一種葡萄糖和溫度敏感性的自組裝納米粒子及其制備方法和應用
【專利摘要】本發明涉及一種葡萄糖和溫度敏感性的自組裝納米粒子及其制備方法和應用，所述自組裝納米粒子的成分包括：聚3?丙烯酰胺基苯硼酸pAAPBA和二甘醇二甲基丙烯酸酯DEGMA。制備方法包括：將AAPBA、RAFT試劑和引發劑溶解在溶劑中，在無氧條件下70℃反應8h，得到聚合物pAAPBA；將pAAPBA、DEGMA和引發劑混合，溶解在溶劑中，無氧條件下，70℃可逆加成反應8h，得到聚合物p(AAPBA?b?DEGMA)，溶于溶劑中，旋轉，即得。本發明的制備方法簡單；納米粒子可以用于包載胰島素，所包裹的胰島素可以隨著葡萄糖濃度的升高，改變釋藥速度，有著很好的實用價值。
【專利說明】
一種葡萄糖和溫度敏感性的自組裝納米粒子及其制備方法和應用
技術領域
[0001]本發明屬于納米粒子的制備領域，特別涉及一種葡萄糖和溫度敏感性的自組裝納米粒子及其制備方法和應用。
【背景技術】
[0002]當前糖尿病已成為影響人類健康最嚴重的疾病之一，目前唯一有效的治療方法是每日皮下注射胰島素，給予胰島素可以很好的調劑其血糖水平，但是卻不能根據葡萄糖濃度來調節其血糖的變化，此外胰島素注射過量可導致低血糖效應，嚴重者可導致患者亡，所以設計一種根據體內的葡萄糖濃度來自動調節胰島素分泌的智能型載藥系統是十分必要的。近年來關于葡萄糖敏感性材料被廣泛的研究報道，伴刀豆球蛋白、葡萄糖氧化酶和苯硼酸系統是三種葡萄糖敏感性的主要單體，由于伴刀豆球蛋白和葡萄糖氧化酶是基于蛋白質應用的，所以其有一定的缺陷，這主要是由于其在體內不穩定，可以刺激血液產生抗體，此外價格昂貴，不易于工業化生產。
[0003]相反，PBA(苯硼酸)可以克服這些缺點，PBA可以提供一個葡萄糖敏感性的硼羥基，硼羥基可以根據葡萄糖的濃度而控制自身的大小，進而用來調節血糖的濃度變化，然而PBA作為葡萄糖敏感性有一個最大的缺點，就是它的PKa值要遠高于人體正常情況下的pH值，否則就會失去其葡萄糖敏感性，所以當前許多專家和學者針對這種情況想出了三種手段來降低PBA的pKa值。第一種方法外，將使用一種含有羧基的高分子聚合物，這種聚合物可以和硼羥基發生結合反應，進而導致其PKa的下降，另一種方法為將PBA與另一種高分子材料結合，調控二者的比例，以尋找一個最佳的比例，使得其PKa降低，目前溫敏性材料研究最多，這主要是由于溫敏性材料可以改變PBA的溶解度，此外其可以提高藥物的載藥率，進而達到降低其PKa的作用。
[0004]關于溫敏性材料，應用最多的為聚(N-1sopropylacryIamide)P(NIPAAm)，此溫敏性材料被廣泛的應用于載藥系統，同時已有的研究報道，其可以降低PBA的pKa值，使得其可以適用于載藥系統，然而P(NIPAAm)有一個最大的缺陷，就是其有一定的毒理性，特別是其在中度到高度的酸性水溶液中可以分解，產生一種有毒的有機胺成分，這種有機胺具有一定的神經毒性，因此當前科學家均在積極的尋找替代其的溫敏性成分。DEGMA是一種溫敏聚合物，目前已經有的研究報道，其相較于P(NIPAAm)具有明顯的低毒性，同時由于其具有優良的性能，可以適用于包括水凝膠、納米粒子等多種載藥系統。因此可能適用于葡萄糖敏感材料的性能研究。
【發明內容】
[0005]本發明所要解決的技術問題是提供一種葡萄糖和溫度敏感性的自組裝納米粒子及其制備方法和應用，該方法納米粒子可以用于包裹胰島素，且具有很好的釋藥性能。
[0006]本發明的一種葡萄糖和溫度敏感性的自組裝納米粒子(基于DEGMA(Diethyleneglycol dimethacrylate，二甘醇二甲基丙稀酸酯)和 AAPBA ( 3_ (ACR YLO YL AMI NO)BENZENEB0R0NICACID，3-丙烯酰胺基苯硼酸))，所述自組裝納米粒子的成分包括:聚3-丙烯酰胺基苯硼酸pAAPBA和二甘醇二甲基丙烯酸酯DEGMA;其中，pAAPBA與DEGMA的質量比為1:10-2:1;比例為1:5時葡萄糖敏感性最佳。
[0007]所述自組裝納米粒子的直徑為100_200nm;具有葡萄糖敏感性和溫度敏感性，用于載藥微球具有很好的包載率和穩定的釋藥率。
