一種肺炎鏈球菌莢膜多糖蛋白結合物的制備方法
【專利摘要】本發明涉及一種肺炎鏈球菌莢膜多糖蛋白結合物的制備方法，包括：將肺炎鏈球菌莢膜多糖溶解于硼酸鹽緩沖液中獲得莢膜多糖溶液，所述莢膜多糖溶液與CDAP接觸活化獲得活化后溶液，將所述活化后溶液與載體蛋白接觸結合獲得肺炎鏈球菌莢膜多糖蛋白結合物。本發明所提供的方法對CDAP法進行改進，采用硼酸鹽緩沖液溶解肺炎鏈球菌莢膜多糖，不需要在反應中調節pH值，化學試劑使用減少，制備工藝簡單，生產效率高。
【專利說明】
一種肺炎鏈球菌莢膜多糖蛋白結合物的制備方法
技術領域
[0001] 本發明屬于生物醫藥化學領域，具體涉及一種肺炎鏈球菌莢膜多糖蛋白結合物的 制備方法。
【背景技術】
[0002] 肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae)為革蘭氏陽性細菌，可導致相當高的發 病率和死亡率，引起肺炎、腦膜炎、中耳炎和菌血癥等疾病。現已發現近百種肺炎鏈球菌血 清型，而只有其中20幾種有致病性。肺炎鏈球菌莢膜多糖為其主要毒力決定因素，因為莢膜 不但保護細菌內表面不受補體影響，而且其本身具弱免疫原性。
[0003] 2000年2月肺炎鏈球菌多糖蛋白結合疫苗Prevnar首先在美國得到許可，隨后國際 市場上陸續出現了10價、11價、13價肺炎鏈球菌多糖蛋白結合疫苗。肺炎鏈球菌結合疫苗在 兒童中普遍接種，疫苗所包含的血清型致侵入性肺炎鏈球菌疾病顯著減少。
[0004] 制備結合物所常用的活化多糖方法大致有:溴化氰(CNBr)活化法，CDAP活化法，水 溶性碳化二亞胺(EDC)法。
[0005] CDAP活化法是先在多糖羥基上形成氰酸酯，通過異脲鍵將多糖與載體蛋白質連接 起來。有資料表明，CDAP法能快速有效地活化肺炎鏈球菌多糖。CDAP活化多糖的關鍵參數是 濃度和pH值，傳統的CDAP法，是采用酸堿試劑調節維持反應中的pH值完成多糖的活化反應， 用己二胺、己二酰肼為間隔基，在一定pH值下與載體蛋白質結合，并以酸堿試劑維持結合反 應中的pH值，反應過程中需要對反應的pH和溫度進行連續監控，操作步驟多，效率低、反應 可控制性差。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的是簡化肺炎鏈球菌莢膜多糖蛋白結合物制備的過程，提供一種簡便 高效的肺炎鏈球菌莢膜多糖蛋白結合物的制備方法。
[0007]為達到以上目的，本發明提供了一種肺炎鏈球菌莢膜多糖蛋白結合物的制備方 法，包括:將肺炎鏈球菌莢膜多糖溶解于硼酸鹽緩沖液中獲得莢膜多糖溶液。
[0008] 進一步的，所述方法還包括，將莢膜多糖溶液與CDAP接觸活化獲得活化后溶液，將 所述活化后溶液與載體蛋白接觸結合獲得肺炎鏈球菌莢膜多糖蛋白結合物。
[0009] 具體的，本發明對于將肺炎鏈球菌莢膜多糖溶解于硼酸鹽緩沖液的方式沒有特別 的限制，只要能夠形成充分溶解、性狀均一的溶液即可。例如可以在室溫下，攪拌溶解。
[0010] 其中，所述莢膜多糖溶液與CDAP接觸活化的步驟包括:在15-25 °C下將CDAP按比例 加入莢膜多糖溶液中，活化2_4min。
[0011]在本發明的一種實施方式中，可以將⑶AP溶于乙腈或注射用水中，形成⑶AP濃度 為100-200mg/mL的儲備液。
[0012]在活化步驟結束后，室溫條件下按比例加入載體蛋白，攪拌反應2_4h，獲得肺炎鏈 球菌莢膜多糖蛋白結合物。
[0013]在本發明的一種實施方式中，在接觸結合步驟后，可以將體系經氯化鈉溶液透析、 Sepharose 4FF凝膠層析柱進行純化，收集kD值0-0.3的分離峰得到純化后的產物。
