一種裝載siRNA的仿生型磁小體及其制備方法
【專利摘要】本發明涉及一種裝載siRNA的仿生型磁小體及其制備方法，屬于化學及生物醫學領域。所述仿生型磁小體以水溶性MNC為核，外包白細胞膜，MNC與白細胞膜間裝載有siRNA；所述仿生型磁小體白細胞膜外可共價偶聯有具有修飾基團的抗體或肽。通過制備MNC、M、MNC:siRNA，將MNC:siRNA溶液、M溶液和緩沖液混合，得到所述仿生型磁小體；通過修飾基團將肽或抗體修飾到所述仿生型磁小體的白細胞膜上，得到偶聯抗體或肽的所述仿生型磁小體。所述仿生型磁小體中的MNC具有正電荷，可吸附siRNA，外部包覆M仿生，可高效、快速達到病灶，同時避免生物體的免疫清除。
【專利說明】
一種裝載s i RNA的仿生型磁小體及其制備方法
技術領域
[0001] 本發明涉及一種裝載siRNA的仿生型磁小體及其制備方法，屬于化學及生物醫學 領域。
【背景技術】
[0002] RNA干擾(RNAi)是指生物體細胞內，和靶向目標基因同源的外源性或內源性雙鏈 小RNA(siRNA)誘導轉錄后引起特異性基因沉默。RNAi類藥物在腫瘤、基因疾病等病癥上表 現出極大的應用前景，但到目前為止，RNAi技術在治療腫瘤方面仍然存在siRNA靶向性和脫 靶效應、體內不穩定、干擾素效應、藥物運送系統、給藥方式以及藥物安全性等問題。
[0003]納米載體介導的基因轉染具有其他藥物載體所沒有的優勢，特別是磁性納米粒子 擁有良好的生物相容性、優越的磁學性能以及較高的穩定性，可以用于磁靶向siRNA輸送。 超順磁性Fe30 4納米材料在外加磁場條件下有較強磁性，撤去外加磁場后磁性很快消失，使 得納米粒子在磁場中不會被永久磁化，這種獨特物理和磁學特性，可以作為siRNA藥物的靶 向載體，在磁場作用下，革G向輸送藥物到腫瘤等病灶部位。
[0004] -定溫度下，鐵磁性粒子出現超順磁轉變的閾值由有效磁各向異性和玻耳茲曼常 數決定而不可改變，增大鐵磁性粒子的粒徑可以增強磁矩及所述粒子的穩定性，但同時也 導致了所述粒子從超順磁性向鐵磁性的轉變，由此引起的剩磁致使所述粒子不能分散在溶 液中，嚴重降低了生物分離的效率和重復性。因此，如何在確保超順磁性和高的比飽和磁化 強度的同時，增強磁矩和磁可操縱性、提高穩定性以及保證好水溶性，是利用磁分離技術在 生物醫學領域實際應用中亟待解決的關鍵問題。
[0005] 另外，siRNA抗腫瘤藥物在生物有機體內需要通過血液循環抵達病變部位，以發揮 治療作用。超順磁性納米藥物載體的設計目標之一是維持其在生物有機體內的長循環時 間。可通過對載體系統表面進行修飾或改性來實現其在生物有機體內部的長循環，目前大 多通過表面修飾，如聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)或其他改性來實現載體在生物 有機體內部的長循環，雖然延長了循環時間，但多具有細胞毒性。
【發明內容】
[0006] 針對于現有技術中，siRNA抗腫瘤藥物的不穩定性，其易被RNA酶降解、易被機體的 腎臟器官清除以及機體內部的循環半衰期極短的缺陷，本發明的目的之一在于提供一種裝 載siRNA的仿生型磁小體，所述仿生型磁小體可高效、快速地聚集于細胞，達到腫瘤病灶部 位，同時避免生物有機體免疫系統的免疫清除、巨噬細胞的吞噬等機體障礙，達到腫瘤治療 的良好效果。
[0007] 本發明的目的之二在于提供一種裝載SiRNA的仿生型磁小體的制備方法，經所述 方法可制備得到的裝載s iRNA的仿生型磁小體。
[0008] 本發明的目的之三在于提供一種裝載siRNA的仿生型磁小體的修飾方法。
[0009] 本發明的目的是通過下述技術方案現的。
[0010] 一種裝載siRNA的仿生型磁小體，所述仿生型磁小體以水溶性Fe3〇4納米團簇為核， 其外包覆白細胞膜，在所述Fe3〇4納米團簇與白細胞膜之間裝載有s iRNA;所述Fe3〇4納米團 簇由Fe304納米單晶和聚乙稀亞胺(polyethyleneimine，PEI)組成，帶正電荷，粒徑為30nm~ 196nm〇
[0011 ] 其中，優選所述Fe3〇4納米團簇的粒徑為81nm;
[0012]優選白細胞膜為白細胞系J774A. 1的細胞膜。
[0013] 本發明所述的裝載siRNA的仿生型磁小體還可在白細胞膜外共價偶聯有具有修飾 基團的抗體或肽，得到一種偶聯抗體或肽的裝載siRNA的仿生型磁小體；
[0014] 所述抗體為Fc端具有賴氨酸殘基的抗體；
[0015] 所述肽為具有氨基的靶向肽、融合肽和穿膜肽中的一種以上；
[0016] 所述修飾基團為 DBC〇-PEGn-NHS，η = 1 ~2000，優選η = 4;
[0017] 所述修飾基團通過環炔化修飾與抗體或肽上的氨基偶聯。
[0018] -種裝載siRNA的仿生型磁小體的制備方法，所述制備方法步驟如下：
[0019] 步驟一、Fe3〇4納米團簇(簡稱為MNC)的制備
[0020] (1)在無氧環境下，將NaOH完全溶解到二乙二醇(Diethylene glycol，DEG)中，制 備得到NaOH儲存液；
[0021 ]其中，無氧環境可通過采用惰性氣體脫氧處理和保護實現；
[0022] 可加熱至100 °C~150 °C使NaOH完全溶解到DEG中，NaOH完全溶解時停止加熱，優選 加熱至120°C使NaOH完全溶解到DEG中；
[0023] 可將NaOH儲存液保持在50 °C~100 °C下儲存備用，優選將NaOH儲存液保持在70 °C 下儲存備用；
[0024]優選NaOH儲存液采用如下方法制備和儲存：
[0025]將DEG在惰性氣體的環境下做脫氧處理，待氧氣清除完全后，將NaOH溶解到DEG中， 同時加熱，升溫至120°C，直到NaOH完全溶解時停止加熱，所述制備過程全程都需惰性氣體 保護，得淺黃色溶液為NaOH儲存液，保持在70 °C下儲存備用。
[0026] (2)將鐵源、PEI與溶劑混合均勻后抽真空5min~30min，然后填充氬(Ar)氣保護， 加熱至100 °C~180 °C，加入步驟一（1)所得的NaOH儲存液，至溶液中NaOH的濃度為0.03mo 1 / L~0.4mol/L，待溶液顏色變黑后加熱至190°C~230°C，繼續冷凝回流30min~2h，反應結 束，得到含有帶正電荷的MNC的反應液；
[0027]待含有帶正電荷的MNC的反應液冷卻后，磁分離，移去反應液，將磁分離產物超聲 洗滌，再磁分離，移去反應液，得到磁分離終產物為MNC;將MNC懸浮于無 RNA酶的雙蒸水中制 備得到MNC溶液；
[0028] 其中，所述溶劑為DEG，或DEG和乙二醇(Ethylene gl ycol，EG)的混合液，所述混 合液中EG與DEG的體積比為1:14~1:4,優選為2:13;
[0029]所述鐵源為含有Fe2+，常溫下穩定、能夠在所述溶劑中溶解且不發生反應的物質， 優選為FeS〇4 · 7H20或FeCh · 4H20;
[0030]所述PEI作為交聯劑和穩定劑使用；
[0031] 鐵源與PEI的質量比為1:60~128:60;
[0032] 優選混合均勻后抽真空25min;
[0033]優選加熱至160°C，再加入步驟一（1)所得的NaOH儲存液；
[0034]優選加熱至220°C繼續冷凝回流lh，反應結束；
[0035]優選將磁分離產物先分散于無水乙醇中超聲洗滌，再分散于去離子水中超聲洗 滌;更優選在無水乙醇中反復超聲洗滌3次，在去離子水中反復超聲洗滌5次；
[0036]可根據需要，通過調節抽真空的時間或NaOH儲存液加入量制備不同粒徑大小的 MNC，如：
[0037] (1)當加入NaOH儲存液體積為固定值時，通過調節抽真空5miη~30miη，可以制備 粒徑為30nm~196nm的MNC;
[0038] (2)當抽真空時間為固定值時，NaOH的加入量變化，可以制備得到粒徑為30nm~ 196nm 的 MNC〇
[0039 ]步驟二、修飾有疊氮膽堿的白細胞膜碎片(簡稱為Μ)的制備
