一種魚用防治多子小瓜蟲病的中草藥復方制劑及其制備與應用
【專利摘要】本發明公開一種魚用防治多子小瓜蟲病的中草藥復方制劑及其制備與應用，屬于殺滅魚類寄生蟲藥物技術領域。該復方制劑由下列原料藥按重量百分比制成：苦參20～40％，白薇60～80％。該復方制劑的制備方法是將各原料藥分別干燥后粉碎，過篩，得各原料藥干粉；將所得原料藥干粉按重量百分比組成，混合，再加入95％的乙醇，浸泡提取2次，得到總提取液；將所得總提取液減壓濃縮，所得濃縮液干燥至恒重，得到魚用防治多子小瓜蟲病的中草藥復方制劑。本發明的中草藥復方制劑具有易分解，無殘留及對環境和人安全的優點，降低了白薇粗提物的毒性，提高了苦參抗小瓜蟲的藥效，其成本大大降低，易于產業化生產及推廣，在水產上具有廣闊應用前景。
【專利說明】
一種魚用防治多子小瓜蟲病的中草藥復方制劑及其制備與應用
技術領域
[0001]本發明屬于殺滅魚類寄生蟲藥物技術領域，特別涉及一種魚用防治多子小瓜蟲病的中草藥復方制劑及其制備方法與應用。
【背景技術】
[0002]多子小瓜蟲(Ichthyophthirius multifiliis)是一種全球分布的寄生纖毛蟲，主要寄生于淡水魚的皮膚、鰓和鰭，引起小瓜蟲病，又稱“白點病”，給水產養殖業造成巨大經濟損失。目前主要通過化學藥物來防治小瓜蟲病，但是化學藥物存在污染環境和危害人類健康的風險，尤其是在孔雀石綠被禁用后，市場上缺少有效防治小瓜蟲病的藥物。中草藥植物具有易分解，無殘留及對環境和人安全的優點，具有開發成安全高效綠色漁藥的前景。目前，已發現部分抗小瓜蟲的植物種類，其中，從白薇中分離鑒定了迄今為止殺小瓜蟲效果最好，且安全性高的活性化合物直立白薇苷C，然而該活性化合物在白薇中的含量僅為
0.0031%，成本太高，難以商業化，而白薇的酒精粗提物可以大大降低成本，同時也有良好的殺小瓜蟲活性，但是白薇酒精粗提物的毒性較高，連續用低于最低殺小瓜蟲成蟲濃度(8mg/L)的白薇粗提物治療患小瓜蟲病的草魚7天，全部魚中毒死亡。另一種中藥苦參也具有抗多子小瓜蟲作用，雖然其粗提物的毒性低，但殺小瓜蟲活性也較低。
【發明內容】
[0003]為了克服現有技術的缺點與不足，本發明的首要目的在于提供一種魚用防治多子小瓜蟲病的中草藥復方制劑。該中草藥復方制劑低毒、易分解、對環境友好。
[0004]本發明另一目的在于提供所述的魚用防治多子小瓜蟲病的中草藥復方制劑的制備方法。
[0005]本發明再一目的在于提供所述的魚用防治多子小瓜蟲病的中草藥復方制劑的應用。
[0006]本發明的目的通過下述技術方案實現:
[0007]—種魚用防治多子小瓜蟲病的中草藥復方制劑，該中草藥復方制劑由下列原料藥按重量百分比制成:苦參(Sophora f lavescens)20?40%，白薇(Cynanchum atratum)60?80%。
[0008]優選地，苦參(Sophoraflavescens)30%，白薇(Cynanchum atratum)70%。
[0009]所述的苦參產于浙江，所述的白薇產于安徽。
[0010]所述的魚用防治多子小瓜蟲病的中草藥復方制劑的制備方法，包括如下步驟:
[0011](a)將各原料藥分別干燥后粉碎，過篩，得各原料藥干粉；
[0012](b)將步驟(a)所得原料藥干粉按重量百分比組成，混合，再加入95%乙醇，浸泡提取2次，得到總提取液；
[0013](c)將步驟(b)所得總提取液減壓濃縮，所得濃縮液干燥至恒重，得到魚用防治多子小瓜蟲病的中草藥復方制劑。
[0014]步驟(a)中所述的干燥是在烘箱中于55?65°C烘干；
[0015]步驟(a)中所述的過篩的目數為40?60目，優選為50目。
[0016]步驟(b)中所述的95%乙醇的體積為各原料藥干粉混合物的重量的10?15倍，優選為1倍。