[0014] 優選的，所述硼酸鹽緩沖液中硼酸的濃度為0.2-0.3mo 1/L，pH值為8.5-9.5。特別 優選的，所述硼酸鹽緩沖液中硼酸根的濃度為〇. 25mol/L，pH值為9.0-9.2。
[0015] 可選的，所述硼酸鹽緩沖液的制備方法包括將硼酸和鹽溶于水后用酸堿堿調節pH 值。其中，所述鹽可以為氯化鉀或氯化鈉，在所述硼酸鹽緩沖液中，硼酸根離子的濃度與氯 離子或鈉離子的濃度的比例可以為0.8-1.2:1。
[0016] 在本發明的一種實施方式中，所述硼酸鹽緩沖液是按照以下方式配制的：硼酸鹽 緩沖液濃度為〇.25mol/L，稱取15.458g硼酸和18.638g氯化鉀，加入注射用水950mL，用 5mol/L氫氧化鈉溶液調pH至9.0-9.2，補加注射用水至lOOOmL即可。
[0017]優選的，所述莢膜多糖溶液中莢膜多糖的濃度為6-32mg/mL。
[0018]可選的，所述莢膜多糖為水解后kD值為0.2-0.65的莢膜多糖，血清型包括但不限 于1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F或 33F 型。
[0019] 可選的，當所述莢膜多糖的血清型為1、2、3、8、12?、158、17?、18(：、23?或33?型時， 莢膜多糖溶液中莢膜多糖的濃度為6_20mg/mL。
[0020] 可選的，當所述莢膜多糖的血清型為4、5、6A、6B、7F、9N、9V、10A、11A、14、19A、19F、 20或22F型時，莢膜多糖溶液中莢膜多糖的濃度為15-32mg/mL。
[0021] 需要理解的是，以上所述的莢膜多糖濃度均為單一血清型的莢膜多糖濃度，并非 為多種血清型莢膜多糖的總濃度。
[0022] 在本發明中，上述列舉的莢膜多糖的血清型的名稱均為按照本領域技術人員所公 知的標準進行分類所確定的本領域所公知的血清型，并可以通過多種途徑(例如購買、贈與 等方式)獲得。本發明對于產生各種血清型的菌株沒有特別的限制，可以為本領域所有目前 已知或未知的生產特定血清型莢膜多糖的肺炎鏈球菌菌株。
[0023] 可選的，當莢膜多糖的血清型為3、4、8、919￥、11六、14、18(：、19?、23?或33?型時，莢 膜多糖與CDAP的質量比為1:0.1-0.3。
[0024]可選的，當莢膜多糖的血清型為1、2、5、6A、6B、7F、10A、12F、15B、17F、19A、20S22F 型時，莢膜多糖與CDAP的質量比為1:0.2-0.6。
[0025]其中，載體蛋白為破傷風類毒素 TT和/或白喉類毒素 DT。
[0026] 其中，相對于所述莢膜多糖，載體蛋白的用量可以按照以下比例確定，多糖：蛋白 質量比為1:1-2.5。
[0027] 利用本發明所提供的方法制備獲得的肺炎鏈球菌莢膜多糖蛋白結合物也屬于本 發明的保護范圍。
[0028] 具體的，在本發明的一種實施方式中，每種莢膜多糖溶液中只含有一種血清型的 莢膜多糖，莢膜多糖溶液與載體蛋白結合后獲得單價的肺炎鏈球菌莢膜多糖蛋白結合物。 當需要制備含有多個肺炎鏈球菌莢膜多糖蛋白結合物的多價疫苗時，可以利用本領域技術 人員所公知的方法將單價的肺炎鏈球菌莢膜多糖蛋白結合物按一定比例進行混合。