[0040] 將白細胞在細胞培養完全培養基中培養20h~28h，換入含有0.1 mM~0.4mM疊氮膽 堿(N3)的細胞培養完全培養基中培養22h~28h，收集白細胞，重新懸浮于緩沖溶液中，用勻 漿機對重新懸浮于緩沖溶液中的白細胞進行間歇破碎，采用蔗糖密度梯度離心對間歇破碎 后的白細胞碎片進行分離提取，得到M;將Μ溶解與Hepes C緩沖液(購自賽默飛世而科技公 司）中，得到Μ溶液
[0041 ]其中，優選白細胞為J774A.1細胞系；
[0042]優選在37°C，C02濃度為5%的恒溫培養箱中培養；
[0043]優選在細胞培養完全培養基中培養24h;
[0044] 優選換入含有N3的細胞培養完全培養基中培養24h;
[0045] 優選所述細胞培養完全培養基為內含10%體積分數胎牛血清(FBS)，60yg/mL青霉 素和100yg/mL鏈霉素的DMEM完全培養基(購自賽默飛世爾科技公司）；
[0046]優選含有N3的細胞培養完全培養基中含有0.1 mM的N3;
[0047] 優選用[KA_?Dispersers and Shakers勾衆機2檔對白細胞進行間歇破碎。
[0048] 步驟三、裝載s iRNA的仿生型磁小體(簡稱為M-M: s iRNA)的制備
[0049] (1)將步驟一制得的MNC溶液與siRNA混合，在4°C~8°C下垂直混懸5min~70min， 磁分離，將磁分離后物質再懸浮于無 RNA酶的PEI水溶液中，在0°C~8°C下垂直混懸20min~ 60min，磁分離得到MNC: s iRNA; MNC: s iRNA溶于無 RNA酶的雙蒸水中，得到MNC: s iRNA溶液；
[0050] 其中，siRNA與MNC的摩爾比為1:5~1:15,優選為1:15;
[0051 ] 優選siRNA溶于無 RNA酶的雙蒸水中，得到siRNA溶液與MNC溶液混合；
[0052] 優選加入s iRNA，在4°C下垂直混懸60min;
[0053] 優選無 RNA酶的PEI水溶液的濃度為0.024g/mL;
[0054] 優選將磁分離后物質再懸浮于無 RNA酶的PEI水溶液中，在4°C下垂直混懸30min。
[0055] (2)將步驟三（1)制得的麗C: siRNA溶液、步驟二制得的Μ溶液和緩沖液混合，Μ相對 于MNC: siRNA過量，在0 °C~8°C下垂直混懸6h~15h，磁分離收集得到表面包裹Μ的MNC: s iRNA，即M-MNC: s iRNA，為本發明所述的一種裝載s iRNA的仿生型磁小體；
[0056] 其中，優選在4°C下垂直混懸8h;
[0057] 步驟（1)和(2)中，優選置于垂直混懸儀上垂直混懸，更優選以20r/min的轉速進行 垂直混懸。
[0058]根據不同的使用需要，可對本發明所述的一種裝載siRNA的仿生型磁小體進行生 物修飾，獲得一種偶聯抗體或肽的裝載siRNA的仿生型磁小體:例如根據靶向腫瘤細胞的需 要，通過修飾基團將肽或抗體修飾到本發明所述的一種裝載siRNA的仿生型磁小體的白細 胞膜上，步驟如下：
[0059] (1)將修飾基團水溶液與抗體或肽水溶液混合得到混合液，在室溫下垂直混懸8h ~12h，除去未反應的修飾基團、抗體或肽小分子，制備得到帶有環炔化修飾基團的抗體或 肽的溶液。
[0060]其中，修飾基團與抗體或肽的摩爾比為1:5;
[0061 ] 優選置于垂直混懸儀上垂直混懸，更優選以20r/min的轉速進行垂直混懸10h;
[0062] 未反應的修飾基團、抗體或肽小分子可采用透析或超濾的方法除去。
[0063] (2)將M-MNC: s iRNA溶于無 RNA酶的雙蒸水中得到M-MNC: s iRNA溶液，和帶有環炔化 修飾基團的抗體或肽的溶液混合，在0 °C~8 °C下垂直混懸lh~3h，磁分離，其中，Μ上帶有N3 基團，通過N3和帶有環炔化修飾基團的抗體或肽的點擊(click)化學反應，使帶有環炔化修 飾基團的抗體或肽修飾到M-MNC: s iRNA表面，得到生物修飾后功能化的裝載siRNA的仿生 型磁小體，即一種偶聯抗體或肽的裝載siRNA的仿生型磁小體。
[0064] 其中，M-MNC: siRNA與帶有環炔化修飾基團的抗體或肽的摩爾比為1:5~1:15，優 選為1:10;
[0065] 優選在4Γ下垂直混懸lh。
[0066] 優選置于垂直混懸儀上垂直混懸，更優選以20r/min的轉速進行垂直混懸。
[0067]具體生物修飾方法可為：
[0068] (1)將二苯基環辛炔-聚乙二醇（2000)-馬來酰亞胺（DBC0-PEG(2000)-Mal (maleimide)，簡稱為DBCO-PEG-Mal)水溶液與精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp，簡 稱為RGD)水溶液混合，在室溫下垂直混懸8h~12h，然后除去未反應的DBCO-PEG-Mal及RGD， 得到DBC〇-PEG-Ma 1與R⑶的連接產物（簡稱為DBC〇-PEG-Ma 1-RGD)溶液；
[0069] (2)將M-MNC: siRNA溶于無 RNA酶的雙蒸水中得到M-MNC: siRNA溶液，與DB⑶-PEG-Mal-R⑶溶液混合，在0°C~8°C下垂直混懸lh~3h，磁分離，其中，Μ上帶有N3基團，通過N 3和 DBCO-PEG-Mal的click化學反應，使DBC〇-PEG-Mal-R⑶修飾到M-MNC: s iRNA表面，得到生物 修飾后功能化的裝載siRNA的仿生型磁小體(簡稱為DBC〇-PEG-Mal-RGD-M-MNC : siRNA)，即 一種偶聯抗體或肽的裝載siRNA的仿生型磁小體。
[0070] 有益效果
[0071] 1.本發明提供了一種裝載siRNA的仿生型磁小體，所述仿生型磁小體中的MNC具有 正電荷，可吸附siRNA，外部包覆Μ仿生，可高效、快速地聚集于細胞，達到腫瘤病灶部位，同 時避免生物體免疫系統的免疫清除、巨噬細胞的吞噬等機體障礙，達到腫瘤治療的良好效 果；
[0072] 2.本發明提供了一種裝載s iRNA的仿生型磁小體的制備方法，所述制備方法在MNC 制備過程中，以PEI為穩定劑，Fe2+鐵源為反應前體，DEG和/或EG為溶劑，在堿性環境中，利用 反應體系溶劑中剩余氧氣的氧化作用，氧化部分Fe 2+生成Fe3+，然后通過共沉淀反應生成 Fe3〇4單晶；在Fe3〇4單晶表面包裹PEI，通過PEI的交聯作用，組裝成MNC;
[0073]通過所述制備方法制得的MNC粒徑均勻，通過改變制備時的抽真空時間或NaOH加 入量，可調控MNC粒徑大小，其水溶性和分散性良好，具有很強的超順磁性，且磁矩隨著粒徑 的增大明顯增強;解決了現有MNC制備方法反應操作復雜、可重復性差、成本昂貴的問題，以 滿足生物醫學等領域對高性能磁性Fe 3〇4納米材料的需求；
[0074] 3.本發明提供了一種裝載siRNA的仿生型磁小體的制備方法，所述制備方法利用 MNC帶有正電荷，可用來吸附帶有負電荷的siRNA，裝載siRNA方法，簡單，操作方便，易分離； 利用PEI將麗C: siRNA表面轉變為正電荷，再次利用靜電作用將其包覆在Μ內，操作簡單；由 于Μ的仿生效果，M-M: siRNA在生物體內循環過程中無法被白細胞識別，可以逃避白細胞的 吞噬，延長siRNA在生物體內的循環時間；
[0075] 4.本發明提供了一種裝載s i RNA的仿生型磁小體的修飾方法，所述修飾方法在白 細胞培養過程中換入含有疊氮膽堿的培養基，可以將白細胞膜成功修飾上疊氮基團，白細 胞膜上的疊氮基團可與DBC0發生條件溫和、高效的點擊化學反應;很多功能蛋白及肽段可 修飾上DBC0，因此可以將所述多功能蛋白及肽段連接到白細胞膜上，繼而完成所述仿生型 磁小體的多功能生物修飾；
[0076] 5.本發明提供了一種裝載s i RNA的仿生型磁小體的修飾方法，所述修飾方法制得 的通過修飾基團連有抗體或肽的M-MNC: siRNA的核心為具有超順磁性的MNC，粒徑大小約為 30nm~196nm，可通實體瘤的高通透性和滯留（EPR)效應及磁富集作用聚集在腫瘤部位；同 時抗體或肽(RGD)還可靶向腫瘤細胞表面高表達的α νβ3整合素，也可進一步加快M-MNC: s iRN 富集在腫瘤部位，發揮siRNA藥物的抗腫瘤作用。
