槲皮素糖苷類化合物在治療肝纖維化中的用圖
【專利摘要】本發明涉及醫藥領域，具體涉及槲皮素糖苷類化合物在治療肝纖維化中的用途。藥效學試驗證明，槲皮素糖苷類化合物具有逆轉CCl4能引起的肝損傷、肝實質細胞壞死、肝纖維化的作用，具有一定的保肝活性。槲皮素糖苷類化合物還能抑制炎癥狀態下HSC細胞的增殖和活化，從而發揮抗肝纖維化的作用。
【專利說明】
槲皮素糖苷類化合物在治療肝纖維化中的用途
技術領域
[0001] 本發明涉及醫藥領域，具體涉及槲皮素糖苷類化合物在治療肝纖維化中的用途。
【背景技術】
[0002] 肝纖維化是由肝損傷引起的持續性炎癥反應，肝臟中細胞外基質的數量及構成發 生改變，正常的降解過程受到抑制，堆積增加，導致過多的不溶性基質堆積在肝臟中，引起 正常組織結構破壞直至器官衰竭，最終發展為肝硬化甚至肝癌。肝硬化是肝臟實質性病變， 醫學界普遍認為較難逆轉，而肝纖維化則是可逆轉的，因此逆轉肝纖維化的研究已成為學 界關注的一個熱點課題。
[0003] 大量研究表明，肝臟內慢性的炎癥反應是導致肝纖維化的主要誘因。巨噬細胞是 肝臟炎癥反應的主要效應細胞，其中Kupffer細胞是肝臟中最主要的駐留型巨噬細胞。在 肝損傷過程中，Kupffer細胞除直接參與炎癥反應外，還能分泌多種促纖維化細胞因子（如 TNF-a，IL-l，IL-6，TGF-0，PDGF)，刺激肝星狀細胞（h印atic stellate cells，HSC)的增 殖、迀移和活化，促進細胞外基質產生和纖維化形成。其中，TGF-β被認為是最有效的刺激 HSC細胞活化的因子之一。此外，Kupffer細胞還釋放大量的氧自由基（reactive oxygen species，ROS)，持續的氧化應激也能誘導激活HSCs，維持肝纖維化的進程。
[0004] 目前，臨床上常用的治療肝纖維化的藥物主要有干擾素、秋水仙堿等，但治療效果 有限，且副作用大。因此，市場上仍需要有效的抗肝纖維化藥物的開發。
[0005] 槲皮素屬于黃酮類化合物，廣泛存在于多種藥用植物和蔬菜水果中。研究表明，槲 皮素及其糖苷類衍生物具有抗炎、抗氧化、降壓、抗抑郁等廣泛的藥理學作用，但至今未見 此類化合物在制備抗肝纖維化治療藥物中的應用報道。
[0006] 槲皮素及其糖苷的結構如下：
【發明內容】
[0008] 本發明公開了槲皮素糖苷治療肝纖維化的用途。本發明所述槲皮素糖苷優選下列 結構通式：
[0009]
[0010] 其中 R 代表-C00H 或-CH2X，其中 X 代表 0H、F、Cl、Br、I、CN、N02、NH2、CF3、SH、0CH3、 0C 2H5 或 C00H〇
[0011] R優選代表_CH20H，即異槲皮苷（代號IQ)。
[0012] R還優選代表-C00H，即槲皮素-3-0- β -D-葡萄糖醛酸苷（代號QB)。
[0013] R還優選代表_CH20CH3。即槲皮素-3-0-β -D-葡萄糖醛酸甲酯（代號QC)
[0014] R還優選代表_CH2F。即氟代異槲皮素苷（代號QF)。
[0015] 下面是槲皮素糖苷的部分藥效學試驗及結果：
[0016] -、槲皮素糖苷類化合物對CC14引起的大鼠肝纖維化模型體內作用研究
[0017] 雄性SD大鼠56只，體重180-200g/只，分籠飼養，自由飲水，室溫20-25°C，光照 12小時/天。隨機抽簽分為7組，每組8只：①正常組（ND);②模型組（M0);③異槲皮苷 組（IQ，25mg/kg/d);④槲皮素-3-0-β-?-葡萄糖醛酸苷組（QB，25mg/kg/d);⑤槲皮素組 (Q，50mg/kg/d);⑥槲皮素-3-0-β-?-葡萄糖醛酸甲酯：(QC，25mg/kg/d);⑦氟代異槲皮素 苷：（QF，25mg/kg/d)。正常組給予橄欖油溶液3mL/kg皮下注射，每周2次，共8周；其余組 別首劑按5ml/kg給予40% CC14橄欖油溶液皮下注射，以后按3ml/kg給予，每周2次，共8 周。每天上午相同時間點分別灌胃給予相應藥物，每周按體重調整給藥劑量，給藥4周。給 藥結束后，禁食16小時，股動脈采血，脫頸椎處死，取肝臟并按常規制備血清、肝組織勻漿。 檢測血清中谷丙轉氨酶（ALT)和谷草轉氨酶（AST)水平。檢測肝臟組織中活性氧（reactive oxygen species, R0S)和 SOD 水平，以及 kupffer 細胞和 HSC 數目。