[0017]步驟(b)中所述的浸泡的溫度為室溫，所述的浸泡的時間為18?36h，優選為24h。
[0018]步驟(c)中所述的減壓濃縮的溫度為70?80°C;
[0019]步驟(c)中所述的干燥的條件是在烘箱中55?65°C下干燥。
[0020]所述的魚用防治多子小瓜蟲病的中草藥復方制劑在制備殺滅多子小瓜蟲的飼料添加劑或飼料中的應用。
[0021]本發明的原理是:該中草藥復方中的每一種中草藥都具有殺滅多子小瓜蟲的功能。據報道，苦參其根部用于治療病毒性肝炎、病毒性心肌炎、腸胃出血和皮膚疾病，如濕疹、陰道炎和牛皮癬等，還具有退熱、抗腫瘤和抗心肌衰弱等生物功能。日本學者已經證明苦參堿和氧化苦參堿具有殺滅刺激隱核蟲的抗寄生蟲效果，張其中等人也報道了苦參粗提物抗多子小瓜蟲活性。
[0022]白薇為蘿蘑科鵝絨藤屬植物直立白薇或蔓生白薇的干燥根。白薇具有抗煙草花葉病毒、抗炎、治療失憶癥和抑制乙酰膽堿酶等功能。張其中等人已經報道了白薇中的直立白薇苷C具有特別好的殺小瓜蟲活性。
[0023]因此，將白薇和苦參兩種中藥配合組成復方，該復方既有良好的抗小瓜蟲活性，毒性又低，商業化前景廣闊。
[0024]本發明相對于現有技術，具有如下的優點及效果:
[0025](I)本發明的中草藥復方制劑，一方面，克服了孔雀石綠和汞制劑禁用藥物毒性大，殘留高，具有“三致”作用的缺點，具有易分解，無殘留，對環境和人安全的優點，另一方面，也降低了白薇粗提物的毒性，提高了苦參抗小瓜蟲的藥效，大大降低了成本，易于產業化生產及推廣。該復方具有預防與治療多子小瓜蟲病的作用，在水產上具有廣闊應用前景。
[0026](2)本發明的制作工藝簡單易行，工廠和個體養殖者都可制備出符合要求的制劑。
【具體實施方式】
[0027]下面結合實施例對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限于此。
[0028]實施例中用到的寄主模型魚為草魚(Ctenopharyngodon idellus)，來源于廣州市花都區五星村魚苗場。寄生蟲模型為多子小瓜蟲(Ichthyophthirius multif iliis)，來源于廣州市花地灣花鳥魚蟲市場。
[0029]實施例1:苦參與白薇對多子小瓜蟲幼蟲的殺滅作用
[0030](I)中草藥乙醇浸膏的制備:將苦參和白薇分別置于55°C烘箱中干燥后粉碎，過50目篩，分別得到干粉;將50g苦參和白薇分別放于中藥材提取罐中，再加入500mL 95%的乙醇，室溫浸泡提取24h，重復2次，得到總提取液;將總提取液在旋轉蒸發儀中進一步減壓濃縮，所得濃縮液置于55 °C烘箱中干燥至恒重。
[0031 ] (2)中草藥藥液的配制:分別稱取乙醇浸膏3.84mg放于1.5mL的EP管中，用含0.10ADMSO的蒸餾水進行溶解，配成2560mg/L的藥物原液，儲存于4 °C冰箱備用。
[0032](3)幼蟲活性檢測:將含有大約600個多子小瓜蟲幼蟲的10yL水溶液加入96孔板的各孔中，另外加入10(^1^不同濃度的藥液，使最終濃度為128、64、32、16、12、8、4、2和01!^/L，每個濃度設置3個平行，實驗溫度控制在23±0.5°(:。4倍顯微鏡下統計4h內幼蟲的死亡時間。
[0033]結果顯示:苦參和白薇乙醇粗提物殺滅多子小瓜蟲幼蟲的最低濃度分別為8和16mg/L，全部致死時間分別為13(^P124min。
[0034]實施例2:苦參與白薇聯用藥敏試驗
[0035](I)中草藥乙醇浸膏的制備同實施例1。
[0036](2)中草藥藥液的配制同實施例1。