[0008]本發明的一種葡萄糖和溫度敏感性的自組裝納米粒子的制備方法，包括:
[0009](I)將AAPBA、RAFT試劑和引發劑溶解在溶劑中，在無氧條件下70 °C反應8h，得到聚合物 pAAPBA;
[0010](2)將步驟(I)中的pAAPBA、DEGMA和引發劑混合，溶解在溶劑中，無氧條件下，70°C可逆加成反應8h，得到聚合物p(AAPBA-b-DEGMA);其中，pAAPBA與DEGMA的質量比為1:10_2:1;但比例為1:5時葡萄糖敏感性最佳；
[0011](3)將步驟(2)中的聚合物溶于溶劑中，旋轉，得到P(AAPBA-b-DEGMA)納米粒子，即基于DEGMA和AAPBA的葡萄糖和溫度敏感性的自組裝納米粒子。
[0012]所述步驟⑴中RAFT試劑與AAPBA的質量比為1:100，引發劑與AAPBA的質量比為1:1000，溶劑與AAPBA的質量比為1:1。
[0013]所述RAFT試劑為三硫代碳酸酯DDATC;溶劑為DMF;引發劑為AIBN。
[0014]所述步驟(2)中引發劑為AIBN，pAAPBA與DEGMA的質量之和與引發劑的質量比為
1000:lo
[0015]所述步驟(2)中溶劑為DMF，加入量為1000mg;pAAPBA與DEGMA的質量之和與溶劑的質量比為1:1。
[0016]所述步驟(3)中溶劑為體積比為1:1的DMSO和水混合溶液。
[0017]所述步驟(3)中旋轉的條件為:300r/min旋轉3?8h。
[0018]本發明中納米粒子的最佳條件:PAATOA/DEGMA為1:5;所用的引發劑為AIBN;所反應的最佳環境為無氧;反應時間Sh。
[0019]所述自組裝納米粒子應用于包裹胰島素。
[0020]所述制備納米粒子不需要特別的條件，反應簡單，制作的納米粒子穩定，任何添加特定條件的其它專利都屬于本專利的范疇。
[0021]本發明的納米粒子可以載胰島素、載藥量高、同時溶解性好、具有穩定的釋藥性，同時其是低毒的，具有很好的臨床應用價值。
[0022]有益效果
[0023](I)本發明利用AAPBA和DEGMA制作的具有葡萄糖敏感性和溫度敏感性的高分子無規共聚物及其所形成的自組裝納米粒子，其制備方法操作簡單、實驗條件溫和；
[0024](2)本發明的制作的納米粒子藥物裝載量高，能夠緩釋，且在體內穩定，其分解產物在體內沒有毒副作用，可能在今后具有臨床應用價值；
[0025](3)本發明的納米粒子可以用于包載胰島素，所包裹的胰島素可以隨著葡萄糖濃度的升高，苯硼酸中的硼酸會識別葡萄糖中的羥基，進而拉拽納米粒子，通過改變納米粒子的大小而改變釋藥速度，有著很好的實用價值。
【附圖說明】
[0026]圖1為本發明中p(AAPBA-b-DEGMA)的合成示意圖；其中A表示合成p(AAPBA)，B表示合成 P (AAPBA-b-DEGMA)；
[0027]圖2為實施例1中p(AAPBA-b-DEGMA)的紅外圖譜；
[0028]圖3為實施例1中P (AAPBA-b -DEGMA)的核磁圖譜;其中，A、B、C和D分別對應AAPBA、DEGMA、pAAPBA和P(AAPBA-b-DEGMA)；
[0029]圖4為實施例2中p(AAPBA-b-DEGMA)納米粒子的TEM;
[0030]圖5為實施例2中p(AAPBA-b-DEGMA)納米粒子在不同葡萄糖濃度中的粒徑變化；
[0031]圖6為實施例2中P(AAPBA-b-DEGMA)納米粒子在不同pH值的水溶液中的粒徑變化；
[0032]圖7為實施例2中P (AAPBA-b-DEGMA)納米粒子在不同溫度中的粒徑變化；
[0033]圖8為實施例3中p(AAPBA-b-DEGMA)納米粒子在不同葡萄糖濃度下的釋藥特點；
[0034]圖9為實施例4中p(AAPBA-b-DEGMA)納米粒子的細胞毒性考查；
【具體實施方式】
[0035]下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發明講授的內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