[0018] (1)槲皮素糖苷類化合物對血清ALT和AST水平的影響
[0019] 表1.槲皮素糖苷類化合物對血清ALT和AST水平的影響
[0020]
[0021] 相較于正常組，aP〈0. 5 ;相較于模型組，bP〈0. 5。
[0022] 結果顯示：與正常組相比，模型組血清ALT和AST水平顯著升高；與模型組相比， 槲皮素糖苷類化合物QB、IQ、QC和QF均能顯著下調血清中ALT和AST水平，而槲皮素（Q) 能顯著下調AST水平，但對ALT沒有明顯影響。以上結果表明，CC14能引起明顯的肝損傷， 導致肝實質細胞壞死，發生肝纖維化，而槲皮素糖苷類化合物則能逆轉這一作用，具有一定 的保肝活性。
[0023] (2)槲皮素糖苷類化合物對肝臟組織中Kupffer細胞的影響
[0024] 結果見圖1，圖1顯示：與正常組相比，模型組肝臟中Kupffer細胞數目明顯增加， 其標志表達物CD68含量明顯升高；與模型組相比，槲皮素糖苷類化合物QB、IQ和QC均能極 顯著減少肝臟組織Kupffer細胞的數目，下調⑶68的表達，而QF和Q對肝臟組織中Kupffer 細胞的數目具有一定的下調作用，但作用不顯著。這表明槲皮素糖苷類化合物QB、IQ和QC 可能通過調控Kupffer細胞，改善肝臟中的炎癥狀態，從而發揮抗肝纖維化作用。
[0025] (3)槲皮素糖苷類化合物對肝臟中HSC細胞的影響
[0026] 結果見圖2,圖2顯示：與正常組相比，模型組肝臟組織中HSC細胞數量明顯增加； 與模型組相比，槲皮素糖苷類化合物IQ，QB和QC均可明顯減少HSC細胞的數目，并且如圖 QB組的效果是最好的，而槲皮素對HSC細胞沒有顯著影響。此部分結果說明，在CC14誘導 的肝損傷過程中，槲皮素糖苷類化合物IQ，QB和QC都能夠抑制HSC細胞的增殖。
[0027] (4)槲皮素糖苷類化合物對肝臟組織中氧化和抗氧化指標的影響
[0028] 結果見圖3,圖3顯示：與正常組相比，模型組肝臟中氧化還原水平失衡，R0S產生 顯著增多，而S0D酶活力明顯下降；與模型組相比，槲皮素糖苷類化合物IQ，QB和QC均能 顯著減少肝臟中R0S的含量，升高S0D活力，而Q則對肝臟中的氧化抗氧化水平沒有顯著影 響。此部分結果表明，槲皮素糖苷類化合物IQ，QB和QC能夠減輕肝臟的氧化損傷，減少R0S 的產生，提高S0D活力，具有保肝作用。
[0029] 二、槲皮素糖苷類化合物對LPS誘導的Kupffer細胞與HSC細胞共培養模型的體 外作用研究（1)大鼠原代HSC細胞和Kupffer細胞的分離培養
[0030] 選用正常雄性SD大鼠，以10%水合氯醛（300 μ L/100g)麻醉后固定體位、消毒， 依次打開皮膚、腹腔暴露門靜脈和下腔靜脈，，打開胸腔下腔靜脈胸段后插入靜脈套管針 以動脈夾固定，剪開門靜脈，同時排空套管針內的空氣，向肝臟灌注37°C預熱的HEPES緩沖 液，流速30mL/min。灌注15-20分鐘后肝臟逐漸變為灰白色即刻停止灌注，換用37°C預熱 的0. 02%含鈣（0. 06% )膠原酶灌注，流速為15mL/min，待看到肝臟表面出現囊泡或者裂 痕時立即停止灌注，小心將肝臟取下放入盛有HEPES緩沖液的燒杯中輕輕沖洗一遍，然后 將肝臟轉移至一個盛有無血清DMEM培養基的燒杯中，用無菌鑷子撕破肝臟表面的纖維膜， 并不斷抖動以抖落細胞。細胞懸液用200目濾網過濾，取過濾后的細胞懸液以50g離心90 秒，使肝臟中的HSC細胞、kupffer細胞與肝細胞分離出來。取上層清液，50g離心5分鐘， 重復1-2次，棄沉淀。取上清液200g離心10分鐘，取沉淀用含10% FBS的DMEM培養基重 懸后，再次200g離心10分鐘，棄上清，余下的沉淀用含10% FBS的DMEM培養基重懸，調整 濃度為2X 105接種至培養瓶中，置于37°C，體積分數5%的C02培養箱中培養，每2-3天換 一次液。