[0029] 特別值得注意的是，在本發明所提供的方法中，不需要對所述莢膜多糖溶液的pH 值進行調節后再進行接觸活化，接觸活化的過程中也不再對體系的pH值進行調整，在接觸 活化后，不需要對所述活化后溶液進行pH值的調節，也不使用間隔基(例如己二胺、己二酰 肼），直接將所述活化后溶液與載體蛋白進行接觸結合，接觸結合過程中不需要對體系的溫 度和pH值進行監測和調整，結合2-4h后進行柱純化即可以完成肺炎鏈球菌莢膜多糖蛋白結 合物的制備。與現有技術相比極大的提高了制備的效率，縮短了生產時間，減少了生產人員 和試劑的投入。
[0030] 本發明所提供的方法，通過將肺炎鏈球菌莢膜多糖溶解于硼酸鹽緩沖液中使得反 應體系獲得了合適的理化環境，這種合適的理化環境允許在后續制備過程中不需要再對體 系的pH、溫度進行監測和調節，不需要添加額外的試劑以保證制備過程順利進行;這種合適 的理化環境使得后續的活化和結合步驟能夠在穩定的條件下進行，避免了活化和結合步驟 因為部分組分的變化所引起的體系理化環境的變化，極大了簡化了肺炎鏈球菌莢膜多糖蛋 白結合物的制備過程。
[0031] 采用本發明制備的結合物原液，其游離多糖含量均小于30%，所得結合物，具有肺 炎鏈球菌多糖的抗原性和免疫原性。
[0032] 本發明所述的制備方法或利用本發明所提供的方法制備的肺炎鏈球菌莢膜多糖 蛋白結合物可應用于制備單價或多價肺炎鏈球菌結合疫苗(例如13價疫苗）。
[0033] 所述單價或多價肺炎鏈球菌結合疫苗中可包含基于鋁的佐劑。例如，所述鋁佐劑 可以為氫氧化鋁、磷酸鋁或明鞏。
【具體實施方式】
[0034]下面結合【具體實施方式】對本發明進行詳細說明。
[0035]以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。若未特別指明，實施例 中所用技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段，所用原料均為市售商品。
[0036]以下實施例中使用的硼酸鹽緩沖液按照以下方式配置:稱取硼酸和氯化鉀，加入 注射用水，用氫氧化鈉溶液調pH后補加注射用水至1000mL即可。以下硼酸鹽緩沖液的濃度 以硼酸根計。
[0037]以下實施例中使用的CDAP指的是將CDAP溶于乙腈中形成的CDAP濃度為100mg/mL 的儲備液。
[0038]以下實施例中使用的各型肺炎鏈球菌莢膜多糖，均來自北京民海生物科技有限公 司。
[0039] 實施例1
[0040]本實施例用于說明1、8、9V、10A、19A、19F、20型肺炎鏈球菌多糖蛋白結合物的制 備。
[0041 ] 用濃度0.25mol/L，pH值為9.0-9.2的硼酸鹽緩沖液(稱取15.4588硼酸和18.6388 氯化鉀，加入注射用水95〇11^，用51]1〇1/1氫氧化鈉溶液調口!1至9.〇-9.2，補加注射用水至 1000mL即可。（根據中華人民共和國藥典2015年版第三部通則8004配制。）），按表1(1、8、9V、 10八、19六、19?、20型肺炎鏈球菌多糖蛋白結合物的制備)給出的濃度分別完全溶解降解的1、 8、利、1(^、194、19?、20型肺炎鏈球菌莢膜多糖，分別獲得莢膜多糖溶液，25°(：下按比例加入 CDAP，活化2min，按比例加入載體蛋白TT，室溫反應2h，經Sepharose 4FF凝膠層析柱純化， 收集kD值0-0.3的分離峰。采用免疫雙擴散法(按照中華人民共和國藥典2015年版第三部通 則3403)，檢測結果顯示多糖蛋白結合物與1、8、9V、1OA、19A、19F、20型肺炎鏈球菌血清形成 明顯的沉淀線，說明有良好的多糖抗原性。
[0042] 表 1
[0043] L0044」 實施例2