[0036]實施例1
[0037](I)稱取AAPBA1000mg，DDATC10mg，AIBNlmg，將上述所有材料混合后溶解于100mg的DMF中，充滿氮氣、70°C，反應8h，即反應生成pAAPBA。
[0038](2)稱取pAAPBA100mg，DEGMA 500mg;同時加入0.6mg的AIBN，將上述所有材料混合后溶解于600mg的DMF中，充滿氮氣、70°C，反應8h，即反應生成p(AAPBA-b-DEGMA)。
[0039](3)稱取1mg的p(AAPBA-b-DEGMA)，將其溶于1mL的1:1的超純水和DMSO中，在低速300r/min的轉速下，將其旋轉3h，即形成P (AAPBA-b-DEGMA)納米粒子。
[0040](4)準確稱量p(AAPBA-b-DEGMA)2mg，將其用溴化鉀粉末壓片后，使用紅外儀對其進行表征，如圖2所示。AAPBA呈現出6個主要的特征峰，分別為C = O的吸收峰(1660cm—工),C =C的吸收峰(1620cm—1KO-B-O的吸收峰(1352cm—O以及B-O的吸收峰(1014cm—O，苯環的吸收峰位于1555cm—1到1610cm—1之間，同時苯環在698cm—1和791cm—1還有一個微弱的吸收峰；DEGMA在1740cm—1有一個C = O的吸收峰，在1650cm—1處有一個C = C的吸收峰;在p(AAPBA)和P(AATOA-b-DEGMA)之間，二者的C = C吸收峰消失，這提示其發生了聚合反應，此外p(AAPBA-b-DEGMA)在996cm-l位置出現一個B-O的吸收峰，這提示，AAPBA在p (AAPBA-b-DEGMA)中的存在。
[0041 ] (4)稱取3-5mg的p(AAroA-b-DEGMA)，將其用氘帶DMSO溶解后，使用核磁H譜表征，如圖3所示。AAPBA(圖3A)的溶于DMSO中的核磁H譜吸收峰為:δ: 10.09 (1H, 4-H)，8.10-7.25(苯環)，6.47(1H，2-H)，6.20(1H，3-H)和5.75(2H，1-H)。DEGMA(圖3B)溶于D20中的核磁H譜!?^；^$S:6.05(1H，1-H)，5.65(1H，2-H)，4.25(2H，3-H)，3.71(2H，4-H)，3.62(2H，5-H)，3.46(2H，6-H)，3.24(3H，7-H)，I.79(3H，8-H) Dp(AAPBA)(圖3C)溶于氘氧化鈉中的核磁H譜吸收峰為δ:8.40-6.33(苯環的吸收峰)，2.95(2Η，10-Η)，2.14(1Η，4-Η)，1.75(1Η，9-Η)，
0.50-1.25and 2.33(C12H25，卜H，2-H和3-H)。p(AAPBA-b-DEGMA)(圖3D)溶于氘氧化鈉中的核磁 H 譜吸收峰為δ:8.10-7.15(苯環的吸收峰)，3.60(1Η, 7-Η)，3.42(2Η, 6-Η)，2.90(1Η，5-Η) ,2.75( 1Η，4-Η)和1.78(2Η，3-H);與AAPBA和DEGMA的吸收峰相比較，可以明顯看出，ρ(AAPBA-b-DEGMA)有一個明顯的苯環吸收峰，提示AAPBA成功的聚合到p(AAPBA-b-DEGMA)。
[0042]實施例2
[0043]實施例1中得到的納米粒子的基本性能。
[0044](I)分別稱取多份Img p(AAPBA-b-DEGMA)，將其溶解于不同濃度(0g/mL、0.5g/mL、Ig/mL、I.5g/mL、2g/mL、2.5g/mL、3g/mL)的葡萄糖水溶液中、不同pH值的溶液(pH值分別為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5)以及不同溫度的溶液中(12度到47度，每5度測定一次)，低速旋轉1h后，使用DLS測定其粒徑。其中，圖5為所得的ρ (AAPBA-b-DEGMA)納米粒子在不同葡萄糖濃度中的粒徑變化；圖6為所得的ρ (AAPBA-b-DEGMA)納米粒子在不同pH值的水溶液中的粒徑變化；圖7為所得的ρ (AAPBA-b-DEGMA)納米粒子在不同溫度中的粒徑變化。