【附圖說明】
[0077]圖1為實施例1中蔗糖密度梯度離心分離提取細胞膜蛋白結果（左）以及蛋白斑點 雜交(Dot Blot)分析結果(右）。
[0078]圖2為實施例1中不同平均粒徑的MNC的透射電子顯微鏡(TEM)圖。
[0079] 圖3為實施例1中平均粒徑為81nm的MCN的高分辨透射電子顯微鏡(HRTEM)圖。
[0080] 圖4為實施例1中平均粒徑為81nm的MNC的能譜圖（EDS)。
[0081 ]圖5為實施例1中不同平均粒徑的MNC的X射線衍射(XRD)圖譜。
[0082] 圖6為實施例1中平均粒徑為81nm的MNC的紅外光譜(FTIR)圖。
[0083]圖7為實施例1中平均粒徑為81nm的MNC在磁場中的分離前(左)后(右)的照片。 [0084]圖8為實施例1中不同平均粒徑的MNC的磁化曲線經Langewan方程擬合后的曲線。 [0085] 圖9為實施例1中加入DBCO-Fluor 525的修飾有疊氮膽堿的白細胞膜、加入DB⑶- Fluor 525的未修飾疊氮膽堿的白細胞膜以及未加入DBCO-Fluor 525的未修飾疊氮膽堿的 白細胞膜的激光共聚焦顯微鏡圖像及流式細胞儀熒光強度表征曲線。
[0086] 圖10為實施例1中DBC〇-PEG-Mal與R⑶連接后，DBC〇-PEG-Mal-R⑶的基質輔助激光 解吸電離飛行時間質譜(MALDI-T0F-MS)。
[0087] 圖11為實施例1中制得的M-MNC: s ihTERT的HRTEM成像圖。
[0088] 圖 12 為實施例 1 中制得的 M、M-MNC:sihTERT、MlPM--MNC:sihTERI^DBTO-Fluor 525染料染色后的激光共聚焦顯微鏡成像圖。
[0089] 圖13為實施例l中瓊脂糖凝膠電泳檢測MNC:sihTERT、M-MNC:sihTERT和DBC0-PEG-Mal-RGD-M-MNC: s ihTERT對s iRNA的保護作用的結果。
[0090] 圖 14為實施例 1 中檢測白細胞對MNC: s ihTETR，M-MNC: s ihTERT，R-M-MNC: s ihTETR 以及PEG-MNC:sihTERT內吞作用的激光共聚焦顯微鏡成像圖。
[0091] 圖15為實施例1中檢測人乳腺癌細胞（MCF-7細胞）對MNC:sihTETR、M-MNC: sihTERT、R-M-MNC:sihTET和R-M-MNC:sihTERT(m+)的吞噬效果的激光共聚焦顯微鏡成像 圖。
[0092] 圖16為實施例1中用蛋白免疫印跡法(Western-blot)檢測sihTERT沉默hTERT蛋白 的效果圖。
[0093]圖17為實施例1中采用檢測細胞毒性方法檢測sihTERT抑制腫瘤細胞能力結果圖。 [0094] 圖18為實施例3中檢測人乳腺癌細胞(MB-MDA-231細胞系）對MNC: s iGFP、M-MNC: siGFP、R-M-MNC: siGFP和R-M-MNC: siGFP(m+)吞噬效果的激光共聚焦顯微鏡成像圖。
[0095]圖 19為實施例3 中檢測MNC: s iGFP、M-MNC: s iGFP、R-M-MNC: siGFP和R-M-MNC: s iGFP (m+)沉默綠色熒光蛋白（GFP)能力的激光共聚焦顯微鏡成像圖。
【具體實施方式】
[0096]下面結合實施例與附圖對本發明進行詳細說明。
[0097]以下實施例中：
[0098]所述磁分離具體采用方法為:使用磁吸附，將反應液用移液槍除去，獲得剩余物質 即為磁分離產物。
[0099] 所述垂直混懸為置于垂直混懸儀上以20r/min的轉速進行垂直混懸。
[0100]無 RNA酶的雙蒸水購自北京索萊寶科技有限公司；
[0101]無定形碳膜銅網為D200，購自北京達濟科儀科技有限公司；
[0102] Hepes B緩沖液和Hepes C緩沖液均購自賽默飛世爾科技公司；
[0103] 蛋白酶抑制劑購自羅氏公司；
[0104] 所述細胞培養完全培養基為內含10%體積分數胎牛血清(FBS)、60yg/mL青霉素和 l〇〇yg/m鏈霉素的DMEM完全培養基，購自賽默飛世爾科技公司；
[0105] 環塊化的染料DBCO-Fluor 525購自Click Chemistry Tools;
[0106] SUPER Green II、羅丹明-鬼筆環肽染料以及hochest染料購自北京泛博生物化學 有限公司；
[0107] -抗CD45和辣根過氧化物酶標記的兔抗小鼠二抗購自艾博抗(上海）貿易有限公 司；
[0108] Tris-Buffered Saline Tween-20(TBST)、磷酸鹽緩沖液（PBS)和聚偏二氟乙烯 (PVDF)膜和質量分數為1 %的羊血清購自北京索萊寶科技有限公司；
[0109] CCK-8細胞活性檢測試劑盒購自碧云天，中國；
[0110] 熒光定量PCR試劑盒購自Takara，日本；
[0111] Western-blot試劑盒購自 Invent Biotechnologies，美國；
[0112] 其他所用試劑均購自西格瑪公司；
[0113] 透射電子顯微鏡(TEM)采用日本電子株式會社(JE0L)的JEM-2100F;
[0114] 能譜儀(EDS)采用牛津儀器公司的Aztec;
[0115] X射線衍射(XRD)儀采用XPert PRO MPD，PANalytical，荷蘭；
[0116] 紅外光譜(FTIR)儀采用JASC0公司的FT/IR660;
[0117] 勾衆機米用德國IKA公司的丨丨(A?Dispersers and Shakers勾衆機，IKA?T18;
[0118] 離心機和離心管均購自美國貝克曼庫爾特有限公司(Beckman Coulter, Inc.)，離 心機米用Beckman Coulter L-100XP Ultracentrifuge;
[0119] 激光共聚焦顯微鏡來自UltraVIEW VoX，PerkinElmer，美國；
[0120] 流式細胞儀來自Beckman Coulter，cyan;
[0121] LCQ DecaXP spectrometer MALDI質譜儀來自Thermo Fisher，美國。
[0122] 實施例1
[0123] -種裝載siRNA的仿生型磁小體的制備方法，所述方法具體步驟如下：
[0124] 步驟一、MNC的制備
[0125] (1)將DEG在Ar氣的環境下，待氧氣清除完全后，將固體NaOH溶解到DEG中，同時加 熱，升溫至120°C，直到固體NaOH完全溶解時停止加熱，所述制備過程全程都用Ar氣保護，制 備得到淺黃色溶液，為NaOH儲存液，保持在70°C下儲存備用；
[0126] (2)將FeS〇4 · 7H20、PEI與溶劑混合均勻后抽真空25min，之后填充Ar氣保護；加熱 升溫至160°C，加入步驟一（1)所得的NaOH儲存液，至溶液中NaOH的摩爾濃度為0.03mol/L， 約3min后溶液顏色變成黑色，然后升溫至220°C，繼續冷凝回流lh，反應結束，得到含有帶正 電荷的MNC的反應液；
[0127] 待含有帶正電荷的MNC的反應液冷卻后，磁分離，移去反應液，將磁分離產物分散 于無水乙醇中超聲洗滌，反復3次，磁分離，將磁分離產物分散于去離子水中，超聲洗滌5次， 得到磁分離終產物，為麗C;將MNC溶解于無 RNA酶的雙蒸水中，得到MNC溶液，濃度為50yg/ mL〇
[0128] 其中，溶劑為DEG和EG的混合液，其中EG與DEG的體積為1:7。
[0129] PEI作為交聯劑和穩定劑；
[0130] FeS〇4 · 7H20與PEI的質量比為 1:60。
[0131] 可根據需要，在其他制備條件不變的情況下，通過調節抽真空的時間制備不同粒 徑大小的MNC，如表1所示：
[0132] 表1
[0133]
[0134] 或在其他制備條件不變的情況下，調節NaOH儲存液的加入量為0.4mL，0.6mL， 0 · 75mL，0 · 8mL，0 · 85mL，1 · 2mL，1 · 5mL和2mL，制備不同粒徑大小的MNC，如表2所示