[0037](3)根據苦參和白薇乙醇浸膏對多子小瓜蟲感染性幼蟲活性實驗的結果，分別以其MIC開始進行兩倍濃度梯度稀釋，每種中草藥稀釋4個濃度梯度。采用棋盤交叉法，每種復方最終檢測濃度為16個濃度梯度。同時以2MIC、MIC、1/2MIC和不加藥的0.1 %DMS0的蒸餾水作為對照組，進行離體殺滅幼蟲實驗。中草藥聯用實驗以FIC指數作為聯用藥敏實驗的判定依據。FIC指數=(聯用后A藥的MIC值/聯用前A藥的MIC值)+ (聯用后B藥的MIC值/聯用前B藥的MIC值)，判斷標準:FIC指數<0.75時，為協同作用;FIC指數=1時，為累加作用；KFIC指數<2時，為無關作用;FIC指數多2時，為拮抗作用。FIC指數越小，協同作用越強，若FIC指數<0.5，則認為兩藥有顯著協同作用。
[0038]結果顯示:苦參與白薇聯用后所得FIC值為I，表明具有累加作用。
[0039]實施例3:中草藥復方對多子小瓜蟲幼蟲的殺滅作用
[0040](I)中草藥復方乙醇浸膏的制備:苦參120g，白薇280g，總重量400g，置于中藥材提取罐中，再加入4L 95%的乙醇，室溫浸泡提取24h，重復2次，得到總提取液;將總提取液在旋蒸儀中進一步減壓濃縮，所得濃縮液置于55°C烘箱中干燥至恒重，得到魚用防治多子小瓜蟲病的中草藥復方制劑。
[0041 ] (2)中草藥復方藥液的配制:稱取乙醇浸膏3.84mg放于1.5mL的EP管中，用20yL無水乙醇促溶，然后用蒸餾水配成2560mg/L的藥物原液，儲存于4°C冰箱備用。以最高濃度藥液中的無水乙醇含量(0.13%)作為標準，配制含0.13%無水乙醇的對照組處理液。
[0042](3)幼蟲活性檢測:將含有大約600個多子小瓜蟲幼蟲的10yL水溶液加入96孔板的各孔中，另外加入10yL不同濃度的藥液，使最終濃度為128、64、32、16、12、8、4、2、1、0.5和Omg/L，每個濃度設置3個平行，實驗溫度控制在23±0.5°(:。4倍顯微鏡下統計4h內幼蟲的死亡時間和第4h幼蟲的死亡率，計算出EC5Q。計算公式如下:
[0043]死亡率(% ) = (1-實驗組幼蟲個數/對照組幼蟲個數)X 100%。
[0044]結果顯示:中草藥復方在12mg/L濃度下，115min能夠使感染性幼蟲100%致死，并且隨著藥物濃度的增加，致死時間變短。
[0045]實施例4:中草藥復方對多子小瓜蟲成蟲的殺滅作用
[0046](I)中草藥復方乙醇浸膏的制備同實施例3。
[0047](2)中草藥復方藥液的配制同實施例3。
[0048](3)成蟲活性檢測:將含有大約60個成蟲的200yL的水溶液加入24孔板的各孔中，隨后加入200yL不同濃度的藥液，使最終濃度為128、64、32、16、12、8、4、2、1、0.5和Omg/L，每個濃度設置3個平行。4倍顯微鏡下記錄5h內成蟲的死亡時間和第5h的死亡率，計算出半數有效濃度(EC5q)。接著將24孔板靜置于23±0.5°C溫度條件下，統計6h各孔存活成蟲形成的包囊個數，經過17h，包囊釋放出感染性幼蟲，統計平均每個包囊釋放出感染性幼蟲的數量，計算公式如下:
[0049]死亡率(%) = (1-實驗前成蟲個數/實驗后成蟲個數)X 100% ;
[0050]平均每個包囊釋放出感染性幼蟲數=各孔感染性幼蟲數/各孔的包囊數。
[0051 ] 結果顯示:12mg//L濃度下的中草藥復方在202min內可全部殺滅多子小瓜蟲成蟲，并且隨著濃度升高，全部致死時間變短。8mg/L的中草藥復方5h內的殺蟲率為85%，并且能夠完全抑制形成的包囊釋放出感染性幼蟲。
[0052]實施例5:中草藥復方對多子小瓜蟲包囊的殺滅作用
[0053](I)中草藥復方乙醇浸膏的制備同實施例3。
[0054](2)中草藥復方藥液的配制同實施例3。