[0045](2)將ρ (AAPBA-b-DEGMA)納米粒子的水溶液滴一滴，置于銅網上，投射電鏡觀察其形貌特點，TEM圖如圖4所示。
[0046]實施例3
[0047]實施例1中得到的納米粒子的載藥特點。
[0048](I)將Img胰島素，與1mg的ρ (AAPBA-b-DEGMA)溶解于1mL的水溶液中，在低速300r/min的轉速下，將其旋轉8h，即完成。
[0049 ] (2)將包裹有胰島素的ρ (AAPBA-b-DEGMA)納米粒子置于Omg/mL、lmg/mL、2mg/mL和3mg/mL葡萄糖濃度的，pH值為7.4的水溶液中，溫度設置為37攝氏度，考查其在60h內的釋藥特點，如圖8所示。
[0050] 實施例4
[0051 ] 實施例1中得到的p(AAPBA-b-DEGMA)的細胞毒性考查。
[0052]將處于對數生長期的單層培養PIEC細胞用胰蛋白酶消化、離心、懸浮、細胞計數板計數，制備成15個/mL的細胞懸液，然后以2X 14個/孔的接種密度將其接種在已經滅菌處理的96孔細胞培養板上進行培養。培養24h后，把ρ (AAPBA-b-DEGMA)的I3BS溶液加入到接種的細胞中，最終形成的聚合物濃度為25，50，100，250，500mg/L，比較其細胞生長特點，如圖9所示。
【主權項】
1.一種葡萄糖和溫度敏感性的自組裝納米粒子，其特征在于，所述自組裝納米粒子的成分包括:聚3-丙烯酰胺基苯硼酸pAAPBA和二甘醇二甲基丙烯酸酯DEGMA;其中，pAAPBA與DEGMA的質量比為1:10-2:1。2.根據權利要求1所述的一種葡萄糖和溫度敏感性的自組裝納米粒子，其特征在于，所述pAAPBA與DEGMA的質量比為1:5。3.根據權利要求1所述的一種葡萄糖和溫度敏感性的自組裝納米粒子，其特征在于，所述自組裝納米粒子的直徑為100_200nmo4.一種葡萄糖和溫度敏感性的自組裝納米粒子的制備方法，包括: (1)將AAPBA、RAFT試劑和引發劑溶解在溶劑中，在無氧條件下70V反應8h，得到聚合物pAAPBA； (2)將步驟(I)中的pAAPBA、DEGMA和弓丨發劑混合，溶解在溶劑中，無氧條件下，70°C可逆加成反應8h，得到聚合物p(AAPBA-b-DEGMA);其中，pAAPBA與DEGMA的質量比為1:10_2:1 ； (3)將步驟⑵中的聚合物溶于溶劑中，旋轉，得到P(AAPBA-b-DEGMA)納米粒子，即葡萄糖和溫度敏感性的自組裝納米粒子。5.根據權利要求4所述的一種葡萄糖和溫度敏感性的自組裝納米粒子的制備方法，其特征在于，所述步驟(I)中RAFT試劑與AAPBA的質量比為1:100，引發劑與AAPBA的質量比為I: 1000，溶劑與AAPBA的質量比為1:1。6.根據權利要求4或5所述的一種葡萄糖和溫度敏感性的自組裝納米粒子的制備方法，其特征在于，所述RAFT試劑為三硫代碳酸酯DDATC;溶劑為DMF;引發劑為AIBN。7.根據權利要求4所述的一種葡萄糖和溫度敏感性的自組裝納米粒子的制備方法，其特征在于，所述步驟(2)中引發劑為AIBN，pAAPBA與DEGMA的質量之和與引發劑的質量比為1000:lo8.根據權利要求4所述的一種葡萄糖和溫度敏感性的自組裝納米粒子的制備方法，其特征在于，所述步驟(2)中溶劑為DMF;pAAPBA與DEGMA的質量之和與溶劑的質量比為1:1。9.根據權利要求4所述的一種葡萄糖和溫度敏感性的自組裝納米粒子的制備方法，其特征在于，所述步驟(3)中溶劑為體積比為I: I的DMSO和水混合溶液;旋轉的條件為:300r/min旋轉3?8h。10.一種如權利要求1所述的葡萄糖和溫度敏感性的自組裝納米粒子的應用，其特征在于，所述自組裝納米粒子應用于包裹胰島素。
【文檔編號】A61P3/10GK106038513SQ201610555414
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年7月15日
【發明人】朱利民, 武俊紫, 李赫宇, 吳煥玲, 周開春
【申請人】東華大學