[0135] 表2
[0136]
[0137] 步驟二、Μ的制備
[0138] 將白細胞1774六.1細胞系置于37°(：，0)2濃度為5%的恒溫培養箱中，用細胞培養完 全培養基培養24h，換入含有0.1 mM的疊氮膽堿的細胞培養完全培養基中繼續培養24h，收集 白細胞，棄掉培養基。
[0139] 將收集到的白細胞用pH 7.6的Hepes B緩沖液重新懸浮，加入10yL/mL的蛋白酶抑 制劑，用勾衆機2檔間歇破碎細胞:破碎2min，停lmin，重復10次，然后1000r/min離心3min， 收集上清，沉淀用加了 1 OyL/mL蛋白酶抑制劑的Hepes B緩沖液重新懸浮，用勾楽:機2檔間歇 破碎細胞:破碎2min，停lmin，重復10次，然后1000r/min離心3min，收集上清，上清液同樣懸 浮于含蛋白酶抑制劑的Hepes B緩沖液中，兩次上清液混入最后一次的細胞破碎液，得到在 緩沖溶液中破碎后的白細胞碎片，采用蔗糖密度梯度離心進行分離提取細胞膜蛋白，得到 Μ，將Μ溶解于Η印es C緩沖液，得到Μ溶液，濃度為20.33yg/mL。
[0140] 所述蔗糖密度梯度離心分離提取細胞膜蛋白具體為:在離心管中，從下到上依次 鋪設質量分數為55 %、40 %和30 %的蔗糖溶液，4°C靜置4h;加入Μ溶液，使用離心機在4°C、 28000g離心2h，如圖1左所示，離心管中出現三個梯度的條帶，由下向上依次為質量分數為 55%、40%和30%的條帶，分別收集所述條帶，分別用Hepes C緩沖液重新懸浮分離在質量 分數為55%、40%和30%的蔗糖溶液中的蛋白條帶，用離心機在4°(：，2800(^離心301^11進行 脫糖處理，得到沉淀為M，對Μ進行蛋白斑點雜交(Dot blot)分析，具體方法為:將所述三個 條帶分別每個取5yL樣品依次點在聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，風干后用質量分數為1%的羊 血清封閉過夜，將封閉好的PVDF膜浸泡至用PBS稀釋過的一抗⑶45溶液中，CD45與roS的體 積比為1:200，震蕩孵育111后取出，用1^8-81^€6代(13 &1丨1^1'冊611-20〇831')緩沖液震蕩 洗3次，再將PVDF膜浸泡至用PBS稀釋過的辣根過氧化物酶標記的兔抗小鼠二抗溶液中，所 述二抗與PBS的體積比為1:2000，震蕩孵育lh后取出，用TBST緩沖液震蕩洗3次，最后將PVDF 膜浸泡在DAB溶液中震蕩孵育10min~30min，之后取出PVDF膜，用去離子水沖洗后晾干，在 凝膠成像儀上觀察膜上的斑點，分析結果如圖1右所示，PVDF膜出現由下向上三個斑點，依 次為質量分數為55%、40 %和30%的條帶，可見質量分數為40%的條帶對應斑點的顏色最 深，效果最好，因此選擇40 %蔗糖濃度梯度分離提取的Μ包覆MNC。
[0141] 步驟三、M-M:siRNA的制備
[0142] (1)將平均粒徑為81nm的MNC溶液中加入無 RNA酶雙蒸水溶解的sihTERT(hTETR:人 端粒酶逆轉錄酶基因），sihTERT與MNC的摩爾比為1:10;置于垂直混懸儀，在4°C下以20r/ min垂直混懸60min，磁分離，去除未吸附的sihTERT，將磁分離后物質再懸浮于0.024g/mL無 RNA酶的PEI水溶液中，置于垂直混懸儀，在4°C下以20r/min垂直混懸60min，磁分離得到帶 正電荷的MNC: sihTERT，溶解于無 RNA酶的雙蒸水中，得到MNC: sihTERT溶液，濃度為50yg/ mL〇
[0143] (2)將MNC: sihTERT溶液、Μ溶液和Hepes C緩沖液混合，置于垂直混懸儀，在4°C下 以20r/min垂直混懸8h，磁分離收集得到表面包裹Μ的MNC: sihTERT，即M-MNC: sihTERT，為本 發明所述的一種裝載s iRNA的仿生型磁小體。
[0144] 對M-MNC: s ihTERT進行生物修飾，修飾方法如下：
[0145] (1)將DBCO-PEG-Mal水溶液與R⑶水溶液混合，其中，DBCO-PEG-Mal與RGD的摩爾比 為1:5,置于垂直混懸儀，在室溫下以20r/min垂直混懸12h，透析除去未反應的DB⑶-PEG-Mal及RGD，得到DBC〇-PEG-Mal-R⑶溶液，濃度為37mM;
[0146] (2)將M-MNC: sihTERT溶解于無 RNA酶的雙蒸水得到濃度為50yg/mL M-MNC: sihTERT溶液，與DBC〇-PEG-Mal-R⑶溶液混合，其中M-MNC: sihTERT與DBC〇-PEG-Mal-R⑶的 摩爾比為1:10,置于垂直混懸儀，在4°C下以20r/min垂直混懸lh，磁分離，得到DB ω-PEG-Mal-RGD-M-MNC: sihTER T (可簡寫為R-M-MNC: sihTERT)，為經過生物修飾后的一種裝載 siRNA的仿生型磁小體，。
[0147] 測試表征實驗：
[0148] 1.對制備得到的MNC溶液進行測試表征實驗如下：
[0149] I、分別取實施例1制得的不同粒徑的MNC溶液各10yL，分別分散在lmL去離子水中， 得到稀釋后的MNC溶液，取10yL稀釋后的MNC溶液分別滴在無定形碳膜銅網載體，經干燥后， 通過透射電子顯微鏡（JEM-2100F)進行觀察，如圖2所示。抽真空時間為30min、25min、 20min、15min和5min時，獲得的MNC依次分別如圖2中圖i、圖ii、圖iii、圖iv和圖v所示，可知 MNC的平均粒徑分別為31nm、81nm、110nm、140nm和196nm，同時，可觀察到所述MNC的分散性 良好且粒徑較均一;對平均粒徑為81nm的麗C用高分辨透射電子顯微鏡進行觀察，如圖3所 示，顯示平均粒徑為81nm的MNC并不是一個完整的單晶顆粒，而是由許多粒徑約為llnm的 Fe3〇4單晶構成的團簇，同時還可以觀察到外部模糊的PEI層，圖3左中方框及圖3右中右上角 的插圖為晶格方向的放大圖，通過測量相鄰晶面的間距為〇.29nm，與面心立方結構的Fe 3〇4 晶體(220)晶面的晶格間距一致。
[0150] Π 、將平均粒徑為81nm的MNC用能譜儀分析，結果如圖4所示，可見其元素組成為C、 0、Fe，圖4中有未標出的峰來源于無定形碳膜銅網載體。
[0151] 分別取實施例1制得的不同平均粒徑的MNC各0.5g，分別采用X射線衍射儀進行X射 線衍射測試，采用波長為〇. 15406nm的Cu-Κα射線采集數據，衍射角2Θ為25°~70°，得到相應 的衍射圖譜結果，如圖5所示，可見圖5中由上向下的曲線依次表示平均粒徑為31nm、81nm、 11 Onm、140nm和196nm的MNC衍射曲線，衍射曲線中出現特征峰的2Θ角依次分別為30 · 4°、 35.6°、43.4°、53.4°、57.4°和62.7°，與JCPDS卡片對比后證明該所述特征峰的峰型為Fe 3〇4 晶體的特征衍射峰，分別所對應的Fe3〇4晶面依次為（220)、（311)、（400)、（422)、（511)和 (440 )，沒有雜峰，衍射峰較尖銳，表明所述MNC結晶度較高。
[0152] m、將平均粒徑為81nm的MNC經真空干燥，取少量與KBr晶體研磨，經壓片處理后制 得樣品，將樣品采用紅外光譜儀進行紅外光譜分析，結果如圖6所示，由圖6可知在波數為 586.70CHT 1處有吸收峰，峰型尖銳，為Fe-Ο鍵特征吸收峰；1613.76CHT1處為氨基中N-H鍵彎 曲振動吸收峰，1053.07CHT 1為C-N鍵伸縮振動吸收峰;游離氨基在βδΟΟαιΓ1~3400011-1處應 有兩條明顯吸收帶，但是在3418.20^^ 1處只有一個寬而強的吸收峰，證明PEI包裹在所述 MNC表面致使其化變化而導致兩條吸收峰變為一條。
[0153] IV、所述MNC具有很強的磁可操縱性，取平均粒徑為81nm的MNC分散于水中，呈現如 圖7左所示的黑色溶液，通過磁鐵磁分離，僅約10s即可完全富集分離，溶液由黑色變澄清， 如圖7右所示;平均粒徑為31nm、110nm、140nm和196nm的MNC進行所述磁可操縱性實驗，結果 類似。