[0045]本實施例用于說明2、5、6A、22F、23F、33F型肺炎鏈球菌多糖蛋白結合物的制備。 [0046] 用濃度0.2mol/L，pH值為9.0-9.5的硼酸鹽緩沖液，按表2(2、5、64、22?、23?、33卩型 肺炎鏈球菌多糖蛋白結合物的制備)給出的濃度分別完全溶解降解的2、5、6A、22F、23F、33F 型肺炎鏈球菌莢膜多糖，分別獲得莢膜多糖溶液，25°C下按比例加入⑶AP，活化2min，按比 例加入載體蛋白TT，室溫反應2h，經Sepharose 4FF凝膠層析柱純化，收集kD值0-0.3的分離 峰。采用免疫雙擴散法(按照中華人民共和國藥典2015年版第三部通則3403)，檢測結果顯 示多糖蛋白結合物與2、5、6A、22F、23F、33F型肺炎鏈球菌血清形成明顯的沉淀線，說明有良 好的多糖抗原性。
[0047] 表 2
[0048] LUU4V」 頭施例?
[0050]本實施例用于說明3、4、9Ν、12F、17F、18C型肺炎鏈球菌多糖蛋白結合物的制備。 [0051 ] 用濃度0.3mol/L，pH值為9.0-9.1的硼酸鹽緩沖液，按表3(3、4、9112?、17?、18(：型 肺炎鏈球菌多糖蛋白結合物的制備)給出的濃度分別完全溶解降解的3、4、9N、12F、17F、18C 型肺炎鏈球菌莢膜多糖，分別獲得莢膜多糖溶液，25°C下按比例加入⑶AP，活化2min，按比 例加入載體蛋白DT，室溫反應2h，經Sepharose 4FF凝膠層析柱純化，收集kD值0-0.3的分離 峰。采用免疫雙擴散法(按照中華人民共和國藥典2015年版第三部通則3403)，檢測結果顯 示多糖蛋白結合物與3、4、9N、12F、17F、18C型肺炎鏈球菌血清形成明顯的沉淀線，說明有良 好的多糖抗原性。
[0052] 表 3
[0053]
[0054] 實施例4
[0055]本實施例用于說明68、7?、11六、14、158型肺炎鏈球菌多糖蛋白結合物的制備。
[0056] 用濃度0.25mol/L，pH值為8.5-9.1的硼酸鹽緩沖液，按表4(68、7?、114、14、158型 肺炎鏈球菌多糖蛋白結合物的制備)給出的濃度分別完全溶解降解的6B、7F、11A、14、15B型 肺炎鏈球菌莢膜多糖，分別獲得莢膜多糖溶液，25 °C下按比例加入CDAP，活化2min，按比例 加入載體蛋白TT，室溫反應2h，經Sepharose 4FF凝膠層析柱純化，收集kD值0-0.3的分離 峰。采用免疫雙擴散法(按照中華人民共和國藥典2015年版第三部通則3403)，檢測結果顯 示多糖蛋白結合物與6B、7F、11A、14、15B型肺炎鏈球菌血清形成明顯的沉淀線，說明有良好 的多糖抗原性。
[0057] 表 4
[0058] LUUDVJ 頭施例t)
[0060] 本實施例用于說明13價肺炎鏈球菌結合疫苗制備。
[0061] 將實施例1-4制備的1、3、4、5、6六、68、7?、利、14、18(：、194、19?及23?血清型原液組 合配制并添加磷酸鋁佐劑，獲得包含磷酸鋁佐劑的13價肺炎鏈球菌結合疫苗。除了 6B血清 型為8yg/mL外，其余各血清型均為4yg/mL;添加不高于0.25mg/mL磷酸錯佐劑以及作為賦形 劑的氯化鈉和琥珀酸鹽及0.2%。的吐溫80。
[0062] 實施例6
[0063] 本實施例用于說明13價肺炎鏈球菌結合疫苗免疫原性研究。
[0064]用制備的13價肺炎鏈球菌結合疫苗、陽性對照和陰性對照分別免疫NIH小鼠（每組 20只），于0、14、28天共免疫三針，42天采血，分離血清，用ELISA法檢測血清中抗各型多糖的 IgG水平。陰性對照平均吸光值X2.1(如陰性對照平均吸光值小于0.05,則按0.05計算）為 Cutoff值；以免疫血清吸光值多Cutoff值判定為陽轉。