[0031] 據上所述，50g離心90秒后分離肝細胞取得的上清液，4°C，450g離心10分鐘，獲 得肝臟非實質細胞。用Percoll兩步梯度離心法1000g，4°C離心10分鐘進行Kupffer細 胞的分離、純化。用含10% FBS的DMEM培養基重懸，調整濃度為2X 105接種至6孔板中， 置于37°C，體積分數5% C02培養箱培養。2小時后，首次換液，洗去未貼壁的細胞，之后每 2-3天換一次液。
[0032] 采用臺盼藍染色法測定大鼠原代HSC細胞存活率為95 ± 2 %，Kupffer細胞存活率 為96 ± 2 %，結果表明，其細胞存活率滿足體外培養的要求。
[0033] ⑵Kupffer細胞（正常）/HSC細胞共培養模型的建立
[0034] 取生長狀態良好的Kupffer細胞，用0. 25%胰酶消化后，在組11。611(中間半透 膜的微孔直徑為〇. 4 μ m)雙層培養室的下室中加入lml密度為2 X 105的Kupffer細胞；此 時再將lmlHSC細胞以2X105個/ml的密度加入Millicell上層小室。用含10% FBS的 DMEM培養基，置于37 °C，體積分數5 %的C02培養箱內培養，每2天更換一次培養基。待5-7 天后，HSC細胞分化成熟，可以進行實驗。
[0035] (3) Kupffer細胞（炎癥狀態）/HSC細胞共培養模型的建立
[0036] 取生長狀態良好的Kupffer細胞，用0. 25%胰酶消化后，在Millicell (中間半透 膜的微孔直徑為〇. 4 μ m)雙層培養室的下室中加入lml密度為2 X 105的Kupffer細胞，加 入含10 % FBS及100ng/ml脂多糖的DMEM培養基培養24小時后，再將lmlHSC細胞以2 X 105 個/ml的密度加入Millicell上層小室。此時將所用的培養基均換為含10% FBS的DMEM 培養基，置于37°C，體積分數5%的C02培養箱內培養，每2天更換一次培養基。待5-7天 后，HSC細胞分化成熟，可以進行實驗。
[0037] (4)實驗分組及給藥處理：
[0038] 正常組1 :HSC單獨培養；
[0039] 正常組2 :Kupffer細胞與HSC細胞共培養（KC+HSC);
[0040] 模型組：LPS誘導的Kupffer細胞與HSC細胞共培養；
[0041] QC 組：50μΜ ;IQ 組：50μΜ ;QB 組：30μΜ ;Q 組：50μΜ ;
[0042] 采用上述兩種共培養模型，置37 °C，體積分數5 % C02培養箱內培養24小時后，吸 棄下小室的培養基，下室加入含不同劑量藥物的DMEM培養基lml，培養24小時或48小時 后，檢測體系中HSC細胞數目、R0S水平及TGF- β含量。
[0043] 5.實驗結果
[0044] (1)槲皮素糖苷類化合物對共培養模型中HSC細胞數目的影響
[0045] 結果見圖4,圖4顯示：與正常組1相比，當正常的Kupffer細胞與HSC細胞共培養 24小時或48小時，體系中HSC細胞數目有所增加，但沒有顯著性差異；與正常組2相比，當 采用LPS誘導的炎癥狀態下的Kupffer細胞與HSC細胞共培養時，無論是24小時或是48小 時，體系中HSC細胞的數目均明顯增加；而與模型組相比，槲皮素糖苷類化合物IQ和QB無 論作用24h或48h均能明顯減少體系中HSC細胞的數量，而QC作用24h也能顯著減少HSC 細胞的數量，但是藥物Q對HSC細胞沒有顯著影響。此部分結果表明，槲皮素糖苷類化合物 IQ，QB和QC均能一定程度上抑制炎癥狀態下HSC細胞的增殖和活化，從而發揮抗肝纖維化 的作用。