[0154] V、常溫下（300K)，將所述不同平均粒徑的MNC真空干燥后，進行振動樣品磁強計 (VSM)測試后得到磁化曲線，如圖8所示，可見圖8中五個曲線圖中的曲線分別代表平均粒徑 為31]1111、8111111、11〇11111、14〇111]1和196111]1的麗(]的磁化曲線，所對應的比飽和磁化強度分別依次 為61 · 99emu/g、71 · 39emu/g、73 · 05emu/g、76 · 37emu/g和 80 · 78emu/g，數值隨著平均粒徑的 增大而增大；同時可以看出磁化曲線都為"S"型，剩磁和矯頑力都為0,說明，常溫下盡管麗C 粒徑在24.8nm以上，但仍表現超順磁性。
[0155] 2.對制備得到的Μ溶液進行測試表征實驗如下：
[0156] (1)利用點擊化學(Click)反應，使環炔化的染料(DBCO-Fluor 525)標記白細胞系 J774A.1的細胞膜，通過激光共聚焦顯微鏡和流式細胞儀對所述細胞膜的疊氮膽堿修飾情 況進行表征，具體步驟如下:將J774A.1細胞系的白細胞置于37°C，C0 2濃度為5%的恒溫培 養箱中，用細胞培養完全培養基培養24h，分別換入含有0.1 mM和0.4mM的疊氮膽堿的細胞培 養完全培養基繼續培養24h。
[0157] 棄掉培養液，加入lmL的體積分數為4%的多聚甲醛固定15min，除去多聚甲醛，用 磷酸鹽緩沖液洗滌2次;之后加入ΙΟμΜ的DBCO-Fluor 525染料，37°C孵育lh后，倒掉染料，再 用PBS洗滌2次，加入PBS獲得樣品溶液，進行激光共聚焦熒光成像和流式細胞儀表征熒光強 度檢測。
[0158] 經過含有0.1 mM的疊氮膽堿的細胞培養完全培養基繼續培養24h后獲得的樣品溶 液進行激光共聚焦熒光成像檢測結果如圖9中cl所示，有紅色熒光信號，說明細胞膜上有疊 氮膽堿并被DBCO-Fluor 525染料所染色;流式細胞儀表征熒光強度檢測結果如圖9中c2所 示，有熒光信號值為1215.25,比a2，b2都要高，表明細胞膜上的疊氮基團已經被DBCO-Fluor 525染料所染色，同時也證明J774A. 1細胞膜上已經成功修飾有疊氮基團。
[0159] 經過含有0.4mM的疊氮膽堿的細胞培養完全培養基繼續培養24h后獲得的樣品溶 液進行激光共聚焦熒光成像檢測結果如圖9中dl所示，有紅色熒光信號，說明細胞膜上有疊 氮膽堿并被DBCO-Fluor 525染料所染色;流式細胞儀表征熒光強度檢測結果如圖9中d2所 示，有熒光信號值為1768.98，出現雙峰，為疊氮基團過多及分布不均，說明0.4mM疊氮膽堿 濃度較〇. ImM疊氮膽堿濃度較高，結合的DBCO-Fluor 525也較多。
[0160] (2)對照實驗1:將J774A. 1細胞系的白細胞置于37°C，C02濃度為5%的恒溫培養箱 中，用細胞培養完全培養基培養48h。
[0161 ]棄掉培養液，加入lmL的體積分數為4 %的多聚甲醛固定15min，用PBS洗兩次，進行 激光共聚焦熒光成像和流式細胞儀表征熒光強度檢測。
[0162] 激光共聚焦熒光成像檢測結果如圖9中al所示，無紅色熒光信號，說明細胞膜上無 疊氮膽堿，也未加入DBCO-Fluor 525染料;流式細胞儀表征熒光強度檢測結果如圖9中a2所 示，流式圖熒光信號值為2.59，信號值較低。
[0163] (3)對照實驗2:將J774A. 1細胞系的白細胞置于37°C，C02濃度為5%的恒溫培養箱 中，用細胞培養完全培養基培養培養48h。
[0164] 棄掉培養液，加入lmL的體積分數為4 %的多聚甲醛固定15min，用roS具體洗兩次； 之后加入1〇μΜ的DBCO-Fluor 525染料，37°C孵育lh后，倒掉染料，再用PBS洗滌2次，加入PBS 獲得樣品溶液，進行激光共聚焦熒光成像和流式細胞儀表征熒光強度檢測。
[0165] 激光共聚焦熒光成像檢測結果如圖9中bl所示，有較弱的紅色熒光信號，說明細胞 膜上無疊氮膽堿，不能與DBCO-Fluor 525發生點擊化學反應，但因 DBCO-Fluor 525少量非 特異吸附在細胞上，因此激光共聚焦熒光成像圖有較弱的紅色熒光信號;流式細胞儀表征 熒光強度檢測結果如圖9中b2所示，流式圖流式圖熒光信號值為94.95,為DB⑶-Fluor 525 染料的非特異性吸附熒光值。
[0166] 綜上所述，可以證明制備得到的Μ為修飾有疊氮基團的白細胞膜碎片，選用含有 0.1 mM的疊氮膽堿的細胞培養完全培養基進行培養。
[0167] 圖9中，DBCO-Fluor 525( + )表示加入有DBCO-Fluor 525，DBC〇-Fluor 525(-)表示 未加入DBCO-Fluor 525; Az ide-Cho表示疊氮膽堿。
[0168] 3.對制備得到的DBC〇-PEG-Mal-RGD溶液進行測試表征實驗如下：
[0169] 取DBC〇-PEG-Mal-R⑶溶液，在LCQ DecaXP spectrometer MALDI質譜儀上檢測，檢 測結果如圖10所示，a表明DB⑶-PEG-Mal與RGD連接形成DBC〇-PEG-Mal-RGD，分子量為 1382 · 025; b為DBC〇-PEG-Mal，分子量為707 · 627，c為RGD，分子量為674 · 755;說明DBC0-PEG-Mal與R⑶已經連接。
[0170] 4.對制備得到的M-MNC:sihTERT進行測試表征實驗如下：
[0171] I、將10yL實施例1制得的M-MNC: sihTERT溶液分散在lmL去離子水中得到樣品，取 約1〇此樣品滴在無定形碳膜的銅網上，通過高分辨透射電子顯微鏡進行觀察，結果如圖11 所示，可見MNC外圍一層稍透明的白細胞膜。
[0172] Π 、將Μ和M-MNC:sihTERT用DB⑶-Fluor 525染料染色，在激光共聚焦顯微鏡下觀 察。
[0173] 對照試驗1:將實施例1步驟二中的白細胞J774A. 1細胞系用細胞培養完全培養基 培養24h，換入含有0.1 mM的疊氮膽堿的細胞培養完全培養基中繼續培養24h改為用細胞培 養完全培養基培養48h，其余步驟同實施例1的步驟，可得到未修飾疊氮膽堿的的白細胞膜 碎片（簡稱為M-)溶液以及M--MNC: s i hTERT溶液。將M-以及M--MNC :sihTERT用DB⑶-Fluor 525染料染色，在激光共聚焦顯微鏡下觀察。
[0174] 激光共聚焦顯微鏡下觀察結果如圖12所示，標尺為ΙΟμπι。其中，al為Μ用DB⑶-Fluor 525染料染色后的觀察結果，圖中有紅色熒光，說明細胞膜上修飾有疊氮膽堿;bl為 M-MNC: sihTERT用激光共聚焦顯微鏡，激發光488，發射光488-500處得到的反射圖，表現為 綠色熒光，說明M-MNC:sihTERT的細胞膜上修飾有疊氮膽堿;clMerge為al和bl的疊加圖，圖 中有綠色和紅色熒光，說明M-MNC: s ihTERT的細胞膜上修飾有疊氮膽堿。
[0175] a2為ΙΓ用DB⑶-Fluor 525染料染色后的觀察結果，圖中沒有熒光，說明細胞膜上 沒有修飾疊氮膽堿，不能被DBCO-Fluor 525染料染色;b2*M_-MNC: sihTERT用激光共聚焦 顯微鏡，激發光488，發射光488-500處得到的反射圖，表現為綠色熒光為『-MNC: sihTERT; c2Merge為a2和b2的疊加圖，圖中只有綠色熒光，說明M--MNC: sihTERT的細胞膜上沒有修飾 有疊氮膽堿。
[0176] IΠ 、用瓊脂糖凝膠電泳檢測sihTERT、MNC:sihTERT、M-MNC:sihTERT和DBCO-PEG-Mal-RGD-M-MNC: sihTERT，具體方法如下：