[0055](3)包囊活性檢測:將含有大約60個成蟲的200yL水溶液加入24孔板各孔中，而后將24孔板靜置于23 ± 0.5 °C溫度條件下6h，待全部形成包囊并統計各孔包囊個數，然后加入20(^1^不同濃度的藥液，使最終濃度為128、64、32、16、12、8、4、2、1和011^/1，每個濃度設置3個平行。在23±0.5°C條件下靜置16h，待全部包囊釋放出感染性幼蟲后，統計每個包囊平均釋放出幼蟲的數量。
[0056]平均每個包囊釋放出感染性幼蟲數=各孔感染性幼蟲數/各孔的包囊數。
[0057]結果顯示:中草藥復方濃度在8mg/L及以上，能夠完全抑制包囊釋放出感染性幼蟲。另外，隨著藥物濃度的降低，平均每個包囊釋放出的感染性幼蟲數增加。
[0058]實施例6:低濃度中草藥復方對多子小瓜蟲幼蟲感染力的影響
[0059](I)中草藥復方乙醇浸膏的制備同實施例3。
[0060](2)中草藥復方藥液的配制:根據實施例3的方法，配制成16、8、4、2和Omg/L的藥液各50mL。
[0061 ] (3)取大約含有100000個感染性幼蟲的1mL蟲液加入50mL燒杯中，再加入1mL藥液，混勻，使最終濃度為8、4、2、I和Omg/L的藥液，然后在23 ± 0.5 °C靜置Ih。取150尾健康草魚隨機平均分配到15個水族箱中(事先準備15個裝有4L曝氣自來水的水族箱，每個水族箱10尾魚)。將被藥液處理過的感染性幼蟲倒入各水族箱中，讓平均每條魚10000只感染性幼蟲感染草魚，每一處理濃度設置3個平行。感染2h后，每個水族箱的曝氣自來水體積加至10L，由充氧栗供氧，實驗溫度保持在23±0.5°C。每天觀察草魚的存活情況，如有死魚及時撈出，以免影響水質。實驗第七天，用150mg/L的麻醉劑(MS-222)(Sigma)麻醉草魚，記錄每尾草魚體表的白點數，并統計感染率和感染強度。
[0062]感染率=(體表有白點的魚數/總魚數)X100% ;
[0063]感染強度=體表白點總數/體表有白點的魚數。
[0064]結果顯示:8mg/L的中草藥復方能顯著阻止多子小瓜蟲感染草魚，且感染強度僅為3.8±4.0。處理濃度在4mg/L時感染強度和感染率與對照相比差異顯著。表明，低濃度的中草藥復方能降低多子小瓜蟲幼蟲的感染能力。
[0065]實施例7:中草藥復方預防和治療小瓜蟲病效果
[0066](I)中草藥復方乙醇浸膏的制備同實施例3。
[0067](2)中草藥復方藥液的配制:稱取5g的中草藥復方乙醇浸膏，根據實施例3，配制成10000、50000、25000 和 Omg/L 的藥液各 50mL。
[0068](3)選擇輕度感染的草魚(體表白點數為37± 13.6)隨機分配到21個含有60L曝氣自來水的10L水族箱中，每個水族箱5尾已感染小瓜蟲草魚。隨后向每個水族箱中加入10尾健康草魚混養。溫度保持在23±0.5°C。隨后向水族箱中加入上述配制的原藥液，混勻，使最終濃度為5、4、2和Omg/L，每個濃度設置3個平行。實驗期間，每天加入與第一天體積相同的原藥液，觀察魚的存活情況(如有死魚，及時撈出，以免影響水質)，隨機麻醉(150mg/L MS-222)3尾患病草魚，計數其體表白點數。若無白點，所對應濃度的實驗組停止用藥，記錄治療時間，用150mg/L的麻醉劑(MS-222) (Sigma)麻醉全部草魚，記錄每尾草魚體表的白點數，統計感染率、感染強度和存活率。在實驗第8天，全部實驗組停止加藥，并統計感染率、感染強度和存活率，同時更換50 %無藥液的新鮮曝氣自來水。在第25天，記錄存活草魚體表的白點數，并統計各實驗組的感染率、感染強度和存活率。計算公式如下:
[0069]感染率(％)=(體表有白點的魚數/總魚數)X 100% ;
[0070]感染強度=體表白點總數/體表有白點的魚數；
[0071 ] 存活率(% )=(實驗后存活魚數/總魚數)X 100%。