[0046] (2)槲皮素糖苷類化合物對共培養模型中R0S水平的影響
[0047] 結果見圖5,圖5顯示：與正常組1相比，當正常的Kupffer細胞與HSC細胞共培 養時，體系中R0S水平稍有上調，但沒有顯著性差異；與正常組2相比，當采用LPS誘導的炎 癥狀態下的Kupffer細胞與HSC細胞共培養時，體系中R0S水平顯著上調；而與模型組相 比，槲皮素糖苷類化合物QC，IQ和QB均能顯著下調R0S水平，其中以IQ和QB的效果最好 (P〈0. 001)，而藥物Q對ROS水平沒有顯著影響。此部分結果表明，槲皮素糖苷類化合物QC， IQ和QB能極顯著減少炎癥狀態下共培養體系中R0S的產生，維持體系氧化與抗氧化狀態的 平衡。因此，槲皮素糖苷類化合物QC，IQ和QB也可能通過抑制體系中R0S的產生減少HSC 細胞的激活，從而發揮抗肝纖維化的作用。
[0048] (3)槲皮素糖苷類化合物對共培養模型中TGF-β含量的影響
[0049] 結果見圖6,圖6顯示：與正常組1相比，當正常的Kupffer細胞與HSC細胞共培 養24小時或48小時時，體系中TGF-β的含量稍微有些上調，但沒有顯著性差異；與正常 組2相比，當采用LPS誘導的炎癥狀態下的Kupffer細胞與HSC細胞共培養時，無論是24 小時或是48小時，體系中TGF-β的含量都明顯上調；而與模型組相比，槲皮素糖苷類化合 物QC，IQ和QB無論作用24h或48h均能明顯下調體系中TGF-β的含量，其中QC和QB作 用48h更為顯著（P〈0. 01)。此部分結果表明，槲皮素糖苷類化合物IQ，QB和QC均能通過 抑制TGF- β的釋放，減少促纖維化因子的產生，抑制HSC細胞的激活，且QC和QB的效果更 好。但槲皮素 Q未見顯著生物效應。
【附圖說明】
[0050] 圖1.是槲皮素糖苷類化合物對肝臟中Kupffer細胞的影響（注：白色箭頭所示為 kupffer細胞標志物⑶68的表達）
[0051] 圖2是槲皮素糖苷類化合物對肝臟中HSC細胞數目的影響（圖中黑色箭頭所示深 藍色小點為HSC細胞）
[0052] 圖3是槲皮素糖苷類化合物對肝臟組織中R0S和S0D含量的影響（相較于正常組， ###Ρ〈0· 001 ;相較于模型組，*Ρ〈0· 05, **Ρ〈0· 01，***Ρ〈0· 001)
[0053] 圖4是槲皮素糖苷類化合物對共培養模型中HSC細胞數目的影響（相較于正常組 2，#Ρ〈0· 05, ##Ρ〈0· 01 ;相較于模型組，*Ρ〈0· 05, **Ρ〈0· 01)
[0054] 圖5是槲皮素糖苷類化合物對共培養模型中R0S含量的影響（相較于正常組2， Ρ〈0· 01 ;相較于模型組，*Ρ〈0· 05, ***Ρ〈0· 001)
[0055] 圖6是槲皮素糖苷類化合物對共培養模型中TGF- β含量的影響（相較于正常組 2, ##Ρ〈0· 01 ;相較于模型組，*Ρ〈0· 05, **Ρ〈0· 01)。
【主權項】
1. 搬皮素糖巧用于制備預防/治療肝纖維化疾病的藥物的用途。2. 權利要求1的用途，其中搬皮素糖巧具有下列結構通式（I):其中 R 代表-COOH 或-CHzX,其中 X 代表地、F、C1、Br、I、CN、N02、畑2、CFs、SH、OC冊、 OC2H5 或 C00H。3. 權利要求2的用途，其中R代表-CH 20H。4. 權利要求2的用途，其中R代表-C00H。5. 權利要求2的用途，其中R代表-CH 2〇邸3。6. 權利要求2的用途，其中R代表-CH 2尸。
【文檔編號】A61K31/7048GK106031732SQ201510109889
【公開日】2016年10月19日
【申請日】2015年3月12日
【發明人】尚靖, 高榕蔭, 王路路, 王濤, 李妤, 丁琳, 張志超
【申請人】南京瑞菁醫藥科技有限責任公司