[0177] 將sihTERT和DBC〇-PEG-Mal-R⑶-M-MNC:sihTERT分別溶解在無 RNA酶雙蒸水溶液 制得濃度為5nM sihTERT溶液和DBC〇-PEG-Mal-RGD-M-MNC: sihTERT溶液，將所述4種溶液分 別放入含有體積分數10 %的FBS的roS中處理4h，得到4個樣品；對照樣品為sihTERT溶液。將 4個樣品和1個對照樣品分別于l%(w/v)瓊脂糖凝膠的3，13，(3，(1，6五個點樣孔處點樣3以1^，顯 色劑為SUPER Green II，在80V電壓下電泳30min。電泳結果如圖13所示，由左向右的a、b、c、 d和e分別依次為處理后sihTERT、MNC:sihTERT、M-MNC:sihTERT和DB⑶-PEG-Mal-RGD-M-MNC: sihTERT電泳結果；a中sihTERT被血清降解后，條帶變淡，b中由于sihTERT與MNC吸附， MNC可減少血清對sihTERT的降解，同時MNC吸附siRNA后限制siRNA條帶速度，故條帶較淡， 并靠后；c 和d分別為 M-MNC:sihTERT和 DBC〇-PEG-Mal-R ⑶-M-MNC:sihTERT，均無條帶出現， 說明M-MNC: sihTERT和DBC〇-PEG-Mal-RGD-M-MNC: sihTERT均對sihTERT有保護作用，且限制 s i R N A電泳。e為對照組的s i h T E R T，出現條帶，說明沒有放入10 %的F B S血清中處理的 s ihTETR不會被降解，為正常的s ihTERT出現的電泳條帶。
[0178] 5.對制備得到的M-MNC: sihTERT的抑瘤能力進行測試表征實驗如下：
[0179] I、檢測仿生磁小體降低白細胞對其吞噬效果。
[0180] 將J774A. 1細胞系的白細胞置于37°C，C02濃度為5%的恒溫培養箱中，用細胞培養 完全培養基培養24h，將實施例1中步得到的MNC: s ihTETR，M-MNC: s ihTERT，R-M-MNC: sihTETR以及將步驟三（2)步中的Μ換為PEG，其余同實施例1，得到的PEG-MNC:sihTERT四種 樣品分別加入J774A. 1細胞，在37 °C孵育24h，棄掉培養基，PBS洗滌三次，分別用羅丹明-鬼 筆環肽染料染細胞膜，Hochest染料染細胞核，用激光共聚焦顯微鏡觀察白細胞對四種樣品 吞噬能力。如圖14所示，圖中紅色代表細胞膜，藍色代表細胞核，綠色為細胞內吞的各樣品， 由圖可見，包覆白細胞膜的M-MNC: sihTERT及R-M-MNC: sihTERT可逃避白細胞的吞噬，細胞 中的綠色熒光少于MNC: s ihTERT及PEG-MNC: s ihTERT組。
[0181] Π 、檢測人乳腺癌細胞(MCF-7細胞)對仿生磁小體的吞噬效果。
[0182] 將人乳腺癌細胞(MCF-7細胞)細胞系置于37°C，C02濃度為5%的恒溫培養箱中，用 細胞培養完全培養基培養24h，得到細胞培養液，將實施例1得到的MNC: sihTETR，M-MNC: sihTERT和R-M-MNC: sihTET分別加入細胞培養液中，其中R-M-MNC: sihTERT組分成兩份加入 細胞培養液，分別為加磁組(R-M-MNC: sihTERT (m+))及不加磁組(R-M-MNC: sihTERT)，四組 樣品在MCF-7培養體系中繼續培養24h，移出細胞培養液，細胞染色同51中J774A.1中染色， 細胞膜，細胞核，樣品顏色同51。
[0183] 如圖 15所示，MCF-7細胞吞噬R-M-MNC: sihTERT(m+)組及R-M-MNC: sihTERT組較多， 細胞中的綠色熒光多于MNC: sihTERT及M-MNC: sihTERT組。
[0184] m、抑制腫瘤細胞能力實驗
[0185] 人乳腺癌細胞(MCF-7細胞)細胞系置于37°C，C02濃度為5%的恒溫培養箱中，用細 胞培養完全培養基培養24h。將sihTERT、實施例1得到的MNC: sihTETR，M-MNC: sihTERT和R-M-MNC: sihTETR分別加入細胞培養液中，其中R-M-MNC: sihTERT組分成兩份加入細胞培養 液，分別為加磁組（R-M-MNC: s ihTERT (m+))及不加磁組（R-M-MNC: s ihTERT )，五組樣品在 MCF-7培養體系中繼續培養24h，收集細胞;按熒光定量PCR試劑盒(Takara，日本)方法檢測 仿生磁小體所裝載的sihTETR沉默人端粒酶逆轉錄酶(hTERT)基因 mRNA的能力；用Western-blot試劑盒 （Invent Biotechnologies， 美國）檢測sihTETR 沉默 hTERT蛋白表達能力 ，結果 如圖16所示。
[0186] 由圖16可見裝載sihTERT的并帶有R⑶肽的仿生磁小體組(R-M-MNC:sihTERT)組與 其加磁組（R-M-MNC: sihTERT(m+))相比較于s ihTERT，MNC: s ihTERT和M-MNC: siTERT沉默 hTETR基因效果更好，更多的減少hTERT基因表達蛋白量，可見s i hTERT: R-M-MNC有更好的沉 默腫瘤s ihTERT基因的效果。
[0187] 用CCK-8細胞活性檢測試劑盒(碧云天，中國）檢測sihTERT抑制腫瘤細胞能力，結 果如圖17所示，裝載sihTERT的并帶有R⑶肽的仿生磁小體組(R-M-MNC:sihTERT)組與其加 磁組（R-M-MNC: s ihTERT (m+))相比較于s ihTERT、MNC: s ihTERT和M-MNC: siTERT對細胞的毒 性作用更大，可更有效的抑制腫瘤細胞生長。
[0188] 實施例2
[0189] -種裝載siRNA的仿生型磁小體的制備方法，所述方法具體步驟如下：
[0190] 步驟一、MNC的制備
[0191] (1)將DEG在Ar氣的環境下，待氧氣清除完全后，將固體NaOH溶解至IjDEG中，同時加 熱，升溫至l〇〇°C，直到固體NaOH完全溶解時停止加熱，所述制備過程全程都用Ar氣保護，制 備得到淺黃色溶液，為NaOH儲存液，保持在70°C下儲存備用；
[0192] (2)將FeCl2 · 4H20、PEI與溶劑混合均勻后抽真空25min，之后填充Ar氣保護；加熱 升溫至100°C，加入步驟一（1)所得的NaOH儲存液，至溶液中NaOH的摩爾濃度為0.03mol/L， 約3min后溶液顏色變成黑色，然后升溫至190°C，繼續冷凝回流30min，反應結束，得到含有 帶正電荷的MNC的反應液；
[0193] 待含有帶正電荷的MNC的反應液冷卻后，磁分離，移去反應液，將磁分離產物分散 于無水乙醇中超聲洗滌，反復3次，磁分離，將磁分離產物分散于去離子水中，超聲洗滌5次， 得到磁分離終產物，為麗C;將MNC溶解于無 RNA酶的雙蒸水中，得到MNC溶液，濃度為50yg/ mL〇
[0194] 其中，溶劑為DEG;
[0195] PEI作為交聯劑和穩定劑；
[0196] FeCh · 4H20與PEI的質量比為 128:60。
[0197] 步驟二、Μ的制備
[0198] 將白細胞1774六.1細胞系置于37°(：，0)2濃度為5%的恒溫培養箱中，用細胞培養完 全培養基培養20h，換入含有0.4mM的疊氮膽堿的細胞培養完全培養基中繼續培養22h，收集 白細胞，棄掉培養基。
[0199] 將收集到的白細胞用pH 7.6的Hepes B緩沖液重新懸浮，加入10yL/mL的蛋白酶抑 制劑，用勾衆機2檔間歇破碎細胞:破碎2min，停lmin，重復10次，然后1000r/min離心3min， 收集上清，沉淀用加了 1 OyL/mL蛋白酶抑制劑的Hepes B緩沖液重新懸浮，用勾楽:機2檔間歇 破碎細胞:破碎2min，停lmin，重復10次，然后1000r/min離心3min，收集上清，上清液同樣懸 浮于含蛋白酶抑制劑的Hepes B緩沖液中，兩次上清液混入最后一次的細胞破碎液，得到在 緩沖溶液中破碎后的白細胞碎片，采用蔗糖密度梯度離心進行分離提取，得到Μ，將Μ溶解于 ifepes C緩沖液，得到Μ溶液，濃度為20.33yg/mL。
[0200] 所述蔗糖密度梯度離心具體同實施例1。
[0201] 步驟三、M-M: siRNA的制備