[0072]結果顯示:中草藥復方在5mg/L濃度下，藥物累加治療8天，預防與治療多子小瓜蟲病，實驗組已感染草魚與未感染草魚的感染率和感染強度均為0，存活率均為100%。藥物在4mg/L濃度下，未感染魚的感染率為0，被感染魚的感染率下降到73.3%，且感染強度與對照組相比，顯著降低。
[0073]實施例8:中草藥復方對魚的急性毒性實驗
[0074](I)中草藥復方乙醇浸膏的制備同實施例3。
[0075](2)中草藥復方藥液的配制同實施例7。
[0076](3)預實驗:中草藥復方使草魚24h全部致死的濃度為190mg/L，96h不發生死亡的濃度 90mg/L。
[0077]事先18個裝有1L曝氣自來水的水族箱，每個水族箱放10尾健康草魚，溫度控制在
23± 0.5 °C，并由充氧栗供氧。在預實驗的基礎上，再設置170、130、100和Omg/L，每個濃度3個平行重復，進行急性毒性實驗。實驗期間，隨時觀察各濃度組實驗魚的中毒情況，如發現草魚中毒死亡，立即撈出，以免破壞水質，影響實驗結果。記錄在24、48、72、和96h各個濃度組，草魚的死亡數量。根據草魚死亡數及死亡時間，計算24h、48h、96h半致死濃度(LC5q)和對草魚的安全濃度。
[0078]結果顯示:中草藥復方對草魚24、48、96h的半致死濃度(LC5q)分別為164.2mg/L，152.5mg/L，136.9mg/L;對草魚安全濃度為39.5mg/L。中草藥復方安全濃度是其預防與治療濃度的8倍左右，對魚絕對安全。
[0079]上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護范圍之內。
【主權項】
1.一種魚用防治多子小瓜蟲病的中草藥復方制劑，其特征在于:該中草藥復方制劑由下列原料藥按重量百分比制成:苦參(Sophora f Iavescens)20?40%，白薇(Cynanchumatratum)60?80%。2.根據權利要求1所述的魚用防治多子小瓜蟲病的中草藥復方制劑，其特征在于:該中草藥復方制劑由下列原料藥按重量百分比制成:苦參30%，白薇70%。3.權利要求1或2所述的魚用防治多子小瓜蟲病的中草藥復方制劑的制備方法，其特征在于包括如下步驟: (a)將各原料藥分別干燥后粉碎，過篩，得各原料藥干粉； (b)將步驟(a)所得原料藥干粉按重量百分比組成，混合，再加入95%乙醇，浸泡提取2次，得到總提取液； (c)將步驟(b)所得總提取液減壓濃縮，所得濃縮液干燥至恒重，得到魚用防治多子小瓜蟲病的中草藥復方制劑。4.根據權利要求3所述的制備方法，其特征在于: 步驟(a)中所述的干燥是在烘箱中于55?65°C烘干。5.根據權利要求3所述的制備方法，其特征在于: 步驟(a)中所述的過篩的目數為40?60目。6.根據權利要求3所述的制備方法，其特征在于: 步驟(b)中所述的95%乙醇的體積為各原料藥干粉混合物的重量的10?15倍。7.根據權利要求3所述的制備方法，其特征在于: 步驟(b)中所述的浸泡的溫度為室溫，所述的浸泡的時間為18?36h。8.根據權利要求3所述的制備方法，其特征在于: 步驟(c)中所述的減壓濃縮的溫度為70?80°C。9.根據權利要求3所述的制備方法，其特征在于: 步驟(c)中所述的干燥的條件是在烘箱中55?65°C下干燥。10.權利要求1或2所述的魚用防治多子小瓜蟲病的中草藥復方制劑在制備殺滅多子小瓜蟲的飼料添加劑或飼料中的應用。
【文檔編號】A61K36/489GK106038682SQ201610569132
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年7月18日
【發明人】張其中, 林德杰
【申請人】暨南大學