[0065]表5 (結合疫苗免疫小鼠后陽轉率及各血清型GMT結果)給出了ELISA分析的小鼠各 血清型陽轉率及抗體幾何平均滴度(GMT)。數據表明，13價肺炎鏈球菌結合疫苗中除7F的陽 轉率為95%，其它各血清型的陽轉率均為100% ;與陽性對照相比較接近或高于其陽性對 照，而陽性對照中不包含的血清型也產生了較高的抗體滴度。
[0066]表 5
[0067]
[0068] 雖然，上文中已經用一般性說明及具體實施方案對本發明作了詳盡的描述，但在 本發明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因 此，在不偏離本發明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發明要求保護的范圍。
【主權項】
1. 一種肺炎鏈球菌莢膜多糖蛋白結合物的制備方法，其特征在于包括:將肺炎鏈球菌 莢膜多糖溶解于硼酸鹽緩沖液中獲得莢膜多糖溶液。2. 根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述硼酸鹽緩沖液中硼酸根的濃度為 0 · 2-0 · 3mol/L，pH 值為 8 · 5-9 · 5。3. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括將所述莢膜多糖溶液與CDAP 接觸活化獲得活化后溶液，將所述活化后溶液與載體蛋白接觸結合獲得肺炎鏈球菌莢膜多 糖蛋白結合物。4. 根據權利要求1-3中任意一項所述的方法，其特征在于，所述莢膜多糖為水解后kD值 為0.2-0.65的莢膜多糖，血清型為1、2、3、4、5、6厶、68、7卩、8、91叭、1(^、11厶、12卩、14、158、 17卩、18(：、19厶、19卩、20、22卩、23卩或33卩型。5. 根據權利要求4所述的方法，其特征在于，所述莢膜多糖的血清型為1、2、3、8、12F、 158、17?、18(：、23?或33?型，莢膜多糖溶液中莢膜多糖的濃度為6-2〇11^/111匕6. 根據權利要求4所述的方法，其特征在于，所述莢膜多糖的血清型為4、5、6A、6B、7F、 9N、9V、10A、11A、14、19A、19F、20或22F型，莢膜多糖溶液中莢膜多糖的濃度為15-32mg/mL。7. 根據權利要求4-6中任意一項所述的方法，其特征在于，莢膜多糖的血清型為3、4、8、 91利、11厶、14、18(：、19?、23?或33?型，莢膜多糖與〇^的質量比為1:0.1-0.3。8. 根據權利要求4-6中任意一項所述的方法，其特征在于，莢膜多糖的血清型為1、2、5、 6八、68、7?、1(^、12?、158、17?、19厶、20或22?型，莢膜多糖與00厶?的質量比為1:0.2-0.6。9. 根據權利要求1-8中任意一項所述的方法，其特征在于，載體蛋白為破傷風類毒素 TT 或白喉類毒素 DT。10. 權利要求1-9中任意一項所述的方法在制備肺炎鏈球菌結合疫苗中的應用。
【文檔編號】A61P31/04GK106039300SQ201610364332
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年5月26日
【發明人】張明華, 龐強, 唐秀麗, 任濤, 段霄, 何迎楓, 崔曉雪, 劉建凱
【申請人】北京民海生物科技有限公司