[0202] (1)將平均粒徑為81nm的MNC溶液中加入無 RNA酶雙蒸水溶解的sihTERT中， sihTERT與MNC的摩爾比為1: 5;置于垂直混懸儀，在8°C下以20r/min垂直混懸60min，磁分 離，去除未吸附的sihTERT，將磁分離后物質再懸浮于0.024g/mL無 RNA酶的PEI水溶液中，置 于垂直混懸儀，在〇°C下以20r/min垂直混懸20min，磁分離得到帶正電荷的MNC: sihTERT，溶 解于無 RNA酶的雙蒸水中，得到MNC:sihTERT溶液，濃度為50yg/mL。
[0203] (2)將MNC: sihTERT溶液、Μ溶液和Hepes C緩沖液混合，置于垂直混懸儀，在0°C下 以20r/min垂直混懸6h，磁分離收集得到表面包裹Μ的MNC: sihTERT，即M-MNC: sihTERT，為本 發明所述的一種裝載s iRNA的仿生型磁小體。
[0204] 對M-MNC: s ihTERT進行生物修飾，修飾方法如下：
[0205] (1)將DBCO-PEG-Mal水溶液與R⑶水溶液混合，其中，DBCO-PEG-Mal與RGD的摩爾比 為1:5，置于垂直混懸儀，在室溫下以20r/min垂直混懸8h，透析除去未反應的DBCO-PEG-Mal 及RGD，得到DBC〇-PEG-Mal-R⑶溶液，濃度為37mM;
[0206] (2)將M-MNC: sihTERT溶解于無 RNA酶的雙蒸水得到濃度為50yg/mL M-MNC: sihTERT溶液，與DBC〇-PEG-Mal-R⑶溶液混合，其中M-MNC: sihTERT與DBC〇-PEG-Mal-R⑶的 摩爾比為1: 5，置于垂直混懸儀，在0°C下以20r/min垂直混懸lh，磁分離，得到DBTO-PEG-Mal-RGD-M-MNC: sihTER T (可簡寫為R-M-MNC: sihTERT)，為經過生物修飾后的一種裝載 siRNA的仿生型磁小體。
[0207] 測試表征實驗方法同實施例1，測試樣品為實施2制得，測試結果與實施例1測試結 果相似。
[0208] 實施例3
[0209] -種裝載siRNA的仿生型磁小體的制備方法，所述方法具體步驟如下：
[0210] 步驟一、MNC的制備
[0211] (1)將DEG在Ar氣的環境下，待氧氣清除完全后，將固體NaOH溶解到DEG中，同時加 熱，升溫至150°C，直到固體NaOH完全溶解時停止加熱，所述制備過程全程都用Ar氣保護，制 備得到淺黃色溶液，為NaOH儲存液，保持在70°C下儲存備用；
[0212] ⑵將FeS〇4 · 7H20、PEI與溶劑混合均勻后抽真空25min，之后填充Ar氣保護；加熱 升溫至180°C，加入步驟一（1)所得的NaOH儲存液，至溶液中NaOH的摩爾濃度為0.4mol/L，約 3min后溶液顏色變成黑色，然后升溫至230°C，繼續冷凝回流2h，反應結束，得到含有帶正電 荷的MNC的反應液；
[0213] 待含有帶正電荷的MNC的反應液冷卻后，磁分離，移去反應液，將磁分離產物分散 于無水乙醇中超聲洗滌，反復3次，磁分離，將磁分離產物分散于去離子水中，超聲洗滌5次， 得到磁分離終產物，為麗C;將MNC溶解于無RNA酶的雙蒸水中，得到MNC溶液，濃度為50yg/ mL〇
[0214] 其中，溶劑為DEG和EG的混合液，其中，EG與DEG的體積比為1:4;
[0215] PEI作為交聯劑和穩定劑；
[0216] FeS04·7H20與PEI的質量比為128:60。
[0217] 步驟二、Μ的制備
[0218]將白細胞1774六.1細胞系置于37°(：，0)2濃度為5%的恒溫培養箱中，用細胞培養完 全培養基培養28h，換入含有0.4mM的疊氮膽堿的細胞培養完全培養基中繼續培養28h，收集 白細胞，棄掉培養基。
[0219] 將收集到的白細胞用pH 7.6的Hepes B緩沖液重新懸浮，加入lOyL/mL的蛋白酶抑 制劑，用勾衆機2檔間歇破碎細胞:破碎2min，停lmin，重復10次，然后1000r/min離心3min， 收集上清，沉淀用加了 1 OyL/mL蛋白酶抑制劑的Hepes B緩沖液重新懸浮，用勾楽:機2檔間歇 破碎細胞:破碎2min，停lmin，重復10次，然后1000r/min離心3min，收集上清，上清液同樣懸 浮于含蛋白酶抑制劑的Hepes B緩沖液中，兩次上清液混入最后一次的細胞破碎液，得到在 緩沖溶液中破碎后的白細胞碎片，采用蔗糖密度梯度離心進行分離提取，得到Μ，將Μ溶解于 ifepes C緩沖液，得到Μ溶液，濃度為20.33yg/mL。
[0220] 所述蔗糖密度梯度離心具體同實施例1。
[0221] 步驟三、M_M:siRNA的制備
[0222] (1)將平均粒徑為81nm的MNC溶液中加入無 RNA酶雙蒸水溶解的siGFP(GFP為綠色 熒光蛋白基因）中，siGFP與MNC的摩爾比為1:15;置于垂直混懸儀，在8°C下以20r/min垂直 混懸70min，磁分離，去除未吸附的siGFP，將磁分離后物質再懸浮于0.024g/mL無 RNA酶的 PEI水溶液中，置于垂直混懸儀，在0°C下以20r/min垂直混懸30min，磁分離得到帶正電荷的 MNC: siGFP，溶解于無 RNA酶的雙蒸水中，得到MNC: siGFP溶液，濃度為50yg/mL。
[0223] (2)將MNC: siGFP溶液、Μ溶液和Hepes C緩沖液混合，置于垂直混懸儀，在8 °C下以 20r/min垂直混懸15h，磁分離收集得到表面包裹Μ的MNC: siGFP，即M-MNC: siGFP，為本發明 所述的一種裝載siRNA的仿生型磁小體。
[0224] 對M-MNC: s iGFP進行生物修飾，修飾方法如下：
[0225] (1)同實施例1生物修飾方法步驟(1);
[0226] (2)將M-MNC: siGFP溶解于無 RNA酶的雙蒸水得到濃度為50yg/mL M-MNC: siGFP溶 液，與DB⑶-PEG-Mal-R⑶溶液混合，其中M-MNC: siGFP與DB⑶-PEG-Mal-RGD的摩爾比為1: 15，置于垂直混懸儀，在8°C下以20r/min垂直混懸3h，磁分離，得到DB⑶-PEG-Mal-RGD-M-麗C: siGFP(可簡寫為R-M-MNC: siGFP)，為經過生物修飾后的一種裝載siRNA的仿生型磁小 體。
[0227] 測試表征實驗：
[0228] 測試表征實驗方法1~4以及51同實施例1，測試樣品為實施3制得，測試結果與實 施例1測試結果相似。
[0229] 5.對制備得到的M-MNC: siGFP的抑瘤能力進行測試表征實驗如下：
[0230] Π 、檢測人乳腺癌細胞(MB-MDA-231)對仿生磁小體的吞噬效果。
[0231] 將人乳腺癌細胞(MB-MDA-231)細胞系置于37°C，C02濃度為5%的恒溫培養箱中， 用細胞培養完全培養基培養24h，得到細胞培養液，將實施例3得到的MNC: siGFP，M-MNC: siGFP和R-M-MNC: siGFP分別加入細胞培養液中，其中R-M-MNC: siGFP組分成兩份加入細胞 培養液，分別為加磁組(R-M-MNC: siGFP(m+))及不加磁組(R-M-MNC: siGFP)，四組樣品在MB-MDA-231培養體系中繼續培養24h，移出細胞培養液，加入PBS。
[0232] 在激光共聚焦顯微鏡下觀察，結果如圖18所示，綠色代表細胞，紫色為細胞內吞的 各樣品；MB-MDA-231 細胞吞噬R-M-MNC: siGFP(m+)組及R-M-MNC: siGFP組較多，多于MNC: s ihTERT 及 M-MNC: s ihTERT 組。
[0233] ΙΠ 、抑制腫瘤細胞能力實驗
[0234] 人乳腺癌細胞(MB-MDA-231)細胞系置于37°C，C02濃度為5%的恒溫培養箱中，用 細胞培養完全培養基培養2411。將8丨6??、實施例3得到的1叱：8丨6??，1-麗(：：8丨6??和1?-1-麗C: siGFP分別加入細胞培養液中，其中R-M-MNC: siGFP組分成兩份加入細胞培養液，分別 為加磁組(R-M-MNC: siGFP(m+))及不加磁組(R-M-MNC: siGFP)，五組樣品在MB-MDA-231培養 體系中繼續培養24h，在激光共聚焦顯微鏡下觀察，結果如圖19所示。R-M-MNC: siGFP組與R-M-MNC:siGFP(m+)，沉默綠色熒光蛋白后，表現為細胞中的綠色較少，相比較于siGFP，MNC: s iGFP和M-MNC: s iGFP沉默GFP基因效果更好，可見R-M-MNC: s iGFP (m+)有更好的沉默腫瘤 siGFP基因的效果。
