祀向性分子探針在制備治療腫瘤藥物上的用途。
【文檔編號】A61K51/08GK106039327SQ201610423362
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年6月14日
【發明人】程震
【申請人】寧波益格愛生物科技有限公司