【主權項】
1. 一種裝載siRNA的仿生型磁小體，其特征在于:所述仿生型磁小體以水溶性Fe3〇4納米 團簇為核，其外包覆白細胞膜，在所述Fe 3〇4納米團簇與白細胞膜之間裝載有siRNA;所述 Fe3〇4納米團簇由Fe3〇4納米單晶和聚乙稀亞胺組成，帶正電荷，粒徑為30nm~196nm。2. 根據權利要求1所述的一種裝載s i RNA的仿生型磁小體，其特征在于:所述Fe3〇4納米 團簇的粒徑為81nm;白細胞膜為白細胞系J774A. 1的細胞膜。3. -種偶聯抗體或肽的裝載siRNA的仿生型磁小體，其特征在于:在實施例1或2所述的 裝載siRNA的仿生型磁小體的白細胞膜外共價偶聯有具有修飾基團的抗體或肽； 所述抗體為Fc端具有賴氨酸殘基的抗體； 所述肽為具有氨基的靶向肽、融合肽和穿膜肽中的一種以上； 所述修飾基團為DBC〇-PEGn-NHS，n = 1~2000; 所述修飾基團通過環炔化修飾與抗體或肽上的氨基偶聯。4. 根據權利要求5所述的一種偶聯抗體或肽的裝載siRNA的仿生型磁小體，其特征在 于:n = 4〇5. -種如權利要求1或2所述的裝載siRNA的仿生型磁小體的制備方法，其特征在于:步 驟如下： 步驟一、Fe3〇4納米團簇，即MNC的制備 (1) 在無氧環境下，將NaOH完全溶解到DEG中，制備得到NaOH儲存液； (2) 將鐵源、PEI與溶劑混合均勻后抽真空5min~30min，填充氬氣保護，加熱至100°C~ 180 °C，加入NaOH儲存液，至溶液中NaOH的濃度為0.03mo 1/L~0.4mo 1 /L，待溶液顏色變黑后 加熱至190°C~230°C，繼續冷凝回流30min~2h，得到MNC反應液； 待MNC反應液冷卻后，磁分離，移去反應液，將磁分離產物超聲洗滌，再磁分離，移去反 應液，得到磁分離終產物為MNC;將MNC懸浮于無RNA酶的雙蒸水中得到MNC溶液； 所述溶劑為DEG，或DEG和EG的混合液，混合液中EG與DEG的體積比為1:14~1:4; 所述鐵源為含有Fe2+，常溫下穩定、能夠在所述溶劑中溶解且不發生反應的物質； 鐵源與PEI的質量比為1:60~128:60; 步驟二、修飾有疊氮膽堿的白細胞膜碎片，即M的制備 將白細胞在細胞培養完全培養基中培養20h~28h，換入含有0.1 mM~0.4mM疊氮膽堿的 細胞培養完全培養基中培養22h~28h，收集白細胞，重新懸浮于緩沖溶液中，用勻漿機對所 述白細胞進行間歇破碎，采用蔗糖密度梯度離心對間歇破碎后的白細胞碎片分離提取，得 到M;將M溶解與H印es C緩沖液中，得到M溶液； 步驟三、裝載siRNA的仿生型磁小體，即M-M: siRNA的制備 (1) 將MNC溶液與siRNA混合，在4°C~8°C下垂直混懸5min~70min，磁分離，將磁分離后 物質再懸浮于無RNA酶的PEI水溶液中，在0°C~8°C下垂直混懸20min~60min，磁分離得到 MNC: siRNA;MNC: siRNA溶于無RNA酶的雙蒸水中，得到MNC: siRNA溶液； siRNA與MNC的摩爾比為1:5~1:15; (2) 將MNC: siRNA溶液、M溶液和緩沖液混合，在0 °C~8 °C下垂直混懸6h~15h，磁分離收 集得到M-MNC: s iRNA，為所述一種裝載s iRNA的仿生型磁小體。6. 根據權利要求5所述的一種裝載s i RN A的仿生型磁小體的制備方法，其特征在于：步 驟一中： (1) 無氧環境通過采用惰性氣體脫氧處理和保護實現； 加熱至100 °C~150 °C使NaOH完全溶解到DEG中，NaOH完全溶解時停止加熱； (2) DEG和EG混合液中EG與DEG的體積比為2:13; 鐵源為FeS〇4 ? 7H20或FeCh ? 4H20; 混合均勾后抽真空25min; 加熱至160°C，再加入NaOH儲存液； 加熱至220°C繼續冷凝回流lh; 將磁分離產物先分散于無水乙醇中超聲洗滌，再分散于去離子水中超聲洗滌； 步驟二中： 白細胞為J774A.1細胞系； 在37 °C，C02濃度為5 %的恒溫培養箱中培養； 在細胞培養完全培養基中培養24h; 換入含有N3的細胞培養完全培養基中培養24h; 細胞培養完全培養基為內含1 〇 %體積分數胎牛血清，60yg/mL青霉素和100yg/mL鏈霉 素的DMEM完全培養基； 含有N3的細胞培養完全培養基中含有0.1 mM的N3; 用丨KA?Dispersers and Shakers勾衆機2檔對白細胞進行間歇破碎； 步驟三中： (1) siRNA與MNC的摩爾比為1:15; siRNA溶于無RNA酶的雙蒸水中，得到siRNA溶液與MNC溶液混合； 加入siRNA，在4°C下垂直混懸60min; 無RNA酶的PE I水溶液的濃度為0.024g/mL; 將磁分離后物質再懸浮于無RNA酶的PEI水溶液中，在4°C下垂直混懸30min; (2) 置于垂直混懸儀上在4 °C下垂直混懸8h。7. 根據權利要求6所述的一種裝載s i RN A的仿生型磁小體的制備方法，其特征在于：步 驟一中： (1) 將DEG在惰性氣體的環境下做脫氧處理，待氧氣清除完全后，將NaOH溶解到DEG中， 同時加熱，升溫至120°C，直到NaOH完全溶解時停止加熱，所述制備過程全程都需惰性氣體 保護，得到NaOH儲存液； (2) 在無水乙醇中反復超聲洗滌3次，在去離子水中反復超聲洗滌5次； 步驟三中： (2)以20r/min的轉速進行垂直混懸。8. -種如權利要求3或4所述的偶聯抗體或肽的裝載siRNA的仿生型磁小體的制備方 法，其特征在于:步驟如下： (1) 將修飾基團水溶液與抗體或肽水溶液混合得到混合液，在室溫下垂直混懸8h~ 12h，除去未反應的修飾基團、抗體或肽小分子，制備得到帶有環炔化修飾基團的抗體或肽 的溶液， 修飾基團與抗體或肽的摩爾比為1:5; (2) 將如權利要求1或2所述的M-MNC: siRNA溶于無RNA酶的雙蒸水中得到M-MNC: siRNA 溶液，和帶有環炔化修飾基團的抗體或肽的溶液混合，在0 °C~8 °C下垂直混懸lh~3h，磁分 離，得到偶聯抗體或肽的裝載siRNA的仿生型磁小體， M-MNC:siRNA與帶有環炔化修飾基團的抗體或肽的摩爾比為1:10。9. 根據權利要求8所述的一種偶聯抗體或肽的裝載siRNA的仿生型磁小體的制備方法， 其特征在于:步驟如下： (1) 置于垂直混懸儀上以20r/min的轉速進行垂直混懸10h; 未反應的修飾基團、抗體或肽小分子采用透析或超濾的方法除去； (2) M-MNC:siRNA與帶有環炔化修飾基團的抗體或肽的摩爾比為1:10; 在4 °C下置于垂直混懸儀上以20r/min的轉速垂直混懸lh。10. 根據權利要求8所述的一種偶聯抗體或肽的裝載siRNA的仿生型磁小體的制備方 法，其特征在于： (1 )DBC〇-PEG-Mal水溶液與R⑶水溶液混合，在室溫下垂直混懸8h~12h，除去未反應的 DBCO-PEG-Mal 及 RGD，得到 DBCO-PEG-Mal-R ⑶溶液； (2)將M-MNC: siRNA溶于無RNA酶的雙蒸水中得到M-MNC: siRNA溶液，與DB⑶-PEG-Ma 1-R⑶溶液混合，在0 °C~8 °C下垂直混懸lh~3h，磁分離，得到偶聯抗體或肽的裝載siRNA的仿 生型磁小體。
【文檔編號】A61P35/00GK106039324SQ201610547657
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年7月12日
【發明人】謝海燕, 張帆, 馬光輝, 魏煒, 趙龍劍
【申請人】北京理工大學, 中國科學院過程